（生物化学与分子生物学专业论文）烤烟游离氨基酸的研究.pdf

摘要 烤烟中的游离氨基酸刘烟株的氮代酣及烟叶品质的形成具有重要作用，其含量的 高低对烟叶和烟气质量影响较大。分析研究烟草不同品种及成熟进程中游离氨基酸、 烟碱、蛋白质含量的差异及变化规律，可为烟草的新品种选育和烟草品质的提高奠定 理论依据和试验基础。 本研究以云烟8 7 、r g l l 、g 8 0 、翠碧一号、n c 8 2 、k 3 1 7 、红花大会元、云烟 8 5 等8 个烤烟品种中部适熟叶片为试验材料，采用p i t c 衍生的反相高效液相色谱法 分析测定了游离氨基酸的含肇：；采用紫外分光光度法测定了烟碱的含量；采用凯氏定 氮法测定了蛋白质的含量。此外，以k 3 2 6 烤烟品种为试验材料，分析测定了成熟进程 中游离氨基酸、烟碱和蛋白质含量的变化规律。并对测定结果进行了统计学分析。试 验所取得的丰要研究结果如下： 1 建立了采用高效液相色谱( p i t c 衍生) 技术定性定量分析烤烟杀青炯叶中游离 氨基酸含量的测定方法。包括游离氨基酸的提取、纯化、衍生和定性定量测定方法。 所形成的实验方法能最大祝度的提取烤烟杀青叶中的游离氨基酸，并较好的除去影响 氨基酸测定的杂质。良好的梯度沈脱程序使各种氨基酸衍生物能得到较好的分离，并 且孩方法重复十牛好，回收率较高。实验结果口】靠。 2 分析和比较了不同基因型烤烟适熟期叶片游离氨基酸、蛋白质、烟碱含量的差异。 发现云烟8 7 、r g l l 游离氨基酸合量较高，红花大会元、云烟8 5 含量较低；不同烤烟 品种总游离氨基酸含量有明显差异：而游离氨基酸种类问含量有极大差异。红花大会 元、r g l l 烟碱含量较高，n c 8 2 、云烟8 5 含量较低i 红花大会元、r g l l 蛋白质含量 较高，翠碧一号、云烟8 7 含量较低。 3 研究了烤烟k 3 2 6 成熟进程中上、中、下部位烟叶的游离氨基酸、烟碱、蛋白质 含量的动态变化。发现游离氨基酸、烟碱、蛋白质的含量呈现有规律的变化。打顶后 l o 天，烟叶中游离氨基酸的含量迅速下降，然后变化幅度趋于平缓。而打顶后烟碱的 含量持续增加。蛋白质含量则持续下降。以打顶后天数为自变量( x ) 烟碱、蛋白质 含量为依变量( y ) 进行相关性分析，结果表明，打项后烟碱含量与扣项后天数呈极显著 正相关，蛋白质含量与打顶后天数呈极显著负相关。 关键词：烤烟：游离氨基酸；烟碱：蛋白质；高效液相色谱技术 a b s t r a c t t h ef r e ea m i n oa c i di nf l u e c u r e dt o b a c c oi si m p o r t a n tf o rt h et o b a c c o p l a n t st om e t a b o l i z en i t r o g e na n dt of o r mt h eq u a l i t yo ft o b a c c ol e a v e s ，a n di t s c o n t e n ta f f e c tt h eq u a l i t yo ft h et o b a c c oa n di t ss m o k eg r e a t l nt h r o u g ht h e a n a l y s i sa n dr e s e a r c ho nt h ed i f f e r e n c e sa n dv a r i e t yr e g u l a t i o no ff r e ea m i n o a c i d ，n i c o t i n e ，p r o t e i n i nv a r i o u st o b a c c o sa n dt h e i rm a t u r i n gc o u r s e ，t h e t h e o r e t i c a lb a s i sa n de x p e r i m e n t a lb a s i sc a nb ep r o v i d e df o rt h et o b a c c o s p e c i e s s e l e c t i o na n di t sp l a n t t h et e s tm a t e r i a l so ft h i sr e s e a r c ha r es t e a m e dr i p e nl e a v e sf r o me i g h t s o r t so fd i f f e r e n tg e n o t y p e s ，w h i c ha r ey u n y a n 8 7 ，r gi1 ，g 8 0 ，c u i b in o 1 ， n c 8 2 ，k 3 17 ，r e df l o w e rd a j i n y u a n f r e ea m i n oa c i di sd e t e r m i n e dt h r o u g h r e v e r s e d p h a s eh i g hp e r f o r m a n c eli q u i dc h r o m a t o g r a p h yd e r i v e df r o mp i t c ； n i c o t i n ei sd e t e r m i n e dt h r o u g hu l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r y ；a n d p r o t e i ni s d e t e r m i n e dt h r o u g ht h e k j e l d a h ln i t r o g e nd e t e r m i n a t i o nm e t h o d w i t h f l u e c u r e dt o b a c c ok 3 2 6f o rt e s t m a t e r i a l ，t h ec o n t e n t so ff r e ea m i n oa c i d ， n i c o t i n ea n dp r o t e i na r ed e t e r m i n e di nt h e m a t u r i n gc o u r s e ，a n dv a r i e t y r e g u l a t i o ni sa n a l y z e d t h er e s u l t so ft h er e s e a r c ha st h ef o l l o w ： 1 t oe s t a b l i s has e to fi n t e g r a t e dm e t h o df o rd e t e r m i n i n gt h ec o n t e n to f f r e ea m i n oa c i di ns t e a m e dt o b a c c ol e a v e st h r o u g hh p l c ( d e r i v e df r o mp i t c ) ， a n di n c l u d i n gt h em e t h o d sf o re x t r a c t i n g ，s u b l i m i n g ，d e r i v i n ga n dd e t e r m i n i n g f r e ea m i n oa c i d w i t ht h i sm e t h o df r e ea m i n oa c i di nt h es t e a m e dt o b a c c o l e a v e sc a nb ee x t r a c t e df u r t h e s t ，a n di m p u r i t yt h a ta f f e c t sd e t e r m i n i n ga m i n o a c i dc a nb er e m o v e db e r e r b e t t e rg r a d i e n te l u t i o ns e p a r a t e se v e r ya m i n oa c i d p e a kw e l l i t sb e r e rr e p e t i t i o na n dh i g h e rr e c o v e r ya l lp r o v et h ec r e d i b i l i t yo f t h i se x p e r i m e n t a lm e t h o d sa n dr e s u l t s 2 t oa n a l y z ea n dc o m p a r et h ed i f f e r e n c e so ft h ec o n t e n t so ff r e ea m i n o a c i d ，p r o t e i na n d n i c o t i n ei nd i f f e r e n tg e n o t y p es t e a m e dt o b a c c ol e a v e s m a t u r i n gc o u r s e i ny u n y a n8 7a n dr g 11 ，t h ec o n t e n to ff r e ea m i n oa c i di s h i g h e r i nn c 8 2a n dy u n y a n8 5 t h ec o n t e n to ff r e ea m i n oa c i di sl o w e r i nr e d f l o w e rd a j i n y u a na n dr g l 1 ，t h ec o n t e n to fp r o t e i ni sh i g h e r i nc u i b i nn o 1 a n dy u n y a n8 7 ，t h ec o n t e n to f p r o t e i ni sl o w e r 3 i tw a sr e s e a r c h e dt h a tt h ed y n a m i c v a r i e t yo ft h ec o n t e n t so ff r e ea m i n o a c i d ，t o t a ln i c o t i n ea n dt o t a lp r o t e i ni nt h eu p p e r ，m i d d l ea n dl o w e rl e a v e s d u r i n gt h ew h o l ek 3 2 6m a t u r i n gp r o c e s s t h ev a r i e t yo ft h ec o n t e n t so ft h e m a i nn i t r i cc o m p o u n d s f r e ea m i n oa c i d n i c o t i n ea n dp r o t e i n h a s s t r o n g e rr e g u l a t i o n t e nd a y sa f t e rt o p p i n g ，t o b a c c of r e ea m i n oa c i d sd e c l i n e d r a p i d l y ，a n d t h e nd i d s l o w l y b u ta f t e rt o p p i n g ，a n dt h en i c o t i n ec o n t e n t c o n t i n u e dt oi n c r e a s et h ep r o t e i nc o n t e n tc o n t i n u e dt od e c l i n e r e g a r d i n gt h e t i m ea f t e rt o p p i n ga s i n d e p e n d e n tv a r i a b l e s x ，a n dt o t a l c o n t e n t so f n i c o t i n ea n dp r o t e i na sd e p e n d e n tv a r i a b l e s y ，a f t e ra n a l y z i n gt h e m ，t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sap o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nn i c o t i n ec o n t e n t a n dt h ed a y sa f t e rt o p p i n g ，a n dt h e r ew a sn e g a t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e np r o t e i n a n dt h ed a y sa f t e rt o p p i n g k e y w o r d s ：f l u e c u r e dt o b a c c o ，f r e ea m i n oa c i d ，n i c o t i n e ，p r o t e i n ，h p l c i l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究二：作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以 ，j i 沱和致谢的地方外，论史中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 少f 缎 - ，撒姊每胁谚j 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汀一编学位论文。同意湖南农、i p 人学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的令部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 纠嫌森 啦沙7年7 二其f ) r 时沁：z 。每z 聂，j 日 第一章前言 从1 4 9 2 年哥伦师在奖洲第一次接受a r a w a k s 赠送的干烟叶，距今已有5 0 0 多年的 历史。烟草及其制品作为闻名世界的商品也走过了4 0 0 多年的历程，如今烟草已成为 全球数识人的涪费菇。我国烟草的释植面赣、产量均詹t 壁赛蕾位h 1 。潮时，圭产在我国礤 民经济中占有特殊煎臻的地位，怒我国财税收入的重要来源之。2 0 0 6 年烟草行业利 税达2 9 0 0 亿元，仅次予石化产业黼屠第二位。但是我国烟孳在质量和安全性方西还存 在许多需要研究解决的闯题。铡镪，潮碱含爨偏麓，裁激镌移杂气编重，香气质和番 气量偏低，烟气欠柔和等| 23 1 。 近年来，科学t ：作置致力予挺赢斓荜的舷琰，改进烟苹广：品的安会性期i 嚣场接受 往，对髑孽中一些j 黼质和安全。睫密沥褶美的化学成分避 f 了，“泛的分轿和研究。诲： 多研究钻聚表明| 4 ”7 1 ，氨旗酸楚，m 1 叶中j 孙 质形成仃密切笑系的曦要化学成分，它们 黢是蛋自质稠烟碱合成的原料，搬楚蛋自质秘糖类化合物转他的中| 珏j 产物，- 并丑在烤 烟生长、调制、船工巅至抽吸过程中，氨基酸都起着十分煎要的俸用。氨基酸在赋哥 烤烟色潜味方面具谢双重作用，方面，氨基酸在有氧条件下燃烧会产生氨，影响烟 气质量；另一方蕊，烤烟在调制和醇化过程中，氨蘸酸和糖类会发生菲酶拣纯反应， 主要燕荚拇德反应，形成大鬟其奄烟草特征香眯的挥发傩化合物和大分予橡色化台穆， 如羰基化合物、呋呐化合物以及吡嗪类和吡咯衍生物等。它们不但赋予烟气烤焙香、 颦采鸯秘聪焦糠昧，澎且还镬烟凝感增 j 蟊，蔸臻建姨蝻类成分，对烟气豹蓑昧袁藿餮 作用。此外，某吩氨雏酸f t 努可蠢接分解为番啄化食物( 如苯f p 孵、苯己黼等) l 郸l 。 l 游离氨基酸分橱方法的磷究进展 氰基酸的分析方法，早期是先通过纸色谱、薄层色潜进行分离，荐与水合茚三酮 进行强色反应，从而用比色法测定其禽量【l 叭。随着分析仪器的发展与普及，氨摹酸的 分撬方法转淘了纹嚣分援。瑗鬻瓣豹蠢氨鏊酸爨凌分援仪、气籀色谱仪、嵩效滚援惫 谱仪等。 氨蒸羧自动分析仪是分析氨撼酸的专用仪器。原理是利用离子交换树脂层析柱静 先摆撬会氨基酸送蟹分离，然爵箨j 承会赫i 黧或邻苯一甲醛与耱疆中滚滋豹鑫耱氢麓 酸分剐驻色，肘分光光度汁或荧光卡：；：测器测定。从而对氰戆酸进 i 定能和定壁分析的 一种方法 l l 垃l 。利蘑的是柱后街生技术。经过几十年静发豫其鑫动纯程度得到了很 大提高，分析时间也从最初的几天缡短到目前的l 小时左右。且操作步骤简单，用邻 苯二甲醛进行械艏衍生，可进行荧光检测。使检测灵敏艘得刊了较大提高。但其仪器 结构复杂，徐格弱赛，检测掇疆德怼较裹，分甄 翔糖对较长 1 3 i 。 气糖色落役霄遴雾猛爵，分离靛皋，灵敏凄毫，分授速度抉，虽徐貉援宜等蓰点。 特别是毛细管拣羊【i 瓴火焰离子化枪测器的麻用，使冀分辨率和检测灵敏艘义得到了极 大提高。但要求被分析样品易气化。而氨基酸要进行气梢色谱分析，必须先把各种氨 纂酸转化幻尘成翳气纯魏物质。缀麟羧奉囊不容易衍生戏茹气化豹物质。艇现常明的 怒至裁螽七氟丁酸聚一聂l 。辞等，均要求在笼对元东予漂条搏下逶嚣。酸衙生爨蓬， 衍生方法复杂，搡作步骤繁琐”撼”i 。有微量承存藏戴会影响氨基酸的觚生，造成 分析结果的误靛加大。还需要特殊的仪器如氮气吹干仪蒋。这都制约了氮撼酸分析气 相色谱法的度朋。 毫效滚疆惫避 史交子采爆了蓊搿逛压辕滚泵、裹跫锻蹙捡辍器、蒋秘楚靛鏊麓键 会技黪纛雉，使萁在分离速凄、分离效黢以及羚涮灵敏度移囊动往寿嚣褥黧了强大撵 高。对样品的髓闲范围广、流动州i i ，选择的种类多等优点。现已得到了j “滋应糟。也 为氨基酸的分析增：( 1 n 了新手段。“ir 人多数氨址唆死i 赎光基闭，为了对氯撼黢进行紫 静或荧光捡测，嚣毙颁封氨摹酸遴 铆生。已 f 许多科究者对衙生裁进行了研究，迄 今e 报逢匏藏酶衙7 裁舂邻苯二二甲鼗( o p a ) ，舜蕊蘸骏笨鸶( h t c ) ，氯译基蕾罕翡 ( f m o c ) ，月磺懿氯( d a n s y l c i ) ，6 氨基嚷啉一n 一羟罄t 二= 酰亚氨纂擘l 酸酯( a q c ) 等。这些衍生试荆各有优、缺点。飙中o p a 的氨基酸 ：生物稳定性差，必颁进行在线 衔生，且不与= 级氨基酸反应。氯甲鉴翁甲酯( f m o c ) ，麒最大缺点是过掇舶氯甲基芴 率嚣f f m o c ) 与农生成懿承簿产秘f m o c - o h 二 二挠溅定。月，磺酸氯( d a n s y l - c 1 ) ，嚣 荧竞检测。藤最鬻爝的是e d m a n 试韵异硫氰酸苯醢( p i t c ) ，它兵有麓梭灏级程二 线氨基酸，衍生物稳定性好，检测牛殛限达1 p m o l ，去干扰力法简单，用紫外检测等优点。 足近年来应用墩广泛的一种液相色潞缓分析氨壤酸的 亍k 制f 1 8 1 92 0 2 2 22 3 1 。 2 烤耀生长发霄帮麓燕工j 遣程中氨基酸静研究进震 早髑的烟蕈游离氨基酸研究工怍由于分析手段限制，仅限于定性分析2 。刭上 世纪六十年代7 r 腰了氨基酸的定黛分析。j e a n 2 6 】在早期烟草中游离氨基酸窿照分析中 馓了大量工作，他主要列弱离子交撅秘双向纸层色谱对游离氨基酸进行分离并对其含 2 量进行测定。自此以后，丌始对烟叶含有的各种游离氨基酸进行研究。1 9 7 2 年，研究 者对美吲优质烤烟和白肋烟的氨基酸进行分析1 4 1 ，结果表明，烤烟成品烟中含有天冬氨 酸、丝氨0 龟、谷氨酸、脯氨酸、丙氩酸、酪氩酸，赖氨酸、苏氨酸、灭门冬酰胺、 ： 氨酸、缬瓴酸、苯丙氨酸、亮氨酸等游离氨皋酸。而白肋妙中除以上氨基酸外，还含 有异亮氨酸、精氨酸、色氨酸等游离氨基酸。研究较多的足烟叶的调制过程、醇化和 发酵的不同阶段氨基酸变化情况，这为卷烟配方、烟叶加料、调制、发酵程度提供了 具体指导。 烟草生长发育过程中氨基酸与烟株的氮代谢、衰老过程以及抵御不良环境有着密 切关系1 45 1 。当烟草受到水分胁迫时，水解酶活性增强，蛋白质趋向水解，引起氨基酸 的积累，其中脯氨酸是一种有效的渗透调节物质，对于干旱胁迫反应灵敏。色氨酸参 与生长素b 一吲哚乙酸的生物合成，甘氨酸参与细胞分裂索代谢的某些反应。甲硫氦酸 存乙烯的，卜物合成及调行t f 起符砸耍作川。协i 巾衰老时，蛋门质分解，伴随着澌离鲺 摹酸的积累。烟草t t 以娴碱为代表的乍物碱类，足 | 糖类物质、钉机酸类和氨卑：酸类 等6 h 提物质逐步形成的次生代谢产物，天冬氨酸、精氨酸等参与合成烟碱所需吡啶坏。 近年来，我国的研究工作者j 】：始对烟草中的氨基酸进行研究。白宝璋2 7 1 等研究了 烤烟n c 8 9 在旺长期脚叶，腰叶和顶叶中游离氨基酸含量。表明总游离氨基酸顶叶含 量最高，腰叶居中，脚叶最低。张晨东1 2 8 1 等研究了香料烟中的游离氨基酸的变化规律， 结果表明：香料烟中谷氨酸和天冬氨酸在总游离氨基酸中所占比例最大，在烟株旺k 部位含量较高，有利于凋节代谢、促进生长、抵抗逆境和抗病菌侵染。有人以香 ： 烟 为材料的试验结果表明：在于早胁迫下，烟叶中游离脯氨酸的含量显著增加。故烟草 缺水时叶片中的游离脯氨酸的含酷州。作为烟草抗z 他的，t 理指标。陈晓斌等1 2 9 1 研究发 现，自肋烟雄性不育系花器一千j 严蚕缺乏游离脯氨酸，而保持系中却大量积累。说则脯 氨酸与花粉的育性有关，烟叶中的游离氨基酸的含量还与烟草受病菌浸染有关，李庆 平【3 0 l 的研究表明，烤烟k 3 2 6 接种野火菌后，苯丙氨酸、赖氨酸的含量下降，但谷氨 酸的含量升高。 在烤烟醇化和发酵过程中，游离氨基酸与烟草中的还原糖之| 日j 也可发生酶催化和 非酶催化反应。特别是m a i l l a r d 反应，对烟草香味物质的产生和色泽变化具有很大影 响。m a i l l a r d 反应经a m a d o r i 分子重排会生成大量的中| 日j 产物，这些化合物进一步反应 生成多种具有烤香、甜香、曜果香及爆米花香味的杂坏化合物，如吡哺类、吡嗪类、 眦咯类、毗啶类锋等。 w e y b r e w 等报道，烟叶在调制过程中，总游离氨撼酸含量逐渐增加，调制后的 烟叶含有4 4 种飘錾酸，其中以脯氨瀚和天门冬酰胺的台照最多。此外，氮熬酸在调制 过程串还可篷搂转化为挥发拄羰基化食物。p r a b h u 等 3 2 1 ( 1 9 8 4 ) 应弱嗣倥豢承踪的方 法证甓，游离懿蘩酸在烟时调制过程牵霹转佳形成醛类秘酾类纯台耪，势菇它稻可迸 一步缩合形成毗嗪类化合物。在烟叶醇化过程中，许多椽化反应产生的挥发性成分将 进一步转化形成大璧的香气物质，如2 甲酰毗咯、乙醚吡咯、2 一乙酰呋哺镣，尤其足 己酰吡咯的人墩增加，将使烟叶释7 t 晶矮迸。步改善。此外，烟草中苯丙鬣酸代谢产 耱苯荦酸、摹乙羧、苯甲簿、苯厶黪等澎蹩灞蕈r 岔蘩较誊嘉豹蠢姥或分之。黪搿 楚烟叶醇化6 个月后，这些苯露氨陂代谢产物显著增朋，其含量比鲜烟叶离1 5 - - - 4 0 倍，而且随着醇化过程的继续，这然笨丙氨酸代谢产物溅步被转化为甲酸举甲醇酯、 乙酸苯耳i 醉酯、笨甲酸甲酯、苯乙黢甲酯、乙酸苯乙醵簿具有很强芳香气睐的酯类化 食物。 氨基陡和滚的非酶镓色铯反痧印荚拉德( m a i l l a r d ) 反应，镀认为楚黉气成分形 成的蘑要过程之。l e f f in g w e l l l 3 3 l 报道，在调制过程中，氨基酸可直接j 糖发生1 f 黪 棕色化反膨，形成聊马卡1 罩( a m a d o r i ) 化合物，如1 脱瓴l i 。一脯氨腹n 果糖， 以及天冬双微、豁氨酰胺、村氨簸、丽氨酸、獭氧酸、笨嗣氨酸和酪氨酸鼯甄萃酸豹 蠲系耱，这些貉矮约占游嚣手爆蘩豹2 镶3 篱，￥t f 绘予溺潮菇翅露7 褥有豹卺气。稼色纯 反应已发璎的化学成分有羟酸4 种、隧类1 5 静、酮类1 2 种、呋喃类1 1 种、吡哺炎2 种、吡嗪类1 4 种、吡咯衍生物7 种，其它3 种，共计6 8 种。荚拉德反应中产生的备 种杂环化合物悬烟草的重要香气成分，但是许多反应机理尚不清楚。 另一方瑟，烟草中豹氮基酸在燃繇裂解过程孛一般形戏其育裁激性豹含氮纯会彩， 魏氨等。对爆气黉屹味产生不良彩晌。令澍氨基酸还产垒h c n 等危害健康懿潮气成分。 烟草中适量的氨糕酸有助于提高烟气勘头和增加丰满度，若过量则具有刺激性和蔷睬。 3 烟草中氨基酸对烟时品质的影响 麓摹中潺褰爨麓酸与诧掌派生 妻之溺存在蓑定豹鞠美关系，枥德廉潮l 耢究认为： 烟叶中丝氨酸、甘氨酸、缬氩酸的台麓高，k 与c l 的比值就较高，则烟草品质就较好。 甲硫氨酸对烟草施术克值的贡献最大，甘氨酸、丙氨酸、色氨酸次之。柴家荣等【3 5 j 对 自肋烟不嗣品种涮游离氨基酸进行研究表明：自肋烟不同品种耳j 组氨酸、麟氯酸、精 4 氨酸，较鬣馥，捧竞氨酸、瓷氮酸赫耪潮差异鞍天。露攘出了品种黼酾番眩睬与游离 氮基酸的荚系。指出：【f 肋烟凉制2 1 天后总游离氨基酸含遣在1 5 一2 4 范围内。 则属优斌囱肋烟的最适范围。 燃孳中趣水熬鬣纂酸爝孳秀吃眯澎毒亵莠一定关系。雯宸恚i e , l 辔谚究交罐，烤蛹 中瘩熬餐蘩酸客爨较骞楚楚：谷氯黢、天冬氯黢、鞴氯酸，嚣氯酸、撩氨酸、营羲酸、 苯丙氨酸，其禽爨约占总含爨的7 0 。总氨基骥含量岛褥气量和劲头得分鼹形相关关 系，与番气质、刺激性和杂气分值呈负相关。而熊氨酸、胱氨酸、甲硫氯酸、赖氰酸 与香虼眯芙系较小。 酸灏裹氨基黢羚，跨黧孛箕袍禽簸纯台耪露灏藏、骚照震等毽黠烤矮懿菇矮产生 狠大影响。爝碱不役是烟时巾最重甏的荦艺学成分，两蟊搬楚卷烟中主要靛赫璇指标之 。在烟气中若烟碱含量过低则劲头小，吸味平淡：糟烟碱含量过离则劲头大，刺激 作增强，产乍擎滁昧。娴孳i i l 的搿h 腰存抽暧时产小烧熊础毛的气蛛，耐r 煳气香吃 囔产童蚕延彩嗡。鬟f 囊鑫餐瀚麝锻隧援影璃莠矮擎鲍矗矗矮潮。 4 本论文的主要研究内容 烟草中的游离氨基酸、烟碱和缀自质含量与品种、，是长期、生态环境和施h 也鼠的 纂弱蠢笈，圭变_ 鲢：。鬏扰。醭突我函誊裁娉翅螽耱中游离氦萋骏、爝碱霖爨爨矮麴盘鬟 帮在蕊熬麓靛变诧躐掺，不鼗薅为濑萃生产移瓣王避程审，采蘩褥攀套效泌诞控技求 和手段，键离烟叶原料的香气品质和工业可甩镌倒造祭 牛，而且也可为爝革新品种的 选育和品质区划提供试验依据，对稳定中式卷肖鲥制品的配方和香气风格，掇离我困卷 烟产船在豳内外盼竞争实力舆夜霞露的理论和瑗实意义。奉沧文的宅要磷究内容包括： ( 饶讫簿潮系蠢 中嚣赢氯撼黢翡挺壤嚣缝纯矗滋，为耨滚箨彘灌竣术分离慧 爝条费露中的游离氨墓酸羹瓮纂勰。 ( 2 ) 探索辨硫氰酸苯酯( p i t c ) 柁前 ； j q - ：煅f 肇游离氮基酸的试验条件和岗效激相 色谱技术分离检测氨基酸的试验条件。 3 ) 旗突袋瓣圭裁魏不颡跨斌熬辩游骞氨纂羧及葜链含蒸饱含黪含爨蕊麓舅。 ( 霹) 麓究海翅成熬过程中游离爨肇酸爱冀魏含氦纯合麓含量黥变优裁镣。 第二章烤烟中游离氨基酸提取纯化方法的 研究 烘干植物材料中游离氨纂酸的提取是采嗣液楣色谱法测定游离氨基酸含量的第一 步。由于太多数游离氨基酸易溶于水，所以常采用水、1 0 乙酸或5 0 - - 8 0 乙醇溶 液浸提植物组织中的游离氨糕酸【3 6 3 7 3 8 3 9 1 。为筛选烤烟叶片烘干样晶中游离氨肇酸提 取豹最臻滚热，本试验分别溺蚤弼浓度鲍乙醇、l o 乙骏爱零徽挺取滚裁，磁甓了不 同溶朝及不丽深凄提取烤潮时琦系菏捶晶t ，游凌氮羲酸的效粜，挣对游离氯疆酸纯 乏 过程中不f 弼浓度沈脱液的沈脱效果进行了研究。 l 材料弓方法 1 试验专孝辩 本试验于2 0 0 5 年3 月嬲9 月在湖南农业大学烟草j ：程技术研究中心试验基地及 烟草重点试验室进行。烤烟晶种为k 3 2 6 ，在试验熬地进行大阡l 栽培。种植土壤为红壤， 瓣茬作物为水稻，无严重病受及晕涝灾害。取丁顶焉3 0 天的爆时迅速甏于1 0 5 条件 一f 鼗箴蓉毒，6 04 c 矮：手，耪毳孳，遂4 0 瓣簿，予瀑褥袋中密羹缳存。 1 2 主要仪器与药品 分光光度汁北京分机仪器r 旋转蒸发仪郑州陡城科工贸公司 c f l 6 r x 毫速冷冻瀵心橇翻本爱立公司 7 3 2 型阳离子交换树脂上海化学试剩公司 茚三酮分析纯上海化学试剂公司 正丁醇分析纯上海化学试剂公司 嚣瓣醇分援缝。匕海像学试翔公司 乙二醇分褫缝+ - 海纯学试裁公司 醋酸分析纯 封化学试剂总厂 醋酸钠分析纯, r 1 4 | 寸化学试剂总f 髭承乙醇分析筑t 海化学试剂公司 6 1 3 试验方法 1 3 1 烤烟杀青叶游离氨基酸提取方法的研究 参照李丹f 4 0 1 、夏静等提取植物中游离氨基酸的方法，对提取条件进一步优化， 以筛选提取烤烟杀青叶l f l 游岛氮基酸的最f # 力法。 1 3 ，1 1 采用不同溶剂提取烤烟杀青叶中的游离氨基酸 称取7 份各1 0 0 0 9 的烤烟k 3 2 6 杀青样品，分别放入7 个具塞容器中，分别加入 5 0 m l8 0 乙醇、7 0 乙醇、6 0 乙醇5 0 乙醇、4 0 乙醇、l o 醋酸、蒸馏水。放入 5 0 c 水浴中加热5 小时，不时震荡，过滤，旮滤渣中再分别加入2 0 m l 各提取溶剂， 5 0 。c 水浴加热3 小时，过滤。再重复一次。合并滤液。用旋转蒸发仪在7 0 ( 2 减压浓缩 至5 m l ，加入2 倍体积的9 5 的乙醇，过夜。以沉淀氨基酸粗提液中的胶体成分。 1 2 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，弃去沉淀。即得氨摹酸粗提液。取粗提液0 5 m l ，加入蒸馏水 9 5 m l ，水合茚- 三酮溶液2 m l ，沸水加热1 5 m i l 3 。用分光光度计在5 7 0 n m 处测再揖取液 的光密度值。 1 3 1 2 采用不同温度提取烤烟杀青叶中的游离氨基酸 称l 披3 份各1 0 0 0 9 的烤烟k 3 2 6 杀青样品分别放入3 个具塞容器中，各加入5 0 m l 蒸馏水。分别放入2 0 c 、5 0 ( 2 、8 0 c 水浴巾加热5 小时，不时震荡，过滤，在滤淤中 再加入2 0 r a l 蒸馏水，再分别放入2 0 ( 2 、5 0 ( 2 、8 0 。c 水浴加热3 小时，过滤。再重复一 次。合并滤液。用旋转蒸发仪在7 0 。c 减压浓缩至5 m ，加入2 倍体积的9 5 的乙醇，过 夜。1 2 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，弃去沉淀。取提取液0 5 m i ，加入蒸馏水9 5 m l ，水合茚 三酮溶液2 m ，沸水加热1 5 m i n 。用分光光度计在5 7 0 n m 处测各提取液的光密度值。 1 3 1 3 采用不同浸提时间提取烤烟杀青叶中的游离氨基酸 称取4 份各1 0 0 0 9 的烤烟k 3 2 6 杀青样品，分剐放入4 个具塞容器中，各加入5 0 m l 蒸馏水。放入5 0 。c 水浴中，分别加热2 小时、4 小时、5 小时、6 小时，不时震荡，过 滤，在滤渣中再加入2 0 m l 蒸馏水，分别在5 0 c 水浴加热2 小时、2 小时、3 小时、3 小时，过滤。再分别重复一次。合并滤液。用旋转蒸发仪在7 0 。c 减压浓缩至5 m l ，加 入2 倍体积的9 5 的乙醇，过夜。1 2 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，弃去沉淀。取提取液0 5 m t ， 加入蒸馏水9 5 m l ，水合茚三酮溶液2 m l ，沸水加热1 5 m i n 。用分光光度计在5 7 0 n m 处 测各提取液的光密度值。 1 3 1 4 采用不同提取剂体积提取烤烟杀青叶中的游离氨基酸 称取3 份各1 。0 0 0 9 的烤烟k 3 2 6 杀l ￥品，分别放入3 个具摩容器中，分刖加入 蒸馏水3 0 m l 、5 0 m t 、7 0 m l 。放入5 0 水浴中加热5 小时，不时震荡，过滤。在滤渣中 再加入2 0 m l 蒸馏水，5 0 c 水浴加热3 小时，过滤。再重复一次。合并滤液。用旋转蒸 发仪在7 0 减压浓缩至5 m l ，加入2 倍体积的9 5 的乙醇，过夜。1 2 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ， 弃去沉淀。取提取液0 5 m l ，加入蒸馏水9 5 m l ，水合茚三酮溶液2 m l ，沸水加热1 5 m i n 。 用分光光度计在5 7 0 n m 处测各提取液的光密度值。 1 3 2 烤烟杀青叶游离氨基酸纯化方法的研究 在烟草叶片游离氨基酸提取溶液中含有较多的色素、可溶性糖、有机酸及其他杂 质。为了消除这_ i 物质对液十目色谱分析氨璀酸的f 扰，需要对氨基酸糨提液迸- 步纯 化。本研究参照刘卣战【1 4 】、李月1 4 0 1 等的方法，用7 3 2 阳离f 交换树脂纯化泐离氰襞酸， 并对纯化条件进一步的优化。 1 3 2 1 阳离子交换树脂的处理和装柱 称取2 0 97 3 2 阳离子交换树脂于烧杯中，加入1 0 0 m l6 m o l lh c i ，搅拌浸泡2 天， 倾出上层h c i ，阿加入1 0 0 m l6 m o l lh c i 搅拌浸泡2 天，倾出上层h c i ，用蒸馏水漂 沈至中性，使树脂完全转化成氢型阳离子交换树脂。把处理过的7 3 2 阳离子交援树脂 用湿法装柱，注意树脂阳j 不能留有气泡。 1 3 2 2 氨基酸粗提液的纯化 ( 1 ) 氨基酸粗提液的进十t 及沈涤 将氨基酸粗提液用旋转蒸发仪存7 0 。c 减胍浓缩个5 m l 左右，倒入装有树脂的e ：丰厅 杜中，使孝h 提液以0 5 m l m in 的速度缓慢流入树脂f | 1 ，当粗提液完令进杜后，停留 1 0 m i n ，以使氨基酸令部结合到树脂。l ，接着用蒸馏水进行沈涤，流速3 m l m in 以除 去氨基酸粗提液中的色素、可溶性糖等杂质。蒸馏水约用去1 5 0 m 左右。 ( 2 ) 氨基酸的洗脱 氨基酸通常用一定浓度的氨水进行沈脱，取6 份氨基酸粗提液样品，分别进柱及 洗涤，分别用l m o l l 、2 m o l 几、3 m o l l 、4 m o l l 、5 m o l l 、6 m o l l 氨水进行沈脱，流 速3 m l m i n 。并用茚三酮随时监测沈脱液( 先用蒸发方法挥发掉氨) ，直至沈脱液中无 氨基酸为止。把沈脱液放入旋转蒸发仪7 0 减压浓缩至于。用少量0 1 m o l l 盐酸溶解， 再用0 1 m o l 几特酸定容至1 0 m l 。即得纯化后的氨摹酸溶液。取纯化后的氨基酸溶液 0 5 m l ，加入9 5 m l 蒸馏水及2 m 1 茚二i 酮溶液，沸水济加热l 5 r n in ，用分光光度计在5 7 0 n m 处测各提取液的吸光度。 2 结果与分析 2 1 不同溶剂对游离氨基酸提取效果的影响 采用不同溶剂提取游离氰基酸，与茚蔓酮反应后进行比色，所获得的光密度值见 表2 1 。 表2 1 采川不l 叫溶剂提取游离氯基酸的光密度值 t a b l e2 i t h eo p t i c a ld e n s i t yv a l u e so f f r e ea m i n oa c i dt h a ta r ee x t r a c t e dw i t hd i f f e r e n ts o l v e n t s 提取溶剂8 0 乙醇7 0 乙醇6 0 乙醇5 0 乙醇4 0 乙醇 1 0 乙酸蒸馏水 光密度值 0 2 6 6 60 3 2 1 4o 3 5 3 3 0 2 8 2 50 ，3 7 9 90 5 3 2 10 7 0 2 4 试验结果锃，j ，用水作为提取溶剂比h j z i 刚浓度的乙醇及l o 乙酸作提取剂的提 取效果要好，且试验中发现，4 0 乙醇和5 0 乙醇的提取液，过滤速度很慢，需花费 的时l 日j 较长；8 0 乙醇的提取液混浊，1 ( ) 乙酸的提取液颜色成深红色。这些现象表明， 1 h j 乙醇提取可能导致随氨齄酸一起溶m 的菜蝗糖类溶解度降低，使溶液变粘稠或混浊； 乙酸提取液变红町能与某些酚类化合物的侧链壤被乙酸酯化有关。 2 2 不同温度对游离氨基酸提取效果的影响 采用不同温度提取游离氨基酸，与茚三酮反应后进行比色，所获得的光密度值见 表2 2 。 表2 2 采 i 不同温度提取游离氨基酸的光密度值 t a b l e2 2t h eo p t i c a ld e n s i t yv a l u e s o f f r e ea m i n oa c i dt h a ta r ee x t r a c t e du n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r ec o n d i t i o n 提取温度i 丽了1 币f 一而琶一一 光密度值0 2 2 0 0 0 7 0 2 8 0 7 0 0 4 试验结果显示，温度为5 0 。c 、8 0 。c 时，提取的游离氨基酸远远多于2 0 c 时的提 取量。但出于8 0 c 条件下同时溶出的胶质太多，过滤速度极慢，所以在实际操作中不 适用。 2 3 不同浸提时间对游离氨基酸提取效果的影响 9 采用不同浸提时间提取游离氨基酸，与茚二酮反应后进行比色，所获得的光密度 值见表2 3 。 表2 3 采川不同浸提时间提取游离氦基酸的光密度值 t a b l e2 3t h eo p t i c a ld e n s i t yv a l u e so ff r e ea m i n oa c i dt h a ta c ee x t r a c t e di nd i f f e r e n tt i m e 提取时间2 小时4 小时5 小时6 小时 瓦萄甄r 丽可百涵1 万丽厂1 雨面广 试验结果显示，用水做提取溶剂提取5 小时，过滤，滤渣再用水提取3 小时，重 复一次，提取效果最好。延长提取时问，不能使游离氩基酸的提取量增加。 2 4 不同提取剂体积对游离氨基酸提取效果的影响 采用不同浸提刺体积提取游离氨堆酸，与茚j i 酮反应后进行比色，所获得的光密 度值见表2 4 。 袁24 采川矸：同提取刺体积提取游离氩荩酸的光密度值 t a b l e2 4t h eo p t i c a ld e n s i t yv a l u e so f f r e ea m i n oa c i d t h a ta r ee x t r a c t e d i n t h ed i f f e r e n tv o l u m e so f e x t r a c t a n t s 试验结果显示，提取溶剂的体积对游离氨基酸的提取效果影响较小，用5 0 m 1 溶剂 提取即可达到最佳提取效果，增大溶剂体积会使后续浓缩步骤的时间增加。 2 5 不同浓度的氨水对氨基酸洗脱效果的影响 存对提取液中的氨基酸j 主行纯化时，采川小州浓度的氯水沈脱【i j 刚离子变换 l ：吸 附的游离氨基酸，j 茚j ! 酮反应后进行比色，所获得的光密度值见表2 5 。 表2 5 采用不同浓度氨水洗脱游离氨基酸的光密度值 t a b l e2 5t h eo p t i c a ld e n s l t yv a l u e so f f r e ea m i n oa c i d t h a ta r ee l u t e d w i t h t h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f a m m o n i a 试验结果显示，用4 m 0 1 l 氨水洗脱氨基酸的效果最好。当氨水浓度小于4 m o l l 时，不能把氨摹酸从树脂：全部沈脱下来。当氨水浓度过大时，少数氨基酸会在碱性 过强的环境中分解，致使纯化历的氨幕酸禽鹭自所降低，造成h p i c 定黾分析氨耩酸时 0 的误差较大。故氨水泷脱滚豹黢往浓度是4 m o l l 。 3 讨论 ( t ) 疆纺中豹游褒鬣鏊羧筑提取套太溺不因浓瘦弱擎醇或乙酶佟滚裁，蠲鸯鬟热回 流的方滚罐取游离氨基酸；矮有入用水或7 5 乙醇作溶剜，超声提取游离氨基酸；也有 人用0 1 m o l 的盐酸提取。本人在研究过程中对这螳方法都进行了比较，证明用这些 方法提取烤娴杀青叶中的游离氮基酸的效果并水好。特j j 】j 是用豁酸提取，过滤速度奇 侵。 ( 2 ) 不论矮群辩溶裁缀取烤溺系青 中静游离氮豢酸，都会蠢大鼙豹色素一起溶 出。在试验中本人尝试了用活性炭、乙醚、丙酮、非水溶性聚乙烯吡咯烷酮等进行脱 色，但效果均不理想只有在采用7 3 2 阳离子交换树脂纯化游离氨熬酸时，用大量的 水冲沈牲孑，l 能除掉大部分色素和其他杂质鼹氨基酸的损失较小。 ( 3 ) 囊予烤潮咛冀进行了杀毒楚透，敖蛋囱菇都已交缝沉淀，溅叛不溶- | 二隶，不 会影响测定缩榘。 ( 4 ) 根据以上试验结果，烤烟杀青叶中游离氨碡酸提取的最佳试验条件为：称取 1 0 0 0 9 烤烟系青叶样品，放入见褒容器中。加入5 0 m i 蒸馏水，放入5 0 。c 水浴中加热5 夺涎，不箨壹震荡。过滤，谯滤渣遵，薅魏l 入2 0 r a l 蒸镶农，5 ) 承涤搬