[精品论文] 半自动化学发光免疫分析仪的研究.pdf

分类号： ! 咝! udc ： 密级 编号 半自动化学发光免疫分析仪的研究 s e m i a u t o m a t i cc h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a ys y s t e m 学位授予单位及代码： 篮壹堡工太堂! ! q ! 竖! 学科亏业名称及代码： 生物匡堂王狸( q 8 3 12 研冗方向：盘电医生i 望墨 指导教师：蟊扫玉熬援 研究生： 重杰 甲请学位级别：亟 答辩委员会主席： 论文评阅人； 长春理工大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声i 州：所呈交的顶士学位论文，半自动化学发光免疫分析仪f l q j f 究是奉人在指导教师的指导下，独立进行研究一【：作所墩得的成果。除文t i 已 经注明引用的内容外，奉论文不包古任何其他个人或集体己经发表或撰写过f | 勺 作品成果。刈本文的研究做出重要贡献的个人和集体。均已在文中以明确万武 标明。本人完全意识剖本声明的法律结果山本人承担。 作者签名翌! l ：! _ 1 1 1 i 长春理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“长春理工大学硕士、膊士学位论文 版权使用舰定”同意长春理工大学保留井向中国科学信息研究所、q 国优秀博 硕士学位论文全文数据库和c n k i 系列数据库及其它目家有关部门或机构送受 学位论文的复印件和电予版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长春理工人学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采川影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 作肯签名 导师签名 兰! ! q 三月_ 王州 2 1 旦l 川! y 竹 够骅 摘要 化学发光免疫分析法是将化学发光反应与免疫反应相结合而产生的一种很有发展 前途的免疫分析方法。它采用微量倍增技术，具有高度敏感性- 加上有抗原抗体反应， 特异性也非常好，所用试剂安全、稳定、廉价，检测的范围也非常广泛，从传统的蛋 白质、激素、酶乃至药物均可检测，对疾病的诊断提供了有力的诊断工具。近年来我 国化学发光免疫分析仪等相关产品正处于研制阶段，本文针对国内产品现状，参考国 外相关产品与技术进行了半自动化学发光免疫分析仪的整体设计与研究。 系统使用包被有抗体或抗原的磁珠作为固相载体，将标记有异鲁米诺衍生物( a b e i ) 的抗体或抗原作为液相载体经过分离洗涤，在过氧化氢的碱溶液中进行化学发光反 应，利用单光子计数系统记录光子数，根据工作曲线测量待测物浓度。系统的机械部 分包括测量室、光电倍增管、试剂仓、试剂泵、底台、外壳：电子学系统包括微控处 理器对电机、泵、阀等功率部件进行控制，光子计数、l c d 显示屏、薄膜按键、打印 机等功能模块。标本随到醢测，经测试灵敏度满足技术要求。 关键词：免疫诊断化学发光单光子计数 a b s t r a c t c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a yc h e m i l u m i n e s c e n tr e a c t i o ni sc o m b i n e dw i t ht h e i l n m u n cr e s p o n s eg e n e r a t e dap r o m i s i n gi m m u n ea n a l y s i si tu s e sm i c r od o u b l i n g t e c h n o l o g y ，w i t hh i g hs e n s i t i v i t y ，c o u p l e dw i t ha n t i g e n a n t i b o d yr e a c t i o n ，t h es p e c i f i c i t yi s a l s ov e r yg o o d ，t h er e a g e n t su s e da g es a f e ，s t a b l e ，c h e a p ，v e r yw i d ed e t e c t i o nr a n g e ，f r o mt h e t r a d i t i o n a lp r o t e i n h o r m o n e s ，e n z y m e sa n de v e nt h ed r u g sw e r cc o u l db ed e t e c t e d ，t h e d i a g n o s i so fd i s e a s ep r o v i d e sap o w e r f u ld i a g n o s t i ct 0 0 1 c h i n ai nr e c e n ty e a r s c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a ya n a l y z e ra n do t h e rr e l a t e dp r o d u c t sa g ei nd e v e l o p m e n t s t a g e ，t h ep a p e rp r o d u c t sf o r t h ed o m e s t i cs i t u a t i o n ，r e f e r e n c et of o r e i g np r o d u c t sa n d t e c h n o l o g i e sr e l a t e d t o t h es e m i a u t o m a t i c c h e m i l u m i n e s c e n t i m m u n o a s s a ya n a l y z e r f o r t h e o v e r a l ld e s i g na n dr e s e a r c h s y s t e mu s e sa n t i b o d yo ra n t i g e nc o a t e dm a g n e t i cb e a d sa st h es o l i dp h a s ec a r r i er ， h m i n o ld e r i v a t i v e s ( a b e l ) l a b e l e dw i t hd i f f e r e n ta n t i b o d i e so ra n t i g e na sal i q u i dc a l t i e r ， a f t e rt h es e p a r a t i o no fw a s h i n g ，t h ec h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o ni nh 2 0 2a l k a l is o l u t i o n ， t h e nu s i n gs i n g l ep h o t o nc o u n t i n gt e c h n i q u et om e b u r ct h ep h o t o nn u m b e ro fr e c o r d st h e c o n c e n t r a t i o no fa n a l y t e sm e c h a n i c a lp a r t so f t h es y s l e mi n c l u d i n gt h em e u r i n gc h a m b e r ， p h o t o m u l t i p l i e rt u b e s ，r e a g e n ts t o r a g e ，t e a g c mp u m p s ；e l e c t r o n i cs y s t e mi n c l u d i n ge l e c t r o n i c s y s t e m sf o rm o t o r s ，p u m p s ，v a l v e sa n do t h e rc o m p o n e n t st oc o n t r o lp o w e r , p h o t o nc o u n t i n g l c dd i s p l a ya n dk e ym o d u l e s ，p r i n t e r sm o d u l e s t h es e n s i t i v i t yo ft h et e s tt om e e tt h e t e c h n i c a lr e q u i r e m e n t s k e yw o r d s ：i m m u n o d i a g n o s l i cc h e m i l u m i n e s c e n c e s i n g l ep h o t o nc o u n t i n g 1 引言 2 免疫诊断技术国内外现状 3 免疫分析检测方法的比较 l _ 4 免疫分析仅发展历程 目录 一 1 ”2 1 5 化学发光免疫分析仪产品现状与发展前景4 16 本课题研究意义及其内容 第二章化学发光免疫技术与单光子计数技术概述 2 1 化学发光简介 22 化学发光的应用和最新进展 2 3 化学发光免疫分析技术 24 单光子计数技术概述 2 5 本章小结 5 7 第三章化学发光免疫分析仪整体设计与控制 3 1 研究方法 32 研究思路 3 3 本章小结 第四章单光予计数系统设计 4 1 单光子计数系统组成 4 2 光电倍增管的结构与性能 4 3 光电倍增管驱动电路设计 4 4 光子计数器的计数误差 45 本章小结 第五章控制系统设计 5 1 系统硬件设计 5 2 系统软件设计一 5 3 本章小结 第六章数据的测试与分析 课题结论与展望 致谢 参考文献 1 3 1 3 1 6 2 0 2 1 2 1 2 2 2 8 2 9 一 沦一绪要氟章 n 一摘地目第 让盯弱 11 引言 第一章绪论 在电子技术飞速发展的今天。医用仪器的发展速度相比之下缓慢得多，尤其国内的 发展速度更远落后于国外先进水平，许多已经广泛应用的设备还依赖于进e l 。根据实 际需求，结合新兴技术改革传统医用仪器的实现方法是医疗领域亟待解决的问题。目 | i i 化学发光免疫分析技术为该领域最为活跃的学科之一，它将发光反应的高度灵敏性 和免疫反应的特性很好地结合起来，因此化学发光免疫分析仪具有非常大的社会和经 济意义。 据相关调查显示，当今生活的快节奏下许多人们忙于工作而忘却关注自身的健康状 况，而普通的脉搏、血压等常规检查已经不能细微的反应身体的健康状况；像对甲状 腺素类、肿瘤标记物、生殖一孕激素类、血清抗原抗体类、心脏指示类等项目检测，常 规检查是很难检测出来的，如不及时调整或治疗，将很可能影响正常工作和学习的效 率，甚至危害生命。化学发光免疫分析方法作为一种很有发展前途的免疫分折方法， 检测范围非常广泛，蛋白质、激素、酶乃至药物均可检测。近年来，我国城乡人民生 活水平的不断提高，人们对身体健康、医疗永平的要求尤为重视。广大患者非常希望 所就诊的医院能够提供优良的服务。尤其是基层医疗机构对化学发光免疫分祈仪器要 求也越来越迫切。因此，市场对该产品的需求决定了该产品一旦形成量产，将迅速得 到推广。 12 免疫诊断技术国内外现状 由于抗原与抗体之间的特异性反应，免疫学检测利用标记法或化学发光等方法对检 测信号放大，常用来检测蛋白质甲状腺素类、肿瘤标记物、激素等微量物质。本世 纪7 0 年代中期a r a k a w e 首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应 分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质并且这一技术已经 普遍运用到了临床常规检测中。发光免疫兴起于2 0 世纪8 0 年代，现已被临床普遍使 用，成为临床免疫诊断的支柱方法：发光免疫分析仪主要以美国、日本、德国最具有 代表性。在欧洲使用发光的大型医院中，6 0 的医院既有全自动又有半自动，他们平 常在急诊和部分门诊化验中使用半自动。小型医院使用半自动化学发光的占多数。在 日本所有使用发光的医院中，除特大型医院外，其余大多数医院都在使用半自动化学 发光免疫分析仪。 我国免疫学的检测基本历经了以下几个过程。如图1 1 免疫学检测发展阶段所示。 2 0 世纪6 0 年代7 0 年代 9 0 年代 时日j 图11 免疫学检测发展阶段 尽管免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位，但是从我国临床免疫诊断现状 来看，无论是临床应用方面，还是产业化角度，都处于相对比较落后的状态，亟待改 进。下表1 1 中外免疫法对照表就此做一比较： 表11 中外免疫现状 中国国际( 欧美为主) 兴起于2 0 世纪7 0 年代，现仍普兴起于2 0 世纪6 0 年代， 放射免疫法 遍使用于县级以上医院； 现已基本退出临床应用； 产品处于衰退期； 产品生命周期己终结； ( r 1a ) 厂商试剂与仪器共同开发，试剂厂商试剂和仪器共同开 基本系列化。发，试剂基本系列化。 兴起于2 0 世纪8 0 年代，现普遍兴起于2 0 世纪7 0 年代， 使用于各级临床机构，为我国临床 现仍在临床应用： 酶联免疫法免疫诊断的基本方法； 产品处于衰退期： ( el is a ) 产品处于成熟期；厂商试剂与仪器共同开 厂商试剂与仪器共同开发，试剂授，试剂基本系列化。 尚未系列化。 导入于z 0 世纪9 0 年代，现个别兴起于2 0 世纪8 0 年代。 较大医院开展个别项目；现已被临床普遍使用，成 产品处于导入期或成长期：为临床免疫诊断的支柱方 化学发光免疫法无厂商开发生产，基本依赖进口。法： ( c l ia ) 产品处于成熟期： 厂商试剂与仪器共同开 发，仪器自动化程度高， 试剂系列化状态好。 1 3 免疫分析检测方法的比较 免疫分析主要有化学发光免疫分析法，酶标免疫法，放射免疫分析法其主要区别如 表l2 所示。 襄l2 免疫分析检测方法比 童 化学发光免疫酶标免疫放射免疫 驯量精度定虽定性，半定量 定量 灵敏度蚧j ) 1 0 1 9l 矿l 矿1 2 测量范围大于i o !小于1 0 4小于1 0 测擐时间短 长根k 试剂稳定性 好 好 差 对环境影响无无有放射性 由以上分析不难看出，化学发光免疫检测是太势所趋：而取代进口，发展我国的化 学发光检测事业，正是临床检验界着手发展的方向。 1 4 免疫分析仪发展历程 免疫学分析或称免疫学检验是以抗原抗体相互结合的免疫学反应为基础的，主要研 究免疫学技术及其在医学领域中的应用。根据分析过程中是否需要标记物分为标记免 疫分析和非标记免疫分析两大类。前者根据标记物的不同又可分为酶免疫分析、放射 免疫分析、发光免疫分析、免疫金( 银) 标记技术等，后者的主要代表是由最初的免疫 沉淀试验发展形成的免疫浊度分析技术。为了适应医学检验中自动、快速、简便的要 求。随着各种免疫分析技术的出现，相应的免疫分析仪器也不断问世。 酶免疫分析仪，酶免疫分析( e n z y m e i m m u n o a s s a y ) 是目前临床应用最多的一种免疫 分析技术，主要原理是用酶标记的抗体( 或抗原) 用于免疫学反应，并以相应底物被酶 分解的显色反应对样品中的抗原( 或抗体) 进行定位分析和鉴定；也可根据酶催化底物 显色的深浅，测定样品中待测抗原或抗体的含量。e i a 具有灵敏度高、特异性强、试剂 性质稳定、操作简便、快速，无放射性污染等优点，在医学及其它领域应用十分广泛。 根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物，分为非均相( 或异相) 酶免 疫测定和均相酶免疫测定两种方法。 化学发光( e h e m i l u - m i n e s c e n c e ) 是指某些化学反应释放的能量使其产物或者中间 态分子激发，形成了激发分子，当激发分子从激发态衰退为基态时能量以可见光的形 式释放出来的现象称为化学发光。发光免疫分析就是利用这种现象，根据物质发光的 不同特征，即辐射光波长、发光的光子数，与产生辐射的物质分子的结构常数、构型、 数量等密切相关，通过受激分子发射的光谱、发光衰减常数、发光方向等来判断分子 的属性分为生物发光免疫分析、微粒子化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析、电 化学发光免疫分析、发光免疫分析等5 种分析方法。 发光免疫分析法是将发光反应与免疫反应相结合而产生的一种很有发展前途的免 疫分析方法。它采用微量倍增技术，具有高度敏感性，加上有抗原抗体反应，特异性 也非常好；所用试剂安全、稳定、廉价：检测的范围也非常广泛，从传统的蛋白质、 激素、酶乃至药物均可检测。因而，发光免疫分析法发展非常迅速，各种相应检测仪 器不断出现，自动化程度也越来越高。 1 5 化学发光免疫分析仪产品现状与发展前景 化学发光免疫分析产品的现状“1 由于化学发光免疫分析操作简单，反应迅速容 易实现自动化，因此目前大多采用全自动工作方式，但价格比较昂贵：部分适合基层 使用的普及型仪器，咀及用于特定化验项目的小型仪器也采用微孔板或其他形式的半 自动方式。无论采用哪种方式整个实验过程均在1 2 h 内完成。为进一步提高反应 速度并增加灵敏度，还有很多机型采用磁性或非磁性微粒包被，以增加表面积：此时 反应时间可缩短至2 0 m i n 左右。由于检测试剂的稳定性提高，加上采用自动化仪器可 使实验误差降低，故目前普遍使用厂家内建标准曲线加校正的方法产生工作曲线- 从 而减轻了工作量并降低了运行成本。 化学发光免疫分析产品应用中存在的问题“1 由于发光免疫的检测方式模式与放射性 免疫不同，因此其测定结果和临床正常值都会有所差异。特别是这些产品多采用单抗， 因此交叉反应与多采用多抗的放射性免疫相比大大降低，所以其样品测定值往往比放 射性免疫要低。 目前普遍使用厂家内建标准曲线加校正的方法产生工作曲线；这虽然减轻了工作量 并降低了运行成本，但其科学性和准确性值得探讨。某些园素( 如温度的波动，金属离 子等) 会影响发光反应。 使用化学发光免疫分析仪必须注意的问题：首先，应在厂家提供的数据基础上，尽 可能自行建立正常参考值系统，以消除实验室和人群的差异。其次应当明确各个试剂 盒的特异性及交叉反应的情况。应充分利用现有的国际参考品校正结果。建议对每个 检测项目自行建立2 3 点质控，其标定值应尽可能的分剐接近正常值的上下限；每次 实验时随样品一起检测以监控实验结果的稳定性和准确性。同时应注意质控的保存 条件和稳定性，如果需要加入防腐剂则必须保证其不会干扰发光。 化学发光与其他分析技术联用实现免疫分析的集成化与微型化化学发光与其他分 析技术联用大大扩大了其应用范围。c l f 汇l 与微流控芯片联用是当前化学发光分析研 究的一个新热点，其中化学发光检测技术与微流控芯片联用是非常具有潜力的研究方 向。化学发光不同于其他的检测系统需要独立光源，它发光底物自行发出光子，因此 在检测快速前提下更容易实现集成微型化。 随着生命科学的迅猛发展，基因工程、分子克隆和生物芯片等一系列分子生物技术 的不断深入，以及各类自动化仪器的相继问世都大大拓宽了临床检验的范围模块化、 微型化生化仪器太大提高了临床化学的工作效率，化学发光技术及磁性微球免疫化学 技术的应用使免疫化学检测进入了一个新的水平。在此基础上，临床实验室还提出了 “全自动实验室”的概念。全实验室自动化又称全程自动化是指将临床实验室中各 种自动化的工作环境它将覆盖临床实验室常规工作的各个部分。全自动化系统可大 火提高实验室的工作效率，有效消除人为因素所造成的干扰，更重要的是他可以减少 实验室工作人员豹数量从而降低实验室的总体支出。同叫该系统- 与n i e 信息系统结合 即可实现检验申请及报告的自动传输，可极大的缩短检验周转期，实现检验结果的全 院共享，更重要的是可将实验数据加以分析综合，准确的转化翻译和汇编为高级层 次的医学判断术语，为临床医生提供更好的咨询服务。全实验室自动化是大型综合医 院检验科及检验医学中心自动化分析发展的必然趋势和结果。今后，化学发光免疫分 析仪的研制开发也将以此为目标，方便更好的提高其临床检测性能。 近年来，各种基于不同原理而研制开发的全自动免疫测定分析仪在临床实验中应用 越来越多，这不但减轻了实验室人员的劳动强度，而且大大提高了测定准确性和重复 性。由于我国对仪器的基础技术和制造工艺的研究不够t 一些影响可靠性的关键技术， 如精密加工技术、密封技术，焊接技术等至今还没有得到很好的解决。导致产品特别 是高档产品的性能不够稳定和可靠，因此应用于临床检测的仪器都是国外开发的仪 器，而且进口试剂与仪器的价格都很贵。不适应在我国广泛地普及和应用，目前我国 的c l i a 产品还处于不成熟阶段。因此我国需要研究开发符合国内条件及需求并在国内 有竞争力的c l i a 系列产品，是我国的免疫分析能尽快赶上当今世界范围内免疫分析发 展的趋势和步伐，从而打破国外大公司对试剂的垄断。 国内企业的主要竞争对手为国外的行业著名企业的产品，当然国内企业之间的内 部竞争也很激烈。预测未来3 5 年，会有一批新的企业加入到此行业中来，市场竞争 会比较激烈。如何有效提升中国的化学旋光免疫分析仪企业的核心竞争力、积极参与 至全球化的竞争之中，是我们迫切需要考虑的问题。可喜的是，以一体化半自动化学 发光免疫分析仪为代表的国家中一体化半自动化学发光免疫分析仪业在2 0 多年的发展 中，凭借着在技术、管理、营销等领域的创新，成为了一体化半自动化学发光免疫分 析仪全球市场的重要参与者，具有了较强的国际竞争力。半自动化学发光免疫分析仪 以其价格优势在中小型城市有很大的市场。该项目的实施，能够缩小国内与国外在半 自动化学发光分析仪上的技术差距，满足国内医疗的需求。而且是超大屏中文操作满 足国内用户的需求。化学发光免疫能够快速、准确地对样品进行检测，检测范围宽， 所用的试剂安全无毒，而且没有放射性污染的问题，很受检验医学工作者的欢迎。 16 本课题研究意义及其内容 普通的脉搏、血压等常规检查已经不能细微的反应身体的健康状况；像对甲状腺 素类、肿瘤标记物、生殖一孕激素类、血清抗原抗体类等项目检测，常规检查是很难检 测出来的，如不及时调整或治疗，将很可能影响正常工作和学习的效率，甚至危害生 命。发光免疫分析法是将发光反应与免疫反应相结舍而产生的一种很有发展前途的免 疫分析方法，检测范围非常广泛，蛋白质、激素、酶乃至药物均可检测，并且没有放 射性，出于化学发光免疫分析仪涉及生物免疫学、光学、电子学、机械学等多方面学 科交叉的的高科技技术，前期需要做大量的实验与研究，目6 口我国在此领域的研究还 处于起步阶段。 本文针对国内产品现状，参考国外相关产品与技术进行了半自动化学发光免疫分析 仪的整体设计与研究。本文第一章介绍了免疫诊断的国内外现状及化学笈光，酶免疫， 放射免疫三种方法比较，免疫分析仪的发展历程，结合市场分析了化学发光免疫分析 仪的产品现状与发展前景。第二章主要介绍了化学发光的原理，异鲁米诺衍生物( a b e l ) 反应体系的发光反应特点及其化学发光的应用与发展；并简单的介绍了国内外微弱光 检测现状，应用领域与发展趋势。第三章主要介绍了半自动化学发光免疫分析仪研究 方法与思路，具体实现方法，各模块在合理有序的协调工作，才能保汪测量的准确性， 有效性。第四章着重介绍了光子计数和光电倍增管的特点，针对它们的特点设计的硬 件驱动电路以及对光子计数的误差进行分析。第五章介绍控制系统的软硬件设计，完 成各个模块之间的协调工作。第六章主要是实验数据的测试与结果分析。最后，对课 题总结，并提出一些后续的设计提出一些建议。 第二章化学发光免疫技术与单光子计数技术概述 2 1 化学发光简介 1 9 7 7 年h a l m a n 将化学发光反应系统与免疫系统相结合创建了化学发光免疫分析法 ( c l i a ) ，以检测抗原或抗体。他即有免疫反应的特异性，又具有化学发光反应的高敏 感性。以化学发光物质为示踪物简便、快速、重复性好，无放射污染，3 0 年来得到 广泛的应用。发光反应是一种物质在催化剂的作用下，经过氧化还原反应由基态跃 迁到激发态，而激发态不稳定再衰退回到基态时释放出的能量所表现出的光的反射。 在光照发光、生物发光和化学发光三种发光类型中，化学发光在免疫学检验中应用最 广化学发光免疫技术主要分为化学发光酶免疫分析、电化学发光免疫分析和化学发 光免疫分析。化学发光免疫的主要优点是灵敏度高、标记物有效期长、检测范围宽， 可实现全自动等，用化学发光免疫标记物代替放射性同位素，避免了使用放射性同位 素的危害，操作方法简便，检测迅速。 抗原是能刺激机体免疫系统并产生引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后， 可刺激机体产生特异性免疫应答，并能与免疫应答产物抗体结合，发生免疫效应的物 质。在免疫测定中，抗原是指能与之对应的抗体结合的物质。大多为蛋白质分子，例 如乙型肝炎表面抗原( h b s a g ) 、糖类抗原( c a l 2 5 ) 、甲胎蛋白( a f p ) 等。 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n ，i g ) 。机体受抗原刺激 后，b 淋巴细胞产生相应的抗体。吉有抗体的血清称为抗血清。免疫测定中所用的抗血 清一般用抗原免疫兔、羊或马制得。产生抗体的b 细胞可以在体外培养而分泌出单克 隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y ) 。将免疫的脾细胞与小鼠肿瘤细胞融合，分离杂交瘤细 胞，接种于小鼠腹腔，产生的腹水中古有浓度很高的单克隆抗体。 抗原与抗体反应有其自身的特异性，大致可以总结为四点。 l 、可逆性：抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡过程 2 、最适合比例：在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗原抗体复合物的曲线的 高峰部分是抗原抗体比例最适合的范围，称为等价带。 3 、特异性：抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点结合形成了抗原与抗体的特异 性结舍，抗原决定簇和抗原结合位点在空间构型和化学结构上呈互补关系，因此 抗原与抗体的结合具有高度特异性。 4 、敏感性：在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的灵敏度为每毫升毫克水 平，酶反应测定法的敏感度约为5 l o u g m l ，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的 敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍，达每毫升纳克 水平。 211 化学发光反应的基本原理 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 是化学反应过程中产生的光。通常化学发光过程可 表示为：a + b i 产物+ 光，a b 为反应试剂 i 为反应产物，由于 i 处于 激发态，激发态不稳定容易释放能量衰减到能量较低的基态，屉终能量以光子的形式 释放出来。 根据激发态物质产生的方式可以将化学发光反应分为两类：一种是由体系中的反应 物发生化学反应后直接生成激友态的产物；另一种则是由体系内存在的易于接受能量 的荧光物质，获得化学反应释放的能量后转变为激发态。 化学发光强度与化学发光速率是相互联系的，从而化学发光的反应速率就可以反映 出化学发光的强度，在一定范围内，发光强度与反应物的浓度成正比。由表达式2 1 所示，化学反应的速率，激发态物质的放出光子的效率，激发态产物的效率等因素直 接影响着化学发光强度的强弱。 i c l 一虹d c l d t 一舡w d c d t( 2 1 ) 式中，皿：化学发光的强度( 每秒发射的光予数) ； 虹：化学发光的量子产率( 每一个参加反应的分子发射的光子数) ； t i c d r ：化学反应的速率( 每秒的反应分子数) ； 破w ：发光的量子产率( 每一个激发态产生的光子数) 。 乒茁：激发态的量子产率( 每一个参加反应的分子产生的激发态) ； 在特定化学发光反应过程中，化学发光的量子产率为一定值。一般化学发光的量子 产率在00 1 0 2 0 之间。 212 化学发光反应体系 鲁米诺是一种易被氧化的化合物，在碱性水溶液和非水溶液中都能被氧化并常伴随 化学发光。鲁米诺最大发光波长为4 2 5 纳米，在化学发光反应过程中发出的是蓝光。 一般情况下，鲁米偌与过氧化氢的化学发光反应十分缓慢，但是，当某些催化剂，如 过渡金属离子( c o 、c u ，f e 等) 存在时，反应速率大大提高。h 。0 。的检测限大约为0 1 u m o l l 线性工作范围可达到l m m o l l 。酶免疫分析来说，过氧化氢酶是最常见的标记物，而鲁 米偌化学发光反应对于衡量标记物的测定是最有效的方法。异鲁米诺衍生物( a b e l ) 是一种易被氧化的化合物，在碱性溶液能被氧化，反应速度快，3 秒钟完成发光过程 产生光强度只取决与双氧水、次氯酸钠和氢氧化钠的浓度，不受环境温度影响，系统 因素仅让标准曲线平移或旋转，不改变曲线形状，无跄酸碱缓冲被a b e l 均能稳定存 在。以鲁米偌的衍生物或者类似结构的化合物本身作为一种标 l 物的化学笈光免疫分 析中得到了广泛的应用，所以鲁米偌类化学发光的用途主要有叫个方面，第一- 由j ： 某些金属配合物、过渡金属离子、荧光试剂、酶等浓度与化学发光强度成正比，所以 可以利用它们对于鲁米偌和过氧化氢反应的化学反应的抑制作片j ，进行该类物质的浓 度分析；第二，通过耦合作用，间接测定有机或无机化合物；第三由于化台物对鲁 米偌化学发光反应的抑制，测定对化学旋光产生猝灭作用的有机作用；第四，将鲁米 偌衍生物或类似他合物标记于酸和胺类化台物上，经色谱分离后，在碱性条件下进行 化学发光测定，也可以作为化学发光免疫分析的标记物用于标记氨基酸和蛋白质等生 命相关成分，用于化学发光免疫分析。 2 2 化学发光的应用和最新进展 化学发光分析测定的物质主要可以分成三类：第一类物质是化学发光反应的反应 物；第二类物质是耦合反应中的反应物、催化剂或者增敏剂等：第三类物质是化学发 光反应中的增敏剂、抑制剂或者催化剂。这三粪物质还可以通过标记方式用来测定其 他物质，从而进一步扩大化学发光分析的应用范围。化学笈光检测方法具有线性范围 宽，所用仪器设备简单、廉价、灵敏度高、背景噪声小等优点，但缺乏选择性是该方 法的一大缺陷。随着分离手段的不断发展，可以再化学发光检测前将混合物分离，使 这一缺点得到弥补。因而，化学发光检测法已经成为化学分析的一个强有力的手段。 广泛应用于如食品、生物医药等分析检测系统。自从1 9 7 7 年h a l m a n 等提出了c l i a 以 来，得益于新的联用检测技术，新型标记物与标记技术、新固相材料的发展，以及免 疫测定的自动化、集成化和微型化，c l i a 在试剂、检测方法和仪器等方面呈现出新的 发展趋势，c l i a 被广泛应用于蛋白质、激素、肿瘤、病毒、毒物等成分检测，服务于 临床，卫生，食品，环保，军事等领域。 近几年来化学发光的应用在多个方面都有发展，从理论到实用性的仪器产品制造不 断成熟。原有的发光体系不断完善，化学发光逐渐成为常规的分析方法；新的发光体 系不断开发，利用增强剂可改善发光信号、增加稳定时间。增强化学发光酶联免疫分 析最小检出值可达i 0 “。1 旷1 1 ，较常规的酶免疫分析的灵敏度提高3 5 个数量级。 其检测快速易掌握。增强化学发光酶联免疫分析的研究国内外已有文献报道”1 。化 学发光与其他方法或技术联用，与许多高效的现代分离方法如高效液相色谱( h p l c ) 和 毛细管电泳相结合，提高化学发光技术体系的选择性和灵敏度：将化学发光与生物学、 数学、物理学三大学科相结合，与流动注射技术、传感器技术、高效液相色谱( h p l c ) 技术联用，改善了化学发光法的性能并使化学发光体系的应用更加广泛；为了提高化 学发光效率继续从理论上对化学发光的机理进行研究，结合各种物理化学原理，借助 荧光光谱、吸收光谱、反应中间体的捕捉等；随着高效化学探针的出现，化学发光仪 器飞速艘展不断向精准忧、智能化、微型化和遥控化近进；化学发光的应用范围在 不断扩大，深入到冶金、药物、生命科学、l 临床、材料、环境等各个领域川“。 23 化学发光免疫分析技术 化学发光免疫分析法包括化学发光法和免疫分折法两大部分：它既具备化学发光法 的高灵敏度，又有免疫分析法的高选择性。化学发光免疫分析( c h e m i l u m i n e s c e n c e i m m u n o a s s a y ，c l i a ) 是用化学发光反应的试剂( 可以是发光剂或催化剂等) 标记抗原抗 体，标记后的抗原和抗体与待测标本中相应的抗原或抗体发生免疫反应和理化步骤( 如 离心分离，洗涤等) ，释放光子，最后以测定发光强度的形式测定待测物的含量。 2 31 化学发光免疫分析方法的建立 23i i 抗体的制各 抗体是化学发光免疫分析不可少的材料因此在建立化学发光免疫法时必须先制得 满足方法所需要的抗体。在抗体的制备过程中，对应的抗原分子质量大于5 0 0 0 d 的化 合物( 一般为蛋白质分子) 注射八机体内，才能够诱发抗体的产生，一些相对分子质量 较小的化舍物( 激素，药物) 要通过其他方法制各抗体，比如将它耦台在大分子载体上 一起注射入机体从而诱导抗体的产生。运用中性盐沉淀法，亲和层析法对抗体进行提 纯。近来，在免疫分析测定中，采用将抗血清用木瓜蛋白酶水解制成抗体的有效片段 的方法，近一步提纯了抗体，增加测定的灵敏度。 2 312 化学发光免疫分析的标记技术 抗原和抗体的标记是化学免疫分析中的非常重要的环节。标记免疫步骤不仅仅要求 标记产物性质稳定不易脱落，更重要的是标记后的标记物应保持原抗原或抗体的活 性，保持标记基因的发光活性，能够正常发光。化学发光免疫分析的标记物主要有鲁 米偌、异鲁米偌及其衍生物，吖啶酯衍生物，辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，是目前 化学发光免疫中使用最多的四类标记物。鲁米偌和异鲁米偌是人们最早应用的发光标 记物，其中，由于异鲁米偌标记后量子产率高于鲁米偌。所以得到更广泛的应用。吖 啶酯衍生物由双氧水和羟基引发可以瞬时发光，并具有很高的量子产率，因此在化学 发光免疫自动化仪器中经常采用吖啶酯直接标记蛋白进行测定。碱性磷酸酶酶和辣根 过氧化物酶的发光底物分别是1 ，2 - 二氧已烷发光体和鲁米偌及其衍生物。这些试剂已 经广泛地应用于化学发光免疫，随着各种标记技术不断创新展现出良好的应用前景。 232 化学发光免疫分析的主要类型 根据化学发光免疫分析的标记物的不同化学发光免疫分析法可分为三大类即化学 发光免疫分析法、化学发光酶免疫分析法和电化学发光免疫分析法。 2421 化学发光免疫分析 化学发光免疫分析( c l i a ) ，是用化学发光试剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定 方法。化学发光试剂应符合下面几个条件：1 参与化学发光反应并在偶联后能保持发光 试剂高的量子效应和反应动力：2 与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂：3 理 想状态下应不改变或者很小程度的改变被标记物的理化特性，特别是其免疫活性。吖 啶酯类是较为理想的发光底物。 24 2 2 化学发光酶免疫分析 化学友光酶免疫测定( c l e i a ) ，从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析归属于酶 免疫分析，只是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定，操作步骤与酶免 疫分析完全相同。经过酶和发光两级放大具有很高的灵敏度。以酶标记生物活性物 质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，并加入发光增强剂以提 高发光稳定性，根据测定的发光信号进行定量分析。目前，常用的酶标记物有辣根过 氧化物酶( h r p ) 和碱性磷酸酶( a l p ) ，它们的发光底物分别为鲁米诺和磷酸酯。 24 23 电化学发光免疫分析法 电化学发光免疫测定( e c l i ) 是指由电化学反应引起的特异性发光反应过程。在电极 上施加一定的电流或电压时，电极上发生电化学反应，在电极反应产物之间发生化学 反应t 在化学反应过程中产生激发态，当其由激发态释放能量衰退成基态时产生发光 现象。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒 定。从整体上讲，电化学发光免疫分析包括了电化学和化学发光两个过程，是化学发 光免疫分析的一种发展。 2 4 单光子计数技术概述 2 41 国内外微弱光检测技术现状 随着光纤通信、生物医学以及环境辐射检测技术的发展，对微弱光的检测更加灵敏。 单光子的检测技术已经运用到医疗、航天等众多行业，国际剂量设备能检测到的最小 光强为1 0 x1 0 1 c d ( 光的单位烛光) 光强的光线。与发达国家相比我国在微弱光测量 的应用差距甚大。之前，微弱光的检测大都运用模拟电流测试方法，此方法缺点是动 态响应差、灵敏度较低，人们对光电倍增管了解的甚少运用的在测量微弱光上面就 更是寥寥无几了。近两年美国、r 本等极少数国家已在高速现象测量、生物医学及 免疫检测等高科技领域开始使用单光子计数技术，灵敏度大大提高。目前国内在光电 倍增管的运用上还尚未成熟。但随着光电转换器件技术的不断提高以及高频微弱电信 号处理技术的成熟，众多行业开始使用单光子计数技术测量微弱光。 242 应用领域及其发展趋势 单光子计数系统在医学、生物技术、细胞分类仪光子研究、高分辨率光谱测量、散 射光的测量、非破坏性物质分析、高速现象检测、环保检测、精密分析、色度光度、 生化仪器、激光雷达、工业在线、放射探测、核医学装置、高能物理、大气观察、高 灵敏度探测、对月测距、天文测光等领域有着特殊的作用。对微弱光的检测技术已成 为解析更加高深现象的重要手段。在检测微弱光信号时常常遇到待测信号被噪声淹没 的情况，例如，对于空间物体的检测，背景辐射十分强烈即使是对较强的光信号， 也部需要从噪声中提取、恢复和增强被测信号等技术措施以提高信号抗干扰能力、实 现精确的检测“1 。单光子计数技术是一门崭新的、鲜为人知的技术，虽然国内单光子 计数技术还处于兴起、发展阶段。今后必将会有重大创新和迅速崛起。光子产业必将 发展成为新兴的知识经济，形成巨大的生产力”1 。 只有采用了适当的微弱信号检测技术才能从强干扰和强噪声背景下提取出十分微 弱的的光谱信号，进而研究出高精度的光谱仪。一般微弱光谱信号检测方法有相干检测 技术、取样平均技术、光子计数技术等3 种“。 单光子计数技术是“”利用弱光照射下光子探测器输出电信号自然离散的特征， 采用脉冲鉴别技术和数字计数技术将淹投在背景噪声中的微弱光信号识别并提取出 来。现代单光子计数技术具有灵敏度高、抗漂移性好、时间稳定性好、信噪比高、动 态范围宽以及与计算机兼容构成自动测试和处理系统等优点。在医学，生物免疫、大 气测污、超高分辨率光谱学等高科技领域有着广泛应用，逐步成为各发达国家光电子 学界重点研究的课题之一。 2 5 本章小结 本章主要介绍了化学发光的原理，化学发光体系的发光反应特点及其化学发光的应 用与发展并简单的介绍了国内外微弱光检测现状，应用领域与发展趋势。 第三章化学发光免疫分析仪整体设计与控制 本课题研究的化学发光具有体积小、功耗低、速度快等特点。应用化学发光免疫 分析法可用十对甲状腺素类、肿瘤标记物、生殖一孕激素类、血清抗原抗体类、心脏指 示类等项目的临床实践，定性定量分析中具有十分重要的作用。在参照国内外相关产 品，分析了它们的优缺点之后，结合本系统的市场定位，在前人研究的基础上对本系 统的硬件部分进行改进，同时进行系统软件的编写，把整个系统分成了主控、电源及 复位、l c d 显示屏人机交互界面、电机控制模块、打印模块、薄膜按键模块、光子计 数等功能模块。化学发光免疫分析( c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ，c l i a ) 是将化学 发光或生物发光体系与免疫反应相结合用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免 疫测定技术。利用化学反应释放的自由能激发中间体，从激发态回到基态，能量以光 子的形式释放。因为不同的抗原与抗体反应激发发光底物发出的光子数不同，从而确 定标准曲线测的待测物的浓度太小。因此。系统硬件设计上的任务就是如何把这种光 子数的多少准确的检测出来。主要的问题是如何产生并获取微弱的光信号，对它进行 初步的处理转化成电脉冲，并消除干扰和噪声，在设计完成后要对系统进行调试，对 电路及软件上的问题进行修正和改进。化学发光免疫分析仪是定量测试仪器，它的定 标准确与否直接关系着测试精度。 3 1 研究方法 在化学发光免疫分析中包含两个部分，一部分是免疫反应系统，另一部分是化学 发光系统。免疫分析系统是将化学发光物质或酶作为标记物，直接标记在抗原或抗体 上，经过抗原与抗体反应形成抗原一抗体免疫复合物，常采用双抗体夹心法、竞争法、 间接法等反应模式如图3 1 、3 2 、3 3 所示。 哆 特测轴 固相支持耪表面 图3l 烈抗体夹心法 丫 包被抗体 0 一 待测袖 一 0 标记抗原 图3 2 竞争法 一 丫 包被抗体 硅抗原 图3 3 间接法 本课题研究中发光标记物使用的是异鲁米诺衍生物( a b e l ) ，其分子式为 i ：州5 n h i c c h j j r n 一 异鲁米诺衍生物( a b e l ) 发光反应特点： 1 反应速度快，3 秒钟完成发光过程； 2 产生光强度只取决于双氧水、次氯酸钠和氢氧化钠的浓度，不受环境温度影响； 3 系统困素仅让标准曲线平移或旋转，不改变曲线的形状： 4 无论酸碱缓冲液，a b e l 均能稳定存在： 5 发光底物无需2 _ 8 度保存，室温条件下稳定长期存放。 其中异鲁米诺衍生物( a b e l ) 在双氧水的碱溶液中反应的化学式为图3 4 异鲁米诺衍生 物发光示意图 群黜三辞乩业瞄z f 一a ：。 一 岛卜 岛卜。m 捌3 4 异鲁米诺衔生物发光示意图 免疫反应原理采用的是双抗体夹心法，首先进行免疫反应如图35 免疫反应示意图 所示。 肺n k + 乞 + y a b e i 标记古有抗原荧光量即i t c 抗体的标本标记的抗体 a b e k 与 _ _ 气 图35 免疫反应示意图 其次加入纳米超顺磁性微球，形成免疫复合物固相载体，