（应用化学专业论文）用于免疫分析的聚苯乙烯微孔板功能化的研究.pdf

摘耍 为满足嗣相时悯分辨荧光免痰分擀( t r f i a ) 研究需要，采用露捆载体政进技术研 露l 弼予梭测系统鞠聚辇乙烯徽孑k 投，不仅提衰t r f i a 系统懿灵敏疫，焉曩可珏把该技 术应用到其他免疫分析技术、生物芯片技术、污水处理、发酵工艺、酶工程和亲和层 柝，具裔藿要的现实意义。 本文姆聚苯乙烯徽魏薮内褒骚潮鞠秘麓化，鹾裁一葶孛强蒙苯乙爝徽孔投蠹表嚣形 成i i i j 受强酸、强碱、有机溶剂的忍挖一6 膜层，辩在膜层表鼷烷基他得到灞性基团与己 二酸二髋肼进行“手臂”连接，用双功能基翻戊二醛活化，活化后的膜艨与鬣自质具 有缀裹熬连接链熬巍稳定性。检测籀浆表鞠，缀螃馋於聚笨乙烯徽魏扳熊学连接蛋是 震结会察魄臻瑾蔽瓣楚邕5 1 8 绥，蒎- 4 x 2 臻凌串存藏6 令秀活犍簿低冷警1 5 。灵敏 度和稳定性显著提藤。本文耧器瓣麓麓纯聚苯己烯微强缀其宥搜藤方法麓使、快捷、 污染小、成本低的特点，有广阔的陂爝前景。 关键词：聚荤乙烯微咒板：恳娥一6 ；圈相功靛化；烷蒸他 i no r d e rt om e e t h en e e do fs o l i dp h a s et i m er e s o l v e df l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y ( t r f i a ) r e s e a r c h ，p o l y s t y r e n em i c r o t i t e rp l a t eo ft h ed e t e c t i o ns y s t e mw a sr e s e a r c h e db y u s i n gs o l i d p h a s ev e c t o rf o rt h ed e v e l o p m e n to ft e c h n o l o 百e s n o to n l ys e n s i t i v i t yo ft r f i a s y s t e mw a si m p r o v e d ，b u ta l s ot h et e c h n o l o g yc a nb ea p p l i e dt ot h eo t h e ri m m u n e - a n a l y s i s t e c h n o l o g y , b i o - c h i pt e c h n o l o g y , s e w a g et r e a t m e n t ，f e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y , e n z y m e e n g i n e e r i n g a n d a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , a n dt h e r e f o r e ，i t h a s i m p o r t a n tp r a c t i c a l s i g n i f i c a n c e c h e m i c a lm o d i f i c a t i o nw a su s c di ni n n e rs u r f a c eo fp o l y s t y r e n em i c r o p l a t ei nt h i s d i s s e r t a l i o n , as 刚越l a y e ro fn y l o n - 6i np o l y s t y r e n em i c r o p l a t ew h i c hw a st o l e r a n c es t r o n g a c i d ，s t r o n ga l k a l i , t h eo r g a n i cs o l v e n tw a sr e s e a r c h e d , a n da c t i v eg r o u p si nt h es u r f a c el a y e r t h a tw e r ef o r m e db ya l k y l a t i o rw e r ec o n n e c t e dw i t ha d i p i ca c i dh y d r a z i d e a s ，t h e n t h e ”a r m ”w a sa c t i v a t e db yt h eg l u t a r a l d e h y d ef u n c t i o n a l l i z a t i o n e x p e r i m e n t sr e s u l t ss h o w e d t h a tt h er a t eo fp r o t e i nb i n d e dt ot h em o d i f i e dp o l y s t y r e n em i c r o p l a t ew a s1 0t i m e sh i g h e r t h a nt h a to fp h y s i c a la d s o r p t i o n , t h ea c t i v i t yw a sd e c r e a s e dl e 辐t h a n1 5 w h i c hw a ss t o r e d f o r s i xm o n t h si n - 4 。cs t o r a g ee n v i r o n m e n t a sar e s u l t ，t h es e n s i t i v i t ya n ds t a b i f i t y s i g n i f i c a n t l yw e l x ：i n c r e a s e d a tt h es a m et i m e ，t h e f u n c t i o n a l l i z e dp o l y s t y r e n em i c r o p l a t e w h i c hw a sp r e p a r e db yt h i sm e t h o dc a nb eu s e dc o n v e n i e n t l ya n d q u i c k l y ，s i m i l a r l y ，i th a dt h e a d v a n t a g eo fs m a l lp o l l u t i o na n dl o wc o s t 。1 隆ef u n c t i o n a lp o l y s t y r e n em i c r o p l a t eh a db r o a d p r o s p e c t so fa p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：p o l y s t y r e n em i c r o p l a t e ；n y l o n - 6 ；s o l i d f u n c t i o n a l i z a t i o n ；a l k y l a t i o n 长春理工大学硕士学位论文原创性声明 零久郑藿声鞠；掰黧交的颟学位谂文，翅子免疫分辑静聚苯氛爨徽琵板秘熬强 弱磷究楚零人在攘罨教烬豹攒导下，独立避行磷究工作所鼗褥瓣袋巢。豫文中已经凌 臻零 髑靛悫餐癸，本谂文不包禽程舞荬镶个入绫熊髂已经发表域撩鬻过熬荐鑫戏莱。对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意谈到 本声翻豹浚律结果由本人承抠。 终蛰豢褒：! 逝。2 照年l 奠生霸 捻者溪王大学学位谂文舨毂使鼹授权书 笨学位诡变俸毒爱撵导彀龄宽垒了瓣“长春理工大学黼士、辩士学整论文叛较键嚣裁定”，弱意长毒理工夫攀绦 鬻莽离游窳毒荚郡 疆辊搀送宽馨键论文麓复辞】转弱魄予敝，先诲论文被壹舞霸借潞。奉a 攫毂长春囊王太学颦豁 将本学位论文的全部或部分内释蹁入有燕数据库进行捻索，也可袋用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位 论文。 瓣虢丛! 醴年二月土曩 指导导师簸名雄醚年二月尘日 1 1 引言 第一章绪论 在临床检验和生物学研究中普遍采用的酶联免疫分析( e l i s a ) 以及近十年发展 的非放射性免疫分析，如荧光免疫分析( e l a ) 、发光免疫分析( 乙r a ) 、时间分辨免疫 分析( t r f i a ) 等的方法学研究一直在追求生物大分子与固相材料的化学共价结合；但 直到目前实际采用的仍然是以前的物理吸附，即通过物理吸附作用将生物活性物质吸 附到固相表面。由于吸附后生物大分子容易失活，在操作过程中有容易脱落，导致起 灵敏度，重复性及稳定性降低。为解决此问题，必需使生物分子与固相形成牢固、稳 定的共价键结合。 由于聚苯乙烯材料来源容易，理化性能稳定，易于) j u t 成型，故被应用于免疫分 析的固相材料，聚苯乙烯微孔板外露的都是稳定的碳氢键，其化学改性或功能化有相 当难度；功能化研究一般采用化学改性、构建功能基团“羽( 氨基、羧机基和硫氢基) ， 功能团移植或共聚等方法。其中有的方法尚未成熟，有的成本过高，未能普及应用。 有关多胺应用的研究多数集中于将尼龙膜作固相材料，做尼龙膜印证实验或 免疫实验；而将尼龙移植到聚苯乙烯表面的研究报告不多”3 ，仅见的研究报告因 尼龙层不能耐受酸、碱及有机溶剂，故采用预先与免疫配基结合睁“，再移植微孔表面， 没有普遍使用价值。 本次实验我们将采用特殊的溶解多氨配方”，并使用特定的聚苯乙烯活化剂， 多氨凝固剂，使多胺均匀、牢固移植于聚苯乙烯表面，形成白色反光u 形多胺基内层， 该多胺内表面固相在室温暴露空气中能长期保存并能耐受强酸、碱、有机溶剂不变形、 不脱落。经烷基化，联结氨基“手臂”处理和共价键结合抗体，显著提高结合免疫配 基的活性，且稳定性高，成本低，具有商品化实用价值。 通过文献检索，本次实验的方法目前国内还未见报道。 1 ，2 国内外标记免疫分析技术研究现状 标记免疫分析技术是一大类超灵敏度，高特异性检测技术的总称，因其具有许多 独特优点，已广泛应用于基础医学和临床各领域。它们的基本原理相同，仅依标记物 的不同而最终测量所发出的信号而异。虽然文献报告的方法已有l o 余种，但有搀厂。应 用价值或已被广泛应用的主要有：放射免疫分析( r i a ) 技术、酶免疫标记分析fe i a ) 技术、化学发光免疫分析( c i 。i a ) 技术、荧光免疫分析技术( f i a ) 和时问分辨荧光免 疫分析f t r f i a ) 技术等。以f 就这上l 种分析技术的研究现状和d 口景进行洋细的比较介 绍”“。 1 2 1 放射免疫分析( r i a ) 技术 放射免疫分析技术是利用放射性核素或其他标记物作为示踪剂，在生物体内或体 外研究各种物质或现象的运动规律，利用辐射检测仪器进行定量或定性分析。1 9 5 9 年 y a l o w 和b e r s o n 创立的放射免疫分析技术( r i a ) 使生化分析发生了革命，y a l o w 因此荣 获1 9 7 7 年度诺贝尔医学奖。该技术方法将检测放射活性的高灵敏度与抗体、抗原反应 的特异性得以巧妙结合，因此具有极高的灵敏度( 1 0 1 乙一1 0 一 m o l l ) ，可以分析许多极 低浓度的生物活性物质。其技术分析方法可以分为以下几种： 、( 1 ) 试管固相法 当前r i a 发展的方向是以试管固相作为取代常规液相法的换代技术。试管固相法 在抗原、抗体免疫反应完成后不必加分离剂和低温离心程序，只需测量管的放射性便 可得出待测物浓度，操作简便快速，适合大量临床样品的检测。尤其以洗涤代替分离 和离心，降低了非特异性结合，提高了方法精密度和准确性。 固相抗原或抗体的包被，常规物理吸附法，所包被蛋白质的量小，均一性差，仅 适合双位点夹心法。1 9 9 0 年c a u s s e 等提出以顺丁烯二酸酐一苯乙烯共聚体处理聚苯乙 烯管进行活化，以共价键结合包被，提高了包被的牢固性、均一性和蛋白质的量。但 因工艺流程复杂，难以推广。我们在实验研究中发现，向试管内加一种双功能基团偶 联剂处理试管，类似共价键结合包被，获得满意结果。最近国外厂家已研制出氨基活 化和琥珀酰亚胺酯活化，以共价键取代物理吸附，从根本上解决了固相抗体或抗原的 质量问题，完全满足不同反应模式的要求。试管固相r i a ，其反应模式也相应地进行了 改进，目前应用的有下列数种： l 固相二抗竞争法：此模式是将二抗制成固相管作为通用分离技术，应用范围广。 测定时将i “标记抗原，待测样品和稀释第一抗体加至二抗固相管中温育，洗涤后测量 放射性。 2 亲和素固相竞争法：将亲和素包被制成固相管，取第一抗体生物素化。测定时 取i ”5 标记抗原，生物素化抗体和待测样品加至固相亲和素管中温育，洗涤后测放射性。 此固相管不仅可以通用，且灵敏度有所提高。 3 固相抗原竞争法：本法是一种新型反应模式，适用甾体类、环核营酸和药物等 小分子化合物的检测。先将小分子半抗原经偶联剂和牛血清白蛋白结合包被试管，制 成固相半抗原，经无水乙醇固定可长期保存。测定时将样品和i ”5 标记抗体加至固相半 抗原管中温育，固相半抗原和待测物共同竞争性地与i ”5 标记抗体结合，洗涤后测管的 放射性。 4 固相抗体竞争法：将抗体i g g 包被制成固相抗体。测定时，将样品和1 2 5 i 标记 抗原加至固相抗体中温育，沈涤后测管的放射性。 ( 2 ) 多肽类双抗体央心法 利用肽类分子片段抗体建立试管同相舣抗体兴心法，是多肽r f a 技术一大进磋， 提高了方法的灵敏度和特异性。例如促肾上腺皮质激素目前合成的片段已有1 6 个，取 1 1 3 片段和1 8 3 9 片段分别和蛋白结合，分别免疫兔和山羊，制备2 个片段的抗体。 将l 1 3 片段抗体包被试管制成固相抗体，另将1 8 3 9 片段抗体进行i “标记。测定 时将样品和1 2 5 i 标记抗体加至固相抗体管中温育，洗涤后测放射性。本模式简便易行， 更重要的是适于抗原分子上无可供1 2 5 i 标记的基团的一类物质。 ( 3 ) 多肽或小分子蛋白片段抗体的应用 最近的研究结果表明，利用多肽或小分子蛋白质片段和牛甲状腺球蛋白结合制备 的片段抗体，可以和完整的多肽或小分子蛋白产生免疫反应，并且和1 2 5 i 标记的片段 呈现竞争性结合反应。这一发现为应用片段抗体，建立r i a 测定生物样品中活性物质 提供了理论依据。例如骨钙素( b g p ) 是一种分子量为60 0 0 的小分子蛋白质，国外建 立r i a 采用从动物骨组织提取抗原。我们将b g p 分子上人工合成的9 1 7 氨基酸片段 ( s i g m a 产品) 制备的抗体，建立了b g p r i a 方法，各项技术指标达到国外同等水平。 ( 4 ) 提高分析方法灵敏度的新途径 目前发现，在生物材料中含量很低的一些活性物质，却具有重要的生物学效应， 常规r i a 方法难以测出。采用冻干方法不便推广，我们在实践中证实以下两种间接提 高灵敏度的方法较为实用。( 1 ) 碳1 8 硅烷微柱提取法：取血浆4 m l 加o 1 三氟乙酸 l o m l ，混匀后放置l o m i n ，离心3 5 0 0 r m i n ，1 5 m i n ，取上清液加至预先洗涤过的微柱 中。然后用蒸馏水淋洗，再向柱中加7 5 甲醇( 含0 1 三氟乙酸) 3 m l 淋洗，流出液收集 至l o m l 青霉素瓶中，电扇吹干，置一2 0 保存，测定前加0 4 m l p b s 溶解。此时样品己 浓缩1 0 倍。( 2 ) 试管固相抗体捕获法：将抗体i g g 稀释，取l m l 加至试管中包被，制 成固相试管。取待测样品l m l 加至固相抗体管中，3 7 放置3 5 小时，将样品吸出弃 去，向管内加i “标记抗原，再次3 7 放置3 5 小时，洗涤后测管的放射性。 综上所述，放射免疫分析法( r i a ) 以灵敏度高、专一性强著称，一直是超微量生 物活性物质分析的最具竞争力的手段，但是由于放射性同位素的一些固有缺点，如放 射性半衰期长、货架寿命短，尤其是放射性带来了环境污染问题，限制了它的应用， 已经引起了发达国家的高度关注；近年来各类非同位素标记检测方法在临床上的应用 已较大程度的取代了一些传统的r i a 项目。 我国采用放射性同位素标记所占的比例由1 9 8 0 年的6 0 下降为1 9 8 9 年的2 5 。非 同位素标记由1 9 8 0 年的不足4 0 上升为1 9 8 9 年的7 5 ，近l o 年来这个比例仍在变化。 以某单位为例，使用r i a 试剂盒从1 0 年前的9 5 下降到目前的4 4 ，三甲以上的大型 医院则不足2 0 ，有的仅为5 。取而代之的是非同位素标记的免疫分析技术。 1 2 2 酶免疫标记分析技术( r i a ) 酶免疫标记分析技术，是在免疫荧光技术和放射免疫技术的基础上，从6 0 年代发 展起柬的一项新技术。该技术作为一种免疫标记技术，具有灵敏度高、试剂稳定、设 备简t 尊、操作安全等优点，同时生命科学、环境科学的发展要求人们必须进行非放射 免疫分析研究。首先对r i a 发起冲击的是酶标免疫分析( e i a ) ，e i a 是在r i a 基本理论 的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫分析技术。早期只有一种反应模式，只限 于病原微生物抗原或抗体的快速定性测定，因标记物制备简易，有效期长和不污染环 境等优点，加速了对e i a 技术的研究和应用，方法日臻完善，其灵敏度和应用范围均 己达到r i a 的同等水平。其发展方法如下： ( 1 ) 固相抗体制备新工艺 1 9 9 3 年y o n e z a w a 应用氨基化酶标板以共价键结合代替物理吸咐包被抗体，将包被 的均一性、牢固性和控制包被抗体i g g 的量提高到一个新水平，并建立了甾体激素的 竞争性e i a ，获得满意结果。最近美国康宁公司研制成功表面经琥珀酰亚胺酯活化酶标 板，其质量达到氨基活化相似水平。由于抗体包被技术的改进，e i a 的应用发展甚速。 ( 2 ) 增强发光酶免疫分析 增强发光酶免疫分析( e n h a n c e dl u m i n e s c e n ee n z y m ei m m u n o a s s a y ，e l e i a ) 是e i a 技术的新发展。其特点是酶促增强发光信号，并稳定和延长发光信号时间，既保持发 光免疫分析的高灵敏度，又克服了传统发光酶免疫分析所发信号时间短的缺点，目前 国外已实现自动化分析。 1 辣根过氧化物酶( h r p ) 一e l e i a ：以第二抗体包被活化酶标板，将h r p 和抗原 结合。测定时将样品、酶标抗原和第一抗体加至二抗板孔中温育，洗涤后向孑l 内加发 光底物( 1 i m i n o l - h 2 0 2 和对碘酚液) ，即刻发出光信号，并可持续半小时，最小检出值可 达1 0 一1 7 m o l 孔。 2 碱性磷酸酶- e l e i a ：研究结果显示，二氧环乙烷的衍生物在适宜的缓冲液中经 碱性磷酸酶的催化可发出强度很高的光信号。根据这一特征，以碱性磷酸酶标记抗体 建立夹心型e i a ，最小检出值可达1 0 2 0 m o l 孑l 。目前常用的发光底物为3 一( 2 一螺旋金 刚烷) 一4 一甲氧基一( 3 - 磷氧酰) 一苯基1 ，2 二氧环乙烷( 简称a m p p d ) 液。 ( 3 ) 生物活性多肽双位点夹心发光e i a 1 9 9 6 年1 w a t a 等报告一种夹心型血浆内皮素( e i 1 ) 发光酶免疫分析。以兔抗e i l 1 5 2 1 片段抗体包被酶标板，另取抗e t 一1f a b 标汪h r p 。发光底物为l u m i n o l h 她4 一 - 4 一( 2 一甲基一噻唑) 酚 。测定时，将样品和酶标抗体加至固相抗体孔中温育，洗涤 后加发光底物。本法最小检出值为0 0 5 p g 孑l 。 ( 4 ) 提高测定半抗原灵敏度的新模式 为了测定生物样品中浓度很低的化合物，国外作者设计了一种新模式，即将待测 抗原连接一个多肽，然后进行生物素化，可以得到一个半抗原结合多个生物素分子。 以s a i i r p 作示踪物，建立固相抗体竞争法。国外有的试剂盒已采用了这一技术。 ( 5 ) 双特异性单克隆抗体( m c a b ) 双位点夹心法7 双特异性c a b 是指1 个m c a b 分子i g g 可以特异性地结台1 个抗原和1 个酶分+ r 。 利用双特异性m c a b 可建立不必进行抗体酶标的分析技术，操作简便，灵敏度和特异性 高，是一种有发展前景的方法。其不足之处是制备这种抗体比较复杂。目前尚处于实 验室研究阶段。 1 2 3 化学发光免疫分析 化学发光免疫分析( c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ，c l i a ) ，是一种超微量的痕 量分析法，它将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来， 其灵敏度并不小于r i a ，其突出的特点是：设备简单，试剂稳定，无放射性污染，本法 与r i a 同点是一般以化学发光物质为示踪物。c l i a 的主要试剂有氧化剂、发光剂和催 化剂，催化剂本身还常用作标记物，本法开始于7 0 年代末，由h a l m a n n 和v e l a n 建立， 为生物物质的超微定量和定性分析开辟了新的途径。 1 9 7 8 年s c h r p e d e r 在r i a 和e i a 基本理论的基础上，以化学发光信号示踪，建立 了化学发光免疫分析( c l i a ) 技术。因其具有和r i a 相似的灵敏度和特异性，受到国内 外学者的重视，并投入了相当的人力和资金对方法进行研究，并制造测量仪器。大量 的实验结果证明，c l i a 因光信号持续时间太短，达不到临床应用水平。虽然灵敏度上 可以达到放射免疫分析法的水平，但是影响的因素较多，稳定度较差，容易受外界环 境的影响，而且化学反应以后，样品的发光无法再现。为解决方法学上的自身缺点， 一些学者进行了发光稳定剂的研究，9 0 年代初首先由英国a m e r s h a m 公司研究人员发现 在h r p 催化l u m i n o l 发光反应中加微量对一碘酚，可以使发光信号持续2 0 3 0 m i n 。随 后生产出试剂盒。 最近的研究结果证明，以甲基吖啶酯标记抗体是较理想的发光物质。因其不必加 催化剂，受外界干扰因素少，只需在碱性溶液中加入微量h ：0 2 ，就可发出很强的光信号。 此外，吖啶酯作为标记物操作简易，稳定性高，自然本底很低，标记蛋白后不降低发 光信号的产生。这些因素是提高灵敏度的有利条件，最小检出值可达l o - 1 8 9 m l 。 目前美国c i b ac o r n i g 公司研制了a c s 一1 8 0c l i a 自动免疫分析系统，并提供为仪 器相匹配的吖啶酯标记免疫试剂盒，由一台仪器完成全部检测程序。 ，2 4 荧光免疫分析法( f i a ) 本世纪4 0 年代，c o o n s 等首先采用荧光素作为示踪物质标记抗体，检测可溶性肺 炎双球菌多糖抗原，从而创建了免疫荧光示踪技术。该技术将抗原抗体反应的高度特 异性与荧光的敏感可测性有机结合起来，可以准确、特异、灵敏、快速地检出和定位 某些未知的微量及超微量物质，广泛应用于生物学、医学和药学等多个领域，并取得 了巨大的成就。尤其是近年来，随着免疫学、生物化学、分子生物学以及仪器制造业 的迅速发展，涌现出一大批的荧光物质，新型免疫荧光分析技术和新型荧光自动分析 仪，使免疫荧光示踪技术的优势得到了充分的发挥，应用范围也更加广泛。 荧光免疫分析法( f i a ) 以荧光物质作为标记物，紫外光激发发光，由于样品自身 荧光和生物大分子物质对激发光的散射，形成很强的本底荧光，降低了信噪比和线性 范围，影响了测量的灵敏度，又常常由于背景干扰影响了分析准确度，因此开发时问分 辨荧光免疫分析对超痕量检测具有及其重要的意义。 ，2 5 时间分辨荧光免疫分析( t i 鹏一r e s o i v e df il l o r j m m u n o a s s a y ，t r f ia ) 2 0 世纪8 0 年代初，在荧光免疫分析法的基础上，发展出镧系时间分辨荧光免疫分 析( t r f i a ) 。镧系离子螫合物标记抗体抗原进行免疫分析具有以下优越性： ( 1 ) 发射光谱带很窄，甚至不到l o n m ，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率； ( 2 ) s t o k e s 位移较大( 2 5 0 3 5 0 n m ) ，有利于排除非特异性荧光的干扰； ( 3 ) 荧光寿命长，一般镧系元素螯合物的荧光衰变时间在6 0 9 0 0 s ，常用的e u ”荧 光衰变时间为7 1 4 s ，而普通荧光免疫分析中的荧光团的荧光衰变时间只有约l l o o s ， 样品中的一些蛋白质的荧光衰变时间也很短，仅为1 一l o s 。因此，延迟测量时间，待背 景荧光完全衰减后测定，所测的便是稀土络合物的特异性荧光，从而消除蛋白质背景 荧光的干扰： ( 4 ) 激发光谱带较宽，激发最大波长在3 0 0 5 0 0 n m ，有利于增高激发能，提高标记 物的比活性； ( 5 ) 稀土元素标记物比较稳定，可以保存l 一2 年，克服了同位素、酶标等不稳定的 缺点。 t r f i a 它既有r i a 的灵敏度高、专一性强、稳定性好和f i a 、c l a 的非放射性的优 点，同时还有线性范围宽( 跨越4 5 个数量级) 、操作简便、样品用量少、分析速度快、 样品荧光能重现、易自动化等优点，受到基础医学、临床检测、分子生物学等领域学 者的关注。可以认为，t r f i a 是当代最灵敏的、最完善的、最有发展前途的免疫分析法。 时间分辨荧光免疫分析技术的进展将会带动相关产业结构的企业形成，国内外高度重 视其科研和应用几种标记免疫分析法检测灵敏度比较( 图1 1 ) 。 图1 1 几种标记免疫分析法检测灵敏度比较 f i g u r e1 1c o m p a r e t i o n s e n s i t i v i t yo fs e v e r a lm a r k e r sm e t h o d s o fi m u n ed e t e c t i o n 有关这方面的理论和临床应用已有专著出版。以下简述最新进展： ( 1 ) 通用e u 标记化合物：将链霉亲和素一生物素系统用于t r f i a 已十分完善，适 用于各种免疫反应摸弋。1 9 9 3 年重组蛋白g 已商品化。蛋白g 保留了与f c 端i g g 结合 的特性，并且带有1 3 个赖氮酸，是杯记高比洒竹! e u 的理想物质，不仅可以通用，还 6 可以进一步提高它的灵敏度，但缺点是样品不得含有蛋白质，可用于脂溶性半抗原的 测定。 ( 2 ) 提高半抗原标记率方法的新进展：提高半抗原标记率的目的，是将方法的灵敏 度提高到一个新水平，以适应生物样品中浓度很低的物质的测定。文献报告已研究出2 种方法，其一是将半抗原和聚赖氨酸结合作为标记e u ”的前体，另一种是将链亲和素与 甲状腺素球蛋白结合作为标记e u ”的前体。利用这两种人工合成的标记前体制备的e u ” 标记物，将方法的灵敏度提高了1 2 个数量级。 同时t r f i a 的特异性又明显高于聚合酶链反应( p c r ) 。p c r 不但易因污染而错误地 进行复制放大，导致较高的假阳性检测结果，也会因被检测物( 如s a r s 病毒) 的浓度 过低或变异而导致假阴性。 目前纳米荧光标记免疫分析法被认为是一种正在探索中的很有前途的高灵敏度分 析技术，纳米荧光探针具有激发光谱范围宽、发射光谱窄、光学稳定性强以及颜色可 调等特点而在生命科学中显示出重要的应用价值，但同样存在着背景干扰问题。基因 组后续研究最重要的热点是基因、蛋白质组学研究和生物芯片技术。基因组学研究在 分析、分离遇到的技术难题是：面对复杂的生物体系，传统的考马斯亮蓝、铜染色法 因灵敏度低不能满足检测的要求。银染法灵敏度高，分辨率好，但操作较繁琐，而且 常常造成蛋白质末端封闭，不利于蛋白质的序列分析。因此，高灵敏度、高特异性的、 高分辨率的荧光标记检测体系( t r f i a ) 研究己成为现代生物分析技术的前沿 表1 1 常见标记免疫学比较 t a b l ei ic o m p a r i s o no fc o m m o ni m u n o l o g i c a lm a r k e r s 1 3 时问分辨荧光免疫分析( t r f i ) 的系统介绍 1 3 1 时间分辨荧光免疫分析原理介绍 ( 1 ) 时间分辨荧光免疫分析背景1 自1 9 7 8 年报道了以稀土荧光配合物作为标记物的时间分辨荧光生物测定法以来， 1 9 7 9 年芬兰的s o i n i 和h e m m il a 在总结自己和前人实验经验的基础上，提出了“时间 分辨荧光免疫分析理论”。1 9 8 3 年h e m m i l a 、s o i n i 和l o v g r e n 等首先报道了以镧系元 素配合物为标记物的时间分辨荧光免疫分析技术的应用。时间分辨荧光免疫分析 ( t i m e r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y ，t r f i a ) 的原理和方法与常规的荧光免疫分析法 不同。它采用长荧光寿命的稀土配合物作为标记物进行抗原或抗体的标记，在荧光激 发后引入一个适当的延迟时间，然后再采集稀土荧光配合物的长寿命荧光信号，从而 有效地克服短寿命的背景荧光和散乱光对测定的干扰( 图1 2 ) ，使非特异性本底信号 降低到可以忽略的程度，达到了极高的信噪比。 圈1 2 时间分辨分析的原理 f i g u r e1 2 t h em e c h a n i s mo ft i m e r e s o l v e da n a l y s i s 时间分辨荧光免疫分析( t i m e r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y ，t r f i a ) 是利用稀土 配合物的特殊荧光性质建立起来的一种以镧系荧光配合物特别是铕配合物作为荧光标 记物的免疫分析方法。t r f i a 使用的示踪物不是荧光素，而是三价稀土离子，如e u ” ，t b ”s m ”和d y ”等，这些稀土离子通过具有双功能基团结构的螯合剂，在水溶液中很 容易与抗原分子以共轭双键结合，形成稀士离子一螫合剂一抗原螯合物。稀土离子的荧 光，不仅与自身的能级结构有关，而且与螯合剂的性质有关。螯合物不同，稀土离子的激 发光和发射光也会有所不同。 ( 2 ) 稀土离子的荧光性能 在紫外线等高能射线的激发下，处在溶液或化合物中的三价稀土离子被激发，从基 态跃迁到激发态，然后再从激发念返回到能量较低的能态时，放出辐射能而发光，这种 光即为荧光。稀土离子的荧光光谱也像吸收光谱一样，束自三个方面的跃迁：f f 跃 迁：5 d 一4 f 跃迁：电荷转移跃迁。当一些络合物的配体不吸收紫外光时，其荧光的产生， 可通过电荷跃迁或4 f 。4 f ”1 5 d 跃迁至相应的激发态，再以非辐射衰变至4 f “组态的激 发态，此激发态向低能态跃迁时，也可产生荧光。 ( 3 ) 紫外线激发产生荧光的物理过程 络合物荧光的能量跃迁过程，一般可分三步来说明( 跃迁过程见图1 3 ) ：( 1 ) 先由配 体吸收辐射能，从单重态的基态s o 跃迁至激发态s ，其激发能可以辐射方式回到基态 s 。( 配体荧光) ，也可以非辐射方式传递给三重态的激发态t l 或t ：( 2 ) 三重态的激发能也 可以辐射方式失去能量，回到基态( 磷光) ，或以非辐射方式将能量转移给阳离子( 图中 是稀土离子) ( 3 ) 处于激发态的阳离子( 稀土离子) 的能量跃迁也有两种方式，以非辐射 方式或辐射方式跃迁到较低能态，再至基态，或以辐射方式跃迁到较低能态，此时就产 生荧光。 缝 量 一辐謦暖迂拿鬟暂跃迂 图1 3e a “配位体受激发能量传递示意图 f i g u r e1 3e n e r g yt r a n s f e rs k e t c ho fc o o r d i n a t i o no fe u e x c i t e d 从这里得知，稀土离子长寿命荧光的产生，是先由配体吸收能量，然后以非辐射方 式，经三重态，传递给稀土离子，将稀土离子从基态跃迁到激发态，接着处在激发态的离 子，以辐射方式跃迁到低能态而发出荧光。所以，要产生较强的荧光，选择合适的配体非 常重要。一般来说，当稀土离子的激发态与配体的三重态相当，或在其以下时，就可能由 配体的三重态将能量转移给稀土离子，产生长寿命荧光。 易氧化的配体与易还原的稀土离子组成的络合物，易发生电荷转移跃迁，e u ”最易 还原成e u ”。因此，在e u 4 的一些络合物的吸收谱中，可经常出现电荷转移跃迁。电荷跃 迂带的出现与位置，和配体性质有关。 ( 4 ) e u 的荧光谱 e u ”荧光谱般为；n ，一? f ，的跃迁光谱，包括电荷转移跃迁光谱和共振能鼙转移光 谱。电荷转移跃迁光潜是配体向稀土离于的电衙转移念( 4 f 壳层内) 发生电荷转移而产 9 生的，矾一。f ，f ：，f 。的荧光波长分别为5 9 0 5 9 6 n m ，6 1 0 6 2 0 n m ，6 8 7 7 0 3 n m 。而当用 1 3 一二酮体作e u ”配位体时，与电荷转移跃迁不同，配位体的三重态与e u ”的5 d 态发生共 振能量转移，而不是电子密度的重新分配。e u 依靠配位二酮体的能量转移，可以得到强 烈的e u ”的d o 一。f ：( 6 1 0 6 2 0 n m ) 跃迁荧光。依靠配体的能量转移获得的e u ”的；d 0 一：f ： 荧光强度远远大于由于电荷转移或4f 一5 d 的跃迁吸收所得到的；d o 一7 f 2 的荧光强度。 ( 5 ) 稀土离子螯合物荧光的特点 稀土离子的荧光激发光波长范围较宽，有利于增加激发能，提高稀土离子标记物 的荧光信号，而被激发的荧光光带极窄，荧光的发射峰非常尖锐( 如图5 5 ) ，可使仪 器调整在极窄的波长范围内测定，极大地降低本底荧光强度，提高分辨率。同时激发光 和发射光之间有一个较大的s t o k e s 位移1 ( 1 8 5 2 年s t o k e s 在考察奎宁、叶绿素的荧 光时，又发现了著名的s t o k e s 法则，即物质吸收的光，其中一部分因振动及其他原因 而损失掉能量，所以从物质发出的光，其波长将长于激发光波长，s t o k e s 以会发出荧 光的矿物莹石c a f 。推衍出这种光，因而称之为荧光) ，某一波长测定样品荧光时，可以 通过非常简单的方法( 如使用滤波片或分光计) ，就可消除非特异荧光( 激发光和散射 光) 的干扰，极大地增强了荧光信号测量的特异性。 稀土离子螯合物荧光与常规荧光化合物的性质比较( 表1 2 ) 表1 2 稀土离子螯合物荧光与常规荧光化合物的性质比较 t a b l e1 2t h ec o m p a r i s o no fc o m p o u n d so ff l u o r e s c e n c eo fr a r e ， e a r t hc h e l a t ea n dt h en a t u r eo fc o n v e n t i o n 卜ii t ：p l u o 蹦c i n 嘲1 l h _ w ! j n 4 k ：删j t c ：m 刈i m 争日】j - i m i f i k ，- n c ；lj5 _ ，a n l t ) c d ，f ： 肛m ” = 3 n j 坤i 巾“日n 耐t i | t l n 出t 曙 荧光寿命长。由于稀土配合物的发光要经过能量从配体的单重态到三重态，再传 递到中心离子的过程，这样的荧光是延迟荧光，其荧光寿命远远长于普通荧光化合物 的荧光( 从第一激发态到基态) 和磷光( 第三单重态到基态) 。一般e u ”配合物的荧光寿 命都大于0 2 m s ，而t b ”配合物的荧光寿命甚至可达到2 m s 以上。 生物样品( 如蛋白质) 本身产生的荧光波长位于4 0 0 - 6 0 0 n m ，几乎涵盖整个可见光 的波长范围。因此，普通荧光的激发波长和发射波长两者相互重叠现象非常严重。所 以用普通荧光素来检测生物样品时自然本底的荧光干扰太大。若用稀土离子代替荧光 素建立t r f i a 检测生物样品。由于稀土离子螯合物所产生的荧光不仪强度高而且半衰 期也长，介于1 0 一1 0 0 0 p s 之| 日j ，比普通荧光标记物高j 一6 个数帚级， 所以当标记抗原待测抗原共同竞争抗体，起免疫反应后，免疫复合物中抗原， 抗体结合部分就含有稀士离予。采取一些办法将结合部分与游离部分分开，利用时间 分辨荧光分析仪，即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原 的量，原理见图1 4 。 根据荧光性质的荧光寿命不同，采用时间分辨荧光测定技术只测定长寿命荧光物 质发出的荧光，而不测定短寿命荧光物质发出的荧光，此即时间分辨荧光免疫分析法 的测定原理，利用该法可消除生物样品及免疫分析用固相材料产生的本底荧光，有利 于荧光免疫分析法灵敏度的提高。 图1 4 时间分辨荧光免疫分析的原理 f i g u r e1 4 t h em e c h a n i s mo ft i m e r e s o l v e df l u o r o i u u n o a s s a y 1 3 2l k b 系统” ( 1 ) 解离增强时间分辨荧光免疫分析 解离增强时间分辨荧光免疫分析( d e l f i a ) 是w a l l a c 公司在8 0 年代初建立的t r f i a 体系侧。d e l f i a 以极高分析灵敏度已经在临床诊断和d n a 杂交分析得到了广泛的应用。 但由于d e l f i a 体系采用不能发光的聚羧酸类螯合剂( e d t a 、d t t a 等) 标记抗原或抗体， 需加入增强液将稀土离子解离下来后同另种螯合剂形成发光螯合物再进行荧光检测 ( 见图1 6 ) ，容易受到稀土污染。又由于离子解离后不能产生特异的空自j 信号，并不 适于所有的应用，如荧光成象，免疫组化、定位杂交、d n a 芯片或在线检测 d e l f i a 采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸一e u ”( d t t a - e u ”) 为双功能螫合试 剂，其一端螯合e u ”，另一端可与蛋白质的n h ：连接。在中性或接近中性p h 条件下， d t t a e u ”对e u 具有足够高的络合稳定性，而在酸性条件下，d t t a - e u “又能将螯合的 e u ”迅速而彻底地释放出来( 见图1 5 ) 。与w a l l a c 标记体系相对应的是其特有的荧光 增强体系。d t t a - e u ”本身荧光极弱，但在w a l l a c 荧光增强液( f l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n ts o l u t i o n ，f e s ) 的作用下，e u ”从免疫复合物上完全解离( 3 - l o m i n ) ， 迅速与f e s 中配体络合并进入胶束的疏水内核，使e u “荧光得以成千力倍地放大，这是 d e l f i a 能实现超灵敏分析的重要原因。 e 邮- w t a l t 凹q i t i i b r 酬蜘 女n 弼i i - 口w c 酣 p + t a + t o p o + t t k x - 1 0 0 p h = t 2 嘲甜 l i l * e f h 非 图1 5d e l f i a 时间分辨荧光免疫分析体系的原理 f i g u r e1 5 t h en l e c h a n i s mo fd e l f i at i m e - r e s o l v e df l u o r e s c e n c e i r m u n o a s s a ys y s t e m 图1 6d e l f i a 的原理 f i g u r e1 6t h em e c h a n i s mo fd e l f i as y s t e m ( 2 ) d e l f i a 增强液的研究。”】 w a l l a cf e s 主要由b 一二酮( b n t a ) 、协同试剂、非离子表面活性剂和缓冲试剂 组成( 图1 7 ) 。b n t a 在w a l l a cf e s 中的作用是吸收激发光并将能量传递给与之络 合的e u 。在种类众多的p 一二酮中，以6 一n t a 和t t a 对e u ”的荧光增强效果为最佳。 但对于t b ”和d y ”等具有更高共振激发态能级的稀土离子，其荧光增强需采用三重激发 念能级更高的b 一二酮，如：p t a 。 w a l l a cf e s 中协同试剂t o p o 的主要作用是饱和e u ”剩余的配位位点，并与母一二 酮一起在e u 周围形成较完整的疏水性屏蔽层，从而防止水分予对e u 荧光的淬灭。胡 继明等人在对s m ”一b 一二酮一t o p o 荧光体系的研究中发现，t o p o 不仅能通过取代水分 子的方式降低荧光淬灭效应，f j ： j + 能作为能量供体将能量传递给b 一二酮，从丽在s m 。一 t 3 一二酮一t o p o 络合物体系中既存在b 一二酮向s m “的能量传递。通过t o p o 与b 一二酮的 这种协同作用，使s 矿荧光得以进一步增强。 表面活性剂t r i t o nx 一1 0 0 在d e l f i af e s 中形成胶束，使疏水性的b 一二酮、协同 试剂同处于胶束的疏水内核，增强了络合体系的稳定性，并进一步避免了水分子对荧 光的淬灭。 由上述三种主要试剂形成的d e l f i af e s 具有对e u ”快速解离的能力、高效的荧光 增强效果和优