（发酵工程专业论文）茶树菇提取物成分分析及免疫调节作用研究.pdf

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量和促进巨噬细胞的吞噬能力；增加空斑形成细胞c ) 的数量等功效。但未发现对n k 细胞活性有显著影响。 实验结果还表明：茶树菇提取物对肿瘤具有明显的抑制作用茶树菇提取物对小鼠 s 1 8 0 移植肉瘤的瘤重抑制率为2 9 9 ；对s m 腹水瘤荷瘤小鼠体重增重比的抑制率为 2 2 7 ；使s l s o 腹水瘤细胞的分裂指数下降了3 2 2 ；对环磷酰胺( c p ) 所致s t 8 0 腹水瘤荷 瘤小鼠的白细胞数下降有显著的恢复作用，其增高幅度为2 0 1 。 关键词：茶树菇提取物；成分分析；免疫调节；抗肿瘤 江南大学硕士论文 a b s t r a c t a g r o c y b ec y l i n d r a c e a ，an e wt y p ee d i b l ef u n g u s ，i sw e l c o m e dd e e p l yi nm a r k e tb e c a u s e o f i t sd e l i c i o u st a s t ea n df r a g r a n ts m e l l i ti sak i n do f u m b r e l l af u n g u s 、) i ，i l l lh i 曲e d i b l ev a l u e a m o n g t h ee x t r a c to f a g r o c y b ec y l i n d r a c e a ，t h ep r o t e i n ，c r u d ef a t , a s h ，c a r b o h y d r a t e a c c o u n t e d f o r 2 9 5 ，0 1 6 ，1 6 1 ，4 6 2 2 o f d r y w e i g h t , r e s p e c t i v e l y 1 1 碹p o l y s a c c h a r i d e c o n t e n tw a s4 3 6 i nt h ec r u d ee x t r a c t i o n s a m o n gt h ep r o t e i no f a g r o c y b ec y l i n d r a c e a , t h e r ew e r e1 7k i n d so fa m i n oa c i d s t h e e s s e n t i a la m i n oa c i dc o n t e n tw a s2 7 9 i nt h et o t a la m i n oa c i d s t h e r ea l m o s tw e r e6 0k i n d so f v o l a t i l em a t t e r si nt h ee x t r a c to f a g r o c y b ec y l i n d r a c e a , i n c l u d i n go r g a n i ca c i d ，a l c o h o l ，k e t o n e ，h y d r o x y b e n z e n e ，a l d e h y d e ，e s t e r , p y r r o l e ，p y r a z i n e a n ds oo n , w h i c hc o m p o s e dt h ev o l a t i l es w e e tm a t t e r so fa g r o c y b ec y l i n d r a c e a t h ee x t r a c to fa g r o c y b e c y l i n d r a c e aw f l s r i c h i nm e t a l e l e m e n t s ，i n c l u d i n g c a l c i u m ( 3 6 0 7 m g g ) ，m a g n e s i u m ( 3 0 2 l i n g g ) ，z i n e u m ( 7 9 。3 g g ) ，i r u n ( 7 9 2 , g g ) c o n s e q u e n t l y , a g r o c y b ec y l i n d r a c e aw a sah i g hp r o t e i n ，l o wf a te d i b l ef u n g u sw h i c h c o n t a i n e d m a n yk i n d s o fv o l a t i l es w e e tm a t t e r s , m i n e r a ls u b s t a n c e sa n da c t i v e p o l y s a e e h a r i d e s i tw a sf o u n di nt h i se x p e r i m e n tt h a tt h ea c ec o u l dp r o m o t et h ed i f f e r e n t i a t i o na n d h y p e r p l a s i ao ft - c e l l ，a n ds t r e n g t h e nt h ed t hi nw h i c ht - c e l lp a r t i c i p a t e d ；p r o m o t et h e s w a l l o w i n ga b i l i t , o fm e - c e l li nv i v oo fe x p e r i m e n t a lm o u s e ；i n c r e a s et h eq u a n t i t yo fp f c a p eh a d n tr e m a r ka b l ee f f e c to nt h ea c t i v i t yo f n k - e e l l 1 1 嵋e x p e r i m e r i tr e s u l t sa l s oi n d i c a t e dt h a tt h ea c ec o u l do b v i o u s l yi n h i b i tt h em o u s e ，s t b m o rf r o mg r o w i n g i ti sc o u l dr e s t r a i nt h eg r o w i n go f t r a n s p l a n ts a r c o m ab y2 9 9 ：p r e v e n t t h ei n c r e a s i n go fw e i g h t - g r o w i n gr a t eo fm o u s eb e a r i n gs z s ot i l m o rb y2 2 7 d c c r e a s et h e d i v i s i o ni n d e xo fa s c i t e s et u m o rc e l l sb y3 2 2 ；i n c r e a s et h en u m b e r so fw b c 。w h i c h d e p r e s s e db yc p ，b y2 0 1 b a s e do ni r n m u n o r e g u l a f i o na n dt h ea n t i t u m o re f f e c to fa g r o c y b ec y l i n d r a c e ae x t r a c t w h i c hm e n t i o n e da b o v e ，t h ea c ec a l lb er e g a r d e d 勰i m m u m t ya 由l a s t i n g a g e n ta n dt h e a s s i s t a n ta g e n to ft u n l o rp a t i e n t sr a d i o t h e r a p ya n dc h e m o t h e r a p yi nc l i n i c a l , i tc a r le s t i m a t e t h a ta g r o c y b ee y l i n d r a e e ae x t r a c t , p o s s e s s e st l l e 、) i r i d c a p p l i c a b l ef o r e g r o u n di nm e d i c i n e f o o d s t u f f a n d h e a l t h p r o t e c t i o n i n d u s t r y k e yw o r d s ：a g r o c y b ec y l i n d r a c e ae x l r a c t ； c o m p o s i t i o na n a l y s i s ； i m m u n o r e g u l a t i o n ； a n t i t u m o re f f e c t 2 第一章绪论 第一章绪论 1 1 食用菌概述 食用菌是一类营养丰富、可供食用的大型真菌的总称。据统计，目前已明确可食用 的真菌约2 , 0 0 0 余种，国内已报导的食用菌近1 , 0 0 0 种，人工栽培种类近7 0 种，有药用 价值的食用菌约3 0 0 多种，迄今真正作为药物使用的仅2 0 3 0 种，占食用菌种类中的极 少部分“。我国的食用菌资源丰富，食、药用历史悠久，神农本草经、本草纲目、 本草备用、食疗本草、本草从新、本草再新、日用本草、中国的真菌、 ( e e 国药用真菌、中国药用真菌图鉴等历代典籍和图书中均有记载。近年来，食用菌 作为功能性食品日益受到人们的重视对食用菌的食用和药用价值的研究也越来越深入。 食用菌细胞的成分中除含有大量水分之外，约含2 的干物质。干物质包括多种矿物 质、蛋白质和氨基酸、碳水化合物、粗纤维、脂类以及维生素等成分u 制 1 1 1 水分 新鲜食用菌的水分含量大约在8 8 9 3 之间，水分直接影响食用菌的嫩度、鲜度 和口感。大量的水分使食用菌外观新鲜、口感嫩脆。 1 1 2 灰分 灰分反映了食用菌中矿物质的含量，其中主要包括磷、钾、镁、钙及微量元素等。这 些矿物质元素是很多酶的辅助因子，参与调节人体代谢，有些还具有构成骨骼，血红蛋白、 细胞色素、维持体内的渗透压和酸碱平衡的作用。 1 1 3 蚤白质和氨基酸 蛋白质和氨基酸是食物营养成分中的重要组成部分，食用菌中的蛋白质种类丰富， 质量分数为干重的2 0 4 0 氨基酸种类也达18 种之多，其中人体必需的8 种氨基酸 占氨基酸总量的4 0 左右，特别是赖氨酸、精氨酸等重要氨基酸的质量分数明显高于其 它食物。食用菌中谷氨酸、天冬氨酸等呈鲜味的氨基酸含量也较丰富，因此食用菌口味也 比较鲜美 1 1 4 碳水化合物 碳水化合物是食用菌的主要化学成分，包括单糖、多糖、糖醇和其他衍生物。其中 多糖是主要成分( 如葡聚糖、淀粉、糖原、几丁质、甘露聚糖等) 。食用菌能产生多种多 糖，此类多糖具有抗肿瘤、降低血浆胆固醇、降血糖、提高机体的免疫力等广泛的生物活 性。食用菌中含有较多的多糖物质，是一类很有开发前景的食、药两用菌。 1 1 s 粗纤维 粗纤维是膳食纤维的一种重要形式，膳食纤维素有“肠道清道夫”之称。食用菌中 的粗纤维含量较多，因此多摄入富含粗纤维的食用菌，符合当前国内外普遍提倡的改变膳 食结构的要求 江南大学硕士论文 1 1 6 脂类 食用菌中的脂类主要包括脂肪、磷脂和甾醇等。食用菌中的脂肪的质量分数较低， 仅为千重的1 4 ，且大部分是不饱和脂肪酸。 1 1 7 维生素 食用菌中含有多种对机体有益的维生素，如胡萝卜素、硫胺素、核黄素、抗坏血酸、 生物素、吡哆醇、烟酸、维生素e 等。其中多数维生索以辅酶的形式参与对机体代谢的 调节。 1 1 8 其它成分 食用菌通常含有组分复杂的风味物质( 包括酯、醇、有机酸、醛、羰基化合物等) ， 因而呈现浓郁的芳香。此外，一些食用菌还含有萜类、黄酮、生物碱等天然活性物质，使 食用菌还具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老等多种功效 食用菌既是一类高蛋白、低脂肪、营养价值很高的食品，同时，因其富含多糖、磷 脂、甾醇、维生素、萜类、黄酮类等天然活性成分而成为具有广阔开发前景的功能性食品。 1 2 常见食、药用真菌的种类、分类地位 目前研究得较多的真菌多糖大多来源于日常生活中常见的食用，药用真菌。本文摘 录具明显免疫调节活性的真菌多糖产生菌刀，采用a i n s w o r t h ( 1 9 7 1 ，1 9 7 3 ) 分类系统粥， 按界、门、纲、目、科、属、种等级依次排列，其分类地位分别为： 真菌门e u m y c o t a 子囊菌亚门a s c o m y c o t i n a 核菌纲p y r c n o m y c c t e s 麦角菌目c l a v i e i r ，i t a l c s 麦角菌科c l a v i e i p i t a e e a e 虫草属c o r d y e e p s ( f r ) l i n k 冬虫夏草c o r d y c e p ss i n e n s i s ( b e r k ) s a e e 担子菌亚门b a s i d i o m y c o t i n a 层菌纲h y m e n o m y c e t e s 有隔担子菌亚纲p h r a g m o b a s i d i o m y e e t i d a e 银耳目t r e m e l l a l e s 银耳科t r e m e l l a e e a e 银耳属曲e m e l l ad i l l e xf r 银耳t r e m e l l a f u c i f o r m i sb e r l 木耳目a u r i e u l a r i a l e s 木耳科a u r i c u l a r i a c e ；a g 木耳属a u r i c u l a r i ab u l le xm e r a t 黑木耳a u r i c u l a r i aa u r i c u l a ( 1 e xh o o k ) u n d c r w 4 第一章绪论 无隔担子菌亚纲h o l o b a s i d i o m y e e t i d a e 非褶菌目a p h y l l o p h o r a l e s 灵芝菌科g a n o d e r m a t a c e a e 灵芝菌属g a n o d e r m ak a r s t 灵芝g a n o d e r m al u c i d u m o e y s s e xf r ) k a r s t 猴头菌科h e r i c i a c e a e 猴头菌属h e r i c i u mp e t s 强g r a y 猴头菌h e r i c i u me r i n a c e u s ( b u l l ) p e r s 多孔菌科p o l y p o r a c e a e 侧耳属p l e u r o t u s ( f r ) k u m m e r 糙皮侧耳p l e u r o t u so s t r e a t u s ( j a e q e xf l ) q u e l 茯苓菌属m a e r o h y p o f i aj o h a n e tr y v 茯苓m a c r o h y p o r i ac o c o s ( s c h w ) j o h a n e tr y v 多孔菌属p o l y p o r u sm i e h e l i 懿f r 雷丸p o l y p o r u sm y l i t t a ec o o k ee tm a s s e 伞菌目a g a r i e a l e s 口蘑科t r i c h o l o m a t a e e a e 微香菇属l e n t i n u l ae a r l e 香菇l e n t i n u l ae d o d e s ( b e r k ) p e 酉e r 粪绣伞科b o l b i a e e a e 田蘑属a g r o c y b e 茶树菇a g r o c y b ec y l i n d r a c e a ( d c 麟f r ) i l m a i r e 牛肝菌目b o l e t a l e s 牛肝菌科b o l c t a c c a e 牛肝菌属b o l e t u sd i l l 麟f t 美味牛肝菌b o l e t u se d u l i sb u l l c xf t 茶树菇为真菌门、担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、伞菌耳、粪绣伞科、田蘑 属真菌。 1 3 真菌多糖研究概况 本节主要综述食用菌成分中含量丰富、且与免疫调节作用相关的真菌多糖( 食、药 用菌所产多糖) 的生物功效。 真菌多糖是一类存在于食用真菌中的多糖组分的总称。通常是由1 0 个以上的单糖以 糖苷键连接而成的高分子多聚物。近代对于食用菌药用价值的研究起源于2 0 世纪3 0 年 代。1 9 3 0 年，德国学者首先发现担子菌具有抑瘤活性。1 9 5 7 年，l u e a seh 发现美昧牛 肝菌可抑制小鼠肿瘤。1 9 6 9 年，日本学者千原首次报道从香菇子实体中分离到多糖类物 江南大学硕士论文 质一香菇多糖，并发现香菇多糖具有明显的抗肿瘤活性1 9 7 0 年。g o r oc h i h a r a 从香菇 子实体中分离出6 种多糖，并证明其中一种具有明显的抗肿瘤活性，命名为l c n t i n a n 。1 9 7 6 年，s a s a k i 发现以2m g & g 剂量腹腔注射香菇多糖对大鼠s 1 3 0 实体瘤的抑制率达8 3 ，水 解后的小分子香菇多糖的抑瘤活性可达9 0 l i u j 这些成果引起了医药界的普遍关注，此 后几乎每年均有关于真菌多糖的研究报告问世，真菌多糖也因此成为一个非常活跃的研究 领域。应建浙等人编著的中国药用真菌图鉴收集的具有抑瘤活性的真菌达2 1 1 种，包 括子囊菌5 科6 属共6 种，担子菌2 7 科7 4 属共2 0 4 种，半知菌1 种。 已知真菌多糖具有多方面的生物活性和功效，其中抗肿瘤活性成分主要是多糖和蛋 白多糖体，通常由1 0 - 2 0 个以上的单糖以糖苷键连接而成。具明显抗肿瘤活性的真菌多 糖种类很多( 超过1 0 0 种) ，其分子中的单糖组成，相对分子质量、分子结构千差万别，生 物学活性也不尽相同。它们可作为一类生物反应修饰剂，通过增强机体的免疫功能而间接 地抑制肿瘤生长，起到“扶正固本”的作用且无毒副反应【l “ 真菌多糖的免疫功效包括刺激mm 细胞的吞噬功能，提高1 - 细胞转化率，促进抗体 生成，提高血浆蛋白浓度，诱导产生干扰素，激活补体系统，提高细胞c a m p 浓度，清 除活性氧等，其中最主要的功能就是免疫调节活性l l “真菌多糖作为一种免疫调节剂， 可广泛应用于免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和肿瘤等疾病的临床辅助治疗。我国已应用于 临床的真菌多糖包括：灵芝多糖、香菇多糖、云芝多糖、猪苓多糖、猴头菇多糖、银耳多 糖等。此外，一些真菌多糖还被作为功能性食品的基料添加到保健食品中。 1 4 真菌多糖的免疫调节作用 真菌多糖的免疫调节作用表现在可广泛地刺激机体的特异性和非特异性免疫反应，改 善机体免疫系统，提高自体免疫力，起到。扶正固本”的作用。 1 4 1 真菌多糖对体液免疫的影响 研究发现，许多种真菌多糖具显著的体液免疫调节作用，影响的途径有【1 纠7 _ 1 9 , 3 ： 1 ) 促进b 淋巴细胞合成抗体( i g m 、i g g 、i g a ) ，提高体液免疫反应； 2 ) 增加溶血素的生成和脾细胞产生溶血抗体的能力； 3 ) 激活补体系统：补体是由肝细胞、巨噬细胞、肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生的具 有酶活性的一类蛋白质。补体系统的生物学活性包括细胞毒及溶菌、杀菌作用；调理作用； 免疫粘附作用；中和及溶解作用等。这些作用大多是由补体系统激活时产生的各种活性物 质( 主要是裂解产物) 发挥的 。、。， 1 4 2 真菌多糖对细胞免疫的影响 1 ) 对t 细胞的影响t 细胞为主要的介导细胞免疫的淋巴细胞，此外还参与免疫应答的调 节。 真菌多糖对t 细胞功能的影响常通过下列途径实现【1 6 2 0 , 2 3 , 3 8 】： 6 第一章绪论 ( i ) 促进c o n a 或p h a 诱导的淋巴细胞增殖反应； ( 2 ) 对t 细胞亚群起调节作用； ( 3 ) 增强迟发型超敏反应。 2 )对m 由细胞的影响m 由细胞( 巨噬细胞) 是又一类重要的免疫效应细胞。真 菌多糖对巨噬细胞的影响主要是激活巨噬细胞的功能，主要表现为【2 7 2 9 j4 5 1 ： ( 1 ) 明显提高巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数( s i 值) ； ( 2 ) 提高小鼠外周血中碳廓清的速度； ( 3 ) 提高m 由细胞的抗原递呈活性； ( 4 ) 拮抗免疫抑制剂( 如某些化疗药物) 对巨噬细胞功能的抑制 3 ) 对n k 细胞的影响n k 细胞( 自然杀伤细胞) 无需抗原刺激和抗体参与，而通过释放穿 孔蛋白e o f o 血1 ) 即能直接杀伤靶细胞，发挥其抗感染和抗肿瘤的功能，对淋巴瘤和白血病 细胞尤为有效由于其具有较广的抗瘤谱，因此在机体的免疫监视过程中至关重要。n k 细 胞还是一类重要的免疫调节细胞，通过分泌、释放细胞因子( 如i f n a ，i f n y ，t n f 等) 调节t 细胞，b 细胞及骨髓干细胞等的免疫功能，有助于维持机体免疫系统的自身稳定” 2 6 ，3 0 】 o 4 ) 对l a k 细胞的影响l a k 细胞( 淋巴因子活化的杀伤细胞) 是由i l 2 等细胞因予诱导产 生的一类大颗粒淋巴细胞，能够杀伤对n k 细胞敏感和不敏感的实体瘤细胞，具有广谱抗 肿瘤作用。其杀伤肿瘤细胞的机理与n k 细胞相类似，可释放穿孔蛋白导致靶细胞裂解， 且很少损害正常细胞。据报道，灵芝、猪苓、糙皮侧耳、香菇等真菌多糖均有增强l a k 细 胞功能的作用【2 l2 2 , 2 6 1 4 3 对细胞因子的调节作用 细胞因子是指主要由免疫细胞分泌的，能调节细胞生长分化，调节免疫功能、参与炎 症反应和创伤愈合等小分子多肽的总称。在机体的免疫应答过程中，细胞因子还参与调节 细胞间的相互作用。机体内与免疫过程密切相关的细胞因子有：白细胞介索( i l ) 、干扰素 ( i f n ) ，肿瘤坏死因子( i n f ) 等。 1 ) 白细胞介素佃l )白介素是由淋巴细胞，单核细胞或其它细胞产生的细胞因子，已见 报到的有i l l - i l l 8 ，主要参与调节细胞间相互作用，免疫应答，造血及炎症反应等。 能刺激巨噬细胞产生几- 1 而发挥免疫调节作用的真菌多糖有树舌多糖、黑柄炭角菌多 糖、灵芝多糖和香菇多榭”1 ，此外，冬虫夏草、薄盖灵芝、云芝、香菇、银耳等真菌多糖 均可促进产生i l - 2 ，从而调节机体的免疫功能f 3 4 ，3 5 , 姗 2 ) 干扰素0 圜n ) 干扰素是机体细胞受病毒等感染或被某些其它物质作用后机体细胞 内的刀f n 基因活化，编码产生的一类具有多种生物学活性的蛋白质，分为i f n q 、i f n b 、 i f n y 三类。其中前两类主要由白细胞、成纤维细胞等在病毒、细菌、多聚肌苷酸( p o l y d ， 多聚胞苷酸( p o l y c ) 等刺激诱导下产生n y 主要由受伴刀豆球蛋白( c o n a ) 或植物血凝素 7 江南大学硕士论文 ( p r a ) 刺激分化的t 细胞分泌，又称免疫i f n i f n 具有广谱的抗病毒，抗肿瘤和免疫调节 等作用 云芝多糖及糖肽、银耳多糖、槐耳多糖、金顶蘑多糖、香菇多糖、茯苓多糖、冬虫夏 草提取液均可诱生及促进刀p n y 的释放，提高i f n 的效价p “卯j 。 3 ) 肿瘤坏死因子( t n f ) t n f 是一类能够直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子，包括 t n f n 和t n f b 两类。t n y o 主要由巨噬细胞产生，n 盯9 由活化的t 细胞产生。两类 肿瘤坏死因子的作用相似，主要有m3 9 , 4 0 l ： ( 1 ) 杀伤或抑制肿瘤细胞； ( 2 ) 提高中性粒细胞的吞噬能力，增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用( a d c c ) ； ( 3 ) 抗感染； ( 4 ) 引起发热； ( 5 ) 促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化。 羧甲基茯苓多糖、冬虫夏草提取物，香菇多糖等均可促进t n f 产生。 1 5 真菌多糖的抗肿瘤活性 抗肿瘤免疫效应一般以细胞免疫为主，但对病毒诱发的肿瘤，体液免疫也起重要作用 参与抗肿瘤免疫的细胞有t 细胞、b 细胞、n k 细胞、l a k 细胞、m 由细胞等。细胞免疫 分子有i l 、t n f 和i f n 等 真菌多糖类物质在抗肿瘤免疫过程中有其独特的优势，与放疗、化疗、手术等治疗方 法合用时，具有“减毒增敏”效应。不但可增强疗效，还能减轻放疗、化疗、手术等对机 体的损伤，减少其毒副作用，延长肿瘤病人的生存时间，并提高其生活质量。这些作用是 通过调节荷瘤机体的免疫功能而实现的，涉及多种免疫成分和免疫途径，包括体液免疫， 细胞免疫以及有免疫功能的多种细胞免疫分子等而共同达到其抑瘤效应的多糖在发挥抑 瘤作用时无特定的量效关系，通常在中等剂量时显现疗效，而在大剂量时反而抑制机体正 常的免疫功能，表现出双向调节的特点 已见报道的具有抑瘤活性的真菌多糖包括；糙皮侧耳多糖、木耳多糖、茶树菇多糖、 香菇多糖、猪苓多糖、茯苓多糖、银耳孢子多糖、金针菇多糖、斜顶菌多糖、短裙竹荪多 糖、灵芝多糖、黑柄炭角菌多糖、灰树花多糖、壳菌多糖等【4 卜4 卯。 此外，许多真菌多糖还可拮抗肿瘤化疗药物( 如环磷酰胺c p 等) 对机体免疫功能的抑制 作用1 4 6 1 。 1 6 真菌多糖免疫活性的影响因素 真菌多糖的活性与其相对分子质量，化学结构、溶解度等因素有关【4 7 ，4 引。但对于多糖 的上述理化性质与其活性间的关系知之较少，目前的认识仅限于如下方面： 1 ) 中等相对分子质量的多糖，其生物活性作用最明显，超过了过高或过低相对分子 质量的活性多糖。 8 第一章绪 论 2 1 有免疫调节活性的真菌多糖主要为葡聚糖，甘露聚糖、肽聚糖和杂多糖等。此类 多糖的结构中常含b - 0 - 3 ) 键的主链及b - ( 1 - - 6 ) 键、b - 0 - 3 ) 键的分枝。其共同的特点是 具有p 一螺旋结构的多糖有较强的生物活性，若螺旋型的主体构型被破坏，多糖活性会明显 下降； 3 ) 多糖的溶解性对其活性有重要影响，若多糖的水溶性提高，其生物活性也随之加 强。一些变性试剂引起的多糖溶解度和旋光度的改变，也会影响其免疫活性； 4 ) 含有蛋白质的多糖其结合蛋白常会减弱其活性，经蛋白酶处理后，多糖活性会有 所提高。对于一些杂多糖，硫酸酯是重要的活性基团 1 7 真菌多糖的研究热点 我国幅员广阔，气侯、地形多变，真菌资源丰富。据统计，传统药用、试验药用， 试验药效显著及民间药用的真菌约有3 8 7 种，分属5 l 科1 3 7 属。许多真菌多糖具有免疫 调节、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等多方面的生物活性，其中最主要的活性就是免疫调节活性。 真菌多糖作为一种免疫调节剂，已广泛应用于免疫缺陷疾病、自身免疫疾病及肿瘤等疾病 的临床辅助治疗，并成为临床常用药品。 但由于真菌多糖成分复杂、分离、纯化困难，相对分子质量不均一，使一系列研究 工作进展较慢。目前对真菌多糖的研究主要集中在以下三个领域： 1 ) 利用现代化的分离，提纯和分析手段对真菌多糖进行分离纯化和结构、性质分析。 目前研究的真菌多糖大多还是杂多糖，对其生理功效的研究多停留在整体或细胞水平。 2 ) 利用确切的免疫指标分析其生物活性及免疫机理，探讨真菌多糖与其靶细胞之间 的分子机制，如参与反应的靶细胞和膜受体以及整个反应的细胞机制等等。 3 ) 深入研究真菌多糖抗肿瘤，抗自身免疫病等药理作用的机理，了解真菌多糖的量 效关系和构效关系。 1 8 茶树菇概述 茶树菇 a g r o c y b ee y l i n d r a c e a ( d c 既f r ) i t m a i r e ，又名杨树菇，柱状田头菇等，是 温带至亚热带地区从春季至秋季生长的一种木生食用菌，主要分布于南欧、北美洲东南部、 中国和日本早在2 0 世纪5 0 年代法国就开始了茶树菇的栽培研究，日本也从2 0 世纪7 0 年代开始报道有关茶树菇的人工栽培技术我国自1 9 7 2 年在福建首次发现野生种菇后， 又相继报道茶树菇在江西、贵州、云南、四川、吉林、江苏、辽宁、浙江、广西、台湾等 地均有分布。2 0 世纪8 0 年代我国也开始了对茶树菇野生品种的驯化以及规模化人工栽培 的研究。 茶树菇因味道鲜美、气味香浓，盖肥柄脆而深受市场欢迎，是一种食用价值很高、 兼有药用价值的伞菌。茶树菇子实体的蛋白质含量占干重的2 7 5 3 4 1 ，还含有游离 氨基酸，这些氨基酸使茶树菇呈现浓郁的鲜昧。茶树菇含有多种挥发性香味物质，包括酯 类、醇类、醛类、羰基化合物、有机酸等。茶树菇多糖含量很高，达干重的3 0 4 0 ， 主要成分为( 1 3 ) - - d - 葡聚糖，主要糖组成为葡萄糖，此外还含有半乳糖、甘露糖、木 9 江南大学硕士论文 糖，鼠李糖及阿拉伯糖等。 同时，茶树菇也是一种药用真菌，福建的闽西北地区，民间常用茶树菇治疗胃冷、肾 炎水肿、腰酸痛等，中医用作利尿、渗湿、健脾、止泻等 1 9 本研究目的 现代研究发现，食用菌所含多糖常有调节人体免疫作用、抗肿瘤、抗氧化、降血糖 等多重功效，而对于茶树菇多糖的生物活性研究国内还鲜有报道。本文将从调节人体免疫 作用、抗肿瘤两个方面探讨茶树菇提取物中多糖的生物活性。选取与机体抗肿瘤过程密切 相关的免疫指标进行检测，以获取茶树菇提取物免疫调节作用和抗肿瘤作用第一手资料， 为茶树菇多糖的进一步开发、应用提供依据。 1 1 0 本研究内容 本研究工作主要有以下三个方面； 一、应用化学分析和仪器分析方法，分析茶树菇提取物，确定茶树菇提取物中的主 要成分、各成分的组成及含量； 二、选用适当的免疫指标，检测茶树菇提取物的免疫调节作用； 三、建立荷瘤动物模型，检测茶树菇提取物的抑瘤作用。 1 0 第二章茶树菇提取物的组分分析 2 1 引言 第二章茶树菇提取物的组分分析 食用菌是营养丰富并兼有食疗价值的食品。近年来，食用菌作为一种绿色食品1 3 益受 到重视，对食用菌的食用、药用价值的研究越来越深入。国内外学者关于食、药用真菌成 分分析的研究报导很多，本章拟对食用菌一茶树菇所含成分进行较全面的测定和分析，旨 在为更好地利用该食用菌资源、开发其药用价值提供依据 2 2 材料 茶树菇提取物购于浙江金元真菌多糖制品有限公司。 2 3 主要仪器和试剂 7 2 1 型分光光度计上海第三分析仪器厂产品 a g i l e a t1 1 0 0 液相色谱仪美国a 百l e n t 公司产品 f i n n i g a nt r a c em s 气相色谱一质谱联用仪 美国f i n n i g a n 公司产品 岛津g c 一1 4 a 气相色谱仪 日本岛津公司产品 s p e c t m a a 2 2 0 火焰原子吸收分光光度仪 美国v 撕a n ( 瓦里安) 公司产品 s p e e t r a a a 2 2 0 z 石墨炉原子吸收分光光度仪 9 乏1 5 1 龇( 瓦里安) 公司产品 标准葡萄糖( 5 0 0 9 g ) 重庆北碚化学试剂厂 氯仿( 5 0 0 m l 瓶)宜兴市钮家助剂厂 正丁醇( 5 0 0 n d 瓶)上海化学试剂有限公司 苯酚c 5 0 0 9 瓶) 上海化学试剂公司 硫酸( 5 0 0 m v 瓶) 宜兴市洋溪镇徐渎化工厂 2 4 主要方法 2 4 1 茶树菇提取物的常规分析 茶树菇提取物的常规分析方法参照食品卫生国家标准阻删。 1 ) 水分质量分数测定 准确称取3 0 0 5 0 0g 样品于己恒重有盖的玻璃称量瓶中，置于1 0 0 1 0 5 干燥箱 中，2h 后取出，于干燥器中冷却3 0m i n 后称重，重复操作，直至二次质量差不超过0 0 0 2 g 为止 水分( ) = ( m l m 2 ) ，m 样& m l 。恒重前称量皿和样品质量： m 2 。恒重后称量r i l l 和样品质量 江南大学硕士论文 m # _ 。样品质量。 2 ) 灰份质量分数测定 准确称取2 o o 5 0 0g 样品于已恒重的瓷坩埚内，于电炉上小心炭化至无烟，移入 5 5 0 6 0 0 高温炉中至白色灰烬为止将坩埚移入干燥器中，冷至室温称重。重复操作， 至前后质量相差不超过0 0 0 2g 为止 灰份( ) = ( m 3 一m i ) ，m 并a m 3 。坩埚加灰份质量； k ；空坩埚质量； m 样b 。样品质量。 3 ) 蛋白质质量分数测定 取样品0 5 2 0g 于1 5 0m l 凯氏烧瓶中，加入k 2 s o | 3g ，c u s o , lg ，浓k ：s o , 1 5 2 0m l 硝化，硝化至透明无黑粒呈蓝绿色后继续加热3 0m i n 后，停止硝化冷却。 将全部样品移至5 0m l 容量瓶，洗涤多次，定容至5 0m 1 取试液5m l 于凯氏蒸馏器中，加入质量分数为4 0 的n a o h 溶液l om 1 ，三角瓶中以 2 5m l3 硼酸溶液吸收，吸收液以1 甲基红一溴甲酚绿混合液为指示剂，注意吸收完全。 将吸收液以0 1m o l k 的h c i 标准溶液进行滴定至指示剂变色。同时作空白对照试 验。 蛋白质( ) ；( v - 1 5 ) 0 0 1 4 x 1 0 0 i o x 6 2 5 m # _ 。h c i 标准溶液的摩尔浓度； 矿。样品测定时h c i 标准溶液的体积； 。空白对照时h c l 标准溶液的体积。 4 ) 粗脂肪质量分数测定 取样5 8g 于严密的滤纸包内，置于索氏抽提器中。取已恒重的平底烧瓶，加入i 0 0 m l 沸程3 0 6 0 的石油醚于样品上部加入抽提器中，连接冷凝管，在水浴6 5 时回流 6 8h ，回收所有石油醚，将脂肪瓶置于1 0 0 c 恒温箱中恒重3h ，称取其质量。 粗脂肪( ) = ( ms - - m6 ) m 样a m 5 。恒重后( 空瓶+ 粗脂肪) 质量： r f l6 。空瓶质量； m # a ，样品质量 5 ) 粗纤维质量分数测定 取样1 0g 于圆底回流烧瓶中，加入1 0 0m l 酸性洗涤剂溶液( 2 0g 十六烷基三甲基 溴化铵溶解于0 5m o l l 硫酸溶液1 0 0 0m l 中) ，接上回流管，在i 0m i n 内使溶液烧沸， 注意火力避免大量泡沫。从沸腾开始计时6 0m i l l ，立即以已恒重的玻璃砂芯漏斗( 2 4 滤片) 减压抽滤，以9 0 1 0 0 热水洗涤3 次，抽干后以丙酮洗涤3 次。除尽丙酮，于1 0 0 恒温箱中干燥3h ，称重。 1 2 第二章茶树菇提取物的组分分析 粗纤维( ) = ( m7 一ms ) m 怦5 m ，残渣质量+ 砂芯漏斗质量； ms ，空砂芯漏斗质量； m # b ；样品质量。 6 ) 多糖质量分数的测定 采用苯酚一硫酸法测定嘲5 2 1 。 1 ) 葡萄糖标准曲线制作精确称取烘干( 1 0 0 c ，2 3 h ) 至恒重的葡萄糖1 0 0m g ，用 蒸馏水定容至1 0 0m l ，配制成标准溶液取上述标准溶液分别稀释成 0 0 4 ，0 0 6 ，0 0 8 ，o 1 0 ，0 1 2m g m l 葡萄糖溶液，各取2n 1 1 分别注入d2 0m m 的玻璃具塞试 管中，试管编号依次为l 5 号。在冰水水浴中，1 5 号各度管小心注入9 8 浓硫酸溶液 5n d ，6 苯酚溶液2n l l ，摇匀，置沸水浴中加热l or a i n ，然后移入冰水水浴。将l 5 号试管内的反应液分别移入比色杯中，置7 2 1 分光光度计测o d 4 9 0 值，绘制标准曲线并求 出回归方程。 2 ) 多糖质量分数计算参照苯酚硫酸法，测定粗多糖的o d 4 值，通过标准曲线 计算得出粗多糖的质量分数 2 4 2 氨基酸分析 采用液相色谱分析法。 1 ) 分析原理 安捷伦1 1 0 0 液相色谱分析氨基酸的工作原理( 柱前衍生) ：具有不同r 基团的氨基酸 与邻苯二甲醛( 0 p a ) 自动衍生化反应 木脯氨酸是与氯甲基甲酯( f m o c ) 反应 后，不 同的氨基酸都能生成唯一的衍生产物( 产物具有紫外和荧光吸收) 。衍生物经c 1 8 柱分离、 检测，外标法定量。 2 ) 色谱条件 c 1 8 柱4 0m m x l 2 5h i m 柱温 4 0 流速 1 0m l m i n 波长3 3 8n m p2 6 2n m ( p r o ) 流动相a ：2 0m m o l 醋酸钠溶液 b ：2 0m m o l 醋酸钠溶液：甲醇：乙腈= l ：2 ：2 ( v v ) 3 ) 样品预处理 精确称取样品3 6 6 5m g 于特别水解管中，加入6 nh c l8m l ，抽真空维持1 0m i n ， 封口在1 1 0 c 篚j 烘箱内水解2 4 小时。取出冷却后，小心全部转移至2 5 m l 容量瓶中定容至 刻度，摇匀。用双层滤纸过滤。取滤液1 m 1 于2 5m l 小烧杯中。在真空干燥器中蒸干( 约 4 0 2 ) ，将小烧杯取出加入0 0 2 nh c l1m l ，在空气中放置3 0m i n 后搅拌均匀，此液上 江南大学硕士论文 机测定氨基酸含量。 2 4 3 挥发性成分分析 采用顶空固相微萃取气质联用法嘞1 1 ) 样品处理 先将萃取头在气相色谱的进样口老化，老化温度为2 5 0 c ，载气流量为0 8m l m i n ， 分流比5 0 ：1 。老化时问2h 。 取2g 样品迅速放入1 5n l l 样品瓶中，盖上盖子备用。 将固相微萃取器的萃取头插入样品瓶中，推出纤维头，注意不要使萃取头碰到样品。 4 5 c 吸附4 0m i n 。随后抽回纤维头，从样品瓶上拔出萃取头，再将萃取头插入气质联用 仪的气相色谱进样口，推出纤维头，于2 5 0 c 解吸2m i n ，抽回纤维头后拔出萃取头， 同时启动仪器采集数据 2 ) 色谱条件 0 v1 7 0 1 石英毛细管色谱柱，柱长3 0m ，内径0 2 5 彻，液膜厚度o 2 5 m ，载气 h e ，流速0 8m l m i n ，不分流，进样口温度2 5 0 c ，接口温度2 5 0 c ，起始柱温3 6 c ， 保持2m i n ，以5 c m i n 至6 0 ，无保留；再以1 0 m i n 至1 0 0 c ，无保留：再以1 8 m i n 至