生物分子纯化技术的最新突破(pdf38)(2).pdf

1 生物分子纯化技术的最新突破 通用电气中国医疗集团 施纯辉 shun-fai.sze 2 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 内容介绍 公司介绍 生物分子纯化为何变得重要 液相色谱为什么成为生物分子纯化的关键技 术 液相色谱技术纯化生物分子如此快速简易 融合蛋白质 单抗 非融合蛋白质 生物分子纯化对液相色谱系统的非一般要求 3 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 从基因分析到蛋白质 功能研究完整技术平台 从基因分析到蛋白质 功能研究完整技术平台 GE Healthcare Biosciences 4 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 光辉历史光辉历史 General Electric 公司成立于公司成立于1892年，创始人爱迪生年，创始人爱迪生 GE公司成立一百多年来，获得了公司成立一百多年来，获得了2个诺贝尔科学奖和个诺贝尔科学奖和60000 多项世界专利多项世界专利 目前目前GE公司拥有公司拥有4050亿美元资产，亿美元资产，34万员工，在万员工，在26个国家 有 个国家 有270家工厂，业务遍及全球家工厂，业务遍及全球150多个国家和地区多个国家和地区 连续六年连续六年(99,00,01,02,03,04)被金融时报评为世界上最 受尊敬的公司 被金融时报评为世界上最 受尊敬的公司 连续六年连续六年(99,00,01,02,03,04)被财富杂志评为全球最受 推崇的公司 被财富杂志评为全球最受 推崇的公司 GE是道琼斯工业指数自是道琼斯工业指数自1896年设立以来唯一一家仍在工业 指数榜上的公司 年设立以来唯一一家仍在工业 指数榜上的公司 2 5 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 GE经营经营6个业务集团个业务集团 工业工业 6个业务集团均可名列财富杂志世界个业务集团均可名列财富杂志世界500强强 工业工业 基础设施 商业金融 消费者金融 医疗 基础设施 商业金融 消费者金融 医疗/生 物技术 生 物技术 全国广播公司全国广播公司 -环球环球 NBC-Universal 6 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 treat detect predict pinpoint 新成立的新成立的 GE Healthcare 7 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 GE Healthcare 目标目标 共同努力开创一个医疗新时 代，那时对疾病将有更好地 了解。疾病将在其更早的阶 段被发现和诊断。治疗方案 因人而异，使疾病得到更有 效地治疗，因此每一个人都 可以达到生命之最，尽情享 受生活。 共同努力开创一个医疗新时 代，那时对疾病将有更好地 了解。疾病将在其更早的阶 段被发现和诊断。治疗方案 因人而异，使疾病得到更有 效地治疗，因此每一个人都 可以达到生命之最，尽情享 受生活。 8 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 共同跨入医疗新时代共同跨入医疗新时代 21st世纪医疗新时代世纪医疗新时代 预测诊断悉知治疗 3 9 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 Biosciences的历史 LKB 电泳发明者 Pharmacia (发玛西亚) 层析技术开创者 Amersham Biosciences(安玛西亚) 提供基因组、蛋白组学研究整体解决方案 GE Healthcare / Biosciences 实现从发现到功能研究，从体外到体内的突破 10 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 生命科学研究的方向：功能生物学研究 100,000 proteins 3 billion bases 35,000 genes 100s of tissues and organs 1 trillion cells A unique individual 功能生物学研究功能生物学研究: 确定基因和蛋白质在细胞中的作用和机理确定基因和蛋白质在细胞中的作用和机理 11 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 2D Ettan DIGE MDLC Ettan LC 从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台 Ettan KTA BIAcore AKTA MegaBACE SNuPe CodeLink Gene expression analysis Protein analysis Protein Purification DNA sequencing Cellomics 蛋白质差异表达 分析系统 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 蛋白质差异表达 分析系统 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 活体检测活体检测 Molecular Imaging InCell Locus Vista Optix 细胞水平 功能研究 细胞水平 功能研究 12 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 2D Ettan DIGE MDLC Ettan LC 从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台 Ettan KTA BIAcore AKTA MegaBACE CodeLink SNuPe Gene expression analysis Protein analysis Protein Purification DNA sequencing Cellomics 蛋白质差异表达 分析系统 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 蛋白质差异表达 分析系统 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 活体检测活体检测 Molecular Imaging InCell Locus Vista Optix 细胞水平 功能研究 细胞水平 功能研究 4 13 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 2D Ettan DIGE MDLC Ettan LC 从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台 Ettan KTA BIAcore AKTA MegaBACE SNuPe CodeLink Gene expression analysis Protein analysis Protein Purification DNA sequencing Cellomics 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 活体检测活体检测 Molecular Imaging InCell Locus Vista Optix 细胞水平 功能研究 细胞水平 功能研究 蛋白质差异表达 分析系统 蛋白质差异表达 分析系统 14 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 2D Ettan DIGE MDLC Ettan LC 从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台 Ettan KTA BIAcore AKTA MegaBACE SNuPe CodeLink Gene expression analysis Protein analysis Protein Purification DNA sequencing Cellomics 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 活体检测活体检测 Molecular Imaging InCell Locus Vista Optix 细胞水平 功能研究 细胞水平 功能研究 蛋白质差异表达 分析系统 蛋白质差异表达 分析系统 15 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 2D Ettan DIGE MDLC Ettan LC 从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台 Ettan KTA BIAcore AKTA MegaBACE SNuPe CodeLink Gene expression analysis Protein analysis Protein Purification DNA sequencing Cellomics 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 活体检测活体检测 Molecular Imaging InCell Locus Vista Optix 细胞水平 功能研究 细胞水平 功能研究 蛋白质差异表达 分析系统 蛋白质差异表达 分析系统 16 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 2D Ettan DIGE MDLC Ettan LC 从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台 Ettan KTA BIAcore AKTA MegaBACE SNuPe CodeLink Gene expression analysis Protein analysis Protein Purification DNA sequencing Cellomics 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 功能蛋白研究 蛋白质纯化 基因分析研究 活体检测活体检测 Molecular Imaging InCell Locus Vista Optix 细胞水平 功能研究 细胞水平 功能研究 蛋白质差异表达 分析系统 蛋白质差异表达 分析系统 5 17 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 2D Ettan DIGE MDLC Ettan LC 从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台从基因分析到蛋白质功能研究的完整技术平台 Ettan KTA BIAcore AKTA MegaBACE SNuPe CodeLink Gene expression analysis Protein analysis Protein Purification DNA sequencing Cellomics 功能蛋白研究功能蛋白研究 蛋白质纯化蛋白质纯化 基因分析研究基因分析研究 活体检测活体检测 Molecular Imaging InCell Locus Vista Optix 细胞水平细胞水平 功能研究功能研究 蛋白质差异表达蛋白质差异表达 分析系统分析系统 18 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 生物技术正推动第四次产业革命 “有人说21世纪是中国人的世纪，也有人说21世纪是生物技术的世纪。我想说，21世纪是 中国人发展生物技术最好的时代。”科技部生物技术发展中心主任王宏广表示。 11月4日至6日，包括诺贝尔生理及医学奖评委会前主席古斯塔夫森在内的海内外生物技术 专家及产业巨头近千人，聚首天津滨海新区“2005中国泰达生物论坛”，就“生物经济、人类 生存与可持续发展的选择”进行深入研讨。 与会官员和专家表示，一些发达国家已把生物产业作为国际科技乃至经济竞争的制高点， 并将其发展提到战略高度。我国也要“争取在未来十年内，使生物技术的整体水平跻身世界先 进行列，使生物技术产业发展成为中国的支柱产业之一”。 “对风险投资者来讲，如果想今天赚钱就投信息产业，如果想明天赚钱就投生物产业。如 果想赚小钱就投信息产业，想赚大钱则要投生物产业”。王宏广这样形容生物产业的发展前景 。统计表明，在世界范围内，生物技术产业的销售额约每5年翻一番，增长率高达25%-30%，是 世界经济增长率的10倍左右。 随着科学技术的高速发展，生物技术及其产业进入了一个全新的发展阶段，发展势头十分 迅猛，已经成为当今高新技术群体中最富有活力的领域之一。生物技术在解决粮食问题、缓解 能源危机、改善资源环境、保证食品安全、提高人类健康水平等方面发挥着越来越重要的作用 。以生物技术为重点的第四次产业革命正带动农业、医药、食品、化工、环保等众多领域的共 同进步。 (来自中国高新技术产业导报) 19 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 生物经济强国战略 天津市市长戴相龙在论坛上指出，我国的生物技术产业面临重大发展机遇，发展时机已经 成熟，经过不懈努力，完全能够抢占生物科技的一些制高点，形成一批拥有自主知识产权的知 名品牌。 我国有世界上最大的市场，而且人才资源优势明显。目前，中国平均研究一种新药只需500 万欧元，大约是国外的1/30，药物研发总费用不足国外的1/5。而且，中国在生物研究领域也很 先进，著名科学刊物上生物技术方面的论文25%来自华裔科学家。 在生物技术领域，我国已列出10大领域、35类关键技术，力争培育1000多家大型企业，以 实现生物经济强国战略。 国家发改委高技术产业司副司长綦成元表示，未来我国将重点发展新兴疫苗、小分子药、 新兴中药、高产优质农作物、生物农药、生物制药业、生物能源、环境生物技术。同时，扩大 生物技术产业链，发展生物材料。 (来自中国高新技术产业导报) 20 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 国外生物制药行业状况 目前美国和欧洲分别拥有生物技术公司1300家和700家。 在美国，已批准上市的产品有 重组-1干扰素、重组-2a干扰素、重组-2b干扰素、重组-1a干扰素、 重组-1b干扰素、重组-1b干扰素、重组白介素-2、重组白介素-11、 重组红细胞生成素、重组人胰岛素、重组人粒细胞集落刺激因子、 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组组织型纤溶酶原激活物、 重组血小板源性生长因子、重组a因子、重组人因子、重组人因 子、 重组人生长激素、重组链球菌DNA酶、重组乙型肝炎疫苗、 重组乙型肝炎核心抗原、 重组抗CD20单抗、 重组抗白介素-2受体抗体、 重组抗癌胚抗原抗体、重组-葡糖脑苷脂酶、重组干细胞因子等等。 700种生物技术药物正在进行临床研究和FDA评估 还有700种药物在早期研究阶段 200种以上产品已到最后批准阶段(期临床与FDA评估) 6 21 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 我国批准上市的生物工程药物已有17种 还有各类疫苗 40 余种 1997HGH1997IFN- 2b 2005TPO1997b- FGF1997IFN- 2a 2004rSAK1997EPO1996EGF 2003TNF1997GM- CSF1996IFN- 2002ProUK1997G- CSF1996rSK 1998Insulin1997IL- 21989IFN- 1b 22 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 为何选择液相色谱(层析)作为生物分子 纯化方法？ 不产生热 不产生外力 高回收率 高分辨率 线性放大，可预期 可自动化 大量成功例子 23 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 融合蛋白质的纯化 His GraviTrap His GraviTrap Kit His Buffer Kit 7 25 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap 自然沉降方式操作 快速简便 (即使没有任何液相色谱系 统也可以在 20 分钟内纯化蛋白质) 适合从澄清或未澄清样品中纯化出 最多 50 mg 小量体积的组氨酸标记 蛋白质 内装有 Ni Sepharose 6 Fast Flow 比市场上同类凝胶高出 4 倍载量 26 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap 快速简便 His Buffer Kit 缓冲溶液套装 His GraviTrap 包装可转化成工作台 LabMate 选购件： 加长装置 27 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap Kit His GraviTrap Kit 包括 20 His GraviTrap 沉降柱和 His Buffer Kit + 28 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap 快速简便 1. 平衡2.上样3. 冲洗4.洗脱 8 29 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap 在天然 条件下快速纯 化 Method: Equilibration: 10 ml binding buffer Sample application: 10 ml clarified E. coli BL-21 lysate containing 8 mg GFP-(His)6 Wash 1: 10 ml wash buffer Wash 2: 5 ml wash buffer Elution 1: 3 ml elution buffer Elution 2: 3 ml elution buffer Elution 3: 3 ml elution buffer 30 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap 快速纯化，洗脱体积小， 天然 条件 His GraviTrap 1.Low molecular weight markers 2.Start material (dil. 1:10) 3.Flow-through (dil. 1:10) 4.Wash 1 5.Wash 2 6.Eluate 1 7.Eluate 2 Ni-NTA Superflow column 8.Flow-through (dil. 1:10) 9.Wash 1 10.Wash 2 11.Eluate 1 12.Eluate 2 13.Eluate 3 31 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap - 变性 条件下纯化 Method: Equilibration: 10 ml binding buffer Sample application: 10 ml clarified E. coli BL-21 lysate containing 8 mg MBP-(His)6 Wash 1: 10 ml binding buffer Wash 2: 10 ml binding buffer Elution 1: 3 ml elution buffer Elution 2: 3 ml elution buffer 32 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap 变性 条件下纯化 Ni-NTA Superflow column 1.Low molecular weight markers 2.Start material (dil. 1:20) 3.Flow-through (dil. 1:20) 4.Wash 1 5.Wash 2 6.Eluate 1 (dil. 1:10) 7.Eluate 2 (dil. 1:10) His GraviTrap 8.Flow-through (dil. 1:20) 9.Wash 1 10.Wash 2 11.Eluate 1 (dil. 1:10) 12.Eluate 2 (dil. 1:10) 9 33 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap 蛋白质结合载量高 Method: Equilibration: 10 ml binding buffer Sample application: 35 ml clarified E. coli BL-21 lysate containing 40 mg GFP-(His)6 Wash: 20 ml binding buffer Elution: 5 ml elution buffer 1. Low molecular markers 2. Start material (diluted 1:10) 3. Flow-through (diluted 1:10) 4. Wash (diluted 1:10) 5. Eluate (diluted 1:10) 34 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap 直接从未澄清细胞裂解 液中纯化 35 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap 未澄清样品准备 稀释沉淀细胞. 加入溶解酶和 DNAse 进行酶裂解 机械性裂解如超声破碎，匀浆化或冻融. 调整裂解物的 pH 注意: 稍微延长机械性裂解的时间, 如超声破碎 10 分钟 36 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap -直接从未澄清细胞裂解 液中纯化 10 37 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap -直接从未澄清细胞裂解 液中纯化 Unclarified sample 1.Low molecular weight markers 2.Start material, 20 ml (dil. 1:10) 3.Flow-through, 20 ml (dil. 1:10) 4.Wash , 20 ml 5.Eluate, 20 ml 6.Start material, 10 ml (dil. 1:10) 7.Flow-through, 10 ml (dil. 1:10) 8.Wash, 10 ml 9.Eluate, 10 ml Clarified sample 10.Start material (dil. 1:10) 11.Flow-through (dil. 1:10) 12.Wash 13.Eluate 38 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 His GraviTrap 高分子量(Histidine)10-标记蛋白质 的快速单步纯化 1. High molecular weight markers4. Eluate 1 2. Start material (diluted 1:20)5. Eluate 2 3. Flow-throughl (diluted 1:20)6. Negative control, (JM109 non-transformed) 39 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 Ni Sepharose 6 Fast Flow 兼容性 还原剂还原剂5 mM DTE 5 mM DTT 20 mM -mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione 变性剂变性剂8 M urea 6 M Gua-HCl 清洁剂清洁剂2% Triton X-100 (nonionic) 2% Tween 20 (nonionic) 2% NP-40 (nonionic) 2% cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic) 40 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 Ni Sepharose 6 Fast Flow 兼容性 其它添加剂其它添加剂500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na2SO4 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate 缓冲溶液缓冲溶液50 mM sodium phosphate, pH 7.4 100 mM Tris-HCl, pH 7.4 100 mM Tris-acetate, pH 7.4 100 mM HEPES, pH 7.4 100 mM MOPS, pH 7.4 100 mM sodium acetate, pH 4 11 41 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 几乎可忽略的镍离子掉落 凝胶凝胶Ni2+掉落掉落 Ni Sepharose 6 Fast Flow99.8 % 纯度 63 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 允许直接粗提层析 任何多增加的步骤会降低产量，增加生产成本 以其他层析技术取代 Protein A 如阳离子交 换，疏水层析等需要最少多加一步交换缓冲溶 液/脱盐的步骤 64 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 有效的病毒去除和灭活步骤 Protein A 层析步骤病毒清除率层析步骤病毒清除率 + 低低 pH 灭活已经验证 可减少 灭活已经验证 可减少 7-8 log 病毒病毒 FDA study by Kurt Brorson (J. Chromatography A, 989 (2003) 155-163)argues that there is no need for validating function of used resins ”we propose that virus removal validation studies should be performed on new media only”. The basis for this recommendation is that they have shown that the function of a A Protein A resin would deteriorate prior to loss of virus clearance function. This is in contrast to other media (IEX) where the function of the ligand is related to the viral clearance capability. 17 65 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 适用于所有人源的 (非 IgG3) 抗体和 Fc 融 合蛋白质 在一个生产多个不同产品的合同生产机构或产 品开发部门来说意味着工作较简单, 只需使用 4- 5 种缓冲溶液/实验条件即可纯化 10 种不同单 抗，而不是 15-25 种缓冲溶液。 66 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 Protein A 非毒性 新数据证明 Protein A (和 SuRe 配基) 是 非毒性非毒性, 非致癌或非致突非致癌或非致突. SuRe 的推出是拥有大量毒性研 究和参考文献支持的. 67 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 为什么 Protein A -可以进行直接粗提层析可以进行直接粗提层析 - 高产量 - 快速转化成稳定中间物 (去除蛋白酶) - 无可比拟的选择性. 一步到99.8 % 纯度 - 高载量高载量 - 大量有效放大例子大量有效放大例子 - 已经证明有效的病毒去除已经证明有效的病毒去除/灭活步骤灭活步骤 - 非常灵活和传统的工艺非常灵活和传统的工艺 不受添加剂, pH 和电导的变化影响 - 适用于所有人源的 (非 IgG3) 抗体和 Fc 融合蛋白质 - 使用使用 MabSelect SuRe 凝胶凝胶, 透过非常简单的在位清洗和消毒步骤就可以 有效延长工作寿命 透过非常简单的在位清洗和消毒步骤就可以 有效延长工作寿命 - 18 (全部共全部共 19) 个美国通过药审的单抗产品都使用个美国通过药审的单抗产品都使用 Protein A 纯化纯化. MabSelect Xtra 和 MabSelect SuRe 引领抗体纯化技术的前沿 18 69 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 单抗作为治疗药物 10,000 升的发酵规模 表达水平增加之 1-5 g/L 细胞培养基成分趋向简单 主要杂质为宿主细胞蛋白质, DNA 和工艺过程产生的 污染物 层析法粗提技术 高通量 高载量 高纯度, 回收率及产量 巨大的挑战 单抗的粗提 70 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 MabSelect 家族 100-100-100- 71 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 适用的空柱 空柱内径柱体积柱高空柱内径柱体积柱高 (mm)(cm) 实验室规模实验室规模: XK 16/401616 60 ml8 - 30 生产规模生产规模: BPG1003000.8 21 L10 - 30 BioProcess 10012000.8 339 L10 - 30 CHROMAFLOW 4002000 13 942 L10 - 30 72 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 经济有效的在位清洗工艺经济有效的在位清洗工艺 0.1-0.5 NaOH 19 73 / 生物分子纯化技术的最新突破 / NaOH 清洗有什么好处? -在位清洗 CIP 和在位消毒 SIP 的金科玉律 -消除 carry-over -经济安全, 无需额外处理或 QC 成本 74 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 40 分钟GuHCl 3 小时GuHCl 经过磷酸在位清洗300 循环的 凝胶 0.1 M NaOH 处理处理 40 分钟3 小时 在位清洗 CIP 步骤的效率 75 / 生物分子纯化技术的最新突破 / EDABCX MSsEDABCX MSs Immunoglobulin binding domains N11 N21 N23 N43 N52 N6 N3 N28 天门冬酰胺-碱性下最不稳定氨基酸 Asn Gln His 提高碱稳定性 - 用蛋白质工程方法取代 Asn 残基 - 研究 B 区的不同 Asn 取代对提高碱性稳定性的影响，IgG 主要和 Protein A 的 B 区结合 碱性条件下保持稳定 金黄色葡萄球菌 Protein A 76 / 生物分子纯化技术的最新突破 / MabSelect SuRe 设计 每区取代 8 个位置上的天门冬酰胺 有四个相似区域的四聚体 单点连接到 MabSelect 凝胶基质 20 77 / 生物分子纯化技术的最新突破 / Number of CIP cycles 020406080100120140160180200220 DBC at 10% breakthrough (polyclonal hIgG) % 0 20 40 60 80 100 15 min contact time with 0.1 M NaOH / cycle 60 min contact time with 0.1 M NaOH / cycle 15 min contact time with 0.5 M NaOH / cycle 15 min contact time with 0.1 M NaOH / cycle (conventional Protein A resin) 15 min contact time with 0.1 M NaOH / cycle (16 X 100 mm) 90 % 在 0.1-0.5 M NaOH 下保持稳定 78 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 特性 稳定性: 使用 0.1 M NaOH 超过一百循 环仍保持稳定 (接触时间/循环 15 分 钟-60 分钟) 产量 95-100% 纯度: HCP 去除 99% 载量: 超过 30 mg hIgG/ml 凝胶 (和 MabSelect 相似) 掉落: 低 PrA 掉落 1-10 ppm 线性流速: 100- 500 cm/h MabSelect SuRe 79 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 摘要 MabSelect SuRe 可承受可承受 NaOH 直接和安全的清洗工艺缩短上市时间 减少优化的时间Less time spent on optimization 降低生产成本 低廉清洗工艺 更纯的最终产品减少批间失败的数目 保持载量增加凝胶使用寿命 80 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 非融合蛋白质的三步纯化策略 Step 纯度 粗提 中度纯化 精细纯化 样品准备 粗提 中度纯化 精细纯化 样品准备, 萃取萃取, 净化净化 达到最高纯度 去除大部分杂质 分离 达到最高纯度 去除大部分杂质 分离,浓缩 和稳定样品 浓缩 和稳定样品 21 81 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 适用於三步纯化策略的层析技术 蛋白质性质层析技术蛋白质性质层析技术 净电荷离子交换(IEX) 大小凝胶过滤(GF) 疏水性疏水层析(HIC), 反相层析(RPC) 生物辩识 (配基特异性)亲和层析(AC) 配基特异性，净电荷, 扩张柱床吸附技术 (EBA) 疏水性有AC, IEX or HIC 82 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 下游纯化中的挑战 上游工艺的发展 上样体积增加 表达水平增加 增加下游纯化的压力 增加要处理的体积 (L/h) 增加要处理的含量 (kg/h) 83 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 适用於三步纯化策略的层析技术 层析技术主要特色粗提中度纯化精细纯化层析技术主要特色粗提中度纯化精细纯化 离子交换 IEX 高分辨率 高载量 快速 疏水层析 HIC 分辨率好 载量一般 快速 亲和层析 AC 高分辨率 高载量 快速 凝胶过滤 GF 高分辨率 反相层析 RPC 高分辨率 84 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 关键步骤 粗提 粗提的目的: 分离 浓缩 稳定 更高的表达水平伴随增加的体积要求分离凝胶需要 在大规模下高流速 在高流速下达到高动力载量 ?缩短 residence time 目标蛋白质 22 85 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 Capto Q 结合 高流速 和 高动力载量 粗提和中度纯化用的高产量强阴离子交换凝胶 86 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 生产规模的高流速和低反压 Capto Q and Sepharose 6 Fast Flow in BPG 300, 20 cm bed height 压力/流速规格: 700 cm/h ， 1 m 直径层析柱, 20 cm 柱高, 低于 3 bar 87 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 高机械稳定性意味着 更多的样品可以在更短的时间内被处理 每循环的时间更少 目标产品会更均一 88 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 琼脂糖基架确保化学稳定性 BSA 结合载量在 1 M NaOH 经过一星期仍不受 影响 0 20 40 60 80 100 120 140 QB10% (mg/ml) Before After Q Sepharose Fast FlowCapto Q 23 89 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 高动力载量 90 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0200400600800100012001400 Mobile phase velocity (cm/h) QB10% BSA (mg/mL) Capto Q Q Sepharose FF 动力载量 vs 流速 Bed height: 10 cm 91 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 高动力载量和高产量 工艺时间大大缩短 短时间内处理大量体积 产量更大 凝胶可以更少 层析柱可以更小 92 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 增加柱高 占地面积更小 直径小的层析柱比较容易操 作和装填 更少缓冲溶液消耗 总成本减少 24 93 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 BPG 300 高效装柱 三次装柱 20 cm 柱高的柱效数据 1.1267003 1.0973002 1.0967001 1.1366001 对称性每米塔板数装填方向装填次数 94 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 Capto Q 特性 组成具备葡聚糖表面延长基 团的琼脂糖, Q group 流速700 cm/h, 1m 柱直径, 20 cm 柱高, 100 mg BSA/ml 化学稳定性所有常用的水相缓冲溶 液, 包括 NaOH 95 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 Capto Q高产量 目标蛋白质: 大肠杆菌表达的 重组绿色荧光蛋白质 (GFP) 目标蛋白质 pI = 6.2 表达水平 2.5 mg GFP/ml 目的: 纯化 24 小时100 kg 目标蛋白质 96 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 简化工艺开发 XK columns 25 ml 凝胶包装 放大 Tricorn columns 25 ml 凝胶包装 优化 HiTrap pre-packed columns筛选 使用手册, 资料档案, 应用报告计划 25 97 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 HiTrap 柱用作快速筛选 Capto Q 虽然同为 Q 基团 但选择性不尽相 同 Q Sepharose XL Q Sepharose Fast Flow DEAE Sepharose Fast Flow ANX Sepharose 4 Fast Flow (high sub) 98 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 放大 400 倍 保留时间基本保持一致 Tricorn 5/100; CV = 2 mlFineLINE 70; CV = 808 ml 99 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 GFP 数据摘要 4.993 + 3FineLINE 70 5.894 + 3Tricorn 5/100 纯化因子产量 (%)运行 Capto Q 是很适合作为粗提 高产量 去除大量杂质 洗脱体积小 100 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 Capto MMC: 一种新型耐高盐的弱阳离子交换凝胶 26 101 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 MMC 配基 具备多种作用 离子作用 疏水作用 氢键 102 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 耐高盐的吸附能力 在样品的电导下可以结合目标蛋白质 允许直接上澄清样品, 无需事先稀释样品来 降低电导值 103 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 高电导下的结合能力 rHSA in Pichia pastoris* at 1 min residence time * please note licensing statement 104 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 不受电导影响的结合能力 比较 3 种不同蛋白质 Capacity values correspond to data at 1 min residence time 27 105 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 高流速低反压的特性适合生产规模 Capto MMC and Sepharose 6 Fast Flow in BPG 300, 20 cm bed height 106 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 HiTrap 预装柱可用作筛选或优化 HiTrap Capto MMC 预装柱 工艺开发的快速和简易筛选 为减少繁琐的样品准备工作，柱子的滤膜孔径适 合上超声破碎的裂解液 1 ml 和 5 ml 107 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 使用寿命研究 100 次重复,大肠杆菌匀浆 DBC for BSA during study 50 40 30 60 0100200300 108 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 从 Pichia pastoris 纯化 rHSA 用 Capto MMC 直接放大 100 倍 Tricorn 5/100 (CV = 2 ml)AxiChrom 50 (CV = 208 ml) Buffer A: 25 mM Na-acetate pH 4.5 Buffer B: 50 mM Na-phosphate, 1M NH4Cl, pH 7.2 93450AxiChrom 9345Tricorn 回收率回收率 (%) 纯化因子纯化因子 内径内径 (mm) 空柱空柱 28 109 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 Capto MMC 从 Pichia pastoris 纯化 rHSA 7.41.4 6No dil SP Sepharose Fast Flow 15 mS/cm 336.0 1356.4 SP Sepharose Fast Flow 3 mS/cm 00 0No dil SP Sepharose XL 15 mS/cm 356.4 1956.4 SP Sepharose XL 3 mS/cm 10219 44No dil Capto MMC 15 mS/cm 每天生产力每天生产力 (kg/24 h) * 每小时生产力每小时生产力 (kg/m3,h) 载量载量 (g/l) 稀释倍数稀释倍数 凝胶凝胶 样品电导值样品电导值 *假设柱直径假设柱直径 120 cm, 20 cm 柱高柱高, 柱体积柱体积 225 L 110 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 所有 Capto 产品都是 BioProcess 凝 胶 适合生产规模 验证有效的制造工艺 稳定供应 药审支援文件协助工艺验证 111 / 生物分子纯化技术的最新突破 / 12/07/2005 增加柱高 占地面积更小 高机械稳定性 ? 可使用更高柱高 ? 更小直径的空柱 ? 装柱更容易 Capto, Sepharose, BPG, HiTrap, Tricorn, AxiChrom, and BioProcess are trademarks of GE Healthcare Ltd, a General Electric company. GE tagline and GE Monogram are trademarks of General All commercial use of the Pichia expression