（生物化学与分子生物学专业论文）热带富油微藻的筛选及pepc2基因的沉默对微藻含油量的影响.pdf

海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人邵照出叫：所t ! 交的化论_ ! = = ，怂本人n ：t 】5 ：t j i l i 的 旨导卜，独立进行研究i ：作所取得的成果。 除史巾l 二经注l l j 弓l 川的l 勺侪外，本沦9 l i , 禽t p l j e 他个人戏绒体已经发表或撰7 j 过的作t i f l 或成果。 对本文的研究做! r 篮贡献n ：j 个人霸i 集体均已允交r 1 1 以f i l 确方式标明。本声明的法律结果由本人 承扛k 论史作者签名： 弘毅 日期：2 口z 口年占月万e l 学位论文版权使用授权说明 ，冬人完全了解海南人学哭j ：收乍、犍仃、健j j 学竹论文的规定，u o - 学校订权保留) t - l ：, 1 国家有 关部fj 或机构送交论文的复【 l j f 旧i l 毡j ：畈允许论文被资阅和借阅。本人授权海南人学可以将本学 纯论文的全部戏部分内存编入仃父故：| i i ：f ：进i j 伶索，n r 以采影印、缩印或扫描等复制手段保存和 f ：编奉学似论史。本人柏：导卿指导卜- ，t 战的沧建成粜，知识产权归属海南人学。 探密论：之杓i 解密扁迹勺：此埘定。 瞅作肯撇：；衣烈 导师签名 ；= ：j ；h j ：1 向l 蔚年参月历f _日期：一z 户l 口年b 月s 日 尜人已经认真阅醭“c a l l s 蠢i 饺，化论文仓文数据库发布章程”。同意将本人的学披论文提交 “c a i ，i st 魁校学似论文个艾数州j ；j 巾个文发自i ，f 可按“章程”中规定孛受椰关权益。融重逾塞 趱窑止溢巫；旦：匕匕旦：尘；迓：皇；丝鱼。 一 论文作肯签识： t q 蝴：为l o f 导师签名： 日j 鲫：1 夕嘲ib 月f f 、父q 孝，勿 反 摘要 微藻通常是指含有叶绿素a 并能进行光合作用的微生物( 包括蓝细菌 c y a n o b a c t e r i a ) 。微藻作为一种新型的生物柴油顷料，具有来源广泛、成本低廉、 清洁可再生等优点，应用前景极为可观。筛选富油藻种、探索最佳培养条件以及 利用生物技术获取高油脂基因工程微藻已成为国际普遍关注的研究课题。 热带地区丰富的藻种资源为筛选大量富油微藻提供了可能性，本实验分离纯 化了7 1 株热带水域微藻藻株，并通过形态学与分子生物学相结合的方法，对部 分藻株进行了种属分类，为进一步对富油微藻进行生理生化分析、分子生物学及 遗传学研究奠定了基础。 本实验通过尼罗红荧光染色的方法对微藻油脂进行定性及定量分析。优化了 尼罗红荧光染色条件：尼罗红染料浓度0 5hg m l 、待测藻液浓度 0 d 4 9 0 = 0 卜1 0 、d m s o 浓度2 0 以及染色时间l o m i n 。并为高通量筛选富油微藻 提供了快速、灵敏、便捷的实验方法。 检测了3 种小球藻在四种不同培养基( s e 、b g l l 、t a p 、d s - 1 ) 培养条件下 的生长及油脂积累情况。结果表明，t a p 培养基更适合小球藻的高密度培养，而 d s 培养基则更适合小球藻油脂的累积；并筛选到油脂积累较为理想的藻种 y 一0 1 9 。并制作了6 0 l 管状光生物反应器用于微藻的扩大化培养。 克隆了影响油脂合成代谢的关键基因p e p c 2 的部分片段，构建了p e p c 2 基因 的r e a l 表达载体，并通过玻璃珠法转化受体藻株莱茵衣藻c h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d t i i ( c o 一1 2 4w il dt y p em t 一) 。采用荧光定量p c r 方法分析了阳性转化 株中p e p e 2 基因的转录水平，结果表明r n a i 导致p e p c 2 基因较高水平沉默，转 化株中目的基因表达量为对照组的1 0 2 1 水平之间，降低了7 9 - 9 0 ；用尼罗 红荧光染色方法分析转化株的含油量水平表明，与对照相比，p e p c 2 基因表达沉 默的藻株含油量最高可提升2 3 4 。 。 关键词：微藻生物柴油微藻生物量微藻油脂p e p c 2 基因 r n a i a b s t r a c t ) m i c r o a l g a eu s u a l l yr e f e rt ot h ep h o t o s y n t h e t i cm i c r o b e sc o n t a i n i n gc h l o r o p h y l la ( i n c l u d i n gc y a n o b a c t e r i a ) a s an e wb i o d i e s e lr a wm a t e r i a lw i t hc o n s i d e r a b l e p r o s p e c t ，m i c r o a l g a eh a sal o to fa d v a n t a g e s ，s u c ha sw i d ev a r i e t yo fs o u r c e s ，l o wc o s t ， c l e a n ，r e n e w a b l e ，a n ds oo n t h e r ea r es o m ec o m m o nc o n c e r no ft h ei n t e r n a t i o n a l a b o u tm i c r o a l g a eb i o d i e s e l ，s u c ha ss c r e e n i n go fl i p i d - r i c ha l g a es p e c i e s ，e x p l o r i n g t h eb e s tc u l t u r ec o n d i t i o n sa n dc o n s t r u c t i o no fg e n e t i ce n g i n e e r i n ga l g a ec o n t a i n i n g n u m e r o u sl i p i db yu s eo f b i o t e c h n o l o g y i nt h i se x p e r i m e n t 2a 1 a r g en u m b e ro fa l g a ls p e c i e si nt h et r o p i c a lw a t e r sh a v e b e e ni s o l a t i o n i n t e r e s t i n ga l g a es t r a i n sh a v eb e e nc l a s s i f i e dt h r o u g ht h ec o m b i n a t i o n o fm o r p h o l o g i c a la n dm o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d s i s o l a t i o na n di d e n t if i c a t i o no f a l g a l s p e c i e sp r e p a r ew e l lf o rt h ef u r t h e rp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a la n a l y s i s ，m o l e c u l a r b i o l o g ya n dg e n e t i c ss t u d yo fm i c r o a l g a e ；a n da b u n d a n ta l g a es p e c i e sr e s o u r c ec a nl a y ag o o df o u n d a t i o nf o rh i g h - t h r o u g h p u ts c r e e n i n go f l i p i d r i c hm i c r o a l g a e b yn i l er e df l u o r e s c e n c es t a i n i n gm e t h o d ，m i c r o a l g a el i p i dc a nb eq u a l i t a t i v e l y a n dq u a n t i t a t i v e l ya n a l y z e d w eo p t i m i z e dt h ed e t e c t i o nc o n d i t i o n s ：n i l er e dd y e c o n c e n t r a t i o n 0 5 p m l ，t e s t e da l g a ec o n c e n t r a t i o no d 4 9 0 - 0 1 1 0 ，d m s o c o n c e n t r a t i o n2 0 a n dt h ed y e i n gt i m e10 m i n t h i sp r o v i d e saf a s t ，s e n s i t i v ea n d c o n v e n i e n t e x p e r i m e n t a l m e t h o df o r h i g h t h r o u g h p u ts c r e e n i n g o f l i p i d - r i c h m i c r o a l g a e t h eg r o w t ha n dl i p i da c c u m u l a t i o r r o ft h r e ek i n d so fc h l o r e l l av u l g a r i sw e r e t e s t e di nf o u rd i f f e r e n tm e d i a ( s e ，b g11 ，t a p , d s 1 ) c u l t u r ec o n d i t i o n sa n dat u b u l a r p h o t o b i o r e a c t o rf o rm i c r o a l g a ew a sp r o d u c e d 1 1 1 e yl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rl a r g e s c a l e a n dh i g h d e n s i t yt r a i n i n go fm i c r o a l g a e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，t a pm e d i u mw a s m o r es u i t a b l ef o rh i g h d e n s i t yc u l t u r eo fc h l o r e l l a ，w h i l et h ed sw a sm o r es u i t a b l e f o rl i p i da c c u m u l a t i o n a n dw es c r e e n e da l g a es p e c i e sy 019w i t ht h ei d e a l l i p i d a c c u m u l a t i o n a c c o r d i n gt ot h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm e d i u mc o m p o s i t i o na r i dl i p i d c o n t e n t ，w es p e c u l a t et h a tt h ee x c e s s i v el i p i da c c u m u l a t i o no fm i c r o a l g a ei so n ek i n d o fs t r e s s p h y s i o l o g i c a lr e s p o n s e t o r e s i s ta d v e r s ee n v i r o n m e n t t h r o u g h t h e a c c u m u l a t i o no fs t o r a g em a t e r i a l a p e p c 2g e n ef r a g m e n tw a sc l o n e d ，w h i c hi sak e yg e n ei nl i p i ds y n t h e s i sa n d m e t a b o l i s m p e p c 2g e n er n a ie x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e d ，a n dt r a n s f o r m e d i n t oc h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i ic c 一12 4u i l dt y p em t b yg l a s sb e a dm e t h o d t h e t r a n s c r i p t i o no fp e p c 2g e n ew a sa n a l y z e db yf l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c r t h e l i r e s u l t ss h o w e dt h a tr n a il e dt oh i g l ll e v e l so fp e p c 2g e n es i l e n c i n g t h e n ，w e a n a l y z e dt h el i p i dc o n t e n to ft r a n s g e n i ca l g a eu s i n gn i l er e df l u o r e s c e n c es t a i n i n g m e t h o d c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ，t h el i p i dc o n t e n to ft r a n s g e n i ca l g a ew a su pt o 2 3 4 k e yw o r d s ：m i c r o a l g a e ，b i o d i e s e l ，a l g a eb i o m a s s ，a l g a el i p i d ，p e p c 2g e n e s ，r n a i o 1 1 1 目录 摘要：i a b s t r a c t ii 目录iv 1 前言1 1 1微藻生物柴油1 1 2不同培养条件对微藻生长与油脂积累的影响。3 1 3微藻光生物反应器研究进展。4 1 4 微藻油脂代谢的分子研究5 1 1 1油脂合成途径5 1 1 2油脂代谢相关酶的基因工程研究5 1 1 3 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( p e p c ) 的研究进展9 1 5 r n a i 技术10 1 1 4r n a i 的含义1 0 1 1 5r n a i 的发现1 0 1 1 6r n a i 的作用机制1 0 1 1 7r n a i 在作物品质中的改良应用1 1 1 6 本研究的目的意义1 2 1 7 技术路线13 2 藻种h , 勺q g 集、分离及鉴定14 2 1材料与方法1 4 2 1 1 试剂及仪器1 4 2 1 2 藻种采集1 4 2 1 3 藻种分离纯化l5 2 1 41 8 sr d n a 基因的分子鉴定1 6 2 2结果与分析2 0 2 2 1 热带微藻种质资源的分离：2 0 2 2 2 微藻藻种的分子鉴定一2 3 2 3 讨论2 6 3 微藻油脂荧光分析方法的建立与条件优化2 8 3 1 材料与方法2 8 3 1 1藻种。2 8 3 1 2 试剂及仪器2 8 3 1 3 微藻的培养2 8 3 1 4 生物量测定2 9 3 1 5尼罗红荧光发射) 匕i 涛当! 描2 9 3 1 6 荧光分析条件优化2 9 3 1 7 油脂荧光染色的显微观察3 0 3 1 8 油脂的定量检测3 0 3 2 结果与分析3 l 3 2 1 油脂最佳发射波长3 1 3 2 2 油脂荧光分析的最适条件。3 l 3 3 讨论3 5 4 微藻生长与油脂积累培养基条件的优化及光生物反应器 的制造3 7 4 1 材料与方法3 7 4 1 1 藻种3 7 4 1 2 试剂及仪器3 7 4 1 3 微藻的培养3 7 4 1 4 生物量测定4 0 4 1 5 油脂荧光定性及定量分析4 0 4 1 6 光生物反应器的制造4 0 4 2 结果与分析4 1 4 2 1不同培养基培养条件下藻株的生长状况4 1 4 2 2 不同培养基培养条件下油脂的积累情况。4 2 4 2 3 光生物反应器的制造4 3 4 3讨论：4 4 5 p e p c 2 基因r n aj 表达载体的构建及转化莱茵衣藻4 7 5 1 材料与方法4 7 5 1 1 藻种4 7 5 1 2 菌种与质粒4 7 5 1 3 试剂及仪器。：4 7 5 1 4r n a 提取及鉴定4 7 5 1 5c d n a 的制备4 8 5 1 6p e p c 2 基因片段的获取4 9 5 1 7p e p c 2 基因的r n a i 载体构建及验证4 9 5 1 8 r n a i 载体转化c h t a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i ic c 一1 2 4 及筛选5 3 5 1 9 s y b r g r e e ni 芡光定量p c r 一5 3 5 2 结果与分析5 6 5 2 1 r n a 质量与浓度检测5 6 5 2 2 p e p c 2 基因r n a i 载体的建立与转化k 5 6 度23 p e p ( ? 基因r n a i 对油脂积累的影响譬6 0 5 3 讨论6 4 结论6 6 参考文献一6 7 致谢7 7 1 前言 在各种经济能源中石油一直占据着主导地位，随着全球经济的不断发展，其 需求量也不断扩大，供需矛盾愈演愈烈导致价格飙升，并且过度的开发利用导致 环境同益恶化，所以寻求绿色、环保、可再生的替代能源已成为可持续发展中最 重要课题的之一。在此紧迫形势之下，生物柴油应运而生。生物柴油由一系列的 脂肪酸甲酯组成，通常由原料油脂三酰甘油与甲醇进行酯交换反应而得。生物柴 油现已成为国际上发展最快、应用最广的石油替代燃料，传统的生物柴油原料多 为大豆和油菜籽，但以动植物油脂做为原料存在以下不利因素：1 征占土地与 淡水资源：大面积种植生物质能燃料作物将使农作物种植面积减少，与粮食生产 之间产生矛盾；灌溉生物质能燃料作物会消耗大量的珍贵的淡水资源，与水资源 之间产生矛盾；2 侵蚀土壤：设法种植高生物量的生物质能燃料作物来制造燃 料，加快了土壤的侵蚀速度，使土壤变得贫瘠；3 使用化学制剂：为了保证产 量，大量使用农药和化肥，是对环境的严峻挑战：4 产生废水：在蒸馏及纯化 过程中产生大量的废水，也对环境带来巨大的压力；5 占用巨大劳动力。这些 均导致生物柴油成本过高，市场竞争力较弱，大大限制了其规模化和产业化的进 程。原料供给不足一直是生物柴油发展的瓶颈。 1 1 微藻生物柴油 微藻作为一种新型的生物柴油原料，已受到国际的普遍关注( s p o l a o r ee ta 1 ，一 2 0 0 6 ；g o u v e i aa n do l i v e i r a ，2 0 0 9 ) 。微藻通常是指含有叶绿素a 并能进行光合作用 的微生物的总称( 包括蓝细菌c y a n o b a c t e r i a ) 。目前发现的微藻约有两万余种， 分属于5 个藻门：绿藻门、金藻门、甲藻门、红藻门和蓝藻门。 微藻的油脂组成与一般油料植物相似，以c 1 6 、c 1 8 系脂肪酸为主( s h e e h a n e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。与传统原料相比，微藻生产生物柴油具有以下优点：1 来源广泛， 易于采集；2 微藻含油量高，生长周期短，可全年不问断培养；3 产油能力高 于绿色油料植物；4 培养仅需要一些自然条件：阳光、水、c 0 2 、微量元素等， 易于进行大规模培养；5 可利用海水及其它不适宜耕种的地区进行大规模培养， 不与粮食作物争水争地。还可以利用工业废气中的二氧化碳为碳源，卜长，缓解温 室气体的排放( b r e n n a na n do w e n d e ，2 0 1 0 ；f r a n c i s c oe ta 1 ，2 0 0 9 ) 。c h i s t i ( 2 0 0 7 ； 2 0 0 8 ) 通过建立数学模型和工程计算得出其是目前唯一可能替代石油的生物柴油 原料。 。 现今制备生物柴油的微藻多以绿藻和硅藻为主，筛选富油微藻已成为商业化 生产的关键因子( b e e re ta 1 ，2 0 0 9 ；s c r a g ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。芰 4 能源部j ：1 9 7 8 年，f = 始 致力于利用藻类制备生物柴油的研究，从海洋和湖泊中相继筛选出3 0 0 多种生 长快、含油高的绿藻、硅藻和蓝藻等藻种。油脂含量与藻种密切相关( m o r o w v a te t a 1 ，2 0 1 0 ；夏金兰等，2 0 0 9 ) ，大多数藻种的含油量均在细胞干重的2 0 7 0 之间， 如表l 所示( 夏金兰等，2 0 0 9 ) 。驯化后的某些藻类的油脂细胞干重含量可高达 8 0 ( s p o l a o r e e ta 1 ，2 0 0 6 ；l y n ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。尽管富油微藻的资源较为丰富，但是 由于微藻个体微小，其鉴定分类一直是科学界的研究难题，已逐渐阻碍了富油微 藻筛选的快速发展。传统的分类只能依据其形态以及生理特性逐级分类，程序较 为繁琐，完整度及准确度不高。现今以基因多态性为基础的分子鉴定方法在微藻 分类领域的应用已r 益完善。在微藻线粒体基因组、叶绿体基因组和核基因组的 各基因序列中，多基因家族、转录间隔区和核糖体r n a 基因等都已成为目前常 用的分子指标( e h a r ae ta 1 ，2 0 0 0 ；m o o n v a i ld e rs t a a ye ta 1 2 0 0 1 ) 。其中1 6 s 、1 8 s 及2 8 sr d n a 基因最为古老，其序列变化与进化距离相适应，已成为广泛应用的 标志性分子指标之一( 洪义国等，2 0 0 2 ；r a s o u l a m i n ie ta 1 2 0 0 9 ；v a nd e rg u c h te t a 1 ，2 0 0 1 ) 。另一方面，快速鉴定微藻油脂含量也是高通量筛选富油微藻的前提。 传统的油脂测定方法为有机溶剂萃取法及重量分析测定法等，这些方法耗时耗 力，无法实现微藻的高通量筛选( b l i g he ta 1 ，1 9 5 9 ；l e ee ta 1 ，2 0 1 0 ) 。而现今，利 用尼罗红这种脂溶性荧光染料，结合荧光显微镜或流式细胞仪，可在合适的发射 波长和激发波长下原位观察不同颜色荧光所代表的极性脂和中性n 旨( e l s e ye ta 1 ， 2 0 0 7 ；e l t g r o t he ta 1 ，2 0 0 5 ；m c g i n n i se ta 1 ，1 9 9 7 ) ；同时结合荧光分光光度的使用使 得对微藻细胞油脂的相对定量分析变得更为快速、灵敏，为富油微藻的高通量筛 选提供了极大的便币l j ( c h e ne ta 1 ，2 0 0 9 ；h u a n ge ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 表1 1 常见微藻的油脂含量 t a b l el 一1 l i q u i dc o n t e n ti nm i e r o a l g a e 2 ( 引自夏金兰等微藻生物柴油的现状与进展中国生物t 程杂志，2 0 0 9 ，2 9 ( 7 ) ：1 1 8 1 2 6 ) 1 2 不同培养条件对微藻生长与油脂积累的影响 影响微藻生长与油脂积累的因素有很多( 石娟& 潘克厚，2 0 0 4 ) ，如培养基成分 ( w h i k f o r s ，1 9 8 6 ；魏东张学成，2 0 0 0 ；x ue ta 1 ，2 0 0 1 ) 、培养方式( l i a n ge ta 1 ，2 0 0 9 ； p e m e te ta 1 ，2 0 0 3 ；t a na n dj o h n s ，1 9 9 6 ；y o o na n dr h e e ，1 9 8 3 ) 、温度( c o n v e r t ie ta 1 ， 2 0 0 9 ；r e n a u de ta 1 ，2 0 0 2 ；s i f l e ie ta 1 ，2 0 0 5 ；z h uc ta 1 ，19 9 7 ) 、光照( r e n a u de ta 1 ， 1 9 9 1 ；t h o m p s o ne ta 1 ，1 9 9 0 ) 、p h 值( 王秀良等，2 0 0 2 ；徐年军等，2 0 0 1 ) 、通气量 ( c h e ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 、盐度( j i m 6 n e ze ta 1 ，1 9 9 1 ；l a i n ge ta 1 ，1 9 8 0 ；m u t s u m ie ta 1 ， 2 0 0 6 ) 等，其中培养基成分的影响最为显著。营养元素充足的条件下，微藻生长 状况良好，但油脂积累量相对较低；当处于营养元素缺乏等环境压力下时，c 0 2 一 则主要用于合成油脂以积蓄能量，油脂含量显著上升，但细胞停止分裂，生物量 下降，也不能满足生物柴油制备的原料需求( r a t l e d g e e ta 1 ，2 0 0 2 ) ，现在用于微藻 培养的基础培养基主要有b g 11 培养基及s e 培养基等。 。 很多研究表明，在众多营养元素中，氮源的种类以及氮的浓度对微藻生长与 油脂积累的影响最为关键( d e a ne ta 1 ，2 0 1 0 ；h s i e ha n dw u , 2 0 0 9 ；l ie ta 1 ，2 0 1 0 ) 。 微藻在不同氮源培养条件下的生长与油脂的积累程度有所差异( l ie ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 铵盐、尿素及硝酸盐等都可作为氮源被微藻吸收利用，但不同的藻种对氮源存在 一定的偏好型，即不同氮源被吸收利用的速度及程度存在差异。相较尿素及硝酸 盐两种氮源，后棘藻( e l l i p s o i d i o ns p ) 在以铵盐为氮源的培养条件下，其生长速率 更快，油脂含量更多( x ue ta 1 ，2 0 0 1 ) 。同样在这三种氮源的培养条件下，铵盐则 更适合新绿藻( n e o c h l o r i so l e o a b u n d a n s ) 的生长，硝酸赫则更适合其油脂累积( “ e ta 1 ，2 0 0 8 ) 。但对于小球藻( c h l o r e l l as p ) ，尿素是其最佳氮源( b e c k e re ta 1 ， 1 9 9 4 ) 。除了氮源种类的影响因素外，氮浓度的影响更为重要。非限制性或高氮 浓度下培养通常总生物量大，但油脂含量有所下降：而氮限制性下培养，生物量 降低的同时油脂含量则相对增加( f a b r e g a se ta 1 ，1 9 8 6 ；1 9 8 9 ) 。斜生栅藻 ( s c e n d e s m u so b l i q u u s ) 和小球藻( c h l o r e l l a 跟) 在培养基氮含量减至原来2 5 的培 养条件下，其油脂含量显著增加，分别由7 9 0 及5 9 0 提高至1 5 3 1 及 16 41 ( c o n v e r t ie ta 1 ，2 0 0 9 ) 。莱茵衣藻( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ) 和刺栅藻 ( s c e n e d e s m u ss u b s p i c a t u s ) 也n ：低氮浓度培养的条件卜现细咆分裂受阻并且细 胞体积变大等异常现象，同时脂类和碳水化合物含量也明显增加( d e a ne ta 1 ， 2 0 1 0 ) 。t a k a g i 等( 2 0 0 9 ) 脱察剑低氮浓度条件下，微藻类囊体膜缩小，酰基水解酶 被激活并促进磷脂水解；并推测这些变化可能进一步导致脂酰辅酶a ( a c y l c o a ) 含量增加，并激活二酰甘油酰基转移酶( d i a c y l g l y c e r o la c y l t r a n s f e r a s e ，d g a t ) ，催 化脂酰辅酶a 生成- - - 酰甘 泄t ( t r i a c y l g y c e r o l ，t a g ) ，因此氮限制可以促进脂质和三 酰甘油在微藻细胞中的积累( l ie ta 1 ，2 0 1 0 ) 。 除氮胁迫外，磷、硫及硅等其它营养元素的缺乏也可提高脂肪酸的含量 ( w h i k f o r s ，1 9 8 6 ；魏东张学成，2 0 0 0 ) 。对硅藻而言，硅是影响其细胞脂肪酸代 谢的最重要的营养物质，其胁迫可诱导乙酰辅酶a ( a c e t h y - c o a ) 活力升高，从而 促进油脂的积累( r o e s s l e r , 1 9 9 8 a ；1 9 9 8 b ) 。同时研究结果也表明，碳、磷及硅元素 对球等鞭会藻生长及油脂积累的影响都不及氮源显著( 樊云真等，1 9 9 8 ) 。近来在 对小球藻的研究中发现，螯合f e c l 3 对其生长及油脂积累也有明显作用。( l i ue ta 1 ， 2 0 0 8 ) 。总之，微藻油脂含量对各营养元素的响应机理以及对于特定藻种选择哪 种合适的培养基可使其生物量和油脂积累量同时达到较为理想的状态，尚待研究 ( f e m d n d e z r e i r i ze ta 1 ，19 9 9 ；n 0 6 m i ee ta 1 ，2 0 0 9 ；s t o t t m pe ta 1 ，19 9 9 ；w i d j a j ae t a 1 ，2 0 0 9 ) 。 1 3 微藻光生物反应器研究进展 研发高效的光生物反应器以实现微藻的高密度大规模培养，是以微藻为原料 制备生物柴油的产业化基础。微藻光生物反应器需依所培养藻类的生物学特性而 设，并尽可能本提高光能利用率以提高产率，同时最大程度得降低生产成本。 目前，微藻光生物反应器主要有丌放式和封闭式两种。开放式光生物反应器 即开放式户外大池培养，主要有池塘、浅水池、循环池及跑道池式四种类型，其 中跑道池式最为典型、常用。开放式光生物反应器结构简单、易于操作而且成本 低廉，已普遍用于螺旋藻和小球藻等少数微藻的商业化生产之中，但由于其易受 污染、培养条件不稳定等缺点受到一定的限制，所以现在人们将更多的目光投向 封闭式光生物反应器的研发。封闭式光生物反应器培养密度高、可无菌操作且培 养条件稳定( r a m o so r t e g a ，1 9 9 6 ) 。目前主要有管道式、平板式及发酵罐式等类 型，其中管道式又可分为水平式、气升式、倾斜式及垂直式等。但封闭式光生物 反应器的生产成本相对较高，需咚呵能扩大采光面积、缩短光输路径、选用合适 的体系循环方式及培养条件以期获得最大生物量、降低成本消耗( 刘娟妮等，2 0 0 6 ； 许建中等，2 0 0 8 ) 。 4 图1 - 1 水平管道式光生物反应器模式图 f 追1 - 1m o d e lc h a r to ft h eh o r i z o n t a lp i p e l i n ep h o t o b i o r e a e t o r 1 4 微藻油脂代谢的分子研究 。 1 1 1油脂合成途径 微藻合成油脂主要用于生物膜的组成以及物质与能量的储存。在微藻不同的 生长时期，油脂的合成量与其用途有明显的差异。在细胞增殖期间，微藻细胞合 成的油脂主要以脂质体的形式存在于生物膜中；但在培养后期或其它营养元素缺 乏的条件下，细胞分裂停止，此时细胞继续利用碳源合成三酰甘油 ( t r i a c y l g y c e r o l ，t a g ) ，用以储存物质与能量( m e n ge ta 1 ，2 0 0 9 ；r a t l e d g e ，2 0 0 2 ) 。微 藻油脂合成主要在细胞质和内质网上进行，生物合成途径如图1 2 所示( r i e k h o f e t a 1 ，2 0 0 5 ) 。整个合成过程中多酶催化，较为复杂，但总体可归纳为三个步骤：( 1 ) 乙酰c o a 羧化形成丙二酰辅酶；( 2 ) 脂肪酸碳链延长；( 3 ) 合成t a g 。 二 1 1 2 油脂代谢相关酶的基因工程研究 微藻基因工程在成功转化模式生物莱茵衣藻( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ) 的 基础上得以不断的发展( 张学成& 杨官品，2 0 0 0 ) 。我们希望利用基因工程改造微藻 油脂代谢调控途径，以提高微藻的油脂积累。 目前微藻基因工程主要用于单细胞绿藻和海洋硅藻。在单细胞绿藻的基因改 造工程中，莱茵衣藻( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ) 与小球藻( c h l o r e l l as p ) 相继成为 转化系统的典型代表( 陈颖等，1 9 9 8 ；c h e ne ta 1 ，2 0 0 1 ) ，尤其是莱茵衣藻已经成为 真核微藻转基因研究的模式生物。众多研究者已相继对其叶绿体基因组、线粒体 基因组及核基因组进行测序和基因的定位( b o y n t o ne ta 1 ，1 9 8 8 ； r a n d o l p h a n d e r s o ne ta 1 ，1 9 9 3 ) ，获取了大量油脂代谢相关基因，如表1 2 所示 ( r i e k h o fe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。其中，乙酰辅酶a 羧化酶( a c e t y l - c o ac a r b o x y l a s e ，a c c a s e ) 和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( p h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y l a s e ，p e p c ) 是现阶段微 g - 3 p l 1 6 f m e f a 十2 6 e t n t2 s s e r 图1 2 衣藻脂类生物合成途径推测 f i g 1 - 2p a t h w a y so fl i p i db i o s y n t h e s i sw h i c ha r ek n o w no rh y p o t h e s i z e dt oo c c u ri n c h l a m y d o m o n a sa n dt h e i rp r e s u m e ds u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n s ( 引r i e k h o f , s e a r s ，a n db， ， ，e n n i n g e u k a r y o t i cc e l l2 0 0 532 4 2 - 2 5 2 ) 【乙酰辅酶a 羧化酶( a c e t y l - c o a c a r b o x y l a s e ，a c c a s e ) ( 1 ) 催化乙酰辅酶a 生成丙二酸单酰辅酶a ，由此进入脂肪。 酸的生物合成。丙二酸单酰辅酶a 在脂肪酸合酶( f a t t ya c i ds y n t h a s ec o m p l e x ，f a s ) ( 2 ) 的催化下下进行连续聚 合反应，每次循环酰基碳链增加2 介碳，最后酰基载体蚩e l ( a c y l c a r r i e dp n _ t e i n s ，a c p ) j 2 _ 结合n j 酰幕- a c p 硫酯酶( a c y i a c pt h i o 鹤t e r a s e ) ( 1 6 ) 的作用下形成软酯睃。随后软酯陵运输到内质网，l ：转化为酰培辅酶a ，经3 - 磷酸甘油酰基转移酶( g l y c e r o l - 3 p h o s p h a t ea c y l t r a n s f e r a s e , g p a t ) 、溶血磷脂酸酰基转移酶 ( 1 y s o - p h o s p h a t i d i ca c i da e y l t r a n s f e r a s e ，l p a a l ) 0 9 、二脂酰l r 油酰慕转移酶( d i a c y l g l y c e r o la c y l t r a n s f e r a s e ，i ) g a 3 3 的依次作用合成三酰f r 油( t r i a c y l g l y c e r o i s ，t a g ) 】 6 藻基因工程研究的重点( m o e l l e r i n ge ta 1 ，2 0 0 7 ) 。a c c a s e 催化乙酰辅酶a 生成丙 二酸单酰辅酶a ，由此进入脂肪酸的生物合成，此步是整个合成过程的调控位点， a c c a s e 为此合成途径的关键限速酶。p e p c 贝j j 参与调节光合作用和光呼吸的关 系，催化磷酸烯醇式丙酮酸( p h o s p h o e n o l p y r u v a t e ，p e p ) 生成草酰乙酸( o x a l a c e t i c a c i d ，o a a ) ( 宋东辉等，2 0 0 8 ) 。由于细胞内油脂与蛋白质合成的最初底物都是丙酮 酸，因此这两种代谢的关键限速酶a c c a s e 和p e p c 的相对活性直接调控细胞油脂 蛋白质