（环境科学专业论文）x20菌的鉴定及其对mclr的酶学降解途径研究.pdf

a d d a 催化降解为其它产物。 关键词：微囊藻毒素，好氧菌，酶降解途径，酶抑制剂 a b s t r a c t m i c r o c y s t i n s ( m c s ) a r eag r o u po fc y c l i ch e p t a p e p t i d em a i n l yp r o d u c e db y b l o o m i n gc y a n o b a c t e r i a n l ep r e s e n c eo fm c sc a nb eap o t e n t i a lt h r e a tt ot h e e c o s y s t e ma n dh u m a nh e a l t h m i c r o b i a ld e g r a d a t i o no fm c s i sc o n s i d e r e da sam a j o r e l i m i n a t i o np a t h w a yf o rm c si nt h ee n v i r o n m e n t t od a t e ，m o r et h a n4 0m c d e g r a d i n gb a c t e r i ah a db e e ni s o l a t e da n dt h em e c h a n i s mo fb i o d e g r a d a t i o no fm c s h a sb e e ns t u d i e d s i n c ed i f f e r e n tk i n d so fb a c t e r i am i g h td e g r a d em c st h r o u g h d i f f e r e n tp a t h w a y s ，i ti sn e c e s s a r yt oe x p l o r et h ed e g r a d a t i o nm e c h a n i s mf o rn e w i s o l a t e i nt h i ss t u d y , w ee x a m i n e dt h ep o s i t i o no fm c s d e g r a d i n ge l l z y m e si nc e l la n d t h ee f f e c t so fe n v i r o n m e n t a lf a c t o r so ne n z y m e sa c t i v i t ya f t e ri d e n t i f i y i n ga n e w l y i s o l a t e dm c - d e g r a d i n gb a c t e r i u ms t r a i nx 2 0 t h eu s eo fc l a s s i cp r o t e a s ei n h i b i t o r s a l l o w e dt h ei nv i t r oa c c u m u l a t i o no ft r a n s i e n tp r o d u c t sd u r i n gt h em c l rd e g r a d a t i o n b yi d e n t i f y i n gt h e s ep r o d u c t s ，t h ee n z y m a t i cp a t h w a yf o rm c l rb i o d e g r a d a t i o nw a s d e d u c e d t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r e 嬲f o l l o w s ： ( 1 ) t h ei d e n t i f i c a t i o n ，a n dd e g r a d a t i o na b i l i t yo fs t r a i nx 2 0 s t r a i nx 2 0c o u l dd e g r a d em c l ro f5m e t eb e l o wt h ed e t e c t i o nl i m i tw i t h i n10 ha t2 5 1 1 1 ec o l o n yo fs t r a i nx 2 0o ns o l i do r g a n i cm e d i u mw a sy e l l o w , r o u n d ， 1 0 1 5m ma c r o s s ，s l i p p e r y , 、i mr e g u l a re d g e sa n dam o i s ts u r f a c e s t r a i nx 2 0i sa g r a m n e g a t i v eb a c t e r i u m 、析t ha b i l i t yo fm o t i l i t y n ec e l l so fs t r a i nx 2 0w e r es h o r t r o ds h a p e d ，、 ，i t l law i d t h o f0 2 0 3p a na n dal e n g t ho fo 4 1 3 岬a f t e rc u l t i v a t i n g f o r4 8ha c c o r d i n gt ot h es e m p h o t o b a s e do nt h ea n a l y s i so fc o l o n i a lm o r p h o l o g y , p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dt h e 16 sr d n ag e n es e q u e n c e ， s t r a i nx 2 0w a si d e n t i f i e da ss p h i n g o p y x i ss p ( 2 ) n ep o s i t i o no fm cd e g r a d i n ge n z y m e si ns t r a i nx 2 0a n dt h ee f f e c t so f e n v i r o n m e n t a lf a c t o r so ne n z y m ea c t i v i t y t h ei n t r a e e l l u l a re n z y m e sw e r em a i n l yr e s p o n s i b l ef o rm cd e g r a d a t i o np r o c e s s p e r i p l a s m i ce n z y m e sp r e s e n t e dl o wa c t i v i t yf o rm cd e g r a d a t i o n ，w h i l ee x t r a c e l l u l a r e n z y m e ss h o w e dn od e g r a d a t i o na c t i v i t y n l ei n t r a c e l l u l a re n z y m e so fs t r a i nx 2 0 d e g r a d e dm c l rf a s t e rt h a ni t s c e l l s 1 1 1 ee f f e c t so fp h t e m p e r a t u r ea n do x y g e n i i i c o n d i t i o no nt h ed e g r a d a t i o no fm c l r b yi n t r a c e l l u l a re n z y m e sw e r ef u r t h e rs t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lp hv a l u ew a s7 5 ，t h ee n z y m ea c t i v i t yi n c r e a s e d o v e rt h er a n g eo ft e m p e r a t u r ef r o m2 0t o4 0 * ( 2a n ds h o w e dn od i f f e r e n c eu n d e r a e r o b i ca n da n a e r o b i cc o n d i t i o n s ( 3 ) t h ee n z y m a t i cp a t h w a yf o rm c l r d e g r a d a t i o nb ys t r a mx 2 0 t h er e s u l t so fe n z y m ea n di n h i b i t o rs t u d i e ss h o w e dt h a ta tl e a s t3k i n d so f i n t e r m e d i a t ed e g r a d a t i o np r o d u c t sw e r ep r o d u c e di nt h ed e g r a d a t i o no fm c l r t h e y w e r el i n e a r i z e dm c l r , t e t r a p e p t i d e sa n da d d a , r e s p e c t i v e l y f r o mt h e s er e s u l t sw e c o u l dd e d u c et h a tt h e r ew e r ea tl e a s t4e n z y m e si n v o l v e di nt h em c l r d e g r a d a t i o n e n z y m ea ，am e t a l l o e n z y m e ，w a sr e s p o n s i b l ef o rt h er i n go p e n i n go fm c l r t og e ta l i n e a rm c l r e n z y m eb ，as e r i n ee n z y m e ，w a sr e s p o n s i b l ef o r c a t a l y z i n gt h e d e g r a d a t i o no fl i n e a rm c l rt oat e t r a p e p t i d ed e g r a d a t i o np r o d u c t e n z y m ec ，a m e t a l l o e n z y m e ，w a sr e s p o n s i b l ef o rd e c o m p o s i n gt e t r a p e p t i d et oa d d a e n z y m ed w a sr e s p o n s i b l ef o rd e g r a d i n ga d d at oo t h e rs u b s t a n c e s k e yw o r d s ：m i c r o c y s t i n ，a e r o b i cb a c t e r i u m ，e n z y m a t i cp a t h w a y ，p r o t e a s ei n h i b i t o r i v 武汉理工大学硕士学位论文 第1 章绪论 随着人类生活方式的改变，工农业的迅速发展，含有氮、磷等物质的污水 大量排入水体，导致水体富营养化不断加剧，水华爆发日益频繁，这一环境问 题已引起了世界范围内的广泛关注【i 3 l 。2 5 7 0 的蓝藻水华污染可产生藻毒素， 藻毒素种类繁多，其中微囊藻毒素( m i r c o c y s t i n s ，m c s ) 是目前已知的一种出 现频率最高、危害最严重的藻毒烈4 1 。由其造成人、畜、野生动物中毒和死亡的 事件已有诸多报道【5 川。研究发现，m c s 具有强烈的肝毒性和肿瘤促进作用【8 9 1 。 本章就m c s 的结构，种类，毒性危害，环境归趋加以初步介绍，并对国内外对 微囊藻毒素降解菌的选育进展，酶催化降解机理及藻毒素降解基因的研究作了 详细的综述。 1 1 微囊藻毒素简介 1 1 1m c s 的产生、结构及理化性质 1 1 1 1 微囊藻毒素的产生 m c s 主要是由水华蓝藻中的铜绿微囊藻( m i c r o c y s t i s a e r u g i n o s a ) 产生，此 外其他种类的藻类，如鱼腥藻( a n a b a e n a ) 、念珠藻( n o s t o c ) 及颤藻( o s c i l l a t o r i a ) 的某些品系也能产生这类毒素【i 们。微囊藻是否能够产生微囊藻毒素主要是由其 遗传基因决定的i l ，但外部环境条件的变化也可调控产毒基因的表达。研究表 明，毒素肽合成酶基因控制合成微囊藻毒素f 1 2 】，其合成机制与核糖体无关，且 不会被蛋白质合成抑制剂影响l l3 1 。另外，外部环境因素( 如光照，温度，p h 值， 营养盐浓度等) 也会在一定程度上影响微囊藻毒素的产生【1 4 j 6 】，其中光照是影 响毒素产生的制约因素。一般认为2 0 左右时，微囊藻毒素的毒性最强，而这 种温度并非微囊藻生长的最适宜温度。营养盐的种类及其浓度也会对微囊藻产 毒过程产生不同影响，如微囊藻毒素的产生量与铁、锌的浓度呈反比。环境因 素主要是通过对蓝藻细胞的分裂速度进行调控从而对微囊藻毒素的产生量起到 影响作用1 1 7 j 。 武汉理工大学硕士学位论文 1 1 1 2m c s 的结构 m c s 是一类由7 个氨基酸组成的具有生物活性的环状多肽，其基本结构为 d 丙氨酸l x 赤b 甲基一d 异天冬氨酸l z a d d a d 异谷氨酸- n 甲基脱氢丙 氨酸，( 如图1 1 所示) ，其中a d d a ( 3 氨基9 甲氧基一2 ，6 ，8 三甲基一l o 一苯- 4 ，6 二烯酸) 是m c 表达生物活性的必须基团，x ，z 是两种可变l 氨基酸，由于它 们在m c s 结构组成中氨基酸种类的不同而导致了m c s 的多样性【1 8 j ，目前已经 分离鉴定的m c s 异构体已达8 0 余种【1 9 1 ，其中毒性较高，存在较普遍的是m c l r 、 m c r r 和m c 乇【2 0 1 ，l 、r 、y 分别代表的是l e u ( 亮氨酸) 、a r g ( 精氨酸) 和t y r ( 酪氨酸) ，我国富营养化水体产生的主要是m c l r 和m c r r 【z 。 g l h c h 1 v i e a s p 图1 1m c s 的分子结构 f i g 1 - 1m o l e c u l a r s t r u c t u r eo f m i c r o c y s t i n s 0 越 1 1 1 3m c s 的理化性质 m c s 易溶于水和甲醇，且不易挥发，具有抗p h 变化的特性。它在水中的溶 解度大于1g l ，不易沉淀或是被吸附于沉淀物和悬浮颗粒物中 2 2 1 ，由于其相对 分子量较低且具有环状结构故稳定性高，难以发生降解【2 3 1 。m c s 在纯水中发生 自然降解的过程十分缓慢，在去离子水中可保持稳定状态达2 7 天【2 4 1 ，在干燥的 状态下则能保存数年之久【2 副。此外，由于m c s 还具有较高的热稳定性，加热煮 沸亦无法破坏其毒性，但是在紫外线照射下m c s 有可能因为发生光降解和异构 2 武汉理工大学硕士学位论文 作用而失去毒性【2 6 1 。然而常规的水处理工艺，如混凝、沉淀、过滤、加氯等均 不能有效去除水中的m c s 9 2 7 。 1 1 2m c s 的危害 m c s 对于许多物种都有毒性作用，由于其对肝脏、肾脏等器官的毒性及其 强促癌性，m c s 已被认为是严重威胁野生生物及人类健康的环境污染物并得到 了广泛关注。 高浓度的m c s 可影响水生植物种类的多样性从而帮助蓝藻获得竞争优势， 直至形成水华【2 8 2 9 1 。m c s 还可对鱼类的肝脏、肾脏、鳃、血液循环系统、消化 器官、免疫系统等造成损害，并进一步导致鱼类产生一系列行为学改变【3 0 3 1 1 。 当水体中m c s 达到一定浓度时，可造成鱼卵变形、藻类死亡、鱼类生长异常或 死亡【3 2 1 ，但在急性毒性的实验中发现鱼类对m c l r 的耐性远强于小白鼠【3 3 1 ， 这可能是由于水生生物比哺乳动物更多的暴露于含有m c s 的水环境中，长期进 化导致m c s 在水生生物体内的清除或代谢速率快于哺乳动物。m c s 作用的主要 靶器官是肝脏，它极易从血液中转移到肝脏中，并且依赖肝脏中的胆酸转运系 统进入肝脏细胞，通过饮用水长期接触低浓度的m c s 可能促成肿瘤或诱发肝癌 】。近年来，由m c s 引起的人类及动物的中毒、死亡事件频频发生，其对人类 健康造成的影响已引起了世界范围内的重视。人类直接接触或饮用藻类污染过 的水体，会引起结膜炎、鼻炎、皮肤反应、发烧以及急性肠胃炎等病症，若长 期接触或饮用此类水，则可能诱发皮肤癌、肝炎或肝癌 1 0 8 】。世界上发现的首例 m c s 致人死亡的报道是1 9 9 6 年在巴西的一个血液透析中心，因透析液受m c s 污染导致1 3 0 名病人中的1 1 6 人出现异常反应，其中至少2 6 人死亡【3 5 】。研究表 明，m c s 在饮用水中的含量与肝癌、大肠癌的发病率有着直接的关系【3 6 】，家畜 及野生动物饮用了被m c s 污染的水后，会发生腹泻、呕吐甚至死亡。近年来， 我国除了在水华高发的滇池、巢湖、太湖有较为严重的m c s 污染，在长江、黄 河中下游的许多水库、湖泊以及养殖水体中也检测出了较高浓度的m c s ，因此 水体的m c s 污染已成为我国及其它许多国家所面临的一个突出的水环境安全问 题1 3 7 ，世界卫生组织建议将饮用水中m c s 的浓度控制在1ug t , 以下。 3 武汉理工大学硕士学位论文 1 1 3m c s 的环境归趋 m c s 是细胞内毒素，只有当蓝藻细胞死亡或溶解后才会被释放到水体田j 。 自然水体中m c s 浓度降低的途径有多种，主要包括：水量稀释，光降解，颗粒物 吸附，生物积累和微生物降解等。 尽管湖泊、河流中蓝藻细胞死亡所释放的m c s 可被大量水体稀释，但是大面 积的水华暴发后大量蓝藻细胞溶解、死亡会使得水体中的毒素浓度达至u m g l 的 水平，从而对人和动物的健康构成极大威胁。 有研究表明，在光照充足的条件下，m c s 可发生缓慢的光降解或异构化从而 导致其毒性降t 氐f 3 8 】。m c s 进行光降解的速率不仅受光照强度的影响，同时还受 催化剂的量的限制，只有在水体中有水溶性的细胞色素或腐殖质等光降解催化 剂存在时，m c s 才可发生光降解1 3 9 ，4 0 l ，t s u j i 等人对m c s 的稳定性实验发现，环 境中色素的存在可加速m c s 的分解【3 8 】。 如前所述，m c s 不易沉淀且不易被沉淀物和悬浮颗粒物吸附，这是因为它的 分子中含有极性官能团，具有一定的亲水性，因此m c s 更易留在水相中，而非被 吸附到沉积物上【捌。在利用各种吸附材料吸附m c s 的研究中，m i l l e r 4 1 】等发现具 有高有机碳含量和高粘土含量的土壤可以有效吸附和降解m c s 。p e n d l e t o n 4 2 j 等 发现同时含有微孔和中孔的木基活性炭比仅含有微孔的椰壳基活性炭吸附 m c l r 的效果更好，这说明吸附剂的孔径对m c s 的吸附能力有一定影响，且吸附 量根据p h 的变化而发生明显的变化。 目前，已在长期暴露于m c s 的鱼类、虾、蟹体内检测到较高水平的m c s 富集 4 3 1 。w a t a n a b e 发现m c s 在浮游动物体内的含量是蓝藻中m c s 含量的2 倍，且通过 对三种浮游动物对m c s 的积累能力进行比较发现b f a t a l i s 对m c s 有较好的积累 作用即j ，因此认为m c s 有可能被某些生物富集。 而近年来，国内外的一些学者研究了非经典的生物操纵法对微囊藻水华的 控制效果，该法通过放养食用浮游生物的鱼类( 鲢鱼、鳙鱼等) 同时控制凶猛 性鱼类的数量来控制蓝藻水华【4 5 蛔，虽然此法能较好的控制水华蓝藻细胞的量， 但却很有可能导致m c s 被富集于鱼体内并通过食物链进行传递，从而威胁到人类 及动物的饮食健康及安全。 微生物降解是自然水体中m c s 的一种主要降解途径1 4 7 j ，研究发现，有m c s 降解能力的细菌是广泛存在的，在污水沟【删、湖水 4 9 1 、沉积物【2 4 l 和河水i 明中均 4 武汉理工大学硕士学位论文 已发现对m c s 具有降解能力的土著细菌，并且在现场实验中也观察到了m c s 的 生物降解作用。目前已有多株m c s 降解菌从环境样品中被分离出来，这些具有 m c s 降解能力的微生物通过打开m c s 的环状结构或是改变微囊藻毒素a a a a n 链 的结构来降低其毒性【5 0 1 。微生物去除m c s 污染具有成本低廉，安全可靠，利 于生态修复等特点，是一种很有潜力的去除m c s 方法，具有较高研究价值【5 1 1 。 1 2m c s 的微生物降解 1 2 1 混合菌群对m c s 的降解 由于m c s 的分子量较低且具有环肽结构和间隔双键，所以在水体中有较好 的稳定性【5 列。目前国内外的许多研究发现，在天然水体中都广泛存在着m c 降 解菌。r a p a l a l 2 4 5 3 】研究了湖泊中的微生物菌群对m c s 的降解情况，发现发生过 蓝藻水华的湖泊其沉积物及水柱中的微生物菌群对m c s 的降解速率比没有发生 过蓝藻水华的湖水体对m c s 的降解快。h y e n s t r a n d “】对湖泊水和沉积物中的细 菌进行分离后，再对m c s 降解活性进行验证，发现仅有1 7 的菌株对m c s 具有 降解作用。 m c s 降解菌除了在自然界中存在，也被发现存在于排污池及稳定塘l 吲，慢 速砂滤池【5 s 、人工湿地【1 0 3 1 等很多水处理人工构筑物中。l a m 5 6 1 发现，污水处理 厂出水口的微生物经过收集并驯化后也对m c s 表现出较强降解活性。吕锡武【5 刀 等采用序批式生物膜反应器对三种不同的m c s 进行了降解实验，发现经过2 4h 处理后，好氧反应器对这三种m c s 的去除率均 9 0 ，而缺氧反应器对它们的 处理效果分别为m c r r5 2 ，m c y r2 4 ，m c l r1 4 6 ，远远低于好氧反应 器的除毒素效率。然而，自然水体中，尤其是发生水华的富营养化水体及其沉 积物中存在着大量的缺氧及厌氧环境，陈晓副5 8 】等对滇池沉积物中的混合菌群 在厌氧条件下对m c l r 的降解能力进行了考察，发现该菌群能在2d 内将m c l r 从5m g l 降解至检测限下，有较强的m c s 降解能力。一些细菌在相互协同或辅 助的情况下对m c s 表现出更高的降解活性。李现尧【删发现并分离出了一株微囊 藻毒素降解辅助菌，该菌株自身对微囊藻毒素几乎无降解能力，但是在其与一 株m c 降解菌协同作用时能将该株m c s 降解菌的降解效率提高6 6 7 。敖鸿毅 【6 1 】等人利用双协菌降解m c s ，在2 8 3 2 条件下经过6d ，m c 的浓度可降至不 足1 0 。降解菌群对m c s 的降解速率一般受环境因素及m c s 诱导的影响，一般 5 武汉理工大学硕士学位论文 环境中的m c s 微生物降解存在一个迟滞期，该迟滞期的长短与这两个因素有关， 温度升高、降解菌群生物量增大及m c s 暴露均可缩短迟滞期并使m c s 的微生物 降解速率显著增加【4 7 1 。此外，p h 值对m c s 的降解过程也有较大影响，中性及 弱碱性环境更利于m c s 的微生物发挥其降解活性【5 9 1 。 1 2 2 纯菌株对m c s 的降解 混合菌群具有降解m c s 的能力，但想要深入了解m c s 降解菌对m c s 的降 解机理的前提是从自然环境中分离出具有m c s 高效降解能力的纯菌株。目前越 来越多的具有m c s 降解能力的菌从环境中被分离出来，迄今为止，n c b i 上的 m c s 降解菌已有4 0 余株，这些降解菌主要分布在变形菌门【6 3 1 ，放线菌门1 6 q ，和 厚壁菌门【6 5 l ，其中大部分降解菌属于a 变形菌纲的s p h i n g o m o n a s 属f 4 7 ，8 2 ，9 2 ，1 0 1 】和 s p h i n g o p y x i s 属【5 5 1 0 5 1 ，还有一些研究发现益生菌也对m c s 具有一定的降解能力 6 6 1 o 目前分离的a 变形菌纲的m c s 降解菌大多属于s p h i n g o m o n a d a c e a e 科，其 中s p h i n g o m o n a s 属和s p h i n g o p y x i s 属的最多，并且因为一株m c 降解菌的分离， 在该科中还提出了新的种属s p h i n g o s i n i c e l l am i c r o c y s t i n i v o r a n sg e n n o v s p n o v 【6 7 1 。19 9 4 年，j o n e s l 4 7 1 率先分离出一株m c 降解菌s p h i n g o m o n a sa c m 3 9 6 2 ，该 菌可将m c 降解为毒性比它小2 0 0 倍的线型m c ，对m c l r 和m c r r 的日降解 速率分别达到了1 3 0m g l 和5 4m g l ，但对节球藻毒素( n o d ) 无降解作用。 2 0 0 3 年，s a i t o 6 8 】从日本的k a s u m i g a u r a 湖中分离出一株能快速降解m c r r ， m c y r 和m c l r 的降解菌m d 1 ；通过1 6 s r r n a 分析该菌同样属于鞘氨醇单胞 菌属( s p h i n g o m a n a s ) 。2 0 0 4 年，i s h i i l 6 9 1 等也从日本的s u w a 湖中分离出一株m c 降解菌s p h i n g o m o n a ss p 7 c y ，该菌可在4 天内将m c l y ，m c l w ，m c l f 及 m c l r 降解至检测限下，并发现该菌株不能单独降解节球藻毒素n o d ，可在 m c r r 同时存在的条件下则可将这两种蓝藻毒素一起降解完全，推测该菌株在 被m c r r 诱导以后可能合成了一种特殊的蛋白酶才具有对n o d 的降解能力。 2 0 0 6 年，v a l e r i a ( 7 0 】等从阿根廷的s a nr o q u e 水库分离出一株s p h i n g o m a n a ss p c b a 4 ，该菌可在3 6h 内将2 0 0l lg l 的m c r r 降解完全。2 0 0 1 年，p a r k 1 0 4 1 等从日本的s u w a 湖中分离出一株m c s 降解菌y 2 ，该菌对m c l r 和m c r r 的 日降解率分别为5 4m g l 和1 3 0m g l ，从生化分类上该菌属于鞘氨醇单胞茵属 ( s p h i n g o m a n a ss p ) ，但从1 6 sr r n a 序列分析来看，它并不属于该菌属，而属 6 武汉理工大学硕士学位论文 于一种新的茵属或菌种。2 0 0 3 年，m a r u y a m a 6 7 】等人从日本的t e l 州河中分离 出两株新的m c 降解菌m d b 2 和m d b 3 ，这两株菌与p a r k ( 1 0 4 】等于2 0 0 1 年分离 的y 2 菌在系统发育学上极为相似，继而对这三株菌的种类进行了详细的界定， 结合化学分类和表型特征分析以及系统发育信息的分析提出了一个新的种属概 念s p h i n g o s i n i c e l l am i c r o c y s t i n i v o r a n sg e n n o v s p 1 2 0 r ，y 2 为这个新种属的模式 菌株。1 9 9 7 年，h a r a d a ( 7 l 】从日本的t s u k u i 湖中分离出的m c 降解菌b 9 ，在这个 新的属种提出后，于2 0 0 6 年经1 6 sr d n a 鉴定发现与y 2 同样也属于 s p h i n g o s i n i c e l l am i c r o c y s t i n i v o r a n s s l 】，b 9 菌不仅能降解m c s ，同时对n o d 也 具有显著的降解能力【7 3 1 。2 0 0 9 年，h o 7 4 】等从澳大利亚南部m y p o m g a 水库的生 物砂滤池中分离出了一株能降解m c l r 和m c l a 的细菌s p h i n g o p y x i ss p l h 2 1 ， 并发现该菌在初次降解m c 时，m c 的初始浓度越高的情况下，该菌的降解迟滞 期越长，但再重新加入m c 时能迅速降解m c 。同年，o k a n o t 7 5 】等从中国贵州的 h o n g f e n g 湖中分离出一株m c 降解菌s p h i n g o p y x i ss p c - 1 ( a b l 6 1 6 8 4 ) ，其最适生 长酸碱度及对m c 降解活性最强的酸碱度均为中性( 6 5 2 p h 9 0 ，得到的m c l r 溶液用灭菌的孔径为o 2 2g m 的醋 酸酯纤维素滤膜过滤除菌，置于4 冰箱中保存待用。 武汉理工大学硕士学位论文 2 1 3 培养基 无机盐液体培养基组成：k 2 h p 0 4o 5g ，k h 2 p 0 40 5g ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5g ， f e s 0 4 7 h 2 0o 0 1g ，n a c l0 5g ，h 2 01 0 0 0m l ，用1 0 n a o h 调节p h 值到7 。 有机培养基采用y p 培养基：酵母粉3g ，蛋白胨3g ，m g s 0 4 7 h 2 00 5g ， c a c l 2o 3g ，h 2 01 0 0 0m l ，用1 0 n a o h 调节p h 值到7 。 半固体水琼脂组成：琼脂5g ，h 2 0 1l 。 固体琼脂组成：琼脂1 8g ，h 2 01l 。 厌氧指示剂( g l ) ：刃天青1 2g 。 2 1 3 菌种来源 本实验室于2 0 0 9 年从长期遭受m c s 污染的滇池沉积物中通过三层平板分离 法分离出的一株m c s 高效降解菌株x 2 0 。将2 0 。c 保存的菌液置于3 0 的温箱 中复苏半小时，然后按1 0 的接种量接种至灭菌的y p 液体培养基中扩大培养， 验证其对m c l r 的降解活性后，供后续实验使用。 2 2 实验方法 2 2 1x 2 0 菌的形态特征 ( 1 ) 菌落形态 为观察该菌株的菌落形态，将菌株x 2 0 按稀释度1 1 0 q ，l 1 0 ，1x 1 0 而 进行有机固体平板涂布，于3 0 恒温箱中避光静置培养4d 左右，定期观察菌 落的生长情况及其形态，包括菌落大小、形状、颜色、边缘、光泽、粘稠度、 隆起状况等。 ( 2 ) 革兰氏染色 a 菌株准备将涂布的有机固体平板置于3 0 恒温箱中培养4d 待用； b 涂片在酒精浸泡过并烘干的载玻片中央滴一滴蒸馏水，在火焰上方烧红 接种环以除去环上的杂菌，待接种环冷却后，从长出单菌落的固体平板上挑取 菌种并与载玻片上的水滴混匀，在玻片上涂布成均匀的薄层。 c 干燥与固定将涂有菌液的玻片在微火上方烘干，并通过火焰2 3 次加热 使得蛋白质凝固而附着在载玻片上( 以不烫手为宜) 1 6 武汉理工大学硕士学位论文 d 染色将固定过的涂片平放，向涂有菌液处滴加草酸铵结晶紫溶液染色约 1m i n ，水洗。 f 媒染向涂有茵液处滴加卢氏碘液染色约lm i n ，水洗，并用滤纸吸去水 分。 d 脱色将9 5 的酒精滴在玻片上，轻轻摇动玻片进行脱色，2 0s 后水洗， 再用吸水纸吸去水分。 e 复染将番红染液滴加在玻片上复染1m i n 后用自来水冲洗，再用吸水纸 吸干。 ， f 镜检在油镜下观察染色结果。 观察到的菌体颜色若为紫色则该菌为革兰氏阳性菌，若为红色则该菌为革 兰氏阴性菌。 ( 3 ) s e m 电镜检测 电镜标本制备：在酒精消毒过的盖玻片上滴一滴无菌水，挑取y p 固体平板 上生长的x 2 0 菌单菌落于无菌水上均匀涂开，待无菌水快干的时，将盖玻片置 于无菌平皿中，滴加2 5 的戊二醛溶液，盖好平皿，置于4 冰箱过夜固定。 第二天取出固定好的x 2 0 菌样品，用灭菌的磷酸钾盐缓冲液冲洗玻板3 次，每 次2m i n ，然后将样品用不同浓度的乙醇溶液进行梯度脱水( 3 0 ，5 0 ，7 0 ， 8 0 ，9 0 ，9 5 ，1 0 0 ) ，由低浓度向高浓度进行，每次脱水时间约为1 0m i n t l 0 7 】， 最后一次使用1 0 0 乙醇脱水6m i n ，酒精脱水后将样品置于无菌操作台内，通 过无菌风使其干燥，干燥后的样品送至武汉理工大学测试中心用于扫描电镜 ( s e m ) 检测。 2 2 2x 2 0 菌生理生化指标的测定 本实验采用杭州微生物试剂有限公司提供的细菌生理生化鉴定管来测定 x 2 0 菌的一系列生理生化指标，具体操作如下：在无菌通风人工操作台中用灭菌 并烧红的接种环从y p 固体平板上挑取x 2 0 菌的单菌落分别置于不同的生理生 化鉴定管中混匀，接种后将生理生化鉴定管放置于小试管中塞上灭菌棉塞，于 3 0 恒温培养箱中避光静置培养4 7d ，定期观察，记录生理生化鉴定管的颜色 变化情况。 除生理生化鉴定管实验外，我们还进行了以下这些指标的检验： ( 1 ) x 2 0 菌的过氧化氢酶检验：通过向有机好氧平板上生长的菌落上滴加 1 7 武汉理工大学硕士学位论文 3 的过氧化氢溶液，若产生气泡则过氧化氢酶检验结果为阳性，无气泡则为阴 性。 ( 2 ) x 2 0 菌的运动性检验：通过穿刺接种实验进行，将y p 半固体培养基 高温高压灭菌，分装至灭过菌的试管中，室温下待其凝固，用高温高压锅灭菌 过的接种针粘取少量菌液，向y p 半固体培养基中进行穿刺，置于3 0 下避光 静置培养，定期观察，根据生长状态判断细菌的呼吸类型和运动性。 ( 3 ) x 2 0 菌的呼吸类型检验：通过厌氧固体平板涂布的方法进行检验，具 体实验方法如下： a 、厌氧条件的控制：本实验的厌氧环境由厌氧培养箱提供，检查厌氧箱的 密封性后向其中放入一个特制塑料袋，该袋容积与箱内体积相似，一边抽出箱 内的空气，一边向塑料袋中充入n 2 ，待n 2 充满塑料袋后关闭真空泵，将袋内 n 2 排至箱中，取出塑料袋，连续两次此操作后，再向箱内充入混合气使得 n 2 ：h 2 ：c 0 2 - - 8 5 ：1 0 ：5 ，采用烘干活化的钯粒作为催化剂催化箱内剩余的氧气创造 厌氧环境，同时箱内放置一瓶硅胶粒以吸收0 2 和h 2 被钯粒催化所生产的h 2 0 ， 2 小时后在箱内打开一瓶美兰指示剂，若美兰不变色说明箱内厌氧条件良好，实 验过程中持续向箱内通入少量氮氢混合气以保持厌氧环境。 b 、厌氧固体平板制作：将y p 固体培养基高温高压灭菌后加入过o 2 2um 混合纤维酯微孔滤膜的n a 2 s 溶液( n a 2 s 浓度为0 1 2g l ) ，同时按o 1 2g l 浓度 加入刃天青指示剂，混匀，将还未凝固的y p 固体培养基按分装至2 5 0m l 磨口 锥形瓶中，每瓶中约2 5m l ，待固体培养基凝固后，放入厌氧培养箱中，同时放 入的还有1 0m l 好氧条件下震荡培养至生长对数期的x 2 0 菌液，打开紫外灭菌 灯3 0r a i n ，待y p 培养基中的刃天青由红色变为无色后，用无菌双蒸水将x 2 0 菌液稀释为1x1 0 4 ，1 1 0 一，l 1 0 击三个稀释度，取不同稀释度的x 2 0 菌液 3 0ul 分别涂布在不同的y p 固体平板上，将玻璃塞抹上凡士林后给锥形瓶封口， 置于3 0 下避光静置培养。定期观察，根据其生长状态判断x 2 0 茵的呼吸类型。 2 2 3x 2 0 菌的1 6 sr d n a 鉴定 本实验采用煮沸法提取x 2 0 菌的基因组d n a l l 嗍，作为扩增1 6 sr d n a 的模 板。 p c r 引物： p c r 反应引物采用的是细菌1 6 sr d n a 的通用引物 1 8 武汉理工大学硕士学位论文 正向引物为：2 7 f ：5 a g a g t ，r t g a t c c t g g c t c a g 3 反向引物为：1 4 9 2 r ：5 g g r r a c c t t g t t a c g a a c t t - 3 p c r 反应体系： 本实验采用的是2 5 灿体系，其中包含有： 1 0 x p c rb u f f e r 2 5 此 d n t p 2 5 “l 2 7 f 0 5 肛l 1 4 9 2 r0 5p l p o l y m e r a s et a q0 5 止 t e m p l a t e2 0 皿 p c r 反应条件： 9 4 预变性5m i n 9 4 变性3 0s 5 5 退火1m i n 7 2 延伸9 0s 7 2 1 0 m i n 4 1 0m i n 3 0 个循环 p c r 的反应程序为9 4 预变性5r a i n ，9 4 变性3 0s ，5 5 退火3 5s ，7 2 s 延伸9 0s ，此步骤共进行3 0 个循环，最后7 2 延伸1 0r a i n 。 p c r 的检测： 样品用0 7 琼脂糖凝胶电泳后置于e b 中染色，再用凝胶成像系统记录结果。 p c r 产物的纯化及测序： p c r 产物的纯化及测序工作由上海美吉生物公司完成。 2 2 4x 2 0 菌的生长及m c l r 降解曲线测定 将x 2 0 菌按1 0 接种至y p 液体培养基后于3 0 避光摇床振荡培养( 摇床 转速1 0 0r p m ) ，经2 4 h 后离心收集菌体( 转速7 0 0 0r p m ) ，用无机盐培养基对所 收集的x 2 0 菌菌体洗涤两次后再将其重悬浮，向9m l 洗涤后的菌液中加入 m c l r ，m c l r 的初始反应浓度约为5m g l ，间隔取样，用分光光度计测o d 6 0 0 ， 测定同时取4 0 0 皿的样品置于2 0 c 中保存待测m c l r 的浓度。实验设置3 组 1 9 武汉理工大学硕士学位论文 平行。 2 3 结果与讨论 2 3 1x 2 0 菌的菌落形态和菌体形态 经y p 固体平板涂布后在3 0 恒温箱中避光静置培养4 8h 左右，可在平板 上看到清晰的菌落，这些菌落呈圆形，黄色，直径约为1 o 1 5i n t o ，边缘整齐， 表面光滑，较为湿润。图2 1 是m c l r 高效降解菌x 2 0 在y p 固体培养基上的 菌落形态。 图2 1m c 降解菌x 2 0 的菌落形态 f i g 2 1c o l o n ym o r p h o l o g yo fm c d e g r a d a t i n gb a c t e r i u m ，x 2 0 x 2 0 菌经过革兰氏染色后通过显微镜观察其菌体细胞为红色，说明x 2 0 菌是 革兰氏阴性菌。目前，国内外学者已从不同水体中分离出4 0 多株m c 降解菌1 9 引， 它们均为革兰氏阴性菌，但是否具有m c s 降解能力的细菌均为革兰氏阴性菌还有 待考证。图2 2 是菌体的扫描电镜图( 放大倍数为1 0 0 0 0 倍) ，由图可见，x 2 0 菌 呈短杆状，经4 8h 的培养，菌体大小为0 2 o 3l am 0 4 1 3um 。 武汉理工大学硕士学位论文 图2 2 菌株x 2 0 的扫描电镜照片( 1 0 0 0 0 x ) f i g 2 2p h o t oo fs a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ef o rs t r a i nx 2 0 ( 10 0 0 0 x ) 2 3 2x 2 0 菌的生理生化特性 在对x 2 0 菌的形态学鉴定的基础上，进一步对其进行生理生化鉴定，其生 理生化鉴定结果见表2 3 。 由表2 3 可知，x 2 0 菌能利用赖氨酸和鸟氨酸，过氧化氢酶检验呈阳性，不 能水解纤维素，不能利用葡萄糖、甘露糖、木糖、棉子糖、山梨醇等，甲基红 ( m r ) 和乙酰甲基甲醇( v p ) 反应呈阴性。 x 2 0 菌在半固体培养基中进行穿刺培养，经2 , - - - 4d 的培养与观察，发现x 2 0 菌落在水琼脂中延穿刺线呈树状向培养基生长，说明其具有一