（发酵工程专业论文）聚ε赖氨酸菌株筛选与发酵工艺的研究.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 聚- 赖氨酸( p o l y - - l y s i n e ，简称p l ) 是一种主要由自色链霉菌( s t r e p t o m y c e s a l b u l u s ) 产生的、由2 5 - - - 一，3 0 个赖氨酸残基通过其a 一羧基和8 氨基形成的酰胺键连接 而成的同型单体聚合物。它具有抑菌谱广、安全性高、水溶性好、热稳定性好、 适应p h 范围广等特点，被广泛应用于食品、生物医药、化工等领域，特别是在食 品防腐剂方面具有巨大的应用前景。 本论文筛选了一株p l 高产菌株白色链霉菌( s t r e p t o m y c e sa l b u l u s ) ，对 其发酵工艺和提取工艺进行了初步研究，对一p l 的稳定性进行了初步探讨。主要 研究结果如下： 从土壤中筛选了株聚- - 赖氨酸( 一p l ) 高产菌株，p l 摇瓶产量人于 2 l ，通过菌落形态观察、镜检观察，结合其生理生化特征分析，初步判断该菌株 为s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 。 采用薄层层析、紫外扫描( u v ) 、高效液相色谱( h p l c ) 、傅立叶变换红 外光谱( f t - i r ) 等多种测试手段对s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 发酵产物p l 进行了初步 表征，初步确定本实验制备的样品为p l 。 利用正交实验对该s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 发酵生产一p l 的培养基成分进行了 优化。实验结果表明，该菌株生产p l 的优化培养基为：葡萄糖3 ，酵母粉0 5 ， ( n h 4 ) 2 8 0 41 5 ，k h 2 p 0 40 2 、k 2 h p 0 40 1 2 、m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 、f - e s 0 4 7 h 2 0 0 0 0 3 、z n s 0 4 7 h 2 00 0 0 8 。在优化培养基下，p l 摇瓶产量达到4 9 5 l 。通 过单因素实验对s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 培养条件的研究结果表明：发酵温度3 0 ， 装液量7 5 m l 5 0 0 m l ，初始p h 7 0 ，接种量4 时，p l 的最高产量为5 1 0 l 。 对离子交换树脂提取发酵液中p l 的工艺条件进行了研究，确立的最佳提 取条件为：使用弱酸性阳离子交换树脂d 1 5 2 ，上柱液p h 8 5 ，以盐酸作为洗脱剂， 洗脱荆浓度为0 1 m o l l ，洗脱速度为1 0 m l m i n 。在优化条件下，p l 平均提取得 率为8 2 ，产品纯度达到了8 0 以上。 利用高效液相色谱仪初步研究了p l 的稳定性。结果表明：p l 在p h 2 1 l 范围内稳定，抗酸能力强，在磷酸、醋酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸等溶液中 稳定：p l 的热稳定性极高；在低浓度的还原剂亚硫酸钠溶液中稳定性较好：一 定浓度的食品添加剂对p l 的稳定性影响不大。一p l 作为食品防腐剂具有较好的 应用潜力。 关键词：聚- 赖氨酸；白色链霉菌；筛选；发酵；提取 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t p o l y 一一l y s i n e ( p l ) f r o ms t r e p t o m y c e sa l b u l u si sah o m o p o l y a m i n oa c i dt h a t c o n s i s t so f2 5 - - - 3 0r e s i d u e so fl - l y s i n ew i t ht h ep e p t i d eb o n db e t w e e n0 【- c a r b o x y la n d a m i n og r o u p so fl - l y s i n e b e c a u s eo fi t sw i d ea n t i m i c r o b i a ls p e c t r u m ，s a f e t y ，h i g h w a t e rs o l u b i l i t y ，w e l lt h e r m a ls t a b i l i t ya n daw i d er a n g eo fp ha d a p t a b i l i t y , p lh a s b e e nw i d e l yu s e di nm a n yf i e l d si n c l u d i n gf o o di n d u s t r y ，b i o m e d i c i n e ，c h e m i c a l e n g i n e e r i n g ，e s p e c i a l l yi nt h ea s p e c to ff o o dp r e s e r v a t i v e t h i sd i s s e r t a t i o nf o c u s e do ns c r e e n i n go f p l - p r o d u c i n gs t r a i n ，o p t i m i z a t i o no f f e r m e n t a t i o nt e c h n i q u e ，c o n d i t i o no ff e d b a t c hf e r m e n t a t i o n ，e x t r a c t i o nt e c h n i q u ea n d t h es t a b i l i t yo f - p l t h ep r i m a r yr e s u l t sa r es h o w na sf o l l o w s ： o n es t r a i nw i t h2 9 l y i e l do f - p lw a sf i r s t l ys c r e e n e df r o ms o i io na na g a r p l a t ec o n t a i n i n gm e t h y l e n eb l u ea n dt h e n f u r t h e rs e l e c t e db yaf l a s ke x p e r i m e n t a c c o r d i n g i t s m o r p h o l o g y a n d p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，t h e s t r a i nw a s p r e l i m i n a r i l yi d e n t i f i e da ss t r e p t o m y c e sa l b u l u s w i t ht h eh e l po fv a r i o u si n s t r u m e n t ss u c ha su vh p l ca n dn i r ，w e a n a l y z e dt h ef e r m e n t a t i o no u t c o m eo fs a l b u l u sa n dc o n f i r m e dt h a tt h es p e c i m e ni s p l t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mf o r p lf r o ms t r e p t o m y c e sa l b u l u sw a so p t i m i z e d b yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s t h eo p t i m a lm e d i u mc o n s i s t e do f3 g l u c o s e ，0 5 y e a s t e x t r a c t ，1 5 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，0 2 k h 2 p 0 4 ，0 1 2 k 2 h p 0 4 ，0 0 5 m g s 0 4 7 h 2 0 ， 0 0 0 3 f e s 0 4 - 7 h 2 0a n d0 0 0 8 z n s 0 4 7 h 2 0 t h ey i e l do f 一p lr e a c h e d4 9 5 l 1 h ec u l t u r ec o n d i t i o n so fs a l b u l u sa r ea l s oi n v e s t i g a t e da n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ey i e l do f - p la c h i e v e d5 1 0 9 lw h e nt h ef e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a s3 0 ， c u l t u r em e d i u ma m o u n tw a s7 5 m l 5 0 0 m l i n i t i a lp hw a s7 0a n di n o c u l a t i o na m o u n t w a s4 t h es t u d yw a sc o n d u c t e dt oe x p l o r et h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f 一p le x t r a c t i o n f r o mb r o t h t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r el i s t e da sf o l l o w s ：p lw a si s o l a t e du s i n g w e a ka c i d i c c a t i o ne x c h a n g er e s i nd1 5 2w i t ht h ep ho ff e r m e n t a t i v eb r o t hb e i n g a d j u s t e dt o8 5b e f o r ei tw a sp u ti n t ot h er e s i nc o l u m n ，h c le l u t i o n0 1 m o l la n d e l u t i o ns p e e da t1 0 m l m i n a p p l y i n gt h ea b o v ec o n d i t i o n s ，p lw a sy i e l d e da tar a t e a b o u t8 2 a n dt h ec o n t e n to f 一p li sm o r et h a n8 0 t h es t a b i l i t yo f p lw a si n v e s t i g a t e db yh p l c t h er e s u l t ss h o w e dt h a t 一p l w a ss t a b l ea tp h 2 11a n dr e s i s t a n tt oa c i d ，s u c ha sp h o s p h o r i ca c i d ，a c e t i ca c i d ，c i t r i c a c i d m a l i ca c i da n dt a r t a r i ca c i d t h e 一p lh a ss t r o n gs t a b i l i t yt oh e a t i n ga n dh a sa l s o s t a b i l i t yt or e d u c i n ga g e n ta ts o m ee x t e n t s o m ef o o da d d i t i v e st e s t e dh a v en oe f f e c t s o nt h es t a b i l i t yo fe p ls o ，一p lh a sw i d ea p p l i c a t i o np r o s p e c ta sf o o dp r e s e r v a t i v e k e y w o r d s ：p o l y 一一l y s i n e ；s t r e p t o m y c e sa l b u l u s ；f e r m e n t a t i o n ；e x t r a c t i o n 溯办j 堂大謦 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创 生声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 靴论文储馘：寺匆嗍：1 钳胁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者鲐寺毒 嘲。下朋洲 湖北工业大学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 防腐剂的种类和性质 防腐剂是防止食品在储存、流通过程中主要由微生物繁殖引起的变质，提高 保藏性，延长食用价值而在食品中使用的添加剂。按照其来源，防腐剂可分为化 学防腐剂和天然防腐剂。 1 1 1 化学防腐剂的种类和性质 目前，在食品工业中主要使用的化学防腐剂有硝酸盐和亚硝酸盐、苯甲酸及 其钠盐、对羟基苯甲酸酯类、山梨酸及其盐类、富马酸二甲酯、丙酸钙、脱氢醋 酸钠等。这些化学防腐剂虽然具有良好的抑菌作用，但有些具有致突、致畸及致 癌等危害作用。 1 1 1 ，1 硝酸盐及亚硝酸盐 硝酸赫及亚硝酸盐被广泛用于肉制品的防腐保鲜中，它能抑制肉毒梭菌的生 长，同时使肉制品呈现红色和香味。但如果在食品中加入的硝酸盐及亚硝酸盐超 过一定量就会引起中毒。当硝酸盐和亚硝酸盐进入人体内被肠道吸收后，能使正 常的血红蛋白( f e 2 + ) 氧化为失去携氧能力的高铁血红蛋白( f e 3 + ) ，导致组织出现缺氧 症状。此外，亚硝酸盐能引起血压降低、头晕、呕吐、昏迷等症状，当它与仲胺 类作用时，还可形成亚硝酸胺类，严重危害人体健康。 1 1 1 2 苯甲酸钠 苯甲酸钠无味，水溶性好，最适p h 2 5 4 0 ，适合于酸性食品。在酸性食品 中，苯甲酸钠可转变为苯甲酸，对酵母菌和细菌有较强的抑制作用，对霉菌的作 用不大。它主要用于对碳酸饮料、泡菜等的防腐。但据研究，苯甲酸钠具有叠加 毒性作用，因此一些国家已禁止在儿童食品中使用。目前g b 2 7 6 0 8 6 中已明确规 定苯甲酸类防腐剂在酱油和食醋中的最大添加量为1 砼1 。 1 1 1 3 对羟基苯甲酸酯类 对羟基苯甲酸酯是世界上用量最大的防腐剂，具有高效、低毒、广谱、易配 伍等优点，防腐效果不易随p h 值的变化而变化口1 。它被广泛用于食品、化妆品和 湖北工业大学硕士学位论文 医药产品中，对真菌、细菌有较好抑制作用。但经过体内、体外毒性试验，表明 对羟基苯甲酸酯有致癌作用。 1 1 2 天然防腐剂的种类和性质 天然食品防腐剂一般是指从植物、动物、微生物中直接分离提取的、具有防 腐作用的一类物质，也称生物防腐剂，是食品防腐剂开发的主要方向之一。天然 食品防腐剂根据来源可以分为3 种类型：植物源天然防腐剂。天然存在于植物 体内，可通过人工分解、蒸馏等方法提取得到，如海藻提取物、果胶分解物、香 料提取物等；动物源天然防腐剂。可从与动物相关的物质中提取得到，如溶菌 酶、蜂胶、鱼精蛋白等；微生物源天然防腐剂。指由微生物代谢产生的抗菌、 抑菌物质，如乳酸链球菌素、纳他霉素、聚赖氨酸等h 1 。 1 1 2 1 植物源天然防腐剂 据不完全统计，目前世界上具有抑菌防腐作用的植物至少有2 0 0 0 多种，这些 植物中许多被公认是安全无毒的，它们分别属于双子叶植物、单子叶植物、藻类 和苔鲜类植物。按植物源防腐剂的来源，可将其分为四个类型：中草药来源、果 胶来源、香辛料来源、野牛植物及其他来源。 中草药来源 中草药有着天然的药用价值，这也使其成为了天然防腐剂的理想来源。李京 晶等人用黄柏、黄芩、连翘、厚朴等十味中草药水提液对金黄色葡萄球菌、枯草 芽孢杆菌、大肠杆菌等六种菌进行了体外抗菌试验，结果表明这十味中草药提取 液抗细菌活性比抗真菌活性强，且他们对以上六种供试菌的抗菌效果各有不同。 其中黄连、黄柏和黄芩提取液的总抗菌活性最强，此外，从研究结果中，我们还 可以看到，7 0 乙醇水溶液比水提取药液的抗菌活性要强瞄1 。 果胶来源 果胶是一种水溶性天然聚合物，一般可从水果、蔬菜中提取。有研究表明， 用酶分解果胶，得到的果胶分解物对食品有很强的抑菌作用，特别是对大肠杆菌 的抑制作用最为显著，其抗菌性在p h 6 0 时最强3 。目前，在国外以果胶分解物 为主要成分的天然防腐剂，已广泛应用于酸菜、咸鱼等食品的防腐中。 香辛料来源 凡主要用来做食品调味用的植物，均可称为食用香料植物，如大蒜、生姜、 黑胡椒等。目前已开发了6 0 余种食用香料植物，用于做防腐保鲜剂，如九里香属 植物、樟属植物、紫苏等等。香辛料的抑菌成分有醛、酮、酯、醚、酸等等，如 2 湖北工业大学硕士学位论文 大蒜含蒜氨酸，对黄曲霉有抑制作用；丁香花含丁香酚，对金黄色葡萄球菌、大 肠杆菌等有抑制作用阳1 。将这些成分协同，防腐效果会更好。 野生植物及其他来源 竹叶、荷叶、芦荟、苦瓜等植物提取物可用作天然防腐剂。竹叶含有机酸和 酚类化合物，有杀菌、抗氧化、抗肿瘤的作用，对金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌等 有较强的抑制作用，广泛用于腌制品和鱼、肉加工品中h 1 ；荷叶的8 0 7 , 醇提取物 对细菌、酵母菌等有明显抑制作用，且在碱性环境下抑制效果最强陋1 ；芦荟中芦荟 素有较强抑菌作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较强抑制作 用；苦瓜提取物对细菌和部分酵母菌有较好抑制作用，主要用于肉类食品的防腐。 1 1 2 2 动物源天然防腐剂 动物源天然防腐剂主要有鱼精蛋白、蜂胶、壳聚糖等。 鱼精蛋白 鱼精蛋白是在鱼类精子细胞中发现的一种细小而简单的碱性蛋白，在中性和 碱性介质中显示出很强的抑菌能力。它能抑制枯草芽孢杆菌、地衣型芽孢杆菌、 粪链球菌等的生长，但对革兰氏阴性菌抑制效果不明显硎。已被广泛应用于 面包、蛋糕、水产品、调味料等的防腐中。 蜂胶 蜂胶含有大量的黄酮类、萜烯类化合物、氨基酸等多种生物活性物质，具有 较好的抗氧化特性和较强的抗菌作用n u 。孟日增等研究蜂胶的抑菌活性表明，蜂 胶对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等有较强的抑制作用，对芽孢杆菌、沙 门氏菌、黑曲霉等也有明显的抑制作用f 1 2 o 壳聚糖 壳聚糖又名几丁聚糖，由甲壳质脱乙酰水解而成，主要来源于甲壳动物的表 皮、昆虫和一些细菌及真菌的细胞壁，是一种成本较低、安全无毒、防腐保鲜效 果好的天然防腐剂。屠洁等对壳聚糖的抗菌性能进行研究，发现壳聚糖对金黄色 葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑制效果随脱乙酰度的增加而增强，对大 肠杆菌的抑制效果随分子量的增大而减弱，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌， 分子量范围为5 0 - - 1 0 0 k d a 的壳聚糖抑菌效果最好n 引。 1 1 2 3 微生物源天然防腐剂 微生物源天然防腐剂主要是指由微生物代谢产物制得的天然防腐剂，具有高 效、无毒、适用性广等特点，霉菌、细菌、放线菌、酵母菌等多种微生物都可代 3 湖北工业大学硕士学位论文 谢产生具有抑菌活性的物质。近年来，开发微生物源天然食品防腐剂已成为食品 保藏研究的热点，将具有十分广阔的前景。 溶菌酶 溶菌酶又称胞壁质酶，主要通过破坏细胞壁中的n 乙酰胞壁酸和n 乙酰 氨基葡糖之间的1 3 - 1 ，4 糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导 致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解n 引。它是一种天然蛋白质，有较强的 抗热性和稳定性，对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有分解作用， 对大肠杆菌等革兰氏阴性菌也有一定程度的溶解作用。其最适p h 5 3 - - 6 4 ， 可作为香肠、奶油、水产品等食品的防腐保鲜剂。 纳他霉素 纳他霉素由纳他链霉菌发酵产生，是一种具有活性的环状四烯化合物。纳他 霉素能有效抑制霉菌、酵母菌，其作用机理是与真菌的麦角甾醇以及其他甾醇基 团结合，阻遏麦角甾醇的生物合成，从而导致细胞破裂，引起细胞死亡口5 t 吲。因 此，可以把纳他霉素直接添加到酸奶等发酵制品中，抑制霉菌和酵母菌，而不杀 死有益的细菌。这是其他防腐剂所不具备的特点。 乳酸链球菌素 乳酸链球菌素是由多种氨基酸组成的多肽类化合物，进入人体体内后可作为 营养物质被人体吸收利用。它能有效抑制多种革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、 肉毒梭菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等的生长和繁殖，但对酵母菌和霉菌无抑制作用1 。 乳酸链球菌素的抗菌作用是通过干扰细胞膜的正常功能，造成细胞膜的渗透，养 分流失和膜电位下降，从而导致致病菌和腐败菌的死亡n 引。1 9 8 9 年，联合国粮食 及农业组织世界卫生组织( f a o w h o ) 食品添加剂联合专家委员会通过乳酸链球 菌素作为食品防腐剂n 引。1 9 9 0 年1 月1 9 日，我国卫生部批准将乳酸链球菌素作为食 品防腐剂在国内使用。 聚- 赖氨酸 聚- - 赖氨酸( p o l y - - l y s i n e ，简称p l ) 最早是由日本的s h i m a 和s a k a i 在白色 链霉菌( s t r e p t o m y c e sa l b u l u s ) 的发酵液中提取分离得到的乜引。它具有抑菌谱广、 安全性高、水溶性好、热稳定性好、适应p h 范围广等特点，对革兰氏阳性菌、革 兰氏阴性菌、霉菌、酵母菌等都有显著的抑制作用。可被广泛用于方便菜肴、酱 油、海产品、奶制品等的防腐保鲜中j 2 1 ，2 2 删。用于糕点、面包食品中，能有效地 抑制耐热性芽孢杆菌的增长，延长保存期；在低温软罐头食品中添加微量p l 可防止杀菌后产生异味。p l 已于2 0 0 3 年1 0 月被f d a 批准为安全食品保鲜剂，目 前已被日本、美国等发达国家广泛应用于食品加工行业中。 4 湖北5 - 业大学硕士学位论文 1 2 p l 白勺坌吉构禾口- i 生质 1 9 7 7 年日本学者从s 驴印f o ，缈c 邪a l b u l u s 的发酵液中提取出一种含有2 5 - 3 0 个 赖氨酸残基的同型单体聚合物，它是赖氨酸残基通过0 【羧基和一氨基形成的酰胺 键连接而成的，因此称为聚- 赖氨酸( p l ) 。一p l 的聚合度一般为2 5 3 0 ，数平 均分子量为4 0 9 0 ，重量平均分子量为4 7 0 0 ，其结构如图1 1 所示： 图1 1 一p l 的结构 f i g1 1t h es t r u c t i o no f 一p l 一p l 纯品为淡黄色粉末，略有苦味，吸湿性强。带正电荷，可以和阴离子物质 发生结合，没有固定的熔点，2 5 0 。c 以上开始软化分解。溶于水，微溶于乙醇，但 不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂瞳引。其不受p h 值影响，对热稳定。盐酸盐类、 酸性多糖类、磷酸盐类等可降低p l 的活性，但当盐酸、柠檬酸、甘氨酸、高级脂 肪甘油酯等与p l 合用时，有增效作用。通过对其进行红外光谱分析表明：在 1 6 8 0 c m 。1 1 6 4 0 c m 1 和1 5 8 0 c m 1 1 5 2 0 c m 。有强吸收峰乜引。 1 3e - p l 的抗菌谱和抑菌机理 p l 抑菌谱广，具有优良的防腐性能。对于霉菌中的黑曲霉、产黄青霉等，酵 母属的尖锐假丝酵母、自假丝酵母、热带假丝酵母菌、啤酒酵母等；革兰氏阳性 菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、结核杆菌、微球菌等； 革兰氏阴性菌中的产气杆菌、大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等引起 食物中毒与腐败的微生物有较强烈的抑制作用。研究表明，分子量在3 6 0 0 - - 一4 3 0 0 之间的p l 抑菌效果最好，当分子量低于1 3 0 0 时，一p l 失去抑菌活性幢4 l 。由于一p l 抑菌最适p h 5 - 8 ，因此其在中性和微酸性环境中有较强的抑菌性，并且当p l 与 醋酸双重作用时，抑菌范围比其单独使用时更加广泛。同时，e - p l 热稳定性好，经 高温处理后仍能保持良好的抑菌效果，所以在食品加工过程中不容易受到高温条 件的影响，适于使用在各种食品中。p l 的抗菌谱如表1 1 所示。 e - p l 的抗菌谱广、抑菌作用强，可能是由于它是阳离子表面活性物质，能破坏 微生物的细胞膜结构，并且能与胞内的核糖体结合，影响生物大分子的合成，最 5 湖北工业大学硕士学位论文 终导致细胞死亡。1 9 9 2 年v a a r am 发现，p l 吸附到细胞膜上可影响微生物细胞的 呼吸，与胞内的核糖体结合而影响生物大分子的合成，从而破坏膜结构完整性， 导致胞内溶酶体膜破裂而诱导微生物产生自溶作用，导致细胞死亡乜6 俐。1 9 9 5 年 d e l i h a s 等人提出不同细菌对一p l 的敏感性不同可能与细菌类型或细胞分泌p l 降 解酶类的多少有关，与细菌的细胞壁结构无必然联系。 表1 1 p l 的抗菌谱 t a b l e1 1t h ei n h i b i t o r ye f f e c t so f - p l 最小抑最小抑 菌种 m 菌i c 浓( 度l t t g 菌种 m 菌i c 浓( 度i a g ：堡曼2：堡垦! a s p e r g i l l u sn i g e ri f 0 0 4 4 162 5 0a e r o b a c t e ra e r o g e n e s8 t r i c h o p h y t o nm e n m g r o p h y t e s6 0 a c 口l i g e n c sf a e c a l i s 8 b a c i l l u ss u b t i l i s b a c i l l u sb e r v i s c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m g e o b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s l e u c o n o s 幻cm e s e n t e r o i d e s p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a c a m p y l o b a c t e rj e j u n i e s c h e r i c h i ac o l ik - 1 2 e s c h e r i c h 砌c o l if 2 s a l m o n e l l at y p h y m u r i u m r a o u l t e l l ap l a n t i c o l a c a n d i d atr o p o c a l i s c a n d i d aa c u t u si f 0 1 9 c a n d i d aa l b i c a n s 1 6 1 3 3 2 c a n d i d au t i l i s b a c i l l u sc o a g u l a n s c o r y n e b a c t e r i u m x e r o s i s a r t h r o b a c t e rs i m p l e x a r t h r o b a c t e rg l o b i f o r m i s p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m e s c h e r i c h i ac o l ib m i c r o c o c c u sa u r a n t i a c u s s a c c h a r o m y c o p s i sl i p o l y t i c a p h a f f i ar h o d o z y m ai f o 1 0 1 2 9 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e p s e u d o m o n a s p u t i d a m i c r o c o c c u sl y s o d e i k t i c u s m i c r o c o c c u sl u t e u s p r o t e u sv u l g a r i s s e r r a t i am a r c e s c e n s m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s 6 勰 2 8 8 跖 l 8 弱 眩 勰 2 2 4 2 b 2 搦 2 8 8 ； l 8 琊 心 煅 2 2 4 2 8 勉 5 卯 3 4 3 啪 1 2 插 8 勰 撕 勰 1 1 i l 湖北工业大学硕士学位论文 1 4e - p l 的产生茵 从1 9 7 7 年s h i m a 和s a k a i 发现s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 能产生p l 以来，除了s z o k a n 报道过一株丝状霉菌麦角菌( c l a v i c e p s p u r p u r e a ) 能产生一种富含肽键、类似于 一p l 的物质麦角胺外，关于p l 的产生菌的研究一直局限于s t r e p t o m y c e sa l b u l u s ， 没有较大进展，因为传统的通过分析筛选菌种的发酵液成分确定p l 产生菌的筛选 方法难以对大量微生物进行筛选1 。直至u 2 0 0 2 年，n i s h i k a w a 和0 9 a w a 利用碱性物 质( 如e p l ) 能排斥碱性染料( 如蓝色的亚甲基蓝) 和吸附酸性染料( 如红色p o l yr 4 7 8 ) 的原理发现了一种简便的平板筛选方法。从约3 0 0 种土样中筛选分离得到了十多种 p l 产生菌。它们分别属于链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 或其亲缘属北里孢菌属 ( k i t a s a t o s p o r a ) 及麦角真菌( e r g o tf u n g i ) 这几类微生物。这一崭新的筛选方 法立即引起了国内外学者的兴趣，随后贾士儒等b 、朱宏阳等n 钉、h i r o h a r a 等d 引相 继报道了一些新分离的p l 产生菌。 特别是h i r o h a r a 等借助这个筛选方法，利用两段培养技术，即细胞生长培养和 产物形成培养，筛选并确定p l 产生菌m 1 。在分离的1 9 0 0 株菌株中有2 0 0 多株能产 生阳离子聚合物。在这2 0 0 株菌株中，有5 0 多株能分泌p l 至i j 培养基中。在5 0 株菌 株中，他们系统研究了1 0 株，这1 0 株菌株都属于链霉菌属。 1 5e - p l 的生物合成机理 聚合氨基酸的生物合成有两种可能的机理，即非核糖体多肽合成酶作用下的 a m p 腺苷化方式，氨基连接酶作用下的a d p 磷酸化方式。前者通常产生分子量小 的固定长度的多肽，如莎梵婷( s u r a c t i n ) 或短杆菌肽s ，后者产生多分散性多肽， 分子量大，如聚吖谷氨酸、藻青素等聚合氨基酸。p l 的单分散性和相对短的分 子长度特性预示着一p l 的生物合成是非核糖体多肽合成酶作用下的a m p 腺苷化方 式。k a w a i 等人通过敏感的放射性同位素验证系统实现了e - p l 的胞外生物合成口“。 p l 的体外合成依赖于a t p ，但不受核糖核酸酶、卡那霉素或氯霉素的影响，在细 胞膜上检测到了p l ，表明p l 的生物合成是非核糖体肽的合成，并且这个反应是 由细胞膜上的酶来催化的。同时，这类酶也可以催化赖氨酸- a m p 和a t p p p i 之间 的转换反应。在这个模型中，赖氨酸单体首先在羧基位点被腺苷化，然后转移到 活性位点一s h 基团上，形成活化的酰胺硫酯中间体，这一特征性物质。多肽赖氨酸 的形成就是通过硫醇模板将赖氨酸的氨基与多肽赖氨酸的羧基结合起来啪1 。e - p l 合成酶能够重复催化硫酯赖氨酸的聚合反应。h i r o h a r a 等发现，s 0 4 2 为s t r e p t o m y c e s 7 湖北工业大学硕士学位论文 s p u s e 5 1 7 f h s t r e p t o m y c e sl y d i c u su s e 一1 1 生产p l 所必需。，印证了这一观点。 h i r o h a r a 等认为，p l 合成的终止可能是脂肪族多羟基化合物的酯化作用日3 1 。 使用5 甘油( 或添加一些脂肪族多羟基化合物) 作为s a l b u l u s 碳源，在一p l 羧 基端，p l 与甘油发生酯化反应。这个现象在聚3 羟基丁酸( p h b ) 发酵中也出 现过髓习。利用2 初始碳源浓度培养p l 生产菌株，通过1 h ( 6 0 0 m h z ) 和1 3 c ( 1 5 0 m h z ) n m r 分析显示，在聚合物中存在甘油酯化物。但是酯化率较低， n i s h i k a w a 和o g a w a 报道利用5 初始碳源浓度时，酯化率可将近1 0 0 。酯化率 与p l 生产菌种有关，也与碳源种类有关，如利用葡萄糖作为碳源时，没有酯化 反应。因此，p l 合成终止模型可能与p h b 相似，即利用一p l 在聚合时活性硫 酯作为中间媒介，亲核试剂如水和( 或) 甘油攻击活性硫酯位点，引起以酰基酶 为媒介的链转移反应。可以推测，e - p l 终止反应受活性硫酯媒介中的酰基、链转 移试剂及其浓度和产生菌的影响。如果培养基中含有两种链转移试剂，它们将彼 此竞争终止聚合反应。终止模型与延长模型存在一致性，因为延长模型也包括活 性硫酯媒介，通过活性硫酯媒介，酶在活性巯基位点被酰化，赖氨酸单体被结合 进p l 羧基末端。 关于s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 合成p l 的相关基因的报道很少。最近，在p l 产 生菌s t r e p t o m y c e s 订肋“如i f 0 1 4 1 4 7 中发现了一种高分子量( 3 7 k b ) 隐蔽性质粒 p n 0 3 3 b 8 1 。利用p n 0 3 3 作为探针通过s o u t h e r n 杂交证明，质粒p n 0 3 3 只在产生一p l 的s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 中发现，在p l 非产生菌中不存在。此质粒可能编码一p l 合成基因或抗性基因。对质粒p n 0 3 3 中4 6 k b 片段分析，有四个开放阅读框，其 中一个与s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r 中b l d b 基因有较高的同源性呻1 。k o b a y a s h i 等发 现铁离子、镁离子、钴离子能增加k i t a s a t o s p o r ak i f u n e n s e 合成p l 产量h 训，并推 测这些离子通过铁吸收调节蛋白( f u r ) 发挥作用。f u r 是一种依赖铁的转录抑制 子，k o b a y a s h i 等推测f u r 可以激活p l 合成酶基因的表达。 h a m a n o 等以p n 0 3 3 为基础，构建了s t r e p t o m y c e s 和e c o l i 穿梭载体，通过聚 乙二醇诱导原生质体转化和基因问结合为p l 产生菌s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 建立基 因递送系统d 们。这可能为进一步阐明一p l 合成机理和构建高效表达的基因工程菌 提供具体思路。 1 6 ；- p l 的降解 k i t o 等发现耷一p l 产生菌s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 中存在一p l 的降解，并从 s t r e p t o m y c e sa l b u l u s 中分离了一p l 降解酶，该酶与细胞膜紧密结合，分子量为 8 湖北工业大学硕士学位论文 5 4 k d a ，是一个含锌的氨肽酶，该酶最适p h 7 0 ，这与实验证明随着p h 增加，p l 降解率也增加相一致n ，利用这一发现很多实验室将p l 产量提高了一大步。 k a h a r 等采用s t r e p t o m y c e sa l b u l u s4 1 0 菌株，利用5 l 自控发酵罐，以分段控制p h 值和流加补料的方法进行一p l 的发酵生产，s p l 产量达到4 8 3 9 l h 引。此外台湾 学者也采用此方法对s t r e p t o m y c e s 口硒“觑si f 0 1 4 1 4 7 生产一p l 的工艺进行了优化， 产量达到了5 2 9 l h 引。 k i t o 等还发现p l 降解酶与细胞膜结合，它的产生与一p l 的产生紧密相关， p l 非产生菌中一p l 降解酶活性低。在以p l ( 0 1 1 0 m g m l ) 作为唯一碳源的培 养基上分离得到了抗p l 细菌，如s p h i n g o b a c t e r i u mm u l t i v o r u mo j l 0 和 c h r y s e o b a c t e r i u ms p o j 7 等，在它们的发酵液中发现了一p l 降解酶。 s p h i n g o b a c t e r i u mm u l t i v o r u mo j l o 产生的p l 降解酶是一种典型的活性中心含钴 的氨肽酶，分子晕8 0 k d a ，最适温度3 0 ，最适p h 7 0 ，外切酶，该酶合成不需要 p l 诱导n 引。c h r y s e o b a c t e r i u ms p o j 7 产生的p l 降解酶含有2 个亚基，分子量 3 8 5 k d a ，为内切酶副。这两种菌在含有一p l ( 1 0 m g m l ) 的培养基上能很好地生长。 在培养基中p l 浓度达到l o o m g m l ，它们生长也没有受到完全抑制。这些事实 说明s p l 产生菌生产的p l 降解酶避免了抗生物质一p l 对s p l 产生菌的影响。 h i r o h a r a 等研究了u s e 1 1 菌株，该菌株不仅高产p l 而且大量产生一p l 降 解酶，该酶可能结合在细胞膜 。在以1 甘油作为培养基成分的两段发酵罐培养 中，在培养基p h 降到4 5 后( 大约2 4 h ) ，s p l 合成酶与降解酶开始产生，当p h 维持在4 5 时，两种酶活力增加，一直持续到3 5 - 4 0 h 。但是，当p h 维持在6 7 时，并不产生p l ，同时p l 降解酶活力也很低，这似乎说明p l 降解酶活力 与p l 有关。但是当向培养基中添加一p l 后，在中性p h 范围，并不激活一p l 降解酶活力。因此，在p h 4 5 ，一p l 的产生可能诱导产生p l 降解酶。 由于生物聚合物的降解酶基因与合成酶基因定位接近，p l 降解酶的存在与 一p l 的合成或抗性紧密相关，因此，p l 水解酶基因的确定也许是解释s p l 生物 机理的最好方法。最近，h a m a n o 等从s a l b u l u s 菌株中克隆了p l 降解酶基因， 在这个基因周围有8 个开放阅读框，从核苷酸序列推断的氨基酸序列与 s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r 金属肽酶有7 0 的相关性。尽管p l 合成酶基因还没有 认定，一p l 合成酶基因与一p l 降解酶基因是否相连也还不清楚，但至少这个发现 给p l 合成机理研究提供了一些线索。 9 湖北工业大学硕士学位论文 1 7e - p l 的发酵生产 日本学者s h i m a 并0 s a k a i 首次从土壤中筛选到一株s t r e p t o m y c e sa l b u l u s3 4 6 发酵 生产p l ，他们发现在最适培养条件下，p l 的积累浓度可达0 5 9 l 比“。如在休止 细胞中添加葡萄糖和硫酸铵作为培养基，且在酸性p h 值的条件下，p l 的生成量 可达4 9 l - - - 5 9 l t 6 。 目前，研究人员已经积累了一些p l 的发酵技术。k a h e r 通过控制p l 发酵过 程中的p