巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶.doc

第 33 卷 第 6 期 2006 年北 京 化 工 大 学 学 报Vol . 33 , No . 6J OU RNAL O F B EIJ IN G U N IV ERSI T Y O F CH EM ICAL T ECHNOL O GY 2006 巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶陈晶晶陈劲春 3(北京化工大学 生命科学与技术学院 , 北京 100029)摘 要 : 对巴斯德毕赤酵母 GS115 菌株在工业培养基中发酵和分离条件进行了研究 。结果表明 :将传统工业培养基中碳源和氮源的质量浓度分别降低至 35 g/ L 和 5 g/ L 时 ,酵母生长期的细胞密度与传统培养基的相差不大 ,但培 养时间可减少 4 h ,节省了生产成本 ;维持诱导期间的 p H 值为 410 对目标蛋白的表达最有利 ,目标蛋白的表达量占酵母分泌蛋白总量的 70 % ,比原来增加了近 30 % ;分离纯化过程 ,采用将强阳离子 ( SPF F) 与弱阴离子 (D EA E) 交换 层析柱偶联的分离方法 ,达到除杂 ,并浓缩目标蛋白的作用 ,目标蛋白产量约为 50 mg/ L ;将目标蛋白酶切后 ,质量酶活性为 8156 10 - 3 mol/ ( sg) 。关键词 : 人溶菌酶 ; 毕赤酵母 ; 发酵 ; 分离纯化中图分类号 : Q786在临床上应用的溶菌酶主要是蛋清溶菌酶 ,蛋清溶菌酶是一种异源蛋白 ,在人体内可能会产生免 疫原性和副作用 。人溶菌酶 ( HL Z) 是人体内的一种蛋白质 ,和人体具有天然相容性 ,临床上应用时 ,比其他 溶 菌 酶 更 安 全 , 没 有 刺 激 性 和 副 作 用1 。此 外 ,溶菌酶作为食品防腐剂和婴儿食品添加剂 ,已在 食品工业上得到广泛应用2 。HL Z 的溶菌活性比蛋清溶菌酶高出 3 倍 ,且热稳定性也高于蛋清溶菌 酶的热稳定性3 。国内利用毕赤酵母发酵生产 HL Z 的研究还比 较少 ,有利用大肠杆菌和真菌表达系统的报道 ,表达最高水平为 40 mg/ L 4 。国外有采用毕赤酵母发酵生产蛋清溶菌酶的报道5 ,但没有对 HL Z 的表达进 行进一步研究 。本文针对传统工业培养基中碳源 、 氮源的质 量 浓 度 和 诱 导 期 间 的 p H 值 对 重 组 HL Z 表达量的 影 响 进 行 了 研 究 , 提 高 了 重 组 HL Z 的 产 量 ,为今后实现重组人溶菌酶的工业化生产提供了 参考依据 。GS115 ,为本实验室保存 。11112 培养基 酵母培养基 YP G( 质量分数) : 1 % 酵母提取物 ,2 %大豆蛋白胨 ,1 %甘油 。工业培养基 ( g/ L ) :二水硫酸钙 0193 ,硫酸钾 1812 ,七水硫酸镁1419 ,甘油 35 ,硫酸铵 5 ,柠檬酸三钠 1147 ,011 mol/ L 的 p H 值 610 磷酸钾缓冲液 。微量元素 ( P TM) ( g/ L) :五水硫酸铜 610 ,碘化钾 018 ,一水硫酸锰 310 , 二水 钼 酸 钠 012 , 硼 酸 012 , 氯 化 钴 015 , 氯 化 锌2010 ,七水硫酸亚铁 6510 , 生物素 012 , 浓硫酸 510 mL / L 。试剂均为国产生化试剂纯或分析纯 。11113其他材料SP F F 强阳/ D EA E 弱阴离子交换层 析 柱 和 填 料 均 购 自 Amersham Bio sciences 公司 。中空纤维膜购自天津膜公司 ,酵母型重组肠激 酶购自罗氏公司 ,10 k 透析袋购自北京泽平科技有 限公司 。112 方法11211 培养方法 将保存的菌种接到 YP G 培养基 中 ,28 和 200 r/ min的条件下振荡培养 12 h , 然后以 5 %的 接 种 量 转 接 到 工 业 培 养 基 中 , 在 28 和200 r/ min 的条件下振荡培养 。期间 ,用氨水调节培 养基的 p H 值使之保持在 515 ,待甘油耗尽后 ,饥饿12 h 开始诱导 。诱导期调节 p H 维持在 410 ,每 12 h 补加体积分数 015 %的甲醇诱导 , 诱导 84 h 后停止发酵 。11212 分析方法 将菌液稀释后于波长 600 nm 处 以去离子水为参比 ,用比色法测定溶液吸光度 ;测定 所取发酵液中的细胞干质量 ,再除以所取发酵液体1 材料与方法111材料11111菌 种含 人 溶 菌 酶 基 因 的Pichi aPast oris收稿日期 : 2005212215第一作者 : 女 ,1981 年生 ,硕士生3 通讯联系人E2mail : jingchunchen hot mail . co m积即得细胞质量浓度 ; 甘油浓度用高碘酸钠氧化法测定6 ;发酵液中总蛋白浓度测定参考考马斯亮蓝 染色法7 ;发酵液中目标蛋白 ( 重组人溶菌酶原) 浓度的 测 定 法 是 取 发 酵 液 离 心 后 的 上 清 走 SDS2PA GE ,将凝胶进行计算机扫描分析 ,用 B IO2PR IN T凝胶成像与分析 系统分析目标蛋白的含量 ,根据考 马斯亮蓝染色法测定的发酵液中总蛋白的量推算出目标蛋白浓度8 。11213 分离方法 将发酵液离心 ,收集上清液 ,用6 k30 k 的中空纤维膜截留 。让收集的蛋白溶液 先流过 SP F F 强阳离子交换层析柱 ,洗脱收集的蛋 白液再流过 D EA E 弱阴离子交换层析柱 ,收集洗脱 峰 。强阳离子交换步骤 ,采用磷酸缓冲体系 ,p H 值 为 710 ;弱 阴 离 子 交 换 步 骤 , 采 用 Tris2HCl 缓 冲 体 系 ,p H 值为 810 。最后将经两步离子交换层析柱得 到的蛋白液用 10 k 透析袋除盐 12 h ,收集备用 。11214 酶切方法 将 10 倍酶切缓冲液与目标蛋白 溶液按体积比 19 ( 按 1L 酶可以切 15 mg 目标蛋 白计算加酶量) 混和均匀 ,20 下 ,酶切 812 h 。10 倍酶切缓冲体系参见商品化酵母型肠激酶使用说明 书 。故将工业培养基中甘油质量浓度降低至 35 g/ L 。表 2 ( N H4 ) 2 SO4 质量浓度对细胞吸光度 A 600 的影响Table 2 Effect of ( N H SO co ncent ratio n o ncell absorbency A 6004 ) 2 4( ( N H SO / g/ L4) 24) ( )A60045739 . 849 . 843 . 8840 . 71043 . 3由表 2 可见 , 当 ( N H4 ) 2 SO4 质量浓度 为 5 g/ L时 ,菌体吸光度较大 ,且相关的实验表明 ,适当的减 少氮源添加量可以减少酵母对杂蛋白的分泌量 。故 将工业培养基中 (N H4) 2 SO4 质量浓度降低至 5 g/ L 。21112 诱导期间 p H 值的优化 诱导期间考察 p H 值在 315710 范围内对诱导的影响 。如图 1 所示 , p H410 处目标蛋白条带最清晰 ,因此维持诱导期间 的 p H 值为 410 对目标蛋白的表达最有利 。此结果 表明 ,在酸性环境中更有利于酵母对碱性蛋白的表达 。11215酶活力测定 方 法采 用 热 激 法 ( 煮 沸 裂 解法) 9 和溶壁微球菌比浊法10 测定酶活 。2 结果与讨论211 发酵条件的优化因为细胞吸光度与细胞质量浓度成直线关系 ,故在实际应用中就用细胞吸光度来反映发酵液中细 胞质量浓度的大小 。21111 工业培养基中碳源和氮源的优化 在传统 工业培养基基础上 ,对甘油和硫酸铵质量浓度分别 进行优化 。结果如表 1 和表 2 所示 。表 1 甘油质量浓度对细胞吸光度 A 600 的影响Table 1 Effect of glycerol concentration on cell absorbency A 600图 1 诱导期间不同 p H 值对目标蛋白表达的SDS2PA GE 电泳图谱分析Fig. 1 SDS2PA GE analysis of effect of p H o n exp ressio n of target p rotein during t he inductio n period212分离纯化结果如图 2 所示 ,洗脱峰 1 中目标蛋白 ( 16 k 附近) 电泳条带较浅 ,杂蛋白 (43 k 附近) 条带较深 ,说明只 用 SP F F 强阳离子交换层析柱分离得到的目标蛋白 含量不高 ;洗脱峰 2 中目标蛋白 ( 16 k 附近) 条带较 深 ,杂蛋 白 ( 43 k 附 近 ) 条 带 较 浅 , 说 明 再 用 一 步D EA E 弱阴 离 子 交 换 层 析 柱 可 以 进 一 步 除 去 杂 蛋 白 ,并将目标蛋白浓缩 。213酶切结果如图 3 所示 ,目标蛋白条带在 16 k 附近 , 而经 重组肠激酶酶切后的重组人溶菌酶条带在 1414 k( 甘油) / ( g/ L )A 600培养时间/ h2025303528 . 837 . 344 . 551 . 228333436 40 52 . 0 40 由表 1 可见 ,将甘油质量浓度由 35 g/ L 增加到40 g/ L 时 ,菌体吸光度的增长不大 ,而适当的降低甘 油添加量有助于缩短培养时间 ,进而降低发酵成本 。北 京 化 工 大 学 学 报2006 年36 能得到了有活性的人溶菌酶 。(a) 去离子水 ; ( b) 人溶菌酶标准品 ; ( c) 经重组肠激酶酶切后的重组人溶菌酶 ; ( d) 目标蛋白图 4 热激法破大肠杆菌结果Fig. 4 Result s of heat shock experiment s o n target p rotein o n E. col i21412电镜照片用电镜观察热激法处理前后的大肠杆菌超微结构 ,结果如图 5 所示 。1 超滤后的上清液经 SPFF 强阳离子交换层析 后 的 洗 脱 峰 1 ;2 洗脱峰 1 中的收集液经 DEAE 弱阴离子交换层析后的洗脱峰 2 图 2 SP2Sep harose F F 洗脱峰 1 和 D EA E2Sep harose F F 洗脱峰 2 蛋白组分的 SDS2PA GE 电泳图谱Fig. 2 SDS2PA GE analysis of elutio n peak 1 and elutio n peak 2附近 ,且 16 k 附近无条带 , 说明酵母型重组肠激酶对目标蛋白进行了比较彻底的酶切作用 。1 目标蛋白 ;2 经重组肠激酶酶切后的重组人溶菌酶图 3 酶切前后蛋白电泳分析图谱Fig. 3 SDS2PA GE analysis of samples before (1) and af ter (2) digestio n by entero kinase214 酶活鉴定21411 热激法 溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌 ,还能水解部分革兰氏阴性菌 ,如大肠杆菌等 ,热激法 就是利用溶菌酶的这种特性而定性检测溶菌酶活性 的常规方法 。取适量去离子水 、人溶菌酶标准品 、酶 切后的重组人溶菌酶 、目标蛋白分别添加至培养好 、并混合均匀的大肠杆菌菌悬液中 ,静置片刻 。结果如图 4 所示 。从图 4 可以看出 : a 和 d 管内的菌悬液加热前 后没有变化 ,仍为悬浮液 ,用手轻晃后可见菌体均匀分布 ;而 b 和 c 管内的菌悬液则明显地分为两层 ,用 手轻晃后可见菌体粘稠成鼻涕状 , 这是 E. col i 细胞壁被溶解后细胞内含物释放出来所致 。热激法结 果显示 ,目标蛋白经过酵母型重组肠激酶酶切后可图 5 大肠杆菌细胞的超微结构Fig. 5 The ult rast ruct ure of E. col i cells viewed by SEM由图 5 (a) 可见 ,加入溶菌酶前大肠杆菌的形态完整 ,细胞壁四周清晰 ,图片有很强的立体感效果 。由图 5 ( b) 可见 ,加入溶菌酶后大肠杆菌的形态不完整 ,细胞壁四周模糊 ,这是由于溶菌酶对 E. col i 细 胞的破坏作用使得菌液粘稠度增加 ,图片立体感较 差 。这表明 ,经酵母型重组肠激酶酶切后得到了有 杀菌活性的人溶菌酶 。21413酶活单位的测定 10得酶活性如表 3 所示 。溶壁微球菌比活法测3结论本实验通过对传统工业培养基中碳源和氮源质量浓度的改良 ,提高了此菌株的生长能力 ;并且通过对诱导期间 p H 值的选择 ,找到了对人溶菌酶表达 最有利的 p H 值 ,使人溶菌酶在较短的发酵周期内表 3 溶壁微球菌比浊法测酶活 (每次加入酶量均为 150L )Turbidimet ry detectio n of lysozyme activity using Microccus lysodei kticus ( V = 150L )Table 3A 450质量酶活性 10 3/ ( mol/ ( sg) )平均质量酶活性 103/ ( mol/ ( sg) )酶质量浓度/ ( mg/ mL )差值A 450初始60 s01501250112501062501805017980179301790017670177801784017850103801020010090100581458189810081898156有较高水平的表达 。此外 ,初步确立了较为简单和可行的分离纯化方法 。将目标蛋白酶切后 ,目标蛋 白产量约为 50 mg/ L ,杀菌质量酶活性为 8156 10 - 3 mol/ ( sg) 。5Masuda T , Ueno Y , Kitabatake N .High yield secretio nof t he sweet2tasting p rotein lysozyme f ro m t he yeastPichi a pastoris J . Protein Ex p ressio n & Purificatio n ,2005 , 39 (3) :35 - 38 .陈宇 ,刘晓 . 高碘酸氧化法检测冰冻红细胞中甘油残 余量 J . 临床输血与检验 ,2003 ,5 (4) :283 - 284 .李娟 ,张耀庭 ,曾伟 ,等 . 应用考马斯亮蓝法测定总蛋 白含量 J . 中国生物制品学杂志 ,2000 ,13 ( 2) : 118 -120 .张思祥 ,杨国胜 ,刘玉良 ,等 . 凝胶电泳图像计算机分 析系统的研制 J . 分析仪器 ,2002 ,32 (2) :1 - 2 . 曼尼阿蒂斯 T ,弗里奇 E F ,萨姆布鲁克 J . 分子克隆6参考文献Shigeru M , Masato K , Masanori N , et al . Secretio n of active human lysozyme by Acre mo nium chrysogenumum using a Fusarium al kaline p rotease p ro moter system J . Journal of Biotechnology , 1995 , 29 (2) :1 - 8 .刘 仲 敏 , 何 伯 安 . 溶 菌 酶 及 其 在 食 品 工 业 中 的 应 用J . 食品与发酵工业 ,1995 ,26 (5) :80 - 82 .71829操作指南 M .64 - 65 .余茂勋 ,译. 北京 : 科 学 出 版 社 , 1987 :3叶军 ,钱世钧. 工程菌人溶菌酶的纯化和性质 J .生物学报 ,1999 ,39 (1) :55 - 59 .微10冯惠勇 ,徐亲民 ,孙国志 . 溶菌酶的生物测定方法研究 J . 食品与发酵工业 ,2002 ,28 (4) :61 - 64 .4王佃亮 . 重组人溶菌酶研究进展 J . 中国生物工程杂志 ,2003 ,23 (9) :59 - 60 .Fermentation of recombinant humanlysozyme in Pichi a past orisCH EN J ing2jingCH EN J in2chun( College of Life Science and Technology , Beijing U niversit y of Chemical Technology , Beijing 100029 , China)Abstract : Human lysozyme , so urced f ro m human bo dy fluids , has fewer side effect s w hen injected into t he hu2man bo dy and is t herefo re safer in p ractice . Here we repo rt a st udy of fer mentatio n co nditio ns and p urificatio n of reco mbinant human lysozyme in Pichi a p ast oris GS115 . (1) When t he carbo n and nit rogen so urces were simul2 taneo usly reduced f ro m 40 g/ L to 35 g/ L and f ro m 10 g/ L to 5 g/ L respectively , t he cell densit y was not signi