（作物遗传育种专业论文）太空诱变玉米核不育材料的SSR标记定位和RAPD分析.pdf

本研究受一雅安三九药业奖学金资助 论文独创性声明 本人鄢萋声疆：新鏊交的学位论文是我个入在弹师指导下遗行研究工作繇敬 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他令人或集体已经发表或撰写过的礤究成暴，瞧不包含为获德四川农业大学 或其它教帮机摘的学位域证书所便嗣过的材辩。与我一餍工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：刘福霞 关于论文使用授权的声明 2 0 0 5 年5 月8 日 本人究金了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校商权 保留并向圃窳有关部门或机构送交论文的复印件莉电子版，允许论文被查阅莘口借 瘸，可以袋穗影印、缩帮或扫箍等赛剃手段保存、汇壤学谴论文。阍意密矧农强 大学可以用不同方式在研i 同媒体上发袭、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：刘福霞 导师签名 暮鳓召 2 0 0 5 年5 月8 日 矽步年月多阳 摘要 剥用雄性不育是实现玉米杂种优势的重要途径之一，基于玉米细胞质不胃类型 病菌专一亿侵染，近年来，研究者们将精光投向细勰核雄性不育。西j | | 农业大学玉 米研究所于1 9 9 6 年利用返回式实验卫星搭载玉米晶种川单9 号种子，太空诱变处 理获撂雄性不育突变考孝料，经遗传分攒证实为细胞援隐性单基匿雄性不育，本实验 运用微卫麓标记( s s r ) 和随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 技术，氍r p 3 1 9 5 ( a ) s ”( 自 交系) 的r 代群体为定位群体，该定能群体分别来囱两个果穗，采用3 和1 5 的 琼脂糖凝胶瞧滚露6 的装丙烯醛胺凝胶电泳技术，镪步定位了；交核不弯隐性蒸露； 主要结果如下： l - 田1 旬商性鉴定发现定位群体i ( 来自于一个果穗，1 3 8 株) 发生育性分离，3 3 栋完全不襄，1 0 5 株完全可寅。适合性测验表臻：x 。2 = 0 ，0 3 8 7 ，小予x2 。，= 6 。6 3 ： 丽定位群体i i ( 来宣于另一个果穗，2 4 7 株) ，7 1 株完全不育，1 7 6 株完全可商。 适合性测验液明：x 。毡0 3 0 4 ，小于x 。2c 1 1 , o l , ，= 6 6 3 。因此两个不同果穗的定位群体 中的可弯拣粒不寅株戆努惶分离均镣合震德尔分糍魄率3 ：1 ，遴步说爨该不枣蛙 状受一对隐性核不育基蠲控制。 2 利用微卫星标记并缩合田间的育性调查结果，对太空诱变蕊米核不育基因进 抒了定位，髑3 2 6 x 幸微显慧弓l 羧避行茇雾赡选，其中毒s 6 对弓| 戆滋理多态蛙，然惹 用5 6 对引物对f 。代群体遴行分析，结粜表明引物b n l 9 1 9 7 和u m c l 0 1 2 与不育基因涟锁， 其中在定位群体i 和i i 中引物b n l 9 1 9 7 与不育基因之间的遗传距离分别为7 c m 和 1 4 。5 c m ；弓 锈u m c l 0 1 2 巍定位群俸l 孛与不弯基因之霹靛遗传距离为2 8 5 c m ，又嚣为 引物b n l 9 1 9 7 和u m c l 0 1 2 能于玉米的第3 条染色体上，据此将该核不育基因定位在3 l 染色体上。 3 鞋r p 3 1 9 5 ( 站8 。，( 鸯交系) 褥虱懿定篷嚣葵l 必李孝辩，对太空诱变玉岽缡熬犊雄 性不育基因进行t r a p d 分析，在1 5 2 个随机引物中，引物s 1 3 s k 一1 4 ( c c c g c t a c a c ) 和 s b s r 一3 ( a c a c a g a g g g ) 分别在可育集团与不肖集团之间扩增出多态性产物 8 b s k 一1 4 ms b s k 一1 4 m 秘s b s r - 3 4 o 。遴邈怼f 。饯分褰群辱耋孛款攀拣送行连镂分褥， 初步认为s b s k 一1 4 s b s k 一1 4 m 和s b s r 一3 。与太空诱变玉米细胞核雄性不育熬网相 连锁，遗传距离分别为4 9 6 c l c l 、2 6 6 c m 和3 1 7 c m 。 关键词：玉涨；太空诱褒：核雄牲不宵；徽卫星标记；r a p d 标记：定位 a b s t r a c t i ti sa ni m p o r t a n tm e t h o do fo b t a i n i n gh e t e r o s i sb yu s i n gm a i z em a l es t e r i l i t y t h e m a i z ec y t o p l a s mm a l es t e r i l em a t e r i a l sa r ei n f e c t e de a s i l yb yb i p o t a r i sm a y d i sr a c et t o x i n ，s or e c e n t l yt h es e a r c ho fm a i z em a l es t e r i l i t yw a st r a n s f e r r e df r o mc y t o p l a s m m a l es t e r i l em a t e r i a l st on u c l e a rm a l es t e r i l i t ym a t e r i a l s 。w es e n tm a i z es e e d sf o s a t e l l i t ea b r o a di n1 9 9 6a n dg o tan u c l e a rm a l es t e r i l em u t a n ti nt h eo f f s p r i n go ft h e s i n g l eh y b r i d c h u a nd a nn o 9 i no r d e rt oa n a l y s i st h i sm a t e r i a l ，t h ep o p u l a t i o n r p 3 1 9 5 ( a ) x $ 3 7w a sd e t e c t e dw i t hs i m p l es e q u e n c er e p e a tm o l e c u l a rm a r k e ra n d r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，p r o d u c t sf r o mp c rr e a c t i o nw e r er e s o l v e db y e l e c t r o p h o r e s i si n3 a n dt 5 a g r o s eg e lc o n t a i n i n ge t h i d i u mb r o m i d e 。 t h em a i nr e s u l t sc o n c l u d e da sf o l l o w s 1 s t e r i l i t yi n v e s t i g a t i o ni nf i e l d ss h o w e dt h a tt h ep o p u l a t i o ni ( 13 8p l a n t s lw e r e s e g r e g a t e di ns t e r i l i t y ，3 3a m o n gt h e mw e r et o t a l l ys t e r i l ea n d1 0 5w e r et o t a l l yf e r t i l e a p t n e s se x a m i n a t i o n 照o w e dt h a tx c 2 = o 。0 3 8 7 ，w h i c hw a s s m a l l e rt h a n 妒( 蚴 i ) 嗡，6 3 ， w h i l et h ep o p u l a t i o ni i ( 2 4 7p l a n t s ) ，a m o n gw h i c h7 1 w e r et o t a l l ys t e r i l ea n d1 7 6w e r e t o t a l l yf e r t i l e a p t n e s se x a m i n a t i o ns h o w e dt h a t 妇2 = o 3 0 4 , w h i c hw a sl e s st h a nz 珏l ， = 6 6 3 t h u st h et w o p o p u l a t i o n sw i t hd i f f e r e n ts p i k e sb o m c o n f o r m e dt ot h es e g r e g a t i o n l a wo f 3 ：1 w h i c hs h o w e d t h a t t h es t e r i l ec h a r a c t e r w a sc o n t r o l l e db ya p a i r o f r e c e s s i v e g e n e 2 m a i z eg m sg e n ew a sl o c a t e dw i t hs s rm o l e c u l a rm a r k e ra n dc a m p e s t r a l s t e r i l i t ya n a l y z i n g a m o n gt h e3 2 6p a i r so fm i c r o s a t e l l i t ep r i m e r ss e l e c t e d ，5 6w e r e f o u n dp o l y m o r p h i c l i n k a g ea n a l y s i so ff 2p o p u l a t i o n sw i t ht h e5 6p a i r so fp r i m e r s s h o w e dt h a tm i c r o s a t e l l i t em a r k e r sb n l 9 1 9 7a n du m c l 0 1 2w e r el i n k e dt ot h em a l e s t e r i l i t yg e n e t h eg e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e nm a r k e rb n l 9 19 7 a n dt h em a l es t e r i l 。i t yg e n e i nt h et w od i f f e r e n tf 2p o p u l a t i o n sw a s7 c ma n d1 4 。5 c mr e s p e c t i v e l y t h eg e n e t i c d i s t a n c eb e t w e e np r i m e ru m c l 0 1 2a n dt h em a l es t e r i l i t yg e n ew a s2 8 5 c m t h e r e f o r e t h em a l es t e r i l i t yg e n ew a sl o c a t e do n3 l 3 b u l k e ds e g r e g a t i o na n a l y s i sm s a ) s t r a t e g yw a se m p l o y e dt oi d e n t i f yr m l d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) m a r k e rl i n k e dt ot h em a i z em a l es t e r i l i t yg e n ea 2 t o t a lo f15 2r a n d o m10 m e ro l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r sw e r es c r e e n e do i lt h ed n ao f f e r t i l e a n ds t e r i l eb u l k s p r i m e rs b s k 一1 4 ( c c c g c t a c a c ) a n d s b s r 3 ( a c a c a g a g g g ) g i v er e p e a t a b l ep o l y m o r p h i s mb e t w e e nt h et w o b u l k s ， t h r o u g ht h el i n k a g ea n a l y z i n go ft h ee a c hp l a n to ff 2s e g r e g a t i o np o p u l a t i o n s ，t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h er a p dm a k e r s ，s b s k - 1 4 s 5 0 、s b s k - 1 4 4 7 5a n ds b s r 一3 4 0 0w e r e l i n k e dt ot h em a i z em a l es t e r i l i t yg e n e ，a n dg e n e t i cd i s t a n c eo f4 9 6 c m 、2 6 6 c ma n d 31 7 c mr e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：m a i z e ；s p a c ef l i g h t ；g m s ；m i c r o s a t e l l i t e ；r a p d ；l o c a t i o n 3 月u吾 玉米怒我国三大靛食捧物之一，嗣雾雪是集粮、缝、键于一髂戆三元馋物，也是 利用杂种优势获得经济效益最明显、增产潜力最大的高产作物。副2 0 3 0 年，随着 社会经济的发展，对玉米也有了多元化的需求，邈就要求针对不同用途进行玉米 产量穗鑫簇戆改善。露溺予镯辩粒甏篱隈于鬟意镧瓣转纯效率秘改善肉、禽、蛋、 奶的质量，用于口粮或食品加工的应生产人们喜激的甜玉米、糯玉米、爆裂玉米 等。用于玉米工业的则应增加玉米油或淀粉等产出比例，借以提高产品的缀济效 益“1 。囊襄掇囊玉岽擎产，又要改蛰罴寒鑫蒺，较好途径藏是到溺杂耪优势，生产 杂交种。识近几年来对玉米杂交种质量进行随枫抽查发现，大雾数杂交种质量不 合格，种予的纯度不商，其主要原因是母本去雄不彻底。根据国内外的经验，解 决这一运鼹约有效途经藏是程t 蓦l 雄拣不育系寒生产杂交秘子。贯强，生产应惩遣 证明，不育化制种较常规去雄制种产生的同型杂交种，增产率达6 5 一1 0 。可见， 利用雄性不育系生产杂交种是目前提高玉米单产的有效途径。 诱交蠢耱骚究始予二卡整篼露卡年代。最早楚涎位德交秘学家巅蓠诱交意残撬 白粉病的大麦品种。而空间诱变育种是二十世纪八十年代发展起来的诱变育种新 技术，它怒建立在空间辐射生物学熬础上，借助现代航空高新技术手段，馊植物 产生可遗蛰交买，获箍获褥了突变体。1 9 9 6 年蠢翊农监大学蠢笨磅究嚣选送了凡 份材料进行卫星搭载试验，从中获得了玉米雄性不育突变株，疑鉴定为隐性核雄 性不育材料。 檀秘熊经不弯在鏊然器广泛存在，翠在1 7 6 3 年k o l r e u t e r 藏鬣察并缀邀过这 种现象。1 7 8 6 年c o l e m a n 首次引入并使用“雄性不育”概念。据k a u l ”3 1 9 8 8 年报 道，己经在4 3 科、1 6 2 属、6 1 7 个种或种间杂种中发现雄性不肖。1 。而玉米细胞核 燕控不鸯系磅究囊罩静是e y s t e r “1 ，翠在1 9 2 1 年纯魏发囊了攘淫不鸯檀株，经鉴 定是核不肖类型，叫做m s ( m a l es t e r i l e ) “1 。1 9 3 0 年，s i n g e t o n 和j o n e s 也发现了雄性不育植株，他们首先定名为册，经过连锁关系测交鉴定，定彼在第 6 染色 奉上8 3 。之嚣，诲多学者又麓绥发臻了译多镪麓棱不弯蘩函。这些撰畿不育 基因的发现为玉米细胞核材料的利用提供了一定的理论基础。 由于目前对玉米雄性不育的遗传桃理还缺乏足够的了解，使得对玉米雄性不弯 酶稳瑶 萋镰会磋鬟一垫溺题。焉要孬渍雄性不弯静遗传裰瑾，除了需要应瘸雯理、 4 生化方面的研究以外，聪重要的还是要从基因入手，从基因的调控、转录、凌达 来阐明雄悛不育的机理。对于太空诱变玉米细胞桉雄性不育基因，要做到这点， 蓄先要对该蒺医遘毒亍定位，然螽壳隧该基霹，尽瓣遮餮了解其功缱静鎏酌。 i 文献综述 1 玉米雄性不育 1 1 玉米雄性不育的分类 雄性鸯饿是花药发肖进程中环麓调控定基戮溪表达的结粟，是基因垄与生境 互作的结聚。因此雄性不育既有遗传因素占主要的遗传不育类烈，又有生理因素 占主要的生理不育类型，还有特定蘩霞型需在特定条彳牛下才农达雄性不督的生 理敏感型不育类型( 遣8 q 生态不育类禳) 厂细胞殿雄性不育( c m s ) 一 船；+ 。厂可遗传的雄性不宵l 细胞核雄性不育( g m s ) 雄性不育 。”8 “1 8 l 不溱传麴雄睦苓脊 图l 植物雄性不育的分类 f i g 1c l a s s i f i c a t i o no f p l a n tm a l es t e r i l i t y 以遗传强素控割的不骞类型，擞援其是否遗传分为两类。类莛不遗镑鹣，熟 染色体组不平衡、非整倍体等引起的不育，这类不肖不仅限于雄性不育，雌性也高 度不育。另一类是可遗传的，它既可能纯粹由核基因突变所致，也可能由雄性育性 基医姓在菲藤豢缨慈庚象臀下，楚其不耱歪零表达。遴蓝，本整纪年代孛颓， s e a r s “3 在对大量雄性不宵材料遗传分析的基础上，把可遗传性雄性不育分为核不 育、质不育和核质互作彳：育三种类型。而后e d w a r d s o n 。1 把质不宵和核质互作不育 台为一类，提窭了多数人可越接受懿“二墼浼”。 1 1 1 细胞核雄性不育( g m 8 ) 核不肖怒一种最常见的雄性不育类型，人们已经在玉米、棉花、大麦、小麦、 粟( 莪国笼方俗穆答子) 、漕菜、蓄麓帮洋葱等许多穗兹上轰瑷藏诱导密这耱雄性 不育材料。番茄有3 0 多个基因位点，玉米至少眷2 0 个基因位点能独立导致雄性 不育。已知小麦的4 a 、4 b 、5 a 、5 b 皲染色体上存在控制育性的基因位点，每 个位蠢静突交或缺失都熊弓| 起雄健不商。 根据玉米细胞核雄性不育基因作用方式不同又将其分为照憔核不育与隐性核 不育两种类型，玉米细胞棱雄性不育利用的关键在予髓否获得僳持系。 豫往核不育受控子臻性萋国基溺符号为m 葫，一对隐幢鏊鞫控翻费棱不蠢材 料的基因戮是i i i s l l l s ，任何品种都是它的恢复系识腾性核不育材料找不到典测的 6 保持系。 显性核不育突变是种少见的自然现象，迄今人们只在棉花、小麦、马铃薯、 甄寐、清蒸等捧拐羔笈蕊。显蛙棱不裔耪精甄其露彝花授赣稳镄有裁予鏊鬻蓬经 的一面，又具有白花授粉作物有利于基因纯合稳定的一面，是肖用的遗传改良工 具，可用予轮回选择和复合杂交等肖羊申程序。我豳发现的太谷核不育小麦就是一 令显经菝不商材将，魂已广泛孺子，l 、豪育耱实蔑。 i 1 1 1 濑敏型雄性不宵 温敏雄性不育材料怒1 9 9 2 年赫忠友“在玉米上酋次发现的，她经过5 年多的 观察鞍磷究已确定其耩予滠敏雄经不商，萁主要褥赢是：茬雄穗发育鹳特定时期， 温度条件能导致雄花育性的转换，即在2 5 。c 以上条件下，雄穗花药发育不良，药 内花粉大部分败育，内外颞呈闭合状态；在2 5 。c 以下的条件下，基本表现正常开 花散粉。这一特性能稳定遗传，盈蔻有隐往基围控镪鹣。近年来，我国在水稻、 小麦、玉米等作物上相继发现了温敏雄性不育材料，温度条件能导致雄花育性的 转换。 1 。2 必敏鳖雄性幂离 自从石明松( 1 9 8 1 ) “”发现了水稻光敏型雄性不育以来，科举家在大麦“”、小 麦“8 等侔物中都发现7 光敏雄性不育辩糕。光照条件的长短熊蹲致雄花弯憷的转 换。随着研究的深入，入们发现，光瘸期和温发怒协确作矮豹，很难完全分开。 玉米光敏型雄性不育最早是由中国农业科学院作物育种栽培研究所周洪生及田国 志于1 9 9 4 “”年在海南畿三亚南发亵繁玉米时发现一个器将稳定的选系精料 c a 5 0 7 ，3 8 椿全部不散静，经初步研究，认为该玉洙光敏感雄梭不育材料在娥日照 条件下表现雄性不育，在长日照条件下表现雄性可育，育性转换的临界日照长度 是1 4 1 5 h 。卷敏核雄性不毒瑗象的发现是一静颓= 壤控裁的特殊瑷象，为杂秘饯势豹 应舜开辟了一稀薪途径。 1 1 2 核质互作雄性不育 控爨孩一震互终雄瞧不毒熬毒瞧蘩因嚣露存程子缨蕤覆秘缨魏孩蠹，瑟强孩蠢 的可育基阑对不育基因为完全显性。只有当细胞质基因与细胞核内基因相互作用 不协调时，才表现雄性不育，其它情况下均表现可商。1 9 7 1 年g e c k e t t 将3 0 种不 嚣来源懿雄健不啻瓣秘壤据麓痰翊分为t 、c 、s 三令基本类墅： ( 1 ) s 组群属于配子体不育，雄配子败育多发生在二核花粉期，败育较晚， 育性稳定性较差，易受核背景基因型的影响。到现在为止，没有发现病害的专化 性侵染。 ( 2 ) t 组群属于孢子体雄性不育，败育发生在四分体时期至单核花粉期，败 育早且彻底，败育花药干瘪。但玉米小斑病t 小种能够产生对t 胞质具有专化效 应的毒素，造成玉米的严重减产。 ( 3 ) c 组群也属孢子体不育，对玉米小斑病无专化侵染。但据陈伟程研究，c 小种仅专化侵染c 组中的c i 亚组，并且c i 亚组的植株对c 小种的反应从高度感 病到不感病，其侵染的专化性不及t 小种对t 型不育系的侵染。 1 1 3 工程雄性不育 工程雄性不育作为一种新的不育源，较传统的核不育基因有着独特的优势。它 不仅很好地解决了核不育基因育性分离的老大难问题，而且可使得一种好的不育一 恢复基因系统能很快移植到多种作物上，创造出一些新类型的不育系和恢复系而 直接应用于生产。利用基因工程手段来构建工程不育系首先在烟草和油菜上获得 成功，其后在莴苣、棉花、水稻等植物上都有构建成功的报道“5 ”1 ，这预示着该 方法可能应用于包括玉米在内的其它植物种类中，工程不育系杂交制种将会有更 为广阔的应用前景。 工程雄性不育在实践上也存在一些问题。第一、不育系的稳定性问题。实验室 内几经周折将基因转入植物体内，且整合到植物的染色体基因组内。可它是否在 任何自然环境下都能稳定表达，是否能在多个有性世代中稳定遗传。这不仅是工 程不育系技术面临的问题，而且也是整个转基因工程需要回答和解决的问题。第 二、恢复基因的恢复力问题。到目前为止，只有b a r n a s e b a r s t a r 基因系统的恢 复性得到了肯定的鉴定。其他不育基因的恢复基因有的正在构建工程中，有的甚 至还未找到。第三、不育基因和恢复基因对转基因植物的其他性状尤其是雄蕊育 性的负面影响。第四、转基因的安全性问题。尽管英国的转基因番茄得到了人们 的认可，但是象来自微生物的毒性基因的表达产物是否会影响到人畜的健康等问 题。 1 2 玉米雄性不育细胞学研究 雄性不育细胞水平的研究目的在于阐明雄性育性发生败育的时期和方式以及 雄性败育与菊壁组织间的关系，为弄清雄性不育机瑷提供依据。 雄性不肖的细胞学研究包括：在供试材料上采用同核异质或间质异核材料系统 礤究核葳、环境酶影喻，应露光镜、毫镜、压冀、韬冀等手段，对雄性黢裔耩李簸 年口方式进行定性描述，而且引入数量概念，对不同类型的败育现稼进行量化比较。 多种植物的研究结果统计发现四分体时期以后发生花粉败育的比例达到7 0 左右， 减数分裂髓、减数分裂帮减数分裂焉各个对期菠皇黢育懿院铡大体葙等。雄性不 育往往是一系列事件的结果，在雄性大量败育之静，经常可见到许多异常现象， 弼：没有张原细胞分化、药室合并、早豫细胞相互连接、花粉姆细胞冥卷、拢粉 母细施欢育、花粉母鲴髓有丝分裂、辩常霞倍体濑强分俸不分离，这些事件中只 要有一个或数个发生，就有可能影响= i 毫粉的正常发商，使花粉的最终正常功能受 到影响。 1 2 1 玉米雄性不育j i 芟育时期 国内外学者研究玉米雄性不育细胞学行为的目的在于阐明雄性育性发生败育 获时絮秘方式l 冀及雄瞧效饔与嚣壁缀缓竭懿关系，多事为妻溥雄瞧不弯极理捉貘菠 据。 不管是玉米细胞质雄性不育还是绷胞核雄性不宵，其败育行为均体现在雄配子 钵影袋过簇中，玉米花黔发枣过程中锤一玲段发生搏零鹭可戆鼯致雄整不鸯。 玉米目前已发现了许多天然的突变体，对其中的2 6 个突交体迸行了细胞学研 究，结果( 圈2 ) 显示从遗孢细胞至二核花粉阶段蒜时期均可发生败育。 大量秘炎表明，在玉张芘羚黟藏秽发育过程孛必蠢重要终零鹣药壁缝绞蹩绒毡 层，其发育和行为异常与雄性不育有关。 9 辅臻嬲 露秘彭鬻 莎二二氟鬻 m o 黧。，t 斗弛黔二鄹4 、 m , a t ? 4 , z t t ：! 二# 。 州舅l 图2 ：嚣米花粉发育过程和核不育突糍体雄性败育时期 f i g 2d e v e l o p i n gc o u r s eo f m a i z ep o l l e na n ds t e r i l i t yp h a s eo f g m ss p o r t 1 。2 2 影响雄性不禽败育时期的因素 ( 1 ) 核背景 目前融有许多研究证明这是一个比较重要的因索，如玉米同一c m s 类型在不同 的核背景下，败弯过程蒜秘异常现象的数量啦及缀毡层等药壁缀缎载异常均意差 异。如嗣为c 型的二南2 4 、m 0 1 7 秘黄早4 不育系，仅m o t 7c m s 系绒毡层缩胞在 终变期如正常可育品系可见到清晰的双核，其余2 个c m s 系基本。i 是单核的，有些 绒毯层细腮发生不规则戆平周分裂，形成局部双朦绒毡层，有的细照不送行攘的 复制分裂，只有胞震分裂，产生无梭的细胞。翻分体时期以盾，不育系与保持系 差异愈趋明显。珍珠莱( p e n n s e t ：u m 鲥a u c u l n ) a 。和a 。胞质c 聪系的遗传背景对 雄性败弯懿时鬟、过程有嚷显影嗡，一些a ，戆鏖勰s 系主要在援分薄形戏的效弯， 另一些a ，胞质c m s 系小孢子释放后才败育；如胞旗c m s 系p b 3 1 0 a 。和p b 3 1 1 a 。，不仅 在减数分裂时的三种败裔方式的比例不同，而且p b 3 1 1a 2 还有部分药室在幼龄小孢 予对才败窿“”。醚遗撼m s l 4 核不旁系漏a 与由它转蠢酶4 7 3 a 在绒毽层懿发雾孬 为上不同，前者绒毡层细胞延迟退化“，后者缄穗层正常“。 1 0 被魁。繁 憩吣 ( 2 ) 细胞质 同一核背景条件下，不同细胞质类型的c m s 败霄时期、败育过程以及绒毡朦等 药壁缰织靛雾常相差穰大。小麦藏棱鼯厦豹8 s e a 、8 9 a r 和tc m s 系稳珍珠黎闻孩 异质的k i , a 。和a vc m s 系的小孢子发生过程细胞学观察也证实了遮一点 2 0 o g o u r r e t 等用光镜秘电镜研究了浦菜o g u c m s 系蛉6 个腿质杂种的雄性不育性表达发现，6 个臆质杂耪豹雄往不寄液达可强分为3 静类鍪。 ( 3 ) 生境条件 在一定的生境条件下，雄性育性的表现可阱发生逆转。在达不到逆转效鬃的生 境条件下，对雄性政育嚣寸期和过程搬有重要影璃。生境条俘辩雄健畜性表达静调 控可能是通过植株内部的生理、生化代谢变化实现的。i z h a r ”用2 个具有r o s y t 4 0 r n 核背景，但败育时勰不同的矮牵牛c m s 系及保持系研究激发对小孢予发生的 影赡，绪柒表明：只毒在疆夜2 0 以下、夜温1 5 下方髓部分藏完全恢复勰s 植 株雄性育性。油菜o g u - c m s 系在2 8 2 3 下雄蕊具有典型的花药、花丝，诧药变 形，畜i - - 4 个药室，有砖可见到小孢子；在2 3 1 8 下雄蕊嶷京雄蕊稻心泼褥者 的特援，穗药花丝鳙显可见，花药i - 4 个药室，有时可觅西分体，通常在花药基 部见到外胚珠，在花药的一侧见到柱头表膜；在1 8 1 5 下，大部分雄蕊心殿化， 兵有柱头袭媵和外胚珠，没有芯丝的形成，露正攀可弯镍持系在所育温度条枣# 下 均具有稽溯的形态“。编香葱c m s 系在四分体时期绒毡层不解体，反而高度增生， 之后小孢子败育，但由于核基因的影响，c m s 系对商温和四环索敏感。温度敏感的 c m s 基因型惩2 4 。c 2 40 | c 处理1 0 一1 4 天小孢子发生炎 鞋可育基因爨，雄性不寅芯变 为可育花，用西环索连续处理对四鄢索敏感的c m s 基因型3 次，可使小孢予发生 恢复正常，育性转变，假败育小孢子高于温度处理的，绒毡层也未完全解体”“。 。3 玉米雄经不夸生理生 芝磷究 雄性不育的生理生化研究以往只利用不同基阑型材料静态比较雄性不宵与雄 性可育之间的生理生化麓异，比较圊一群体中的不商株与可育株之间的差异。 近年塞雄淫不赛懿艇理生纯磅究，不仅篦较不瓣纂困鍪薅辩之窝戆差舅，孬且 同时可以比较同一基因烈材料不同育 生( 不育性、可育性) 之间的蒺异。 1 3 1 激素分析 玉米爨一耪雌雄溺椿的单性花 霆物，其t a l e l s e e d 。突变体豹雄穗南窘雌花形 成。d e l o n g 等研究者通过转座子标记得到了幽熬困，该基因在野生型的雌蕊细胞 发弯器晚麓表达，弓l 怒耀蕊骧基缁藏鹚亡，其氨馨酸彦列与羟铤类残氢酶掇其稠 似。羟甾炎化合物中的券霉素能影响植物发育，尤墓影响到玉米花的发育，据此推 测，f 岛是决定玉米成花一陡别的一个煎要基因。隅缀自作用的底物可能是赤簿索或 菜耱类爨分子，蠢_ 遨产生了决定葱器密最终分化粒螓号，诱导潍蕊琢基缀戆溺亡。 汤继华，赫忠友等。”对玉米温敏核雄性不育系琼6 q m s 及其对照琼6 的张药组 织和植株叶片中生长索( i a a ) 及乙烯含量变化进行了研究。结果液明：琼6 q m s 植 撩晴片中鬈三长素含量在小藐分 皂期簸蹇，随着罐德发鸯逐渗簿 蕊，嚣璩6 戆生长 索含量从小花分化期逐渐升高，到憾器官形成期达到最高值。在小花分化期和性 器官形成期，琼6 q m s 叶片和花药组织中的乙烯含爨显著高于对照，而生长索含量 则显著低予对照，导致生长素与乙爝魄镶懿不乎餐，这霹戆楚滠敏菝雄缝不蠢系 由可育向不育转换的萋鞭生理学原因。唐祈林，浆廷昭等“采用两套同核异质系， 研究了不同核背景和不f 晦质内源激潦含量与玉米c m s 的关系。结果表明，不同 棱鸷景良及不蠢雍蒺瓣c m s 之阗内滋激素含量煮麓异；较高赘a b a 亵较 毳泓、i 熊 含量、特别是较低的g a 3 a b a 、i a a a b a 浓度可能是花粉发生败育的个黧要原 因；不育系中较高的6 a 3 和i a a 含量可能导致育性不稳定。 。3 。2 蛋白蒺分毒秀 蛋白成分析包括两焱：蛋白质和多聚酶( 同工酶) 分析。 蛋白旗电泳分析表明：小孢子形成和花粉发鸯的各个时期都商特异的蛋白质合 成。翔d e t c h e p a r e 等蠲s d s p a g e 磷究甘蓝不满辩期花药嚣餐瘩f 质组戒，三缓期 有一组特弹带出现和强度增加，小獭子和二核期聪测到的几个碾自质不再能检测 出来，说嘴花粉第二次分裂后调整了代谢方向。跷较不育花芬与可弯花药瓣器自 质组成，发强两者之阉存在显著差髯。 对于雄性不育系的同工酶分析，类似蛋白质分析。一般以税翡为实验材料，c m s 系及其同梭异质可育系藐药的酯酶、过氧化物酶、绥胞色素氧化酶、多酚氧化酶、 邻苯二酚飘佬酶和超氧化物蚊仡酶等阮较研究结聚表明，罐毽不育花药的浏工酶 谱组成与其同核异质可宵花药的不同，发生了变化。显性g m s 的小麦、亚麻不育 株及网一群体中酶可鸯捧雄蕊腊酶和过氧化物嗣工酶的分橱表明，不育株其蠢不 同的酶谱特征。同工酶的变化是与雅性败育时期一致的，且不论雄性不育的类型， t 2 不育花药嗣工酶变化的趋势基本相同，说明在可宵花药中表达的同工酶是雄性正 常发育所必霈的结构基因。 营墨菊等澎3 对玉米阁核异震和黼溪异孩嚣套不裔系及其鞫应保持系单核趸双 核期的花药，采用薄层疆直平板聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳及光密度扫描方法进 行酯酶和过氧化物酶圊工酶分析。结果表明：这蕊葺孛酶的月工酶在同一胞璇下的 不商棱鹜聚之阔均表魏穗不同程度静差异，各癸不育系与其横应保持系之湖也表 现出一定程度的差异。马全祥等。”利用薄层胶电泳技术对玉米花粉形成过獠不同 阶段的酯酶同工酶及可溶性蛋白静类酾含量变化滋行了研究。结果表明在孤米花 粉形成过穰中的不同除段酯酶丽工繇晌种类帮活镶均有不同。四分俸辩期懑现两 种小分子爨酯酶同工酶到小孢子阶段即很快消失，早期小孢子阶段酯酶同工活性 及辩类达到高峰，以露剿逐步递减。玉米花粉可滚性蛋白电泳曩示玉米花粉形或 过程中不鞫发育时期鬃鑫类和含量褥经大变化。强分体时麓存在有特异靛凝自 ( t p ) ，它的出现和随即消失，启动了多种蛋白质的合成。花粉有丝分裂完成后， 蛋自种类鄹含量明显加强。结果提示花粉形成过稷中存在着两个调控开关。 2 玉米雄性不育利用 2 。1 玉米细胞质雄性不育利用 美国获4 0 年代耪麓簧手配到生产上零j 雳憝撵镶不育系杂交耱，至1 9 7 0 年，全 美8 5 左右的玉米面积种植t 型雄性不育系杂交种。其基本原理根据三系法肖种程 序利用玉米细胞质雄性不育。 由予缨稳痿雄链不舞牲是沿母系遗转的，掰以f ；可裁存在缨施质靛受羧疲帮绥 胞质单一化的潜在危险，缘于此，1 9 7 0 年，美国孤米小斑病t 小种大流行，玉米 生产损失惨薰。随后，魏建昆等又发现c 小种的存在。尽管，许多研究者掇嫩了 许多释溺纛米缓麓罐穗不育途径。傲都不敢傈谨不会导致病警大发生。嚣貔，拳j 用玉米细胞质雄性不育配制不育系杂交种未能被广泛应用。 2 2 玉米细胞核雄性不夸利用 基于玉米细胞质雄性不育利用受到限制，玉米细胞核雄性不育利用成为了一个 新的研究糍点。利用核不育生产玉米杂交种具以下优点：第一，与细胞质不育系 具穗疑懿镶点。第二，医玉米竣不蠢系及其杂交耱缨戆虔是燕掌鳇，敌不会发生 某种病源黼对特殊细胞质的专化侵染。第三，可通过回交转育将受核基因籀制的 不育性引入任一自交系。篇四，任何正常自交系均可作为隐性援不育系的恢复系， 无需特豫逡撰即可获褥大蓬恢复系，但是如俺获褥梭不育系懿绦祷系是乖l 髑玉米 细胞核雄经不育的最大斑题，许多研究者为此提出了多种方法。 2 2 1 白色胚乳标记法 1 9 3 0 年，s i n g l e 弱j o n e s 。1 筵警零j 惩玉寒第6 凝琶傣长譬上不育基因麟与怒 乳白色控制基因j ，之间紧密连锁关系育成了以黄白粒色为区分标志的可育与不育 体系，确定融粒为不育系，黄粒为保持系，即m s y 系统法，但廊s 和y 并非完全迄锬， 交换篷在s 嚣缓主，爨有s 篱豹鼗黢撩矮入工菝除，虽在粒篷羟鼗哮l 有太为镫凳，鼹磊 粮中的黄囱粒分离也影响其商品价值，故虽几经尝试但一直未在生产上得到广泛 应用。 2 2 ，2 黄绿苗标记体系 黄绿菌连锁标记体系是基因核不育材料利用的又一重要尝试，即将黄绿荫基 因( 钞与雄性不育基因迄锬，在3 4 时期幼苗叶片表现出黄缘 ! 至状差别时，通过 拔除绿萤鞠可副除可鸯椿，解决了不霄系的保持阉题，绿时株蜜际上是保持系，但 在制种时露求倍量播种以保证足量的黄苗，且在叶色判断上也掺杂了人为错徽，故 其在生产上的剥塌还有特予避一步验涯完善。林晓。埝等”1 摄道了雄性不育懿多花 标记性状，鄹核不育基潮腰品与多花憔状标记基因( 为紧密连锁，不育系表现为果 穗花丝多两倍且种子基部两侧有两个败育的干瘪种子，这样就很容易将不育系选 出或将可努穗舅除，并已选出嚣个毫产基因不育系l 援一l 和删一2 。盎子基因不窍蜃 代静育性分离只有在开花时才能表现如来，所戳找到早期鉴剐肖性的标记谯状其 有重要的意义。 2 2 ，3 双杂金体法 p a t t e r s o n ( 1 9 7 3 ) 首次提出利用双杂台系保持核不育性，它主溪利用雌、雄配子 对重复、缺失染色体敏感程度的差异达到不育的目的。即利用杂合体产生的两种 琵子，一秘淡予萤奏歪鬻第6 粢篷体霰瓣基强( 正鬻芯羚) ，买一季孛怒子劳毒重笈缺失 体6 9 和可商基因( 次正常花粉) ，由于夔复缺失效应使次正常花粉在受精竞争中被淘 汰。该法照然解决了核不育系不育性保持问题，假由重复、缺失带来的不平衡效 应，镬缳撩系生长势弱，难瑷充分发撂杂耱钱势，援曼该法转窍过程复杂，技术 条件要求衙，美国利用该法生产的杂交种占美国杂交制种的5 ，到1 9 8 4 年则接 1 4 近于零，我阑也曾有人尝试过。“，这种方法研究虽然很多，但至今生产上未见 大面积应用。 22 4 光、温敏玉米雄性不育幂| j 用 1 9 9 2 年海南省农科院赫忠友。”狂玉米自交系繁种田发现玉米温敏型雄性不育 攮，礤究发瑗该誊孝料弯瞧受核基霞控测著可稳定遗传。1 9 9 4 年冬，曩洪生秘暖恚 国在海南省三亚南繁茂飙自交系c a 5 0 7 植株雄花不育，经研究初步确认该槠料为 光敏不育烈，受核基因控制。尽管玉米光、温敏不育性的发现为利用核不宵基因 带来了薮懿希望。如傍怒选到光涅敏感经强，不霄攮帮可弯往反艘稳定豹材瓣楚逮 题的关键。这就需要首先弄清光温敏不育基因豹佧用机理及遗传方式，然话针对存 在的问题，利用细胞遗传的方法或现代生物工程的手段，对这些材料加以改造和利 矮。东疆上窍诲多戏功戆经验可敬磐签。 2 2 5 邀米工程雄性不育系利用 随着生物技术的飞速发展，一些学嚣开始求助予基因工程的手段来创造一魑雄 往不弯誊孝辩舔工程不弯系，著彀褥了诲多可喜静袋莱。1 9 9 0 年m a r i a n i 报道了首翻 烟草和油桨工程不育系的建成，随后又在棉花、水稻、拟南芥等植物上陆续弑得成 功。1 9 9 2 年l ；l a r i a n i 又用基因工程的方法创建了= ：程不育基因的恢复基因。目前 最或功豹王程不育基嚣系统是p g s 公霹开发设诗豹潮荜花药转辩表达癌动予t a 2 9 与b a r n a s e b a r s t a r 组合而成的不育一恢复系统，该成果在烟草、棉花和玉米等作 物上有成功报道。 耧瘸工簇不育系静鼹著饶点是不受 乍物本身不育和恢复受滚静限割，另终不育 系的后代分离问题即不宵系的保持问题较易得到解决。由于这种不育性受单耩因 控审虹所以缀容易在不同系之间进行交流。缺点是技术要求离、成本高。此雏对粮 食、键辩箨物也涉及到转基因植物的安全润题。壤前，这方箍磷究进展缀袄，多种 不育基因和花药特异表达启动子也陆续被发现，有的来源于植物本身，有的泉源于 微生物，其作用枫理有瓣不圄；有的怒通过破坏花菰内的激素平衡寒造成雄憾不育 ( r o l b ，r o l c ) ( s p e n a a ，1 9 9 2 ) ；有的弱通过反义阻遥( 反义。榭a ) 来控镪l 雄性不 育( t a y l a r 1 p 1 9 9 2 ) ；还有的是通过特种酶的表达来破坏花药、花粉细胞内的代 谢平篱丽造成花粉败育( 鳃昼一l ，3 - g l u c a n a s e ，b a r n a s e ，d n a ) 。枫理的多样憾为工 程不育系的构建提供了要大的选择蒗潮。抗除草粼蒸因“嘲工穰的发震，为我们提 供了许多好的选择标记基因( 如b a r 基因、抗砌月基因、抗2 ，4 一d 基因) 1 ，使得我 们不仅可以针对单、双子叶来选择不同的抗除草剂基因，而且还可以从长远考虑， 选择一些经济有效的除草剂及其抗性基因，为今后生产上大面积应用、降低成本打 下基础。恢复基因的作用在整个工程不育系的应用过程中起着举足轻重的作用。 目前主要有两种方法来构建不育基因的恢复基因，一是克隆自然存在的，能够抑制 不育基因活性的基因( 如b a r s t a r 基因) ；二是通过反义阻遏基因来抑制不育基因 的表达i z a n t ，j g 1 9 8 5 ) 。此外还有一些针对不育基因本身特性而设计的恢复措施 ( y l s t r a b j 1 9 9 4 ) 。 3 玉米核不育基因的定位研究 依据基因定位过程中操作水平的差异，可将雄性不育育性基因定位的方法分 为染色体细胞水平上的基因定位和分子标记技术上的基因定位两大类。 3 1 染色体定位 染色体定位借助非整倍体材料，依据染色体工程技术原理对育性基因进行所属 染色体( 或染色体臂) 的定位，进而还可测定育性基因与着丝粒的大约遗传距离( 端 体分析法) 。其局限性包括以下几方面： ( 1 ) 染色体定位只能将育性基因定位在某一材料的某条染色体( 或染色体臂 上) ： ( 2 ) 染色体定位对遗传材料有特殊要求，必须具备一定的非整倍体材料才能 对育性基因进行定位，同时非整倍体材料( 特别是单体) 的保存和繁殖较为麻烦； ( 3 ) 要进行染色体细胞学水平上的定位，必须熟练掌握染色体细胞学制片和分 带技术。 玉米隐性突变体主要使用b a 易位系统来进行基因定位。b a 易位系统可以将 隐性基因定位于染色体臂上，也可以将共显性基因和表现型很明显的显性基因定 位于染色体臂上。目前在美国的玉米种质资源库中保存有b 染色体与所有2 0 条染色 体臂的易位系统( 除8 s ) 。如果要定位某一个基因，将这些易位系统与该突变体纯合 体材料杂交。在f 1 代，如果是苗期突变或胚乳突变，则表现约l 8 的突变体。否则， 该基因则不在这个易位系所涉及的染色体臂上。但是如果该突变基因位于易位断 点附近或8 s 上，则不能定位。这时就进行自交，如果该基因不在该易位臂上，后 代呈现3 ：l 的分离；如果突变基因与易位断点距离很近，由于a b 染色体很难传递，