（环境科学专业论文）人工合成色素细胞跨膜作用.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t s u d a nr e dc o m p o u n d s ( i 、i i 、1 i i 、i v ) a r eh y d r o p h o b i cc o m p o u n d s b u ti n c o n t r a s tt oh y d r o c a r b o n s ，s u d a nr e dc o m p o u n d sc o n t a i na z oa n dh y d r o x yg r o u p s ， w h i c hc a nf o r m h y d r o g e nb o n d sw i t ht h ep o l a rh e a d g r o u p so fm e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s t h u s ，e n t r ym a yb ei m p e d e d t h e yc o u l dh a v ed i f f e r e n tt o x i c i t i e sf r o m o t h e rl i p o p h i l i e h y d r o c a r b o n s i nt h i sp a p e rl i p o s o m ei s u s e dt o i n v e s t i g a t et h e i n t e r a c t i o nb e t w e e ns i m u l a t i o nl i p i dm e m b r a n ea n ds u d a nr e dc o m p o u n d s t h e r e s u l t sr e v e a lt h a ts u d a nd y e sc o r r e s p o n dt ot h el a n g m u i ra d s o r p t i o ni s o t h e r mw h i c h h a sb e e ns e tu pf o rm a n yy e a r s t h eb i n d i n gn u m b e ro fs u d a nr e dc o m p o u n d sw e r e c a l c u l a t e di nl i p o s o m e s e f f e c t so fe l e c t r o l y t e ，t e m p e r a t u r e ，a c i d i t yo fs o l u t i o na r e d e t e c t e dt oa n a l y z et h ep o s s i b l em e c h a n i s mo f i n t e r a c t i o nb yt l l e i rm o l e c u l a rs t r u c t u r e a g g r e g a t i o no fs u d a n r e da n dl i v i n ge s c h e r i c h i ac o l i 组c o l i ) w a sa n a l y s i s e dw i t hi n v i t r o e x p e r i m e n t s ，w h i c ha r et oc o n f i r mt h et h e o r e t i cs u p p o s et h a ts u d a nd y e s a c c u m u l a t e do n l yo nt h ec e l lm e m b r a n es u r f a c ea c c o r d i n gt ot h em o n o l a y e r a d s o r p t i o nb e c a u s eo fc o n t a i n i n gt h eh y d r o g e n - b o n d t h e yc o u l dn o td i f f u s ei n t o c y t o p l a s mo rl e a dt ot a r g e tt o x i c i t ya l s o t h et w ok i n d so fi o n i co r g a n i cc o m p o u n d s ，a n i o n i cd i a m i n eb l u e3 r ( d a b ) a n d c a t i o n i cr h o d a m i n eb ( r b ) ，w e r ec h o s e nt ob ei n v e s t i g a t e dt h eb o n d i n g sw i t hl e c i t h i n l i p o s o m e sa n dec o l i t h ei n t e r a c t i o n sc o r r e s p o n d e dt ot h el a n g m u i ra n dt e m k i n a d s o r p t i o ni s o t h e r mi no n l ym o n o l a y e r t h ei n f l u e n c eo fi o n i cs t r e n g t h ，p ha n d t e m p e r a t u r eo nt h ea d s o r p t i o nw a sc a r r i e do u t t h eb i n d i n gf o r c e ，t y p ea n ds i t e so f d a ba n dr bw e r ea n a l y z e da n dd i s c u s s e d t h er e s u l t sh a v es h o w e dt h a tt h ec h e m i c a l a d s o r p t i o no fd a ba n dr bo nt h el i p o s o m e sa n dc e l li ss t r o n g , e x o t h e r m a la n d i d i o p a t h i c ，w h i c hc o n t a i n e dt h eu n i o no fn o n c o v a l e n tb o n d s ，s u c ha se l e c t r o s t a t i c b o n d ，h y d r o g e nb o n da n d v a nd e rw a a l sf o r c e m o r e o v e r ，m o s to f d a ba n dr bw e r e a c c u m u l a t e do nt h ee x c e l l u l a rm e m b r a n ea n dw a l l ，h a r d l yt oe n t r yi n t oc y t o p l a s m b e s i d e s ，t h ec o m p e t i t i v ea b s o r p t i o nw a sf o u n dw h e nb o t hd a ba n dr be x i s t e d s i m u l t a n e o u s l yi nal i p o s o m eo rc e l ll i q u i d t h eh y d r o p h o b i cp o l a ro r g a n i c s ( s u d a nr e d ) a n dt h eh y d r o p h o b i ep o l a ro r g a n i c s ( d a b 、r b ) w e r ea d s o r b e do np e r i c e l l u l a rm e m b r a n eb yh y d r o g e nb o n d t h e a d s o r p t i v ec a p a c i t yw a sr e l a t e dw i t hm o l e c u l a rs t r u c t u r ea n dt h ea m o u n to fe l e c t r o n c h a r g e t h ed i f f e r e n c ei st h eh y d r o p h o b i cp o l a ro r g a n i c sw e r ea d s o r b e db yi o n i cb o n d i i ， a b s t r a c t i na d d i t i o n t h er e s u l t sp r o v i d e dav e r yu s e f u l e x p e r i m e n t a ls t r a t e g y f o rt h e q u a n t i t a t i v e a s s e s s m e n to fm e m b r a n e t o x i c i t y o fa r o m a t i c h y d r o c a r b o n a n d r e c o g n i t i o no f t h et e r m i n a lt o x i cs u b s t a n c e s k e yw o r d s ：s y n t h e t i cp i g m e n t s ：s p m ：c e l l u l a rm e m b r a n e ec o l i ：s u d a nr e d c o m p o u n d s a n i o n i cd i a m i n eb l u e3 r ； c a t i o n i cr h o d a m i n eb ：m e m b r a n e t o x i c i t y i 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：孪旅 弼年月了日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：茎鹚 砌留年1 月多日 第一章引言 1 1 研究目的与意义 第一章引言 近年来，许多染料及色素生产企业因环保原因而停产，部分由于在应用过程 中引发皮肤敏感及致癌病变而被禁止使用。仍有人为追求经济效益不顾国家法 令，向日用品和食品中添加禁止使用的色素危害人民群众生命安全。一些发达国 家的环保部门已开始对染料生产厂家所排废水的毒性提出了严格的限制要求，并 在染料及色素的应用上建立严格的控制标准。目前市场上共有8 8 种致癌性染料或 色素【l 】，其结构类型分偶氮型、蒽醌型和三芳基甲烷型等，而以偶氮型结构居多 【2 1 。其毒性问题已引起染料生产商和应用者的广泛关注，这些由偶氮色素引起的 环境和健康问题，迫使我们对人工合成色素的致毒机理进行研究，建立更完善的 毒理模型。 近年来，随着微相吸附模型的发展【3 】，提出了静电( 含偶极效应) 吸附诱 导非共价键协同作用促进结合的机理，研究了有机物分子结构对生命大分子二级 结构的影响机制【4 - 6 】。本项目将结合前期的研究基础，研究多种人工合成色素苏 丹红及亲水性色素在体外单层磷脂膜( s p m ) 及微生物上的结合及运输过程。研 究目的为：1 通过环境有机色素与细胞膜作用，分析其跨膜热力学过程。2 分析 膜结合方式、结合浓度及结合量，由此推断膜毒性。3 研究细胞积累及放大与效 应机理，认识与评价靶毒性风险。从跨膜过程分子相互作用的角度研究有机物对 微生物活性的影响，探索极性有机物对微生物的膜毒性机制，为掌握其在环境介 质中的迁移、转化和积累规律探索新的研究方法，对保障人类健康和保持国民经 济健康、稳定、可持续发展有着重要现实意义。 1 2 环境中合成色素来源、分布及危害 有机色素和染料因为特殊的染色功能常常被用于纺织品染料、玩具、食品和 化妆品添加剂等，使人们的生活丰富多彩。近几年我国不仅色素产量迅速增长， 而且品种也同步发展。迄今我国可生产的色素品种超过1 4 0 0 个，经常生产的品 种在7 0 0 8 0 0 个；我国可生产的有机色素品种约2 4 0 个，经常生产的品种有1 2 0 个。此外，进入新世纪以来我国染料、色素新品种的开发速度明显加快，新品种 不断涌现。新开发的染料和色素主要着眼于符合e c o - - t e xs t a n d a r d1 0 0 的环保和 生态要求，其中8 5 用于纺织品着色。这些新染料和色素具有“六不”的特点： 第一章引言 不含致癌芳香胺和不会裂解产生致癌芳香胺，不含过敏性物质，不含超标的重金 属，不含超标的甲醛，不含可吸附有机卤化物，不易产生环境污染或低三废等【7 】。 自1 8 5 6 年w h p 合成第一个有机染料以来各种合成有机染料和色素源源不 断的得到研制和合成，其中大规模应用于工业、商业领域至少有1 0 0 0 0 种，而5 1 0 的染料和色素被排放入环境水体中【8 】o 其品种和数量的增加引发了有机 染料和色素的环境污染问题，我国每年排放的染料和色素废水高达1 5 亿吨左右， 其中大部分废水未经处理直接排除环境水体中，全世界每年至少消耗约7 0 万吨各 种染料和色素【9 l ，其中许多有机染料和色素存在对人体致癌的健康风险【s 】。 目前人们已在多种环境介质中检出了难降解人工合成色素及降解后二次污 染物，包括空气、水、土壤、沉积物、和食品等【1 “。大气中的色素分子来源于 其生产和使用过程，他们主要吸附在烟尘颗粒物上，随着颗粒物的飘动发散在环 境各处。粒径小的颗粒物进入人体内会生成多种代谢衍生物，其中有的是重要的 致癌物，严重危害人体健康。大气监测表明，空气中色素分布随地理位置、季节 变化和气象条件的不同而变化很大。色素工厂上方空气中其浓度通常要高于周围 空气的几个数量级。未经处理印染废水偷排造成地表水、地下水受污染，进一步 使得河道底泥和周边土壤中含有大量有机色素。由于染料生产厂家和使用厂家多 集中在沿海一带，这使得近海和淡水湖泊也深受其害。基于染料的多种结构和其 理化特性，水溶性染料多含有卤素离子和重金属离子，它们在水中处于游离态， 导致卤素与重金属污染。脂溶性染料通过环境介质进入生物体内，一部分经过代 谢转化成无毒物质排出体外，但是更多含有芳环类染料代谢产物为芳香胺类物 质，严重危害人体健康。大气污染严重的地区土壤中的染料含量也较高。此外， 污水灌溉、污泥农用、工业渗漏等都会使土壤遭受它们的严重污染【1 0 】。 1 9 9 1 年6 月，美国环境基金委员会和环保署通过e d f v b r o w n e r ， c i v n o 8 9 0 5 9 8 ( d d c ) 法令，环保署按此法令的规定检查3 种类型的染料和色素： 以对二氨基联苯为基础的偶氮类，蒽醌类和三芳基甲烷类 1 h 。在偶氮染料和色 素中列出了含氮类、单偶氮、双偶氮、三偶氮、多偶氮、偶氮和对二氨基联苯； 蒽醌类列出了蒽醌和二萘嵌苯；三芳基甲烷类列出了三芳基甲烷、三苯甲烷和吡 唑啉酮【1 2 1 ，目前市场上可见染料和色素多为偶氮型结构【2 1 。 近年来，有证据显示，一些染料和色素可导致人类产生过敏、皮炎、致癌和 致突变等毒性效应 1 3 - 14 1 。例如许多含有致癌芳香胺的色素会对人体产生危害， 使用此类纺织品、服装、玩具当人体与染料长期接触后，易被皮肤吸收，并在人 体内扩散，与日常的代谢过程释放的物质混合在一起发生还原反应，使人体细胞 的脱氧核糖核酸发生变异而诱发癌症或引起过敏。违法使用某些色素作为食品添 第一章引言 加剂会导致消费者恶心、呕吐，严重者则有损肠胃甚至神经系统正常运转甚至导 致癌症。 在众多有机色素中以有偶氮结构为代表的偶氮色素备受关注。它们是人工合 成的偶氮化合物，其分子中有两个氮相联结在一起的结构( 一n ：n 一) 。目前全球 市场上有三千多种偶氮染料和色素，其中以联苯胺为基体的有2 0 0 多种，常用的 有9 0 多种f 1 5 】。偶氮结构色素在有氧的状态下，不易分解矿化，在厌氧状态下， 则很容易被微生物分解还原为芳香胺和其他产物。芳香胺无色无臭，在环境中更 不容易分解矿化。有些芳香胺具有致突变性，致癌性和其他毒性，会影响接触者 健康【1 6 】。 由于污染了水源、食物等，偶氮色素和色素可能经口进入人体。水溶性的偶 氮色素会被肠道菌分解成芳香胺。非水溶性的偶氮色素则会被肝脏吸收，被肝内 的酶分解还原成芳香胺。有些芳香胺是诱变剂或致癌剂，或有其他生物毒性。这 种偶氮还原作用是代谢活化作用，偶氮还原酶便是一种代谢活化酶。许多偶氮色 素本身并没有诱变性，但是经过肠道细菌的分解产生联苯胺等其他产物。这些分 解产物都有诱变性，并诱发人体产生膀胱肿瘤【1 7 - 2 。许多证据都指出了偶氮色 素被分解还原所产生的芳香胺如联苯胺才是祸源。而偶氮还原作用是一种毒物的 代谢活化作用。而这些芳香胺被排放到环境中便造成环境污染。虽然人体肝脏具 有偶氮还原酶，但是大多数的偶氮色素是水溶性的，它们的分解主要在人体肠 道内。人体肠道内有3 0 多种细菌具有偶氮还原酶。研究发现职业性接触芳香胺化 合物的工人如化学工业、染印工业、纺织工业、天然气工业、杀虫剂制造工业， 其膀胱癌患病率比一般人要高【2 2 1 。因此对这一类化合物的生物毒性如诱变性， 致癌性有详加研究的必要。 虽然偶氮色素的生物毒性是由于其分解还原产物一芳香胺，但并不是所有的 偶氮色素都会产生有生物毒性芳香胺。只有偶氮色素化学结构中含有联苯胺或苯 二胺才有此特性【2 3 1 。一般说来，两个氨基彼此在邻位时，其致癌的可能性比彼 此在对位时高。m i l m a n 和p e t c r s o n 综述并探讨了2 3 种苯二胺及其化学构造相 类似的芳香胺的致癌性。对硝基苯胺来说，将其环构造上的甲基氧化为羰基，其 致癌性也会降低。对对苯二胺来说，在苯环上要多加两个氯原子，便变成有致癌 性。而对间苯二胺或邻苯二胺则只要加一个氯原子就有致癌性了。由于苯二胺及 其化学构造相似的化学物或衍生物被用作染发剂，经常染发或职业上使用这些染 发剂的人，其膀胱癌患病率显著地高于一般人。而苯二胺也是确认的有害物质 畔】。联苯胺除会诱发膀胱癌外也会诱发人的胃、。肾脏、神经系统、口腔、咽喉、 食道、肝脏、胆囊、胆管和胰脏肿瘤。同样的，联苯胺也诱发实验动物的各种肿 瘤【2 5 - ”】。和联苯胺化学构造类似只是少一个氨基的4 氨基联苯也会诱发人的膀 第一章引言 胱癌，也可能是人类肺癌的凶手。在实验动物身上也诱发膀胱癌，及大鼠的肝癌 和小鼠的肠癌。但是和4 氨基联苯化学结构极其相似的2 氨基联苯和3 一氨基联 苯，则根本没有致癌性 2 7 - 2 s 1 。所以联苯胺和苯二胺是偶氮色素具有致突变作用 部分。研究这些芳香胺的化学结构与突变性的关系，一方面可以预测新设计的芳 香胺化合物的突变性，同时有利于进一步研究致突变与致癌的分子机制。 1 3 苏丹红毒性研究 苏丹红系列有机物是一组人工合成的以苯基偶氮萘酚为主要基团的亲脂性 偶氮化合物，在欧洲委员会公布的名单上有6 个品种，其商品名分别为苏丹 i ( s u d a ni ) 、苏丹i i ( s u d a ni i ) 、苏丹i i i ( s u d a n i i i ) 、苏丹i v ( s u d a n i v ) 、苏丹橙b ( s u d a n o r a n g eb ) 和苏丹红7 b ( s u d a nr e d7 b ) 。由于苏丹红成本低廉、颜色鲜艳、不易褪 色，被大量地用在工业、化学和医学领域，如机油、汽车蜡、鞋油、生化研究中 的着色剂等【2 9 1 。其中苏丹i ，尤其是苏丹i 常被违禁用于食品着色。从1 9 9 5 年起，欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹i ；我国食品添加剂 使用卫生标准中也不允许将苏丹红i i v 用作食品色素添加剂使用。2 0 0 5 年2 月1 8 日，英国食品标准署发布了包括亨氏、联合利华等3 0 家企业生产的可能含有 苏丹i 的4 1 9 种食品名单，并下令诏回；中国国家质量监督检验检疫总局在2 月2 3 日发布了相关公告，加强相关监督检查。英国食品标准署分别在4 月2 1 日和5 月7 日亦公布3 5 种辣椒酱中存在“对位红” 3 0 1 。国内将以上4 种苏丹红染料分别称为 苏丹红1 号、2 号、3 号、4 号。4 种苏丹红染料的中、英文化学名称、分子式和分 子量【”1 见表1 1 和图1 1 。 国际上从2 0 世纪8 0 年代起陆续有关于苏丹红在体内代谢、遗传毒性、致癌机 理的报道。苏丹红系列色素是非生物合成亲脂性偶氮化合物，一般不溶于水，因 苏丹红能引起实验动物肝脏、膀胱细胞癌变【3 2 1 ，所以它们对人体健康有害并可 能致癌。在对苏丹红系列的代谢研究表明，这类偶氮色素经口摄入后可以被还原 成相应的胺类物质，体外实验中致突变和动物实验中的致癌作用都与胺的产生和 继发的代谢活化有关。据报道苏丹红的代谢产物为以下物质f 3 3 1 ：苏丹i 在体内可 以被还原代谢为初级产物苯胺和1 一氨基2 萘酚。苏丹i i 在体内代谢可产生2 ，4 二甲基苯胺和1 氨基2 萘酚。苏丹在体内代谢可产生4 氨基偶氮苯、1 氨基2 萘酚、苯胺、对一苯二胺和1 一( 4 一氨基苯基) 偶氮2 萘酚。苏丹在体内代谢可产生 邻一氨基偶氮甲苯、l 一( 4 氨基2 甲基苯基) 偶氮一2 萘酚、2 ，5 二氨基甲苯、1 氨 基一2 萘酚和邻一甲苯胺。其中苏丹i i i 的代谢产物4 一氨基偶氮苯和苏丹的代谢产 物邻一甲苯胺和邻氨基偶氮甲苯为人类可能致癌物。 * 弈羽嚣残 一i_ * 豁回雀q 怅鑫懵唾 旱季葵末泉攥硼嗣嚣 * 弈司鼎嚣 西cin一 掣撵霉忙 掣辣喜忙掣舞喜杯 霉壤旃套媒 终醑* 已辨悻 瓣*辨睁 荨o n q 毛h h d ioao鼍q_导口曲6n孓#q 昌8墨n舌孓案望啼暑g盖暑i【善点i 6 c 器n q n l h u oib岳盖干qo霜主cpild(营暑基暑丫$-i n c - 譬h o岁王9_ll=u io口絮暑乓db口砷夏暑giia暑苦差一pitn一】-一 一葛 q 毛一号d iogiih乓d色口-z。茸暑g禹di 密撩l z - 嚼率 一埔将一聪警一醐将粥 j 文= 6 巨 凶v】-呷蛳矗】i 蛊垛啼一腻攀一瑚 精一聪旺郴将y已_i 密垛叩一1葶匿一粥 *郴itn一】-i h 一一虫椽 一一索糠 谣赫呻蜡雎端将-i h 术橡 葵掣 p v 缝 越摊 掣赡* 捌卜泰 懈n 畚 怯钗球_)簿砰扑晕 杖子_)簿驿扑掌 掉畦 棰婶扑睾雠脚鼎索椽【_【僻 妞而褂1 躲 第一章引言 苏丹i i i 删久 | c h 3 苏丹i i 图1 1 苏丹红染料结构 苏丹i v 虽然苏丹红色素并非直接致癌物，但进人体内的苏丹红经各种酶系代谢后形 成的部分代谢产物具有致突变、致癌变的生物活性，如引起遗传物质d n a 和r n a 损伤、细胞微核形成、活化产物与d n a 和r n a 形成加合物等最终导致组织发生 癌变【3 4 l 。参与苏丹红体内代谢的主要酶系有肝和肝外组织微粒体和细胞质的细胞 色素还原酶系和过氧化氢一过氧化物酶体系。细胞色素氧化酶系p 4 5 0 ( c y p ) 是致 癌物代谢活化的重要酶系之一 3 “。早期报道苏丹红代谢以大鼠肝微粒体以及植物 微粒体试验为主，近年来陆续出现了人肝脏微粒体参与苏丹红染料代谢活化的报 道 3 “。研究表明苏丹i 导致人体肝脏表达c y p l a l ，其水平高低与苏丹i 氧化代谢 的活性高低相关。在肝微粒体代谢活化苏丹i 形成致癌物的反应中占1 0 至3 0 。 这表明苏丹红染料有可能对人体肝脏产生致癌作用p 7 _ ”】。 国际癌症研究中一t ：, ( i a r c ) 在其1 9 9 9 年公布的对人致癌性总评价表中将苏丹 i 、苏丹i i 、苏丹、苏丹红7 b 定义为对人致癌性尚无法分类的物质。最近， 国际癌症研究机构对苏丹红的致癌作用进行了分析评价，将其归类为三类致癌 物，但这种致癌物进入人体后代谢为二类致癌物，即人类可能致癌物【3 9 1 。国际上 对苏丹红的毒理学研究，主要集中在苏丹染料在体内代谢活化后形成的代谢产物 对细胞遗传物质的损伤，促癌活性以及致敏作用。目前尚无充分的证据证明对人 体有致癌性。关于苏丹红本身的毒性和毒理学研究国内至今尚无报道。 1 4 水溶性有机色素研究 二氨基蓝3 r ( d a b ) ，溶于水呈红蓝色，微溶于乙醇。用于纤维壁染色， 弩书 舭 一 刮 一 丹 讲 苏 。 第一章引言 属于生物染色剂，不容许做食品染色。罗丹明b ( 1 m ) ，易溶与水，可溶于乙 醇，在溶液中有强烈的荧光，用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟 花爆竹等行业。罗丹明b 具有强的荧光效率且稳定性好，被应用于荧光光度分 析、单扫描示波极谱法和共振散射光谱，测定蛋白质等生物大分子、亚氯酸根和 溴酸根。其测定机理包括荧光崔灭，氧化褪色等【舡4 4 1 。罗丹明b 还用于光度测 定金、镓、汞、锑v 、铊，荧光测定锰、钴等，比色测定镉，氧化还原指示剂 用于滴定锡、锑、铌、钽的沉淀剂，同时它也是生物染色剂，属于系列激光染料。 大量使用此种染色剂所产生的污水影响水体色度使之无法达标排放，也带来一些 生态问题。作为工业染色剂，罗丹明b 不容许用作食品染色，但由于罗丹明b 具有脂溶性，价格低廉且颜色鲜艳，被许多不法商贩用作调味品( 主要是辣椒粉 和辣椒油) 染色剂，给消费者带来健康危害。d a b 、r b 化学名称、分子式、分 子量和分子结构如表1 2 和图1 2 所示，d a b 在水溶液中为阴离子有机物，分子 结构呈线型；r b 在水溶液中为阳离子有机物，分子结构里球型，两种有机物皆 为极性亲水芳烃类有机物。目前并无对两种物质毒性的深入报导。 表1 2d a b 、r b 化学名称 屯一 图1 2d a b 、r b 结构 1 5 污染物跨膜作用研究进展 硒 发达国家大都针对有机污染物尤其是持久性有机污染物在环境中的空间分 布、迁移、转化和归宿进行研究【4 5 1 ，目前，许多研究己深入到纳米介微和分子原 第一章引言 子层次。我国对环境中有机污染物研究起步较晚，跟踪性研究较多1 4 6 1 。微生物与 外界环境中有机物交换是透过细胞膜界面进行的，但它们等会成为细胞中物质、 能量转化过程的抑制剂，通过改变膜的透入率、膜电位、p h 、离子平衡等影响 细胞活动【4 7 l 。近年来，环境毒物的研究在微界面上逐步展开，探索了其在水体颗 粒物、水体沉积物等若干重要的界面过程的规律【4 8 1 。在污染物特性和活性预测 研究方面，定量结构活性相关技术己被广泛应用【4 9 1 。王连生等 5 1 通过模拟外源 污染物与生物大分子在复杂的三维空间中的相互作用，揭示了污染物一受体相互 作用的机理，建立了混合有机毒物膜水分配系数的理论模型与测定方法。在污 染物迁移、生态毒理效应、水环境风险等方面，建立了污染物化学行为和生态效 应研究的先进方法【5 0 】以及痕量污染物生态毒理效应模拟新技术5 1 1 。傅家谟等【5 2 1 开展环境中持久性有机污染物和内分泌干扰化合物的生物地球化学与调控研究， 其中包括大气、水、沉积物土壤和生物中毒害有机物的检测技术与存在状态、 界面作用等。 关于有机污染物对生物的毒性作用，研究多集中在毒物作用于靶点( 终毒) 方面，即通过胞外模拟实验研究其与基因、蛋白质等生命分子的相互作用或对代 谢反应的抑制等【5 3 1 ，而对于它们如何从胞外转运到生物体内以及转运过程中的反 应、结合和平衡缺乏研究。而此过程更能反映污染物对微生物最初的毒性作用， 也是后期基因学研究的基础所在。研究污染物的跨膜过程是实现其生物降解，减 小毒性的基础m 1 。但是污染物在跨膜过程中会通过非共价键与磷脂膜相互作用， 容易通过相分配在细胞膜上积累。 细胞膜又称质膜，是细胞表面的一层薄膜，有时称为细胞外膜或原生质膜。 主要结构成份一般是蛋白质占6 0 8 0 ，类脂占2 0 4 0 ，碳水化合物约占 5 ( 分布在类脂和蛋白质之间) 。细胞膜把细胞包裹起来，使细胞能够保持相对的 稳定性，维持正常的生命活动。此外，细胞所必需的养分的吸收和代谢产物的排 出，都要通过细胞膜。细胞膜功能主要为：( 1 ) 分隔形成细胞和细胞器，为细胞 的生命活动提供相对稳定的内环境，膜的面积大大增加，提高了发生在膜上的生 物功能；( 2 ) 屏障作用，膜两侧的水溶性物质不能自由通过；( 3 ) 选择性物质运 输，伴随着能量的传递；( 4 ) 生物功能：激素作用、酶促反应、细胞识别、电子 传递等。由于细胞膜对生物的巨大作用所以需要对其与污染物的行为做更深入的 研究。 对有机物与生物分子之间相互作用的研究能帮助人们认识物质相互间的反 应平衡、分子间相容性和结合稳定性，以便从分子生物学的角度研究有机物的毒 理学和药理学。国内外关于有机物与蛋白质、核酸、聚糖、表面活性剂等相互作 用的研究较多5 5 - 5 8 1 。通过微生物研究细胞膜与多环化合物作用也有报道【5 9 - “1 。 第一章引言 微生物是研究脂溶性化合物与膜毒性作用最有效的工具。亲脂性有机物会损害微 生物生长，这些化合物的某些组分还有直接抑制作用，所有切表明，毒物首先 与细胞膜发生作用。细胞膜直接参与许多重要的功能例如识别，能量转导，物质 运输等。膜中的结构和功能会被亲脂类污染物破坏从而影响到细胞生长和生命活 性。污染物对于环境中微生物的作用在毒理学方面被广泛关注，很多有毒物质对 微生物抑制生长，对其呼吸作用或者其他重要功能的影响已经通过体外实验做出 评估。对这些污染物的毒性结合它们的物理化学特性从分子水平到器官角度都有 数据研究，通过这些数据可以建立结构活性关系。这些数据有助于确定环境污染 无的上限阈值并用来评估污染物环境毒性风险。研究者多数选择脂肪嗜热芽孢杆 菌作为研究对象 6 2 - 6 5 】，选择硫丹、d d t 这些在环境中分布广泛，易于在生物体 内聚集并产生一定毒性的物理化学性质稳定的亲脂性污染物研究它们的毒性机 理。通过绘制在不同污染物加入量下微生物生长曲线变化图和测定污染物存在条 件下膜中磷脂的极性变化可以得出结论：污染物的存在使得微生物生长和活性受 到很大抑制，同时污染物聚集在磷脂双层膜上使得细胞膜中物理成分发生改变， 这些污染物通过膜毒性而干扰细胞的正常生命活动和代谢作用。有关于环烃 ( p a l l ) 与大肠杆菌制作得到的s p m 作用的研究表明p a i l 极容易截留在细胞膜 表面 6 1 1 ，它们的相互作用类似于辛醇一水分配体系。这导致了细胞膜表面p h 和 电势随着p a h 在膜表面聚集增多而减小，而细胞膜离子渗透量增加，当污染物 浓度增大到一定量时细胞色素氧化酶失活。这些现象表明p a h 存在于膜和水相 中，在它们的共同作用下与细胞膜的磷脂层和膜蛋白产生作用，这种作用类似与 憎水物质和磷脂的作用方式。常用来表征结合与分配作用，但是基于污染物跨膜 过程分子间相互作用对微生物致毒机理缺乏深入研究。 综上所述，目前我国虽然对苏丹红等偶氮有机物的使用范围有严格规定，还 是有很多含有类似结构的食品和日用品进入市场，引起社会的密切关注。虽然经 实验表明这些物质诱发动物肿瘤的剂量较人体最大摄入量多2 4 个数量级【3 3 】， 其对人体致癌的可能性较小，但并不意昧着其无危险性，如果经常摄入或接触含 较高水平偶氮有机物的食品和生活用品就会增加其致癌的危险性，危害人体健 康。国内外大量的研究已解释了偶氮有机物对动物和人类的危害机制。随着对微 观领域的分子毒性作用深入研究，可以在以前的基础上建立低等生物与污染物的 分子毒理学模型，进而继续研究它们与高等动物作用机理，同时也丰富了亲脂性 有机物分子相互作用的模型。 第一章引言 1 6 论文研究内容 本课题由上海重点基础研究( n o 0 4 j c l 4 0 7 2 和0 5 j c l 4 0 5 9 ) 和国家自然科学基 金( n o 2 0 4 7 7 0 3 0 ) 支持。研究选择了人工合成色素苏丹红和可溶性离子型色 素为主要研究对象，重点进行以下内容的研究： 1 6 1 苏丹红一体外单层磷脂膜( s p m ) 作用 要开展苏丹红跨膜过程研究，首先要通过实验研究苏丹红由水一体外磷脂单 层膜( s p m ) 吸附过程，建立模拟细胞液条件下的苏丹红一s p m 微相吸附模型，为 研究微生物膜内外苏丹红的吸附平衡奠定理论基础。 1 6 2 苏丹红一大肠杆菌作用 大肠杆菌( e s c h e r i e h 妇c o l i ，ec o l i ) 革兰氏阴性短杆菌，大小0 5 1 3 微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物 肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活 动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害， 还能合成维生素b 和k ，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。 但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布 在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可 能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数( 或大肠菌值) 常作为饮水和食物( 或 药物) 的卫生学标准。该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，5 5 经6 0 m i n 或 6 0 加热1 5 m i n 仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度 较低的粪便中存活更久。 大肠杆菌在生物技术中应用广泛。其作为外源基因表达的宿主，遗传背景清 楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视目 前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。所以 实验选择大肠杆菌做为体外细胞实验对象，研究其与人工合成色素的作用机理。 苏丹红的吸附过程为：水溶液一细胞膜。前者由于细胞活动、溶液混合，使 得苏丹红吸附到细胞膜，并进入膜磷脂相通过疏水键与磷脂结合，从而滞留、不 断积累，只有很少量苏丹红进入细胞液。通过微生物在含有苏丹红的条件下进行 培养，确定其在细胞内外的吸附参数，与微相吸附模型的分析结果进行比较，建 立苏丹红吸附模型。结合所建立的模型、细胞膜形貌观察结果等，分析苏丹红在 不同时间和温度上的吸附规律。 第一章引言 1 6 3 水溶性色素- - s p m 作用 以苏丹红一s p m 作用研究为基础开展可溶性色素跨膜过程研究，通过实验研 究色素由水一s p m 吸附过程，建立模拟细胞液条件下的色素一s p m 微相吸附模 型，为研究微生物膜内外水溶性色素的吸附平衡奠定理论基础。 1 6 4 水溶性色素一大肠杆菌作用 通过微生物在含有水溶性色素的条件下进行培养，确定其在细胞内外的吸附 参数，与微相吸附模型的分析结果进行比较，建立污染物吸附模型，同时绘制时 间温度吸附量关系曲线，并建立模型。结合所建立的两个模型和实验结果等， 比较分析不同结构有机污染物在s p m 上的吸附规律。 1 6 5 技术路线 根据文献制备s p m 。图1 3 所示，s p m 与有机物充分混合后离心分离，测定 上清液吸光度，得到水体中游离有机物浓度( l 1 ) 。用乙醇溶解离心沉淀并对其 测定吸光度，得到s p m 上吸附有机物浓度( b ) 。 图1 4 所示，将有机物分别加入到已到平稳期的微生物培养液中进行混合实 验。控制参数和条件包括：微生物和有机物加入量、培养基浓度、温度、培养时 间等。定时对培养液进行活细胞检测，绘制微生物生长曲线。水体中游离污有机 的量可直接对细胞离心分离液进行吸光度测定得到，而细胞液积累的污染物需要 通过细胞破碎、离心将细胞膜壁分离开来，对上清液进吸光度测定得到胞外水 体和细胞液混合有机物量。破碎细胞的细胞膜沉淀物采用与有机溶剂如乙醇等溶 解，破坏双层卵磷脂膜结构，提取膜中有机物，利用吸光光度法测定污有机浓度， 计算膜吸附量。 第一章引言 图1 3 色素一s p m 作用测定流程图 图1 4 色素一大肠杆菌作用测定流程图 1 2 第二章苏丹红与s p m 作用 2 1 材料与设备 2 1 1 材料 第二章苏丹红与s p m 作用 卵磷脂( 1 e c i t h i n ) ：b r 国药集团化学试剂有限公司。 苏丹i ( s u d a ni ) ：b r 国药集团化学试剂有限公司。 苏丹i i ( s u d a n i i ) ：b r 国药集团化学试剂有限公司。 苏丹i i i ( s u d a n l i i ) ：b r 国药集团化学试剂有限公司。 苏丹i v ( s u d a n i v ) ：b r 国药集团化学试剂有限公司。 苏丹红系列化合物溶解在乙醇溶液中，分别形成0 2 m m o l 1 ，0 2 m m o f l ， 0 2 m m o l 1 ，0 1 m m o l 1 的乙醇溶液，避光室温保存。 p b s 缓冲溶液：8 9 n a c l ，o 2 9 k c l ，1 4 4 9n a 2 h p 0 4 ，o 2 4 9n a h 2 p o a ，p h = 7 4 ， 蒸馏水1 0 0 0 m l ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。用于混合液重悬，清洗。 n a c l ：b r ，国药集团化学试剂有限公司，用于离子强度条件实验。 p h 缓冲溶液( b r i t t o n - - r o b i n s o n ) ：磷酸，乙酸，硼酸( 各0 4 m m ) ，加入 一定体积的n a o h 溶液，得到不同p h 的缓冲溶液。 以上水溶液均使用去离子水配制。 2 1 2 主要仪器 国) 。 分析天平：a l l 0 4m c t t l c rt o l e d o 恒温摇床：c h a - 2 上海亿通有限公司。 高速离心机：t g l - 1 6 c 上海安亭科技有限公司 电热式恒温水浴锅：d k 一8 d 上海精衡仪器仪表有限公司。 冰箱：b c d 一1 9 6 美菱。 紫外可见分光光度仪：p e r k i ne l m e rl a m b d a2 5 p h 计：p h s 2 5 上海精密科学仪器有限公司。 电子天平：b s l1 0 s 北京仪器厂。 超声清洗器：k u d o s ，s k 3 3 0 0 6 1 上海科导超声仪器有限公司。 细胞破碎机：j y 9 2 一i i 宁波新科医疗器械有限公司 o 5 一l o 皿，5 5 0 “l ，2 0 - - 2 0 0 p 1 ，1 0 0 一1 0 0 0 “l 移液枪( f i n n p i p e t t e 公司，德 第二章苏丹红与s p m 作用 1 2 x 5 具塞1 0 m l 比色管( 崇明县斜桥玻璃仪器厂，上海) 。 2 2 实验过程 2 2 1 体外s p m 制备 将一定量的卵磷脂固体加入去离子水中，利用超声制备卵磷脂单层膜脂微 囊胶体溶液，浓度为2 0 m g m l 。步骤如下：冰浴条件下超声1 5s 间歇4 58 ，超声 2 0 m i n ，形成稳定的s p m 悬浮液吲，在4 c 下保存。s p m 用于进行体外实验。 2 2 2 标准曲线绘制 配制苏丹红i 一系列的乙醇溶液1 6 m m 0 1 1 ，0 8 m m 0 1 1 ，0 2m m o l 1 ，0 1 m m o l l 。在1 0 m l 的比色皿中分别加入苏丹i 、i i 和i v ( 0 、3 0 、5 0 、8 0 、1 0 0 、1 2 0 、 1 5 0 、1 8 0 、2 0 0 、2 5 0 1 2 1 ) 用乙醇稀释n 5 m l ；苏丹( 0 、3 0 、5 0 、8 0 、1 0 0 、1 2 0 、 1 5 0 、1 8 0 、2 0 0 、2 5 0 9 1 ) 用乙醇稀释至l j l o m l 。在苏丹红i i v ( 4 7 7 n m ，4 9 5 n m ， 5 0 4 n m 和5 1 5 n m ) 处测定溶液吸光度，由各浓度与吸光度关系绘制色素一乙醇标 准曲线。 苏丹红化合物在水溶液中溶解度非常小，其水溶液是把上述母液苏丹i 一 ( 0 2 m m 0 1 1 ，0 2 m m o l l ，0 2 n u n 0 1 1 ，0 1 m m o l 1 的乙醇溶液) 稀释，得到的水 一乙醇溶液。在1 0 m l 的比色皿中分别加入苏丹i ( o 、3 0 、5 0 、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 、 1 1 0 、1 2 0 、1 3 0 、1 5 0 i t 1 ) 用去离子水稀释到5 m l ；苏丹i i ( 0 、3 0 、4 0 、5 0 、7 0 、 8 0 、9 0 、1 0 0 、1 1 0 、1 2 0 、1 3 0 p 1 ) ；苏丹i i i 和( o 、