（发酵工程专业论文）bacillus+subtilis+wshdz01发酵生产过氧化氢酶条件优化.pdf

摘要 捅矍 过氧化氢酶( c a t a l a s e ，简称c a t ) ，能够催化h 2 0 2 分解为h 2 0 和0 2 ，被广泛用 于食品消毒、临床分析、医学诊断以及纺织、造纸、制浆等工业。随着环保意识的加强， 在纺织染整工艺中采用酶替代传统的强碱高温工艺对棉织物进行前处理已得到了广泛 的应用。c a t 在棉织物前处理过程中的主要作用是去除织物漂白废液中残余的h 2 0 2 ， 以消除对后续染色工序的影响。 本论文研究营养条件以及环境条件对发酵过程的影响，通过提高b a c i l l u ss u b t i l i s w s h d z 0 1 生物量，最终提高过氧化氢酶的产量。主要研究结果如下： 1 通过优化营养成分，枯草芽孢杆菌w s h d z 0 1 在优化后的发酵培养基中，即在 麦芽汁浓度为2 。的发酵培养基中添加2 0g l 葡萄糖和1 0g l 硝酸钠，培养3 0 小时，生 物量达到6g l ，总酶活达到1 1 0 0 0u m l 。对比优化前罐上最佳结果，生产强度提高了 三倍，为工业化生产研究奠定了基础。 2 b a c i l l u ss u b t i l i sw s h d z 0 1 在3 l 发酵罐条件下研究表明：在通气量与装液量一 定的条件下，搅拌转速对过氧化氢酶产量影响不大；在初始葡萄糖浓度为2 0g l 且通气 量控制在1w 瑚的情况下，将搅拌转速恒定在4 0 0r m i n 即可满足细胞生长和过氧化氢 酶合成对溶解氧的需求。 3 在研究温度对b a c i l l u ss u b t i l i sw s h d z 0 1 合成过氧化氢酶的影响时发现：较高 的发酵温度( 4 0 ) 有利于缩短细胞生长的延迟期，提高发酵前期细胞对碳源的利用能力； 适中的温度( 3 5 ) 则有利于发酵中期过氧化氢酶的合成；而较低的温度( 3 2 ) 延长了合 成过氧化氢酶的时间。根据发酵过程中比产酶速率曲线，提出分批发酵生产过氧化氢酶 的多阶段温度控制策略，即0 1 0 小时发酵温度为4 0 ，1 0 2 0 小时将温度控制至3 5 ， 2 0 小时后将温度切换至3 2 。采用该优化的温度控制策略，最高酶活( 2 0 8 9 6u m l ) 和 生物量比单一温度下的最大值( 3 2 1 4 1 2 4u m l ) 分别提高了4 7 和1 7 。 4 理论计算的结果为：在3 0 l 发酵罐条件下采用搅拌转速3 1 3r m i n ，通气量0 5 6 v v m 。根据前期研究经验，b a c i l l u ss u b t i l i sw s h d z 0 1 合成过氧化氢酶需要较严格的溶 氧条件，即3 0 l 发酵罐中将装液量维持在6 0 上，通气量控制在o 5 0v v m ，罐压保持在 0 0 2m p a ，搅拌转速确定为3 0 0r r a i n 。采用温度控制策略过氧化氢酶产量最高可达2 0 1 3 3 u m l ，其中胞外过氧化氢酶产量在6 0 小时左右达到最高，其最高值为1 5 3 8 6u m l ，该 结果与3 l 上研究结果基本吻合。 5 通过对发酵过程中过氧化氢酶分布情况分析发现，胞外过氧化氢酶与总过氧化氢 酶出峰的时间不相同，胞外过氧化氢酶最大值出现的时间滞后于总酶活的最大值出现时 摘要 间。考虑到提取胞内产物的成本和复杂性，综合考虑生产强度以及产品的得率，以胞外 过氧化氢酶含量的变化为依据确定发酵结束时间。 关键词：过氧化氢酶，营养条件，环境条件，搅拌转速，温度阶段控制，生产强度 a b s t r a e t a b s t r a c t c a t a l a s ec a r ld e c o m p o s eh 2 0 2i n t oh e oa n d0 2e f f e c t i v e l y p h y s i o l o g i c a l l yi ta c t s 弱a r e g u l a t o ro fh 2 0 2l e v e l si no r g a n e l l e sa n dp r o t e c to r g a n i s mf r o mt h ed a m a g eo fr e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s 。c a t a l a s e sf r o mv a r i o u ss o u r c e sa r eu t i l i z e di l ls e v e r a la p p l i c a t i o n s ，s u c h 鹤 d i s e a s e sd i a g n o s i sa n dr e m o v a lo f h y d r o g e np e r o x i d ei nf o o ds t e r i l i z a t i o n c a t a l a s ei su s e di n r e m o v a lo f h y d r o g e np e r o x i d ei nt h et e x t i l ep r e t r e a t m e n ta sas u b s t i t u t ef o rh i g h - t e m p e r a t u r e w a t e rw a s h i n ga n d u s i n gc h e m i c a lr e d u c i n ga g e n t s i no u rp r e v i o u ss t u d y , t h eb i o m a s so fb a c i l l u ss u b t i l i sw s h d z 01w a so n l y1 2 5 g l 弱瓣p r o d u c t i o no fc a t a l a s ew a ss t r o n g l ya f f e c t e db yt h el o wb i o m a s sc o n c e n t r a t i o n 。f o r i n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fc a t a l a s e ，t h eb i o m a s sc o n c e n t r a t i o ns h o u l db ei m p r o v e da tf i r s t i n t h i ss t u d y , t h en u t r i t i o nc o n d i t i o na n dt h ee n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n sf o rt h ec u l t i v a t i o no f b a c 绞醒s u b t i l i sw s 疆d z 01f o r t h ep r o d u c t i o no fc a t a l a s ew e r ei n v e s t i g a t e d i 。t h ee f f e c to fn u t r i t i o nc o n d i t i o no nc a t a l a s ep r o d u c t i o nb yb a c i l l u ss u b t i l i sw s h d z 0 1 w a si n v e s t i g a t e d i tw a sf o u n dt h a ts o d i u mn i t r a t ew a st h eo p t i m u m n i t r o g e ns o u r c e t h e e f f e c to fa d d i n gv a r i o u so r g a n i cn i t r o g e ns o u r c e so nc e l lg r o w t hw a sf u r t h e rs t u d i e d ，t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a ta p p r o p r i a t ea d d i t i o no fm a l te x t r a c tc o u l db o t hg r e a t l yi n c r e a s et h e b i o m a s sa n ds h o r t e nf e r m e n t a t i o nt i m e c o m p a r i s o nw i t ht h a tb e f o r eo p t i m i z a t i o n ，t h e b i o m a s sr e a c h e d6 e g l ，t h ec a t a t a s ea c t i v i t yw a s110 0 0u m l ，f e r m e n t a t i o nt i m ew a s s h o r t e n e dn e a r l y6 0 a n dt h ep r o d u c t i v i t yo fc a t a l a s ei n c r e a s e d3t i m e s 2 a c c o r d i n gt ot h ef e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t si n3l i t e r sf e r m e m o r , i tw a sf o u n dt h ea g i t a t o r s p e e dw a sn o tt h ev i t a lf a c t o rf o rc a t a l a s ep r o d u c t i o n t h eb e t t e rc u l t u r ec o n d i t i o nw a sa s f o l l o w s ：t h ei n i t i a ls u g a rc o n c e n t r a t i o na t2 0 玑，t h ea g i t a t o rs p e e da t4 0 0r r a i n ，a e r a t i o n r a t ea t1 0v v i n 。 3 e n h a n c et h ey i e l do fc a t a l a s e ，t h ek i n e t i cp a r a m e t e r so fb a t c hf e r m e n t a t i o na td i f f e r e n t t e m p e r a t u r e sr a n g i n gf r o m3 0t o4 0 w e r ei n v e s t i g a t e d i tw a sf o u n dt h a ta tt h el o w e r t e m p e r a t u r es u c ha s3 2 ，t h ep r o d u c t i o nc a p a b i l i t yw a se l e v a t e da n dr a t eo fc a t a l a s ew a s p r o m o t e d b a s e do nt h ek i n e t i cp a r a m e t e ra n a l y s i s 。am u l t i s t a g e dt e m p e r a t u r ec o n t r o l l i n g s t r a t e g yw a sp r o p o s e d ，i nw h i c ht e m p e r a t u r ew a sc o n t r o l l e da t4 0 i nt h ef i r s t10h ，t h e n s h i f t e dt o3 5 d u r i n g10 2 0ha n df i n a l l ys h i f t e dt o3 2 a f t e r w a r d s i tw a s e x p e r i m e n t a l l yv e d f i e d 。b yu s i n gt h i ss t r a t e g y , t h em a x i m u mc a t a l a s ea c t i v i t yw a s2 0 8 9 6 u m la n di n c r e a s e db y4 7 b yc o m p a r i s o nw i t ht h a to fc o n s t a n tt e m p e r a t u r e3 2 4 o nt h eb a s eo ft h e o r yc a l c u l a t i o n ，t h ec u l t u r ec o n d i t i o n si n3 0lf e r m e n t o ra r ea sf o l l o w s ： a g i t a t o rs p e e dw a sa t3 13r m i na n da e r a t i o nr a t ea t 0 5 6w m t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o wt h 耩圭a g i t a t o rs p e e do f3 0 0r r a i n , a e r a t i o nr a t eo f0 6w m ，b a c kp r e s s u r e 敷0 。0 2m p a a n dc o n t e n tv o l u m ea b o v e6 0 a r eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rc a t a l a s ep r o d u c t i o n 硼1 e r e s u l t sm a t c ht h eo n e si n3l i t e r sf e r m e n t o r 5 b a s e do nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s sa n a l y s i s ，i tw a sf o u n dt h a tt h em a x i m u me x t r a c e l l u a r a b s t r a c t c a t a l a s ea c t i v i t yr e a c h e dt h ep e a kp o i n tw h e nt h et o t a lc a t a l a s ep r o d u c t i o nd e c r e a s e d c o n s i d e r i n gt h ec o m p l e x i t yo f e x t r a c t i o no fi n t r a c e l l u l a rc a t a l a s e ，i ti ss u g g e s t e dt oe n d f e r m e n t a t i o np r o c e s sw h e nt h ee x t r a c e l l u a rc a t a l a s ep r o d u c t i o nr e a c h e st h ep e a kp o i n t k e y w o r d s ：c a t a l a s e ，n u t r i e n tc o n d i t i o n ，e n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n ，a g i t a t o rs p e e d ，m u l t i s t a g e d t e m p e r a t u r ec o n t r o l ，p r o d u c t i v i t y i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是芬人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：e l 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 日 期： 第一章缝论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 。1 过氧化氢酶概述 人们研究过氧化氢酶的历史可追溯到1 0 0 多年前，旱在1 8 1 1 年就已发现动植物组 织可以分解h 2 0 2 产生0 2 ，到1 8 9 2 年j a c o b s o n 证明了在动植物组织内有专一分解过氧 化氢的酶，器霉过氧化氢酶的存在。1 9 0 1 年l o e w 毯第一次报道了过氧化氢酶的生物化学 特性。到1 9 3 7 年，s u m n e r 和d o u n c e t 2 首次从牛的肝脏中分离得到过氧化氢酶的结晶， 这是最早分离得到的高纯度酶之一。这一事件也标志着生物化学学科旱赣发展酌胜利。 随后相继报道了哺乳动物的肝脏、红细胞及大多数微生物体内均含有此酶，其中哺乳动 物组织中过氧化氢酶的含量差异很大，肝脏中含量最高，结缔组织中含量最低，在上述 组织细胞内过氧化氮酶主要与细胞器如线粒体和过氧化物酶体结合的形式存在，而在红 细胞中则以可溶的状态存在。 过氧化氢酶是红细胞的衍生物，它可催化过氧化氢分解为水和氧气，使过氧化氢不 至于与超氧化物自由基反应生成有害的o h ：并对血红蛋白及其它的含巯基蛋白质起 戮保护作黑，傻它们不被氧化，因此对减轻溪性氧损伤有一定意义。 大多数从不同机体分离出的过氧化氢酶由4 个相同的亚单位组成，分子量在2 4 0 k d a 左右，在亚基的活性部位各含一个血红素基髓。来自哺乳动物以及某些真菌和细麓的过 氧化氢酶还含有4 个紧密结合的n a d p h 分子。过氧化氢酶可被氰化合物、苯酚类、叠 氮化物、过氧化氢、尿素及碱等物质所阻抑。 1 1 。2 过氧化氢酶与过氧化物酶 过氧化物酶和过氧化氢酶都是两种广泛存在于动植物体内，含血红素( 铁卟啉) 辅 基的氧化还原酶。毽由于它们作用的底物都有过氧化氢，容易将它们混淆。 过氧化氢酶( h y d r o g e np e r o x i d a s e ) ，又称触酶( c a t a l a s e ，c a t ) ，其系统名称是： h 2 0 2 ：h 2 0 2 氧化还原酶。国际酶学委员会编号为e c l 1 l 。1 6 ，其催化反应简示如下； 过氧化氢酶f e ( i i i ) + h 2 0 2 一化合物i 化合物i 十h 2 0 2 一过氧化氢酶( f e i i i ) + 2h 2 0 + 0 2 过氧化物酶( p e r o x i d a s e ) 也有人简称过氧化酶，其系统名称是：供体：过氧他氢氧化 还原酶。国际酶学委员会编号为e c l 1 1 1 7 ，其催化反应式为： 蒯h 2r+2h20 从两种酶的反应式可以看出，触酶只有一种底物，反应生成水帮氧气；丽避氧化物 酶则要两种底物，其反应的实质是：酶催化共体脱氢( 氧化) ，同时催化脱下的氢使h 2 0 2 还原为h 2 0 。在这个反应中，妻瑟果只有碣0 2 ，没有供体，反应则不麓进行。 1 1 3 过氧化氢酶的应用领域 自2 0 世纪8 0 年代以来，织物和纸张的生产者以及其他工业就已经开始使用过氧化 氢代替有毒的氯气来漂自和消毒产品。过氧化氢可用于消除新鲜水果和蔬菜上有害的细 江南大学硕士学位论文 菌，如沙门氏蓥和大肠籽菌，还可用于消毒奶制晶，失食品的纸包装如果汁盒消毒也不 必冷藏储存等。在去除生产过程中剩余的过氧化氢的过程中，人们将注意力转向了具有 非常高的催化效率的生化酶一过氧化氢酶，因此过氧化氢酶在食品、医药、临床等行业都 有着广泛的用途。 ( 1 ) 临床 在锰床分析中，c a t 对研究巍由基代谢失衡，抗衰老和肿瘤发病机理具有一定价值， 对某些疾病的诊断，鉴别诊断亦具有重要意义f 3 卅。c a t 可消除h 2 0 2 ，对超氧化物歧化 酶起保护作用，因而具有抗衰老作用【5 】。 ( 2 ) 医药 由于h 2 0 2 具杀菌、清洁、漂白及消毒的功效，常用于器械消毒。如在隐形眼镜消毒 过程中添加c a t 可分解消毒液中残留的0 2 。国内、韩均有研究的专利发表【硒】。 ( 3 ) 食品加工 c a t 可使食燕保鲜，并作为消除啤酒、饮料中分子氧、活性氧和自由基的抗氧化裁。 与葡萄糖氧化酶并用作氧的去除剂，牛乳杀菌及干酪原料乳的杀菌【9 】。 ( 3 ) 其它工业 与h 2 0 2 同时使用，用于橡胶成型，塑料及多泡性粘合剂。纸浆、纤维、鼍漂自工艺 中除残留的h 2 0 2 。加入化妆品中可防止皮肤衰老，还可处理半导体废水。近年来随着 掩0 2 在纺织、造纸、刽浆等行业的普遍廒用，市场对c a t 的需求也呈大幅增长趋势。 l 。l 。4 蒜内外研究概况 c a t 来源丰富，存在于几乎所有好氧生物中，和一部分厌氧生物中。动物过氧化氢 酶存在予动物的主要组织中，尤以肝与红细胞为最多，脑、心与骨髂肌为最少，动物肝 脏是过氧化氢酶的一个很大来源，国内外均已实现这一工艺的工业化生产。另外，巴西 研究者开发了从人胎盘中提取医用过氧化氢酶的技术【1 0 1 。植物方面，主要集中在过氧化 氢酶保护植物抗氧化枧理方面的研究。徽生物过氧化氢酶是目前研究的热点。除生理机 理研究外，工业开发方面也进行了更深入的研究，国外继黑曲霉和微溶壁球菌产c a t 分别实现工业优生之孟，又开发了产酶性能更佳的嗜热子囊菌、芽孢杆菌、重组大肠杆 菌等微生物菌种。国内用微生物生产过氧化氢酶仍停留在研究开发阶段。现在市售商品 过氧化氢酶基本为牛肝过氧化氢酶和微生物产过氧化氢酶共存，微生物产过氧化氢酶基 本由诺维信、有田酵素、杰能科等大公司控制。 目前已用于生产过氧化氢酶的菌株及合成水平见表1 i ： 2 第一章绪论 t h e r m o p h i l i cs t r e p t o m y c e s a s p e r g i l l u sn i g e r 基因工程菌 m i c r o c o c c u sl y s o d e i k t i o u s p e n i e i l l i u r av a r i a b i l e a s p e r g i l l u sn i g e r s a c c h a r o m y c e se e r e v i s i a e p s e u d o m o n a d v t b r i or u m o i e n s i s t h e r m o a s c u sa u r a n t i a e u s 基因改性黑曲霉 基因改性黑曲霉 未知 嗜热子囊菌 中国科学院微生物研究所 中山大学生物工程研究室 江南大学 苏州大学生命科学学院 意大利b a s i l i c a t a 大学 波兰，m a r i ac u r i e s k l o d o w s k a 大学 印度，中央食品技术研究院 瑞典，h e i n ok u u s k 日本，早稻田大学 日本，三菱气化公司 n o v o z y m e g e n e n c o r r e y o n e t 江南大学 1 4 0 u m l 3 8 9 1 7l im o l m i n 。1 9 - l 1 8 5 u m l 2 9 2u m l 7 3 5 u m l 7 8u m l 1 0 4 u g 湿菌体 1 6 1u m l 3 2 1u m g 细胞 1 0 7 0 0u m l 5 0 0 0 0 u m l 5 0 0 0 0 u m i ， 5 0 0 0 0 i ，m i ， 3 7 0 0 i7 m i ， 摇瓶 摇瓶 发酵罐 摇瓶 发酵罐 发酵罐 发酵罐 摇瓶 摇瓶 发酵罐 商品 商品 商品 发酵罐 1 2 立题依据 1 2 1 过氧化氢酶在纺织中的应用 纺织工业是许多发展中国家的一大工业，同时也是我国的传统产业和支柱产业。纺 织业是产生污染非常严重的工业，尤其是在印染加工过程中，传统工艺耗费大量的水和 化学品，不仅耗费资源，同时还造成环境污染，破坏生态平衡。这对实施可持续发展战 略是极为不利的。因此随着世界范围内，水的消耗和废水处理变得越来越昂贵，大多数 染色和整理工厂正非常密切地注视着减少水的消耗和废水排放的节约潜力。要从根本上 改变纺织工业高消耗、高污染的传统粗放型经济增长方式，必须大力推动和发展纺织工 业清洁生产技术，实现纺织工业污染防治由“末端治理”向“源头预防”的转变。用高效生 物催化剂参与的酶处理工艺替代传统的化学处理工艺，可以显著降低水耗、能耗，废 水量显著减少并且容易处理：节省染料并获得更稳定的染色效果；织物的柔软度更 好、强度更高；操作更加安全和简便；由于用量少，在使用成本上也具有竞争力， 因而成为纺织工业清洁生产技术的未来发展方向。过氧化氢酶用于去除氧漂后残留的过 氧化氢是已建立的生物技术在棉、纺织行业应用的一个最好例子。在染整工艺中使用过 氧化氢酶替代多次清洗及化学还原剂去除漂白液中残留的h 2 0 2 ，具有很大的经济优势 和环保优势【1 1 15 l 。 1 2 2 不同来源过氧化氢酶的性质比较 由于纺织工艺的特殊性，对纺织用过氧化氢酶的最适p h 及热稳定性提出了耐强碱耐 高温的严格要求，而目前市场上商品过氧化氢酶还不能很好的满足这一要求【1 昏17 1 。 3 江南大学硕士学位论文 表1 2 目前市场上主要商品过氧化氢酶与枯草芽孢杆菌产过氧化氢酶的性质比较 t a b l e1 2c h a r a c t e r i s t i c so fm a i nc a t p r o d u c t sa tp r e s e n tm a r k e t 1 2 3 菌株的选择 不同来源的过氧化氢酶在细胞中的位置有所不同。动物红细胞、肝脏，以及细菌的 过氧化氢酶存在于细胞质中，必须将细胞破碎才能提取到过氧化氢酶，因此酶的分离、 提纯较为复杂。细菌过氧化氢酶的热、碱稳定性虽然可随来源不同而不同，但因为是胞 内酶，实现高产和提取均不方便。国内用工程菌合成的过氧化氢酶，则仅限于性质研究， 没有开展生产性的研究。酵母的c a t 主要积累于胞内，而一些丝状真菌的过氧化氢酶 则主要分泌于胞外，胞内也含有一定量的过氧化氢酶。在纺织热漂去除过氧化氢时，温 度和p h 均较高( 6 0 。c 左右，p h 约1 1 ) ，要求使用的过氧化氢酶必须有较高的耐热和耐 碱特性1 1 8 j 1 8 。 江南大学环境生物技术实验室在纺织厂的废水中筛选出一株过氧化氢酶高产菌，在 摇瓶上，发酵3 6 小时过氧化氢酶产量高达3 2 0 0u m l 。1 6 s r d n a 序列分析表明，菌株 w s h d z o1 为b a c i l l u ss u b t i l i s 。b a c i l l u ss u b t i l i sw s h d z 01 所产c a t ，在p h 5 12 范围 内，随着p h 升高，酶活基本呈线性增长，在p i l l 2 的缓冲体系中，即时酶活最高。酶 的p h 稳定性实验表明，该酶在p h 8 1 1 范围内比较稳定，放置3 0 分钟，剩余酶活仍在 原酶活水平9 8 以上。耐碱性以及过氧化氢酶产量与文献中其它微生物产c a t 相比， 具有显著的优势。 1 3 研究目的与内容 1 3 1 前期研究和存在的问题 在前期工作中，筛选出一株耐碱、耐热过氧化氢酶的高产菌株，经过菌体的形态和 生理生化特征的分析和1 6 s r d n a 序列分析，鉴定该菌为枯草芽孢杆菌；对b a c i l l u ss u b t i l i s w s h d z 0 1 产c a t 进行了应用酶学性质的考察，发现该菌株所c a t 的最适反应p h 为1 1 o ， 最适温度为5 5 c ，在p h l l 和5 0 。c 下保持1 5 分钟后的剩余酶活仍达9 8 以上；在摇瓶水 平上对b a c i l l u ss u b t i l i sw s h d z 0 1 进行了初步的发酵条件优化，结果显示其最佳碳源为 1 0g l 的葡萄糖，最佳氮源为5g l 的n a n 0 3 ，在此条件下产酶最高可达3 2 5 8u m l 。 通过前述研究发现，要实现过氧化氢酶的工业化生产，存在最主要问题是发酵过程 中菌体量较低仅1 2 5g l 。 本论文研究营养条件以及环境条件对发酵过程的影响，通过提高b a c i l l u ss u b t i l i s 4 第一章绪论 w s h d z 0 1 生物量，最终提高过氧化氢酶的产量。 1 3 2 主要研究内容 本论文针对上述问题，重点研究了以下内容： ( 1 ) 以b a c i l l u ss u b t i l i sw s h d z 0 1 为研究对象，考察营养条件对菌体生长的影响； ( 2 ) 以b a c i l l u ss u b t i l i sw s h d z 0 1 合成c a t 为研究对象，考察环境条件对其合成过 氧化氢酶的影响； ( 3 ) 以b a c i l l u ss u b t i l i sw s h d z 0 1 合成c a t 为研究对象，初步研究其放大试验。 江南大学硕士学位论文 第二章营养条件对枯草芽孢杆菌w s h d z 1 9 i 羔菌体生长的影响 2 1 引言 微生物为了生长、繁殖需要扶外界不断地吸收营养物质，加以剩用，从中获得能量 并合成新的细胞物质，同时排出废物。通过对微生物的营养特性和培养条件的研究，可 进一步控制和利用它们更好为工业生产服务【1 9 】，丽发酵培养基成分和配比是根据菌种的 生理生化特性和生物合成的要求决定的。 本课题组在前期的菌种筛选工作中，筛选到一株枯草芽孢杆菌w s h d z 0 1 所产的过 氧纯氢酶( c a t ) ，具有耐碱、发酵周期短、c a t 产量高等优点。摇瓶上初步培养实验发 现，b a c i l l u ss u b t i l l i sw s h d z 0 1 在发酵过程中生物量仅为1 2 5g l 、过氧化氢酶酶活却 高达3 2 5 8u m l ，由于藏体量较低，限制了b a c i l l u ss u b t i l l i sw s h d z 0 1 大量合成过氧纯 氢酶【2 0 】。为解决这一问题，本章在摇瓶条件下考察了氮源种类、氮源浓度以及不同氮源 复合添加的方式对w s h d z 0 1 生长以及生产过氧化氢酶的影响，旨在通过提高b a c i l l u s s u b t i l l i sw s h d z 0 1 的生物量从而提高过氧化氢酶的产量。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌种： 芽孢杆菌b a c i l l u ss u b t i l l i sw s h d z 01 ，由武汉中国典型培养物保藏中心保藏，保藏 编号为c c t c cn o ：m 2 0 6 0 6 2 。 2 2 2 仪器 台式高速离心枧美国礼来亚溯公司 电热恒温水浴锅江苏省医疗器械厂 回转式恒温调速摇瓶框上海医疗工业研究所 立式匮形压力蒸气灭菌锅上海医用核子仪器厂 紫外分光光度计u v 2 4 5 0日本岛津公司 2 2 。3 培养基 2 2 3 1 斜面培养基：糖度为6 。的天然麦芽汁，p h7 5 。 2 2 3 2 种子培养基：糖度为6 。的天然麦芽汁，p h 7 5 。 2 2 3 3 基本发酵培养基：葡萄糖l og ，n a n 0 35g ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5g ，n a 2 h p 0 4 9 5 2g ， k h 2 p 0 40 6g ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 2 5g ，定容至1l ，p h 7 5 。 2 2 。3 4 麦芽汁的制备：大麦麦芽经研磨，加入4 倍于麦芽重量的水，在6 0 度下保温糖 化，间歇不断搅拌，经过4 个小时后，糖化结束。纱布过滤残渣，煮沸1 5 分钟，经过 滤布过滤，得到清澈透骥的麦芽汁。大约每1 0 0 0g 麦芽粉麓得至l3l 左右的麦芽汁( 一 般为1 6 1 8 度) 。 2 。2 4 培养方法 2 2 4 1 斜面培养：3 7 培养3 0 小时。 2 2 4 2 发酵条件：基本发酵培养基5 0m l 盛于2 5 0m l 三角瓶中，按6 的接种量接种 幸本章部分内容已被应用与环境生物学报录用。 6 第二章营养条件对枯草芽孢杆菌w s h d z 。0 1 发酵生物量的影响 子培养基后在旋转式摇床上3 7 ，2 0 0r l m i n 培养4 8 小时。 2 2 5 分析方法 2 。2 。5 1 生物量的测定 取2 0m l 发酵液于1 0 0 0 0r m i n 、4 下离心l o 分钟，收集湿菌体，用蒸馏水洗涤 1 次后，置1 0 5 下恒温干燥至恒重，用称重法测定生物量【2 l 】。 2 。2 。5 2 酶液样品的削备 取一定量发酵液1 0 0 0 0r r a i n 离心1 0 分钟，上清液作为胞外过氧化氢酶测定的样品； 菌泥以5 0m mk 2 h p 0 4 k h 2p 0 4 缓冲液( p h7 0 ) f 2 1 】洗涤1 次，以适量耀同的缓冲液重悬 后置冰浴预冷；超声波破碎1 0 分钟，镜检破碎的效果，1 0 0 0 0r m i n 离心1 5 分钟，上 清液即为胞内过氧化氢酶测定样品。 2 。2 5 3 过氧化氢酶活性测定 采用分光光度法在3 7 下测定。反应总体积为3m l ，含o 1m l 酶液样品和2 9m l 含1 0m m o l l 的5 0m m o l lm p 。4 n 鑫2 舯虢缓冲液 生物量变诧鼗线 f i g2 3 ( b ) t i m ec o u r s eo f b i o m a s sw i t hn a n 0 3a s n i t r o g e ns o u r c e ol o加3 04 0 7 0 t a m 国 图2 3 ( c ) 过氯化氢酶产攫变化曲线 f i g2 3 e ) t h et i m ec o u 3 s eo f c a t a l a s ep r o d u c t i o nw i t hn a n 0 3 a sn i t r o g e n s o u r c e 2 。3 。1 。毒有机氮漂种类毒浓度酵确定 在添加5g l n a n 0 3 的基础上，考察三种不同有机氮源( 麦芽汁、酵母膏、邋米浆) 及其浓度对菌体生长和产酶的影响。其中酵母膏添加量为l 、3 、5g 几，玉米浆添加量 为3 、7 、1 1g l ，麦芽汁添加量为1 0 、3 0 、5 0m l l 浓度药1 5 。的麦芽汁。结采如圈 2 4 所示，可以看出麦芽汁的适量添加对w s h d z - 0 1 生长和产酶的促进作用较为显著。 9 _ n 4 3 2 l e ，鼍一旨ulo基 江南大学硕士学位论文 4 4 0 0 4 0 0 0 3 6 0 0 茸3 2 0 0 譬2 8 0 0 吝2 4 0 0 2 0 0 0 1 6 0 0 l o2 03 04 05 0 m a l te x t r a c t ( 1 删 0 0 1 6 0 0 图2 4 ( a ) 不同麦芽汁添加量对菌体生长 和产酶的影响 f i g2 4 ( a ) t h ee f f e c to fd i f f e r e n ti n i t i a lm a l t e x t r a c tc o n c e n 打m i o no nt h ec a t a l a s ea c t i v i t y 一一过氧化氢酶酶活c a ta c t i v i t y 一一生物量b i o m a s s 4 4 0 0 4 0 0 0 点3 6 0 0 茸3 2 0 0 ， 譬2 8 0 0 卜。 吝2 4 0 0 2 0 0 0 1 6 0 0 l2 345 y e a s te x t r a c t ( g l ) 图2 4 ( b ) 不同酵母膏添加量对菌体生长 和产酶的影响 f i g2 4 ( b ) t h ee f f e c to fd i f f e r e n ti n i t i a ly e a s t e x t r a c to nt h ec a t a l a s ea c t i v i t y 一一过氧化氢酶酶活c a ta c t i v i t y 一一生物量b i o m a s s 24681 01 2 c o r ns t e e pu q u o r ( g l ) 图2 4 ( c ) 不同玉米浆添加量对菌体生长和产酶的影响 f i g2 4 ( c ) t h ee f f e c to fd i f f e r e n ti n i t i a lt o ms t e e pl i q u o ro nt h ec a t a l a s ea c t i v i t y 一一一过氧化氢酶酶活c a ta c t i v i t y一一生物量b i o m a s s 由图2 4 ( a ) 可知，过氧化氢酶产量和w s h d z 0 1 生物量随着麦芽汁添加量的增加 而提高。为此，可考虑在发酵过程中提高麦芽汁的添加量，在提高w s h d z 0 1 生物量 的基础上，提高过氧化氢酶产量。 实验室中常用的氮源有碳酸铵、硫酸铵、硝酸盐、尿素及牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、 多肽、氨基酸等。工业发酵中常用鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉等作氮源。 铵盐、硝酸盐、尿素等氮化物中的氮是水溶性的，玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、醇母膏等 1 0 1孑)鼍暑01日 o 2 4 6 8 o 4 3 2 i o o 呦 黼 鲫 抛 蜘 枷 咖 姗 砌 姗 珈 撇 姗 姗 (1葺，nv鲁i_譬暑u (1黧吕。一 d 2 4 6 8 4 3 2 l q 一、葛一警巨oih d 2 4 6 8 0 4 3 2 l q n 第二章营养条件对桔荜芽孢杆菌w s h d z 0 1 发酵生物量的影响 有枕氮化物中的氮主要是蛋皇质的降解产物，都可以被菌体蛊接吸收利用，称为速效性 氮源。速效氮源通常有利于菌体生长。 2 3 1 5 发酵培养基中麦芽制汁浓度的确定 在摇瓶水平上，进一步考察不同麦芽汁浓度对菌体生长与产酶的影响。分别配制麦 芽汁浓度为o 。5 。，l 。，董5 6 ，2 。，2 5 4 ，3 。的发酵培养基，其他营养条件不变， 结果如表2 】所示。 由表2 。l 可知，添加麦芽汁后菌体生长良好，过氧化氢酶的产量随着麦芽汁添加浓 度的变化而变化。当发酵培养基中含2 。麦芽汁时，w s h d z - 0 1 酶活最高( 9 5 4 5u m l ) 。 综合考虑w s h d z 0 1 生长与产酶情况，确定初始发酵培养基中麦芽汁含量为2 。 表2 1 不同浓度麦芽汁的添加对发酵过程的影响 t a b l e2 1e f f e c to f d i f f e r e n ti n i t i a lm a l te x t r a c tc o n c e n t r a t i o no i lc a ta c t i v i t ya n dc e l lg r o w t h 2 3 。2 提高初始葡萄糖浓度对产过氧化氢酶的影响 在分批发酵过程中，碳源浓度决定着培养基的碳氮比，壹接影响到细胞的增殖和产 物的形成，但同时也要考虑到高浓度初糖产生的抑制效应【2 。摇瓶研究发现，葡萄糖是 b a c i l l u ss u b t i l l i sw s h d z 0 1 发酵的最适碳源，初糖浓度1 0g l 最有利于摇瓶发酵，前翅 菌体浓度偏低，可能是菌体缓慢利用葡萄糖合成过氧化氢酶的原因。本小节在添加一定 量的麦芽汁的基础上，进步在摇瓶上考察了不同初始葡萄糖浓度下w s h d z 0 1 菌株 的发酵过程。图2 5 ( a ) 为不同初始葡萄糖浓度下菌体生长过程曲线，从图中可以看出， 菌体可以在较大的葡萄糖糖浓范围内生长，初始葡萄糖浓度为1 0 4 0g l 时，菌体均能 较好地生长，最终菌体浓度可达6 朗- 7 8g l 。僵较低的初糖浓度下，菌体的生长延迟 期较短，可以更高的速度生长，而初糖浓度为4 0 虮时则有明显的生长延迟现象。图 2 。5 ( b ) 为不同初始葡萄糖浓度下，过氧化氢酶合成曲线，从图中可以看出虽然初始葡 萄糖的浓度有所不同，但是过氧化氢酶的产量差别不大，初始葡萄糖浓度为2 0 舡时过 氧化氢酶产量最蕙( 9 9 9 1u r m l ) 。 江南大学硕士学位论文 9 6 葛 g o 3 o o1 02 03 0 4 0 5 0 t i m e ( h ) 图2 5 ( a ) 不同初始葡萄糖浓度对 菌体生长的影响 f i g2 5 ( a )e f f e c to fi n i t i a lg l u c