（光学工程专业论文）光学显微层析实验系统设计与研制.pdf

硕十论文 光学显微层析实验系统设计与研制 摘要 光学显微层析技术是计算机层析技术和显微干涉技术的一种有机结合，它能够实现 细胞尺度生物样品折射率空间分布的层析测量，在生物学和医学领域有着重要的应用价 值。为此，论文在理论上讨论了光学显微层析的基本原理和实现方法；在实验上建立了 光学显微层析的实验装置，并进行了初步的实验，取得的主要研究结果如下： 论文在概述了国内外有关光学显微层析技术研究现状的基础上，建立了以锥形光束 投影结合水平扫描代替平行光束投影结合角度扫描获取多方向投影数据，并以此为基础 进行细胞尺度生物样品折射率三维重建的物理模型和基本的重建方法。 根据上述光学显微层析的物理模型，进行了光学显微层析装置的方案设计、器件选 型与装置调试工作，给出了光学显微层析实验装置完整的调试过程。该装置可在4 、 l o x 、1 6 x 、2 5 x 、4 0 和6 0 x 的显微物镜下工作，且水平扫描的精度可高达到o 0 8 1 u n ，可 实时采集细胞尺度生物样品的显微干涉图像，并进行干涉图像的处理和分析。 选择洋葱细胞作为实验对象，进行了光学显微层析的初步实验，给出了洋葱细胞的 典型显微图像和显微干涉图像。在此基础上，引入傅立叶分析，结合相位解包算法，提 取出洋葱细胞显微干涉图像的相位信息，得到了洋葱细胞在锥形光束投影下的相位投影 数据，为后续三维重建奠定了基础。 此外，论文还对氦氖激光器跳模、显微物镜离焦和器件自身误差等对光学显微干涉 过程的影响进行了分析和讨论。 关键词：计算机层析，干涉仪，共焦，折射率，移相，相位物体，相位解包 a b s t r a c t 硕士论文 a b s t r a c t o p t i c a lm i c r o t o m o g r a p h yi st h ec o m b i n a t i o no fc o m p u t e dt o m o g r a p h ya n dc o h e r e n c e t o m o g r a p h y i tc a na c q u i r et h e3 dr e f r a c t i v ei n d e xs p a t i a ld i s t r i b u t i o no ft h es p e c i m e nl i k e c e l l s ，s oi t sw i d e l yu s e di nt h ef i e l do fb i o l o g ya n dm e d i c i n e i nm yt h e s i s ，w ed i s c u s s e di f s b a s i cp r i n c i p l ea n dm e t h o d si nt h e o r ya n de s t a b l i s h e da n o p t i c a lm i c r o t o m o g r a p h y a p p a r a t u s w ea c q u i r e ds o m em a i nr e s u l t sa sf o l l o w s w es u m m a r i z e dt h ea c t u a l i t ya b o u to p t i c a lm i c r o t o m o g r a p h yi n t e r n a la n de x t e r n a la t f i r s t t h e nw ep r e s e n t e dae x p e r i m e n ts y s t e mt h a tc o m b i n e dc o n i c a ls c a n n i n gb e a m sa n d h o r i z o n t a ls c a n n i n gm e t h o di n s t e a do fu s i n gp a r a l l e lb e a m si nc o n j u n c t i o n 、i t hv a r i a b l e i l l u m i n a t i o na n g l et oa c q u i r et h ep r o j e c t i o n si nm u l t i p l ed i r e c t i o n s t h e nw ed i ds o m er e s e a r c h o nt h ep h y s i c a lm e t h o da n dr e c o n s t r u c t i o no ft h r e e d i m e n s i o n a lp h a s eo b j e c t s a c c o r d i n gt o t h et h e o r ya b o v e ，w ep u tf o r w a r dap r o j e c ta n df a b r i c a t e dao p t i c a l m i c r o t o m o g r a p h ys y s t e m i tc a nc a p t u r ep r o j e c t i o n so fc e l l sw i mo b j e c tl e n so fd i f f e r e n tk i n d s o fm a g n i f i c a t i o n ss u c ha s4 x ，l o x ，1 6 x ，2 5 x ，4 0 xa n d6 0 x i t sr e s o l u t i o nc a na c h i e v e 0 0 8 - t m w e h a v e d o n es o m ec a l c u l a t i o na b o u tt h ep r o j e c t i o n sw h i c h c a p t u r e db y u s w ed i ds o m ee x p e r i m e n to no n i o nc e l l b yo u rs y s t e m ，a n da c q u i r e di t sm i c r o s c o p y i m a g e sa n dm i c r oc o h e r e n c ei m a g e s b ym a k i n gu s eo ff o u r i e rt r a n s f o r ma n dp h a s e u n w r a p p i n gm e t h o d ，w er e t r i e y e da b s o l u t ep h a s eo fo n i o n t h e s ep r o v i d eaf o u n d a t i o nf o rt h e f o l l o w i n gr e c o n s t r u c t i o no fs p e c i m e n i na d d i t i o n ，w ed i s c u s s e ds o m eo t h e rf a c t o r sw h i c hc a l la f f e c to u re x p e r i m e n tr e s u l ts u c h a sm o d ej u m p i n g ，d e f o c u so fm i c r oo b j e c tl e n sa n de r r o ro ft h eo p t i c a le l e m e n t k e yw o r d s ：c o m p u t e dt o m o g r a p h y , i n t e r f e r o m e t r y , c o n f o c a l ，r e f r a c t i v ei n d e x ， p h a s e s h i f t i n gm e t h o d ，p h a s eo b j e c t ，p h a s eu n w r a p p i n g i l 声明尸i 刃 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本 学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或 公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使 用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均己在论文 中作了明确的说明。 研究生签名：加罗年f 月2 问 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或 上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并 授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密 论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： 互兰 加厂年月2 珀 硕上论文 光学显微层析实验系统设计与研制 1 绪论 1 1 课题研究背景 为了解决医学光子学发展中出现的多种复杂问题，最直接的办法就是彻底了解生物 组织的折射率分布情况。为此医学光子学的发展也向组织光学提出了新的要求，即建立 更准确的生物组织光传输模型，这些研究必然要以建立更加贴切的组织光学模型为前 提，保证能反映生物组织空间结构及其尺寸分布情况。要想建立关于生物组织中每个部 分的散射与吸收特性的组织光学模型的一种最理想，最贴切的途径，就是确切的了解生 物组织内部折射率的空间分布。国家自然科学基金委信息科学部组织专家在2 0 0 3 年编 写的“光子学的重要学科及发展一文中，将生物组织折射率测量问题列为医学光子学 基础的一个研究重点，本文的目标也正式设计出合理的光学系统，以能够满足对生物组 织折射率空间分布测量的需要。 生物组织空间折射率分布的另一个直接的应用背景是解决生物组织共焦扫描技术 中，由生物样品引起的相差问题。以t w i l s o n 为首的牛津大学的扫描光学显微成像工 作小组在进行共焦扫描成像研究时，发现组织样品将引起测试系统较大的像差，而共焦 扫描成像技术对像差十分敏感，像差的存在直接影响共焦成像信号的强度和测试系统的 分辨率。生物组织引起像差源自于生物样品自身的折射率结构，因此透彻了解生物样 品自身的折射率分布是解决问题的根本途径。由此可见，生物组织空间分布问题的解决 将为生物组织共焦扫描成像装置的优化设计提供直接的理论指导。 综上所述，生物组织折射率在组织光学的研究中有着不可忽视的价值，但是由于生 物组织的三维折射率分布测量在实际中存在比较多的困难，关于这个方面的研究国内外 有不少，但是成果非常少，因此关于生物组织折射率空间分布测量的问题在很长时间内 不能得到大的突破。这些问题主要包括光学显微层析实验系统的设计和研制，非完全数 据的三维重建等。本文的目标正是设计出合理并有实际应用价值的实验系统，研制出国 内属于自己的光学显微层析实验装置，为后期的三维折射率空间分布的非完全数据三维 重建提供实验平台和部分数据信息。 1 2 国内外研究现状 作为目前发展最快的生物医学光学成像技术，光学层析技术常采用近红外激光器作 为实验室光源，对于较薄的透明细胞穿透能力强，能非侵入的观察样品内部结构。因为 其投影图像包含了光路在样品中路径长度和折射率分布乘积的信息，所以只要建立合理 l 绪论硕_ 上论文 的折射率分布反演模型就可以提取出关于样品的折射率分布信息，进而对样品进行折射 率分布的三维重建，也就得出了整个样品的折射率分布信息。但利用o c t 方法测量生 物组织折射率空间分布时也存在很多不足，最常见的是获取的投影数据信噪比过低和数 据量很不充分，以致难于提取足够多的有用信息。 目前关于生物组织折射率问题的研究大部分集中于平均折射率的实验研究，国外主 要有俄罗斯的光物理测量研究学院 2 ，美国的麻省理工大学电子工程与计算机科学实验 室 3 3 和底特律h e n r yf o r d 医院肿瘤放射科 4 3 以及澳大利亚的西澳大利亚大学光学与生 物医学工程实验室 5 1 等机构；国内主要有香港科技大学电子工程系m 】，福建师范大学激 光研究所 7 ，西安交通大学生命与科学技术研究所陋 ，南开大学光子学中心( 9 ，中科院 福建物构所 1 0 ，南京理工大学信息物理与工程系1 等为数不多的几家研究机构曾经开 展过或正在开展与生物组织折射率问题相关的研究。在这些研究中，涉及到生物组织折 射率空间分布问题的研究为数不多。 浙江大学从事过“基于o c t 的投影折射率成像( p i c t ) 方法研究”，这是一种高分 辨，非侵入性折射率分布层析成像技术。而他们所提出的p i c t 概念是由美国伊利诺斯 大学的z y s k 和b o p p a r t 等人在2 0 0 3 年提出的 1 到，这是一种基于计算机层析技术的一种 投影图像重建理论，利用多个角度下的光学干涉层析成像数据快速的重建出样品的断层 折射率分布情况。由于其采用o c t 技术采集样品的折射率投影信息，所以空间分辨率 高，对生物样品穿透性强，图像对比度高并能在不干扰样品状态的情况下对生物组织进 行无损检测。 香港科技大学电子工程系的j m s c h m i t t 等利用“相衬显微镜”观测了哺乳动物组 织内折射率的起伏，他们发现组织折射率结构服从大气湍流的经典k o m o g o r o v 模型。 但相衬显微镜只能用于组织折射率结构的定性观测，难以对生物组织折射率三维空间分 布进行定量测量，因此应用价值大大降低。 在1 9 9 5 年t e a r n e y 等人提出了应用o c t 技术来测量生物组织空间折射率分布的方法 n 驯，随后麻省理工大学电子工程与计算机科学实验室gj t e a r n e y 等提出的“基于弱相 干光学层析技术( o c t ) 的组织折射率测试技术”，可用于组织折射率三维分布的测量， 但是这种方法在在原理上是有缺陷的，它没有考虑光线的实际路径，而实际的生物组织 折射率分布不是很不均匀，光路在生物组织内的传输情况非常复杂，各种散射的存在对 获得真实清晰的投影图像造成了比较大的麻烦，而实际也证明用这种方法测得的组织折 射率值与真实值相比偏差较大。 在所有的实验装置中，比较典型的是俄罗斯光物理测量研究院采用计算机层析显微 镜系统( c t - m i c r o s c o p e ) ，其样品保持静止，通过移动扫描镜来获得多方向平行投影数 据，以及牛津大学研制的主要用于测量相差的相位步进干涉仪。 美国麻省理工大学电子工程与计算机科学实验室的w o n s h i kc h o i 和c h r i s t o p h e r l 论女光学镀微层析实验系统* 与研制 f a n g y e n 等在2 0 0 7 年报道了其利用移相激光干涉仪测量通过旋转照明光线角度来对测 量活细胞生物组织三维折射率空间分布的技术“。他们指出测量三维折射率分布的基 本要求就是获取样品的多方向平行投影数据信息。为了迂明其实验装置的合理性，他们 首先对浸入油中的l o i a n 的聚苯乙烯水珠进行了三维折射率分布测量实验，测试结果显 示聚苯乙烯水珠和其外围物质的折射率差为血= 00 2 8 5 o0 0 0 5 ，这个数值与实际数值 00 2 9 在一定程度上非常符台，这也证明了其实验装置的合理有效性”“。他们还通过大 量的实验数据得出了和常识相反的信息：并不是每个细胞的折射率分布都是中心比四周 高。在他们的实验中得出了某种样品细胞的中心细胞核部分的折射率为n = l3 3 5 13 6 5 ， 而其周边区域的折射率n = 1 3 6 - 13 9 。他们后期还通过实验研究了活细胞内部的生理变 化，实验中获得一幅层析图像的时问不到1 0 s ，所以近乎做到了对生物样品的实时观测。 其实验装置光路图如图12 1 所示： 缬 目i2 i 层析相位显微镜光路矧 俄罗斯光物理测量研究学院的g e n n a d y nv i s h n y a k o v 和g e n n a d y gl e v i n 等在其发 表的文章“三维相位物体的计算机微断层干涉测量”中提出了将讨算机层析方法 ( c o m p m c d l o m o g r a p h y ) 引入细胞等透明生物样品折射率的三维分布测量，建立了干涉 显微镜与计算机层析技术 日结合的实验测量装置，如图12 2 所示。 l 绪论硕上论文 反凸显微样显微物滤 射 透 物镜品物镜镜光 镜镜12片 物偏 c 镜正 c 片d 图1 2 2 计算机层析显微镜系统示意图 该系统采用马赫曾德干涉仪基本结构，结合计算机层析技术和移相干涉测量技术， 在小范围内测量生物组织多方向平行投影干涉图。他们用这个实验装置主要是测量光学 透明相位三维样品的空间折射率分布，将自动干涉计算机层析显微镜装置，c c d 探测 装置，自动干涉图处理软件和p z t 计算机控制相位步进干涉装置完美结合，对人类单红 细胞进行层析测量研究。 观察图1 2 2 所示光学原理图，采用波长6 2 3 8 n m 的h e - n e 激光器作光源，分束镜 将光源分成两束，一束作为参考光，一束作为物光。光路中凸透镜和显微物镜1 ，显微 物镜2 和物镜保持共轭关系，所以照明样品的是平面波，从物镜出射进入滤光片的也相 应变成平面波，通过旋转滤光片可以改变物光相对光强，最终的干涉图经过偏振片成像 在c c d 上，其强度大小可以通过旋转偏正片做一定范围内的调整。最大的不足是没有 对应于图1 2 2 所示实验装置的计算机自动相位解包的技术，而且针对这种实验装置的 后期的三维数据重建速算法目前仍不是很成熟。 在他们对红细胞进行测量时，发现透射过细胞的折射光非常强，而且样品在测量是 时在不断移动的，为了解决这些问题，他们将红细胞浸入一定的液体中，在将这些液体 夹持在厚度为0 2 m m 的两片载玻片之间，常用的液体为甘油，琼脂糖或者一些混合物， 物体的折射率和所用的浸液液体的折射率大致相同。 他们指出，绝大部分的生物样品是光学透明的，不会对透射光的传输路径产生大的 影响，所以投影图像数据中更多包含的是细胞折射率和样品厚度的信息 1 0 - e o 。他们工作 初期采用光学显微镜作为实验仪器，利用自动相位解包程序对微小生物细胞进行测试， 经过大量的数据实验后建立了比较完善的实验装置，利用数值孔径为o 6 5 ，放大倍数为 4 0 x 的一对显微物镜在3 6 0 范围内，每次采样间隔为2 0 ，一共对样品进行了1 8 次成像数 据采集，利用计算机层析技术对样品进行三维重建，并且获得了人类单红细胞的三维折 4 碗+ 论立 光学微目析实验系统设计与研制 射率分布图。图1 23 中a ，b ，c 三幅图为投影角度分别取一1 4 。，0 0 ，1 6 。时的投影图，d 足人类单红细胞断层图。 霆冒嘲 赠雷_ 圈12 3 ( a ) l 细胞一1 4 0 时的投影例：( b ) 红细胞0 。时的投影凹i ( c ) 红细胞1 6 。时的投影图：( d ) 红细胞断层幽 在他们的实验中，利用拍摄获得的多幅投影图，经过程序计算获得的人类单红细胞 相位图和三维重建图如图12 4 所示，其中a 是重建后的相位灰度图，b 是三维图。图像 代表的样品中区域的太小为1 0 岬1 l o b m ，图像包含了2 5 6 x 2 5 6 个像素点和6 4 级灰度值。 为降低噪声对干涉图的影响，所有图像部先经过程序进行了前期处理，利用个大小为 2 0 个像素的平均滤波器对图像进行了滤波去噪，这在我们后期的投影图处理中也是必须 的 |荤： 鏊 番霉每蕊慧7 ：，。三：萼蛩i 妻 a b 囤12 4 ( a ) 红细胞重建相位灰度图( b ) 红细胞二维重建图 日自d 绝大多数利用光学显微层析法对细胞进行三维折射率分布测量的研究机构，其 实验装置的工作原理是通过获得小于1 8 0 。范围内关于样品尽可能多的投影数据，探测角 度的大小由于显微物镜数值孔径的限制，不可能达到1 8 0 。，一般在5 0 。左右，所以= 三维 l 绪论硕上论文 重建结果的可靠真实性在很大程度上依赖于后期的相位解包和非完全数据的三维重建 精度，所以越来越多的用于自动相位解包和折射率三维分布反演的算法程序应运而生， 但没有一个机构能做到对样品的全方位投影。 l 图1 2 53 6 0 0 范围光学c t 光路图 在2 0 0 7 年，日本k a g a w a 大学的t o s h i k iy a s o k a w a 和i c h i r o ui s h i m a r u 等提出 了一种创新的方法，将光学镊子( o p t i c a lt w e e z e r s ) 技术和具有移相功能的马赫曾德干 涉仪相结合搭建实验装置 1 7 1 ，从实验上获得了单细胞的三维折射率分布图。其实验系 统的主要创新点就是突破了一般o c t 系统观测角度受显微物镜数值孔径限制的局限， 可以对细胞进行3 6 0 。范围内的测量，从而避免了因数据不足而在三维重建中可能带来的 误差。其实验装置光路图如图1 2 5 所示，其中激光器1 是波长为6 3 3 n m 的h e - n e 激 光器，激光器2 为绿光激光器。 如前所述，图1 2 5 所示的实验系统原理图中我们发现有两个激光器，并且波长不 一样。激光器1 是用来作为干涉光路光源使用的，激光器2 的使用则是其与至今为止与 其他实验装置不同的地方，是很大的创新。利用绿光激光器发射光波产生的光压对待测 的单细胞进行一定角度一定时间内的旋转，在样品单细胞被旋转一定角度的几秒时间 内，再次利用移相干涉层析实验装置对样品成像。实验中通过控制激光器，对样品细胞 每间隔l o 。利用光压旋转一次，一共进行3 6 步操作即可完成对样品单细胞3 6 0 0 范围内 6 顷论文光学e 微层析实验东统设h 研制 的测量利用已经很成熟的c t 技术进行三维重建，获得细胞三维折射率分布图。 对于活细胞的钡4 量，他们认为激光器发出的不足1 0 m w 的光波在对其产生旋转效应的几 秒内不会对活细胞造成损害。图1 26 是其工作小组对乳癌单细胞的测量结果，非本文 实验所得。其中a ，b ，c 分别对应的是距离细胞外围表面l l t m ，3 m ，5 岬处的图像； 图像右边图表分别对应各自左边图像中虚线所在位置上细胞的折射率值，箭头表示折射 率峰值所在位置。 图l2 , 6 ( a ) 乳癌细胞蚯表面lum 深处折射率分布圈 ( b ) 乳癌细胞距表面3um 深处折射率分布图( c ) 乳癌细胞距表面5hm 深处折射率分布国 如前所述，牛津大学设计的相位步进干涉仪也是基于马赫曾德干涉仪而搭建，主要 用于测量波前相差，这种显微层析实验系统在对折射率变化较小且较透明细胞进行测量 时，图像数据的相差较小，经过计算获得的波前图像也比较清晰，但无论细胞的折射率 分布变化是多么微小，其自身引入的相差会在定程度上降低投影干涉的信号量，日会 随显微物镜数值孔径的增人m 相差变大十涉图变得越来越小清晰，这个实验装置的初 期设汁目标是为了测量由于生物样品折射率分布比较复杂而引起的复杂光波波前信号 18 2 2 l 。 他们通过实验发现，无论采用球差被修正得多好的显微物镜，由于细胞样品折射率 影响的投影t 涉图信号较弱，分辨率较低图像失真都很不可避免。图l27 是他们获 得的部分典，诬样品波前分布图。 蕊一酗一蕊勰一函一斛 顾l 论文 图127 部分样l 昂波前柑位分布图 罔像的扭曲都是由于光波聚焦探测部位的折射牢变化引起的波1 i 扭曲造成的，而探 测部位折射率的变化包括载玻片和浸液之削的折射率变化，或者当光线传播至被探测区 域时，由于样品自身折射率变化比较大引起的，然而这些失真可以通过自适应光学方法 对其进行补偿，但是对自适应光学系统的设计需要拥有对典型细胞相差特性的先验知 识。为此他们设训了如图128 所示的光学实验装置。 兜 器 幽12 8 相位步进干涉仪 这个实验装置的另一个用处就是在对其做部分改变后，能当作激光共焦扫描显微镜 使用，如图l2 9 所示： 分析可得，当聚焦探测点位于样品的底部时，a 和b 两种探测方式由于样品的影响 而产牛的相差是相等的。为了获得样品引起的相差，就需要将不同部分的引起的相差分 别测出来，所以通过两部完成：首先对没有加任何样品的只有盖玻 和载玻片的测试物 放置在测试光路中，得到其波前并i 已为b l 。此时是将物镜的聚焦点直接聚焦在盖玻片 下表面处，并且调节集光镜的位置，使得到最小的相差图像；其次就是在不做其他改变 的情况下，将浸液在水中的样品放置到盖玻片和集光镜之削进行测量，得到波前记为 b 2 。最后就是对样品进行xy 方向的扫描并记录其波前数据b 3 。b l 和b 2 的筹就是静 态时样品引起的相差，b 3 和b 2 的若是探坝4 样品不同探测区域时造成的相差。 硕士论文光学显微层析实验系统设计与研制 图1 2 9 明场照明法观测样品显微结构光路图 除了以上几个研究机构做过关于生物组织折射率空间分布测量的相关研究工作外， 其它未见有关于测量生物组织折射率空间分布研究的报道，所以本文的实验装置的完成 对国内外利用光学显微层析技术测量生物组织折射率空间分布具有重要的意义。 1 3 本文主要研究工作 本论文以国家自然科学基金项目“光学显微层析在生物组织折射率空间分布测量中 的应用”为依托，在理论上讨论了光学显微层析的基本原理和实现方法；在实验上建立 了光学显微层析的实验装置，并进行了初步的实验。具体工作可归纳如下： 1 ) 在理论上讨论分析光学显微层析的基本原理和实现方法，给出光学显微层析装 置的方案设计；在实验上通过器件选型与装置调试，建立以锥形光束投影结合水平扫描 以获取多方向投影数据的光学显微层析实验装置，并以此为基础研究细胞尺度生物样品 折射率三维重建的物理模型和基本的重建方法。 2 ) 选择典型样品( 本文采用洋葱细胞) 作为实验对象，进行光学显微层析的初步 实验，给出样品组织的典型显微图像和显微干涉图像。并以此以依托，引入傅立叶变换 技术，结合相位解包算法，解算得到样品细胞显微干涉图像的相位信息，为后续三维重 建奠定基础。 3 ) 通过多次实验调试，摸索总结出光学显微层析实验装置调试的经验，从理论上 分析现有装置的不足，并从实验上对初步搭建的实验装置进行优化改进，为后续实验提 供更合理的实验装置。 9 2 光学娃微层析的理论模型与方法 硕十论文 2 光学显微层析的理论模型与方法 2 1 光学显微层析的物理模型 光学层析技术技术是计算机层析技术在发展过程中的一个分支，计算机层析技术的 发展主要是在生物学c t 中得到应用1 2 3 - 2 6 。层析技术实质上就是通过一定的测量手段， 将对一个复杂的三维物体的测量转化为对一系列断层面的二维测量，进一步再将复杂的 二维断层问题简化为对平面上多方向一维投影数据的测量。每个投影数据可以看作是光 线传播方向包含样品折射率和空问尺寸的积分。计算机层析从数学的角度上看是一个反 演层面原场的问题，而这个问题的解决就需要解出一系列多方向积分方程，如我们分析 的，由于光学计算机层析技术的测量不可能向医学计算机层析技术那样对样品进行全方 位的立体式测量，所以除了求解通过轴对称物体时的多方向积分方程这种类似的特殊情 况外，计算机层析问题中的多方向投影方程组一般得不到确切解。以最常见的对复杂瞬 态流场的测量为例，它和具有非常丰富的先验知识的静态医学计算机层析技术不一样， 存在多方向投影图的同时获取，复杂干涉图的数据提取，非完全数据下的三维重建等三 大难题。根据几何光学知识，根据图2 1 1 所示的共焦扫描成像光路，引入光学计算机 层析技术( o c t ) 中多方向投影的概念，可知扫描过程中的每一次共焦测量，可获得经 过组织内共焦探测点的多方向光线的投影数据，因为多方向光束覆盖角度依赖于透镜的 数值孔径角，小于1 8 0 度，因此投影数据是不全的，基于这种模型的重建问题是一个非 完全数据重建问题，通过对待测生物样品进行三维空间扫描，可获得组织样品的多方向 投影数据1 2 7 - 3 1 。我们认为组织样品多方向投影数据反映出的光学量或物理量是由于组织 的存在，使得光线在穿越组织过程中所受的相位延迟或者光程差，它携带了生物组织折 射率空问分布信息。如果忽略光线的弯曲，仅考虑光线相位的变化，则对于共焦测量过 程中的每条投影光线均存在式2 1 1 表示的关系： 矽= r ( 刀( ，) 一矽 ( 2 1 1 ) 式2 1 1 中矽为光线穿越待样品时引入的光程差或位相差，n q ) 为光线路径上的折 射率分布，为周边介质的折射率。公式2 1 1 描述了由于组织的存在，光线穿越待测 空间时所受的附加相位延迟，这个相位延迟值，可通过对实验中获得的干涉图进行处理 而间接获得，如图2 1 1 所示。 1 0 硕士论文光学显微层析实验系统设计与研制 平面波 尸严oo l 土 17 茏澎曩叮絮妻 既女磁2 缮绷纭挚学。 l 、 ， ， ， ， 、 萨 口 阴 醯缆貉戮绺辫 上， i ： k多七1r ， 调制后的波面 图2 1 1 共焦扫描成像光路原理图 从激光器发出后经扩束准直等处理后的平面波入射到聚光镜上，当光束经过薄透明 样品后，由于通过对生物组织自身折射率的变化，出射光将不再是平面波，而是包含了 样品空间折射率分布的曲面波，通过移动样品或者移动入射光位置，使得其产生相对位 移后，便测量可测量获得物镜数值孔径角范围内多方向的平行投影数据。因此我们也将 得到一系列描述生物组织折射率空间分布与多方向平行投影相位数据之间关系的积分 方程，方程组中的每个方程都具有公式2 1 1 的形式，它代表了沿光线方向的投影数据。 这就是我们进行生物组织折射率三维测量与重建的出发点，即物理模型。通过对出射光 波面的分析处理，便可间接计算得样品的空间相位分布信息，再通过非完全数据三维重 建算法，模拟反演出样品的三维折射率空间分布。 2 2 多方向投影数据的提取 2 2 1 多方向投影数据的提取现状 对于多方向投影图的获取，光学层析技术和医学中的计算机层析技术有所差别，医 学计算机层析的测量是静态的，而且对象是有充分解剖学先验知识的人体，可获得1 8 0 0 范围内充分多方向上的物体投影图，因此在求解一系列积分方程组时，可以得到一个较 满意的方程的解，而对瞬态流场的测量就很难，不可能同时得到全方位内多方向投影数 据，所以方程组的解很复杂，需要经过大量的假设和理论建模才能得出近似解，而理论 模型的建立是比较困难的 3 2 - 3 5 。其次就是投影数据的提取方面，在医学计算机层析中测 得的是直接量，可以直接反映出被测物体的平面断层图，而光学层析中测得的是干涉图 2 光学移微层析的理论模型jj 方法硕上论文 之类有关被测物理信息的间接量，只有经过一定得数学方法转换后才能被人所识别。相 对比较简单的断层图像，复杂干涉图的处理显然困难得多。为了解决这个难题，发展了 大体两种投影数据的提取方法：条纹跟踪法和相位展开法。条纹跟踪法直观，处理速度 快，因此应用很广泛，然而这种基于条纹的分析方法对由折射率分布严重不均匀的复杂 生物样品引起的不连续干涉图条纹的处理非常困难。相位展开法则是对整幅图像进行处 理，利用条纹强度分布的规律性，在频域范围内从投影干涉图像中提取关于样品的相位 差信息，这个也更符合光学层析的本质特点，但观察从我们的实验中获得的干涉图，这 个图像由于环境自身的原因，照度不均匀，边缘比较模糊，有时甚至无法分辨，再加上 光学系统本身带来的各种误差，对于本来对误差就很敏感的干涉系统来说更是致命的， 更加困难的就是在测量生物组织时出射的干涉图必然会会是非平行等问距的很复杂的 条纹，这个对相位提取是比较大的挑战 3 6 39 | 。再次就是三维重建算法方面，作为o c t 中最后一道工序，也是最重要的一个环节，由于实际的关于生物样品的测量，观察视角 受到物镜数值孔径的影响，一般只能达到4 0 0 - 5 0 0 ，相对1 8 0 0 的全角度测量获得的数据 信息，o c t 的实际测试获得数据非常有限，投影数据很不完全是必然的，这就造成了严 重病态，因此在求解积分方程组时，很难得到确定解。所以过于探测物体数据不完全问 题就成为o c t 测量的瓶颈，尽管非常多的国内外学者对此进行过研究，但至今仍未解 决。 对于活细胞内部结构的研究包括形态学，蛋白质在细胞内部的空间分布以及细胞内 部有毒化学的分布等。在显微测量技术中大致如下三种细胞是被使用的：荧光活放射性 细胞，染色或振幅型细胞和透明相位型细胞。对于不同的探测对象，所使用的扫描方式 也不一样。对于相位型细胞，是显微测量中近年来最长遇到的种类，因为对于光学探测 系统他们几乎是全透的。并且t i k h o n o va n 在1 9 8 7 年提出将计算机层析技术和显微 测量技术相结合，利用锥形光束对样品进行多方向投影数据的探测，并且获得了分层介 质的三维重建图。 正如前面所述，层析技术包含大致两个方面的内容：投影数据获取和断层图重建。 对于重建技术是所有层析技术都要使用的，因此获得了很大程度的发展，但是对于投影 数据的获取方法大家却各不相同。在层析技术中，对于投影数据的获取是通过对样品进 行多方向内的探测，但是在光学c t 中，这个方法就显得比较复杂。对于显微层析术， 其最基本的要求就是在尽可能大的角度内采集尽可能多的投影数据，最好是达到1 8 0 0 ， 但在实际中是很难满足这样的要求，因为实际中的观测角度受到物镜数值孔径的限制， 一些可用的探测方法如图2 2 1 1 所示【4 0 。4 3 1 。 图2 2 1 1 所示的是显微层析中常见的样品探测方式。 1 2 硕士论文 光学显微层析实验系统设计与研制 物镜焦平面 物镜 样品 物镜 物镜后焦平面 d b e c 图2 2 1 1 显微层析技术常见样品探测方法示意图 其中最常使用的是图a 和图b 所示的方法。图a 中从物镜前焦平面出射的聚焦电光 源照射聚光镜后，以一定宽度的一束平行光照明样品，透射光再经过物镜聚焦到后焦平 面上，最终被c c d 采集。当改变点光源在物镜前焦面上的位置时，出射光仍然保持为 平行光，但与光轴的夹角是变化的，采集这些数据，即获得了关于样品的多方向平行投 影数据。在采集数据时探测器的位置也需要根据出射光的位置移动作适当调整。这种探 测方式在俄罗斯光物理研究院的实验装置中得到了实际应用，这种装置在实验中不会因 为样品离焦问题而使采集的图像由于相差而变得模糊不清，但物镜前焦面上点光源的获 取和移动在实际的光学系统调节中是比较困难的。 图b 中入射到聚光镜前焦面上的平行光经物镜聚焦后照射在样品上，相当于点光源 照射样品中的某一部分，透射光经物镜后再次转变成平行光，如果直接这样利用，就相 当于激光共焦扫描显微镜，被照明的样品中几乎只有点光源以外光能进入探测器，其他 部分细胞的像由于离焦原因而西部能正常进入探测器以被接收。牛津大学t o n y w i l s o n 等人搭建的实验装置大多采用的是这种探测方式。但是对于这种探测方式我们 1 3 2 光学显微层析的理论模型与方法 硕七论文 也通过实验的手段进行了实际的研究，发现在实际调节中存在难调节两物镜之间的距 离，也即保证平行光入射至第一个显微物镜，从第二面显微物镜出射的也是平行光。经 过总结，若但从显微物镜自身原因的角度上考虑，可能是由于由复杂透镜组组成的显微 物镜自身聚焦点不是严格的点造成的。虽然显微物镜卖方表示在标准共轭距离为1 6 0 m m 下对其校正了近轴相差，及球差彗差和位置色差，但对于共焦扫描这种对光波面要求相 对较高的设施来说，我们还是不得不考虑。而且在实际的使用中，一般根据经验是将两 显微物镜的共轭焦点调在最小弥散斑处，最小弥散斑的位置位于近轴光线焦点距离边缘 光线焦点3 1 4 的地方。然而实际测量时，即使将两显微物镜调试到如上所述的位置，但 对于很薄的样品细胞，要想把样品探测点正好放置在显微物镜聚焦点处是比较困难的。 在我们实验初期虽然进行了无数次尝试，对非常细的光纤线芯进行共焦扫描测量，但没 有出现理想的干涉投影图，之后我们利用载玻片装载较大面积的洋葱表皮获得了比较理 想的结果。 而图c 中的探测方式我们可以认为是对前两种技术在理论设计上的完美结合，首先 考察聚焦于物镜前的一个点光源，当其入射至显微物镜后，出射平行光对样品进行扫描， 与图a 类似，对于这种探测方式下的投影数据的处理是相对比较简单的，而且已经发展 了相对比较成熟的程序。当聚焦点光源在物镜前焦平面上移动时，将会有不同方向的平 行光对样品进行探测，我们就可以获得不同角度内的投影数据，若对这些图像单独获取， 一个个处理是可以的，就如图a 所示的方式，当观察图c ，聚焦与物镜前焦面的点光源 是非常多的，所以一次就可以获得很多方向上对样品的多方向平行投影数据，而且随着 计算机处理能力的增加，同时处理这些数据不是大问题，但根据我们的研究和调研，还 几乎没有哪个机构采用这种方法进行实际探测实验，虽然理论上分析得比较多，我们认 为主要存在如下的问题：对于一次性获得的如此之多的投影数据，我们对于他们的获取 在实际中该采用什么方式，因为在不大的角度内，要想获得彼此之间有较多重叠的干涉 投影数据对于一般的采集手段是不切实际的，我们在对此分析时认为，利用图c 所示的 装置进行光学c t 探测时，若实验能真正实施成功，那我们将可以对样品进行实时的观 察分析，但最需要解决的就是一次性如此之多的投影数据的获取问题。 2 2 2 多方向投影数据的提取方法 目前获取投影数据的方法大致分为有两种：一种是研究新的创新光学探测方法，改 善实验装置，以类似医学c t 的方式，力求对样品在1 8 0 0 范围内探测，获取充足的投影 数据；另一种就是受探测器件的影响，只能在小于1 8 0 。范围内获取样品的不充分投影数 据，结合相位解包和非完全数据重建技术，对物体三维空间折射率分布进行再现。根据 现有资料，除了日本k a g a w a 大学设计出了利用光压技术，对单细胞进行全角度内测量 的实验装置外，其他包括俄罗斯光物理测量研究学院，美国麻省理工大学电子工程与计 1 4 硕士论文 光学显微层析实验系统设计与研制 算机科学实验室和英国牛津大学t o n y w i l s o n 为首的扫描光学显微成像工作小组在进行 相关研究时使用的都是只能在一定角度内对相位物体进行探测的层析实验装置。本文也 将采用这种方式，着重研究建立多方向平行投影数据获取装置，结合相位步进干涉装置 等，从实验上设计并搭建出光学显微层析实验装置。 从光学显微层析的物理模型中，我们可以发现利用平行光照明聚光镜，出射的汇聚 焦点聚焦到样品中某一点后，从样品中聚焦点出射并被调制的光波再经集光镜出射的光 波面实际上是样品中聚焦点的共焦扫描图像信息，即断层图像，虽然通过对样品中逐个 点的三维扫描得到大量的断层图像也能反演出样品的三维结构，但工作量非常大，不利 于对样品三维结构的实时快速获取，观察图1 2 8 ，我们假定显微物镜1 瞳面上的复杂波 面为p ( x ，) ，) ，且可表示为式5 4 1 的形式： p ( x ，y ) = a ( x ，y ) e x p ( j 缈( x ，少) ) ( 2 2 1 1 ) 假定参考光束的振幅为1 ，则每幅干涉图具有式5 4 2 的数学形式： i ( x ，y ，矽) = 1 + 彳2 ( x ，y ) 【1 + 2 c o s ( o ( x ，y ) + 缈】 ( 2 2 1 2 ) 其中矽为参考臂引入的相移，这个参数我们是可以通过预先设置知道的参数，观察式 2 2 1 2 ，我们发现一共有三个未知数，所以为了求得方程的解，至少要建立三个独立方 程，这就是我们常讲的三步法，除此之外还有四步法和五步法_ 4 6 1 ，虽然表达式形式各 不相同，但其基本原理是一样的。 以三步法为例，为了获取三幅干涉图，我们需要将参考臂的相移分别取 0 ，2 z 3 ，4 n 3 ，即= i ( x ，y ，o ) ，厶= i ( x ，y ，2 z 3 ) ，厶= i ( x ，y ，4 z 3 ) ，由此能够推得波面的 相位如式5 4 3 所示： ( x ，y ) = t a n 。1 【3 ( 厶一2 ) ( 2 i l 一厶一3 ) 】 ( 2 2 1 3 ) 通过这种方式得到的矽( x ，y ) 是一个相位包( w r a p p e dp h a s e ) ，它是波面的绝对相位 妒( x ，力与2 万的模，通过相位解包技术可获得样品波面的绝对相位分布缈( x ，y ) 4 7 1 。 通过上面的分析，我们发现光束只能对样品的其中某一点进行探测，而这是无法满 足对样品空间结构观察需要的，所以必须通过一定的系统，获得生物样品各个部分的探 测扫描投影图。类似我们的光学显微层析实验系统，要想获得多方向平行投影数据，就 必须对样品进行二维移动，如图2 2 2 2 所示。 早期的共焦扫描系统已经拥有各自的扫描方式。发展的初期，将样品安装到三维移动平 台上直接进行移动，无需再次调节光路中的其他光学器件，保证了聚焦于物面的光点的 位置基本不动。我们的实验装置也采用的是这个结构，这种方式不会破坏光学系统的平 衡，保证光学系统的光轴水平，使扫描点始终处于系统光轴上，充分发挥了以光学系统 为中心的优势，提高系统成像质量。但是对于这种方式我们又发现了其自身存在的一种 不足，现有的机械扫描平台首先在移动时会有振动，所以对于高速的图像采集是非常不 2 光学显微层析的理论模型与方法 硕十论文 利的，可以发现振动对于图像质量的影响是非常大的，而且机械位移台的移动速度比较 有限。 样 品 图2 2 2 2 多方向平行投影数据获取光路图 我们采购的二维位移台在设置运行速度为1 0 0 0 s t e p s 时，其移动速度仅为 1 0 m m m i n ，而比较麻烦的是所有的机械位移系统在运行时都需要加速度时间，在这个 时间内的速度是不均匀的，移动步距比进入正常运行时的步距小，比如在进入正常运行 速度时是0 5