扇贝裙边酱的多菌种阶梯发酵工艺及风味变化研究.pdf

河北农业大学 硕士学位论文 扇贝裙边酱的多菌种阶梯发酵工艺及风味变化研究 姓名：王晓茹 申请学位级别：硕士 专业：食品科学 指导教师：王颉 20120519 摘要 为了提高扇贝加工副产物一扇贝裙边的利用率，增加其附加值，本研究将以扇 贝裙边为主要原料，利用豆粕与米曲霉沪酿3 0 4 2 制曲，在扇贝裙边酱发酵后期添加 耐盐四联球菌和鲁氏酵母菌，以改善扇贝裙边酱的风味。本研究对发酵工艺进行了探 讨，确定其最优工艺参数，研制出一种营养丰富、配比合理、口感鲜美的扇贝裙边酱。 主要试验结果如下： 1 研究确定了扇贝裙边酱的混合阶梯发酵加工工艺。( 1 ) 蛋白质水解发酵工 艺：将洗净的扇贝裙边放入沸水中漂烫，放凉后切碎，豆粕经过高压灭菌( o 1 m p a ， 3 0 m i n ) 后，冷却至3 5 接种米曲霉，接种量为o 0 5 ，保持温度3 0 经过3 6 h 制 曲得成曲；将扇贝裙边和豆曲以4 ：l 的比例混合发酵，加入中性蛋白酶2 0 0 0 u g 、 食盐添加量为成品总量的1 2 ，4 0 恒温发酵。( 2 ) 增香发酵工艺：待酱醪发酵8 d 后，按1 的接种量接种已活化好的耐盐四联球菌，3 0 恒温发酵6 d 后，接种已活 化好的鲁氏酵母菌，接种量为1 ，3 0 恒温发酵7 d ，酱醪经磨细、杀菌，得成品。 2 利用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用的方法，分析了扇贝裙边酱的混合 阶梯发酵各阶段挥发性风味成分的变化。添加耐盐四联球菌发酵扇贝裙边酱可以增 加产品中酸类物质的相对含量，特别是乙酸和乳酸的相对含量，再加入鲁氏酵母菌 发酵扇贝裙边酱可以有效抑制产品中酸类物质的产生，促进成酯反应，最终使酸类 物质相对含量下降，酯类物质的相对含量明显提高，使产品的风味质量显著提高。 添加耐盐四联球菌和鲁氏酵母菌发酵的扇贝裙边酱样品中主要的挥发性风味成分 是乙醇、乙酸乙酯、3 甲基丁酸、2 甲基丁酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙醛、2 甲基丁 酸、3 甲基丁醛、十六酸乙酯、3 甲基丁酸乙酯、2 甲基丁醛，这几种物质在扇贝 裙边酱样品中所占比例为7 6 4 5 ，构成了扇贝裙边酱的主要香气成分。 3 分析了扇贝裙边酱基本营养成分及理化指标。蛋白质含量为1 9 8 5 ，脂肪 含量为o 8 0 ，氨基酸态氮为1 7 5 9 1 0 0 9 。由营养成分及理化指标分析结果可知， 以扇贝裙边为主要原料生产的扇贝裙边酱具有高蛋白、低脂肪、低糖的特点。 4 分析了扇贝裙边酱游离氨基酸的组成。游离氨基酸总量为9 8 2 9 1 0 0 9 ，游离 必需氨基酸总量为4 1 5 9 1 0 0 9 ，具有酸鲜味感的谷氨酸g l u 和天冬氨酸a s p 含量较 高，占氨基酸总量的1 9 3 4 ；具有甜鲜味感的苏氨酸t h r 、丝氨酸s e r 、丙氨酸灿a 、 甘氨酸g l y 、脯氨酸p r o 、赖氨酸l y s 占氨基酸总量的3 8 8 0 ，他们对扇贝裙边酱 的风味具有突出贡献。 5 分析了扇贝裙边酱的感官特性及微生物指标。经过感官及微生物指标分析， 扇贝裙边酱为棕黄色酱状物，入口细腻，具有浓郁的海鲜风味，且各项微生物指标 符合国家标准。 关键词：扇贝裙边酱；耐盐四联球菌；鲁氏酵母菌；挥发性风味成分 a s t u d yo nm u l t i - m i c r o o r g a n i s ms t e p w i s ef e r m e n t a t i o np r o c e s sa n d f l a v o r p r o f i l ec h a n g eo fs c a h o ps k i r ts a u c e a u t h o r ：w a n gx i a o r u s u p e r v i s o r ：w a n gj i e m a j o r ：f o o ds c i e n c e a b s 仃a c t i no r d e rt oi n c r e a s et h eu t i l i z a t i o nr a t ea n dt h ea d d e dv a l u eo fs c a l l o ps k i r t , a f e r m e n t a t i o np r o c e s su s i n gs c a l l o ps k i r ta sr a wm a t e r i a l ，a n ds t e r i l i z e ds o ym e a la n d a s p e r g i l l u so r y a s e3 0 4 2 a s s t a r t i n gc u l t u r e w a ss t u d i e d a tl a t e rs t a g eo ft h e f e r m e n t a t i o n ，t e t r a g e n o c o c c u sh a l o p h i l u s a n d z y g o s a e e h a r o m y e e s r o u x i iw e r e i n o c u l a t e dt oi m p r o v et h ef l a v o ra n dt a s t eo ft h es c a l l o ps k i r ts a u c e 1 1 h ef e r m e n t a t i o n p a r a m e t e r sw e r eo p t i m i z e dt od e v e l o pan u t r i t i o u ss c a l l o ps k i r ts a u c ew i t hb a l a n c e d f l a v o rp r o f i l e t h em a i nr e s u l t sw e r el i s t e da sb e l o w ： 1 s t u d yo nm u l t i m i c r o o r g a n i s ms t e p w i s ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ( 1 ) p r o t e i n h y d r o l y s i sf e r m e n t a t i o np r o c e s s ：s t a r t i n gc u l t u r ew a sm a d eb yi n o c u l a t i n ga s p e r g i l l u s o r y z a et os o ym e a l ( a u t o c l a v e da t0 1 m p af o r3 0 m i n , c o o l e dt o3 5d e g r e e sc ) a t0 0 5 1 e v e l a n di n c u b a t i n ga t3 0d e g r e e scf o r3 6 h s c a l l o ps k i r t sw e r eb l a n c h e di nb o i l i n g w a t e r , c o o l e da n dm i n c e d t h em i n c e ds c a l l o ps k i r t sw e r em i x e dw i t ht h es t a r t i n gc u l t u r e a t4 ：1r a t i o ，a n df e r m e n t e dw i t hp r o t e a s e ( 2 0 0 0 u g ) ，a n ds a l t ( 1 2 b yt o t a lw e i g h t ) i na s e a l e db e a k e ra t4 0d e g r e e sc ( 2 ) a r o m af e r m e n t a t i o np r o c e s s ：a f t e rf e r m e n t a t i o nf o r8 d a y s a c t i v a t e dt e t r a g e n o e o c c u sh a l o p h i l u sw a si n o c u l a t e da t1 l e v e l t h ef e r m e n t a t i o n w a sc o n t i n u e df o ra n o t h e r6d a y sa t3 0d e g r e e sc t h es c a l l o ps k i ts a u c ew a st h e n i n o c u l a t e dw i t ha c t i v a t e dz y g o s a c c h a r o m y c e sr o u x i i ( 1 1 e v e l ) ，i n c u b a t e da t3 0d e g r e e cf o r7d a y s ，g r o u n da n ds t e r i l i z e dt om a k et h ef i n a lp r o d u c t 2 a n a l y s i so ff l a v o rp r o f i l ed l a n g e sd u r i n gt h es t e p w i s es c a l l o ps k i r ts a u c e f e r m e n t a t i o n p r o c e s s ，u s i n gh e a d s p a c es o l i d - p h a s e m i e r o e x t r a c t i o na n d g a s c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r ym e t h o d t e t r a g e n o e o c c u sh a l o p h i l u sf e r m e n t a t i o n i n c r e a s e dc o n t e n t so fa c i dc o m p o u n d s ，e s p e c i a l l yo fa c e t i ca n dl a c t i ca c i d f u r t h e r f o r m a t i o nw i t hz y g o s a c c h a r o m y c e sr o u x i ie f f e c t i v e l yi n h i b i t e dt h ef o r m a t i o no fa c i d c o m p o u n d s ，a n dp r o m o t e dt h ee s t e r i f i c a t i o n a sar e s u l t ，t h ef l a v o rp r o f i l eo ft h ef i n a l p r o d u c tw a si m p r o v e db yi n c r e a s e dl e v e lo fe s t e r sa n dd e c r e a s e dl e v e lo fa c i d s 田1 em a i n v o l a t i l ec o m p o u n d si nt h es c a l l o ps k i r ts a u c ei n c l u d e de t h a n o l ，e t h y la c e t a t e ，3 - m e t h y l b u t y r a t e , 2 - m e t h y lb u t y r i ca c i de t h y le s t e r , e t h y ll a c t a t e ，p h e n y l a c e t a l d e h y d e ，2 - m e t h y l b u t y r i ca c i d , 3 - m e t h y lb u t y r a l d e h y d e , p a l m i t i ca c i de t h y le s t e r , 3 - m e t h y le t h y lb u t y r a t e ， a n d2 - m e t h y lb u t y r a l d e h y d e t h e s ec o m p o u n d sw e r et h em a i nf l a v o rc o m p o n e n t s ，a n d a c c o u n t e df o r7 6 4 5 o ft o t a lv o l a t i l e si ns c a l l o ps k i r ts a u c e 3 n u t r i t i o n a lp r o f i l ea n a l y s i so ft h es c a l l o ps k i r ts a u c e t h es c a l l o ps k i r ts a u c e c o n t a i n e d19 8 5 o fp r o t e i n , 0 8 0 o ff a t ，a n d1 7 5 o fa m i n oa c i dn i t r o g e n t h e n u t r i t i o n a lp r o f i l es h o w e dt h a tt h es c a l l o ps k i r ts a u c ei sh i g hi np r o t e i n ，a n dl o wi nf a t a n ds u g a r 4 f r e ea m i n oa c i dp r o f i l ea n a l y s i so ft h es c a l l o ps k i r ts a u c e t h et o t a lf r e ea m i n o a c i dc o n t e n tw a s9 8 2 9 1o o g t h ef r e et o t a le s s e n t i a la m i n oa c i d sc o n t e n tw a s4 15 9 lo o g t h es a u c ec o n t a i n e dr e l a t i v e l yh i g hl e v e lo fs o u ra n du m a m ia m i n oa c i d s ，g l ua n d a s p ( 19 3 4 o f t o t a la m i n oa c i d s ) t h es w e e ta n du m a m ia m i n oa c i d s ( t h r , s e r , a l 如g l y , p r o l y s ) a c c o u n t e df o r3 8 8 o ft o t a la m i n oa c i d s t h e s ea m i n oa c i d sf i l et h em a i n c o n t r i b u t o r st ot h et a s t eo ft h es e a l l o ps k i r ts a u c e 5 s e n s o r ya n a l y s i sa n dm i c r o b i o l o g i c a la n a l y s i so ft h es c a l l o ps k i r ts a u c e t h e s c a l l o ps k i r ts a u c ew a sab r o w np a s t ew i t hs m o o t ht e x t u r ea n dr i c hs e a f o o df l a v o r a l l m i c r o b i o l o g i c a li n d i c a t o r sm e tn a t i o n a ls t a n d a r d s k e y w o r d s ：s c a l l o ps k i r ts a u c e ；t e t r a g e n o c o c c u sh a l o p h i l u s ；z y g o s a c c h a r o m y c e sr o u x i i ； v o l a t i l ef l a v o rc o m p o n e n t s 扇贝裙边酱的多菌种阶梯发酵工艺及风味变化研究 1 1研究目的及意义 1 引言 根据国家统计局公布的数字，2 0 0 9 年我国人口总数为1 3 亿，耕地总面积为1 3 亿公顷，平均每人0 1 公顷，随着人口的迅速增长和工业的快速发展，人均耕地面积 正在逐渐缩小，人类的食物来源受到越来越多的危胁。我国海疆辽阔，环列于大陆东 南面有渤海、黄海、东海和南海四大海域，海岸线超过1 8 0 0 0 k i n ，可管辖海域3 0 0 多万k m 2 ，蕴藏着丰富的海洋生物资源。据测算，海洋可向人类提供食物的能力等于 世界上所有耕地面积所生产农产品的上千倍之多，每年可提供海水产品3 0 多亿吨， 将能满足3 0 0 亿人蛋白质的来源，而目前全球海产品的开发量只有1 4 亿多吨。从海 洋中获得更多安全、优质的食品资源，对于解决我国食品安全和质量安全需求及开拓 海洋生物资源具有重大意义。随着全面开发利用海洋资源新时代的到来，大力发展海 洋食品加工产业，已成为有效缓解资源短缺、解决人口膨胀、促进社会经济可持续发 展的重要途径之一。 我国沿海贝类资源丰富，种类较多，生活着8 0 0 余种海洋贝类，贝类产量名列 世界第一。根据国家统计局公布的数据显示，2 0 0 9 年，我国水产品总产量为5 1 1 6 4 万吨，其中海水产品总产量为2 6 8 1 6 万吨，海水贝类产量达到1 1 2 0 0 万吨，占贝 类总产量的9 5 5 6 ，居于海水产品产量之首。贝类不仅营养丰富，味道鲜美，还有 很多保健功能，具有重要的食用价值和经济价值。对这些贝类资源进行高值化开发 利用，为人类提供理想的海洋食品及海洋药物，增加经济效益，将有助于推动我国 海洋产业的迅速发展。 扇贝是我国重要经济海产品之一，产量仅次于牡蛎和蛤类，是我国第三大经济 贝类。扇贝肉质鲜美，营养丰富。据报道，扇贝不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、 微量元素等营养成分，还含有许多生理活性物质，例如扇贝多肽、氨基多糖、酚氧 化酶、牛磺酸、糖蛋白、d h a 和e p a 等，这些功能成分具有抗肿瘤，抗病毒，抗 衰老，降血压、保护视力等多种生理功能【l 2 】。扇贝柱是较为名贵的海珍品，目前 我国冷冻贝柱及干制贝柱的加工和出口量非常大，且其出口量在海产加工制品中所 占的比重逐年增加。而在加工贝类制品的过程中，会产生很多碎贝柱、贝边等下脚 料。据试验：加工lk g 扇贝柱需9k g 扇贝，产生下脚料扇贝裙边2 5k 1 。然而， 由于水产品的深、精、细加工技术滞后，导致大量低值水产品和其下脚料腐败变质。 这不仅造成极大的资源浪费同时也给养殖捕捞区周边的水、陆环境带来了严重污 染。对这些资源进行综合开发利用，为人类提供理想的海洋食品，并创造出可观的 经济效益，将有助于推动我国海洋产业的迅速发展 4 1 。因此，开发研究如何利用贝 类加工后的废弃物，进行精深加工，提高其附加值，解决资源浪费和环境污染等问 题，对于我国海洋产业的发展显得尤为重要。 水产调味品与利用粮食作物生产的复合调味品相比，除了具有原料上的优势以 1 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 外，市场需求前景广阔。随着社会经济、文化的迅速发展，人们生活水平不断提高， 人们对美味美食的追求日趋强烈，调味品作为生活必需品，品种越来越丰富，现已成 为食品工业中重要的组成部分，我国调味品年产值约占食品工业总产值5 ，每年均 以两位数增长。人们对调味品的需求也不仅仅只要求色、香、味俱佳，人们日渐关注 调味品的营养化、多样化、功能化，比起无益健康的化学制品人们更青睐于绿色概念 的天然制品。这就使得调味品由过去使用的传统酿造调味品或化学调味品转向更高级 味感的功能性调味品和天然调味品。水产调味品，因其含有丰富的氨基酸、多肽、糖、 有机酸、核苷酸等呈味成分和牛磺酸等保健成分，越来越受到人们的青蜊5 1 。我国对 水产品的加工有着悠久的历史，以水产原料制作的调味料一直是我国人民传统的佐味 佳品，如鱼酱油、鱼露、蚝油、虾油、虾酱等。发酵调味品由于微生物的作用使原料 中蛋白质、脂肪、碳水化合物等大分子物质被微生物酶水解成肽、氨基酸、脂肪酸、 低聚糖和单糖等小分子物质，提高了产品营养价值和消化性能，发酵赋予产品的口感、 风味、色泽以及外观等的改善和多样化，使产品更易为消费者喜爱【6 l 。利用现代生物 技术同传统调味品的生产技术相结合，将是今后水产调味品生产发展的方向网。 我国陆地微生物发酵工程已有了长足的发展，在对陆地生物蛋白资源的利用研 究中，积累了丰富的研究资料和经验。将陆地微生物发酵工程技术应用于海洋蛋白 资源的综合利用研究是未来水产品加工的发展方向之一。将较成熟的黄豆酱发酵技 术应用在氨基酸含量丰富的扇贝边发酵中，生产出美味的扇贝豆酱，既增加了调味 酱的新品种，又拓宽了扇贝边综合利用的途径。国内的研究领域已经有一些关于利 用乳酸菌和酵母菌多菌种发酵改善黄豆酱发酵工艺及风味方面的报道，但应用于海 鲜酱的发酵技术还未见报道。国外尤其是日本已有利用乳酸菌发酵生产海鲜酱的报 道。本实验室前期已经成功的利用微生物发酵技术对扇贝柱进行发酵生产扇贝豆 酱，并确定了快速发酵法制取扇贝豆酱的生产工艺，确定了较优的发酵菌种和工艺 参数，但原料为成本较高的贝柱且仅限于单一菌种发酵。 为了提高对扇贝裙边的加工利用，增加其附加值，本研究将以扇贝裙边为主要 原料，利用豆粕与米曲霉沪酿3 0 4 2 制曲，在扇贝裙边酱发酵后期添加耐盐四联球 菌和鲁氏酵母菌以改善扇贝裙边酱的风味。本文将对其发酵工艺进行探究，确定其 最优工艺参数，研制出一种营养丰富、配比合理、口感鲜美的扇贝裙边酱。 1 2国内外研究进展 1 2 1 海产贝类调味品的研究进展 水产调味品是以海产品为原料，采用抽出、分解、加热，有时也采用发酵、浓 缩、干燥及造粒等手段来制造的调味品【8 】。目前，我国常见的水产调味品，包括传 统水产调味品鱼露、蚝油、虾油等以及利用化学或生物技术方法开发的调味粉、沙 司、海鲜酱等新产品。水产调味品按其加工工艺的不同可将其分为三种类型：抽提 2 扇贝裙边酱的多菌种阶梯发酵工艺及风味变化研究 型水产调味品、反应型水产调味品和分解型水产调味品【7 ，9 ，1 0 1 。 抽提型水产调味品是以天然的鱼、虾、蟹等为原料，经过抽提、分离、混合、 浓缩或干燥等工序生产的一类味感鲜美浓郁、丰满醇厚、圆润香滑、回味悠长、风 味特征性强的天然浸出物。例如，蚝油加工在我国已有相当悠久的历史，多是从蚝 干加工所得的蚝汁经煮沸浓缩而得到的。 反应型水产调味品多以水产品原料为基料，通过添加不同配比的氨基酸、还原 糖，以及h v p 、酵母精等鲜味物质，通过控制氨基酸与糖类之间的m a i l l a r d 反应条 件和反应物的不同，从而生成多种香味物质。目前国内关于m a i l l a r d 反应制备海鲜 风味调味品尚处于试验开发阶段。广东海洋大学的陈美花等人【l l 1 2 】通过考察还原糖 种类及其配比、还原糖添加量、反应起始p h 、反应时间和抽提物含水量等因素， 利用美拉德反应改良马氏珠母贝酶法抽提物的风味，得到了贝类特征香气突出、体 香浓郁丰满、整体香气协调统一的调味基料。并且探讨了呈昧成分在美拉德反应产 物的呈味中所起的作用。 分解型水产调味品是指以富含蛋白质的水产品为原料，通过加酸、加酶或者利 用原料自身所含酶类及微生物发酵的作用，将原料蛋白质分解，形成富含氨基酸、 多肽、生物碱、有机酸等营养及风味成分的调味料，再经过调配、浓缩或造粒而成 的一类天然水产调味品【l o 】。目前研究较多的有酶解型水产调味品和发酵型水产调味 品两种。 酶解型水产调味品是鱼贝类通过蛋白酶等酶水解，加工调配而成的调味品。迟 玉森【l3 】等人利用酶解的方法由扇贝裙边制取了海鲜调味料，酶解液中氨基酸态氮含 量可达o 9 以上。朱麟【1 4 】等人以扇贝裙边为原料，采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 双酶水解，再用酸性蛋白酶进行分段酶解，可使扇贝裙边水解度达到6 2 5 9 ；水解 液再经过浓缩、调配、干燥可制成营养丰富，有浓郁海鲜风味的调味品。楚水晶嗍 等人以同样的方法对扇贝裙边进行酶解。然后将水解液浓缩，再配以各种辅料，研 制出一种营养丰富的新型海鲜酱，产品的氨基酸态氮含量为0 4 - - , 0 5 。纪蓓【1 6 】 等人以扇贝裙边为原料，分别用中性蛋白酶、动物蛋白水解复合酶对扇贝边进行水 解，通过正交实验确定了扇贝裙边的最佳酶法水解工艺条件。为利用扇贝边资源制 备水解动物蛋白及海洋生物活性物质探索一种有效途径。 发酵型水产调味品是鱼贝类通过自身的或外加的微生物发酵而制成的调味品， 其中最具代表性的就是中国传统的鱼露。我国生产鱼露有着悠久的历史，在研究鱼 露的风味和快速发酵工艺等方面有着较大的进展，侯温甫【l 刀等人研究利用淡水鱼加 工下脚料制备低盐鱼露的速酿工艺。制得的鱼露产品固形物含量1 9 4 3 ，氨基酸态 氮含量为0 7 3 。黄紫燕【l8 】等人通过前期高盐酶解、中期加曲自然发酵、后期高盐 保温等工艺研制出分段式快速鱼露发酵工艺，结果表明，总可溶性氮、氨基酸态氮、 游离氨基酸含量增长较快，发酵1 5 d 时其含量已超过国家一级鱼露标准，经后期高 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 盐保温后其风味、体态、颜色均较好。采用此方法与传统方法相比，可以使鱼露发 酵时间从三年缩短为一年。j y o n g s a w a t d i g u l 1 9 】等人研究了一种利用蛋白酶和微生 物发酵生产鱼露快速发酵方法，结果表明样品发酵1 2 个月后氨基酸含量有所提高， 主要的氨基酸为谷氨酸，天冬氨酸和赖氨酸。赵华杰【2 0 】等人分别采用米曲霉、高渗 酵母、啤酒酵母和乳酸菌对贻贝蒸煮液进行发酵，结果表明，用4 种不同菌发酵均 得到令品评员可接受的贻贝蒸煮液调味品，其总体感官特性为滋味较醇厚，海鲜味 突出，咸味适中，略带酸味和腥味。与市售酱油类产品相比，产品的氯化钠含量略 微偏低，总氮含量较高，氨基态氮处于中间水平，有机酸组成独特。随着研究的不 断深入，鱼露的速酿工艺逐渐发展成型。将传统发酵方法和现代方法相结合的酿造 工艺通过保温、加曲、加酶等手段，不仅缩短了鱼露的生产周期，还降低了产品的 盐度，同时也减少了产品的腥臭味，更为人们所接受。 利用扇贝作为原料的调味品的研究相对较少，其中，大部分是利用酶解的方法 生产调味汁，产品风味远不及发酵产品。利用微生物发酵扇贝裙边生产酱油的方法 已有相关研究。大连工业大学的孔繁东【2 l 】等人，以扇贝裙边、豆粕、小麦为原料， 通过a s 3 0 4 2 ，a s 3 3 5 0 ，u e 3 3 6 2 多菌种混合制曲，采用先低温后常温的发酵工艺， 在常温期添加耐盐鲁氏酵母菌，利用高盐稀态发酵方法研究开发扇贝裙边海鲜酱 油。生产出的酱油产品为红褐色，各项指标均达到国家标准。山东师范大学的迟玉 森田】等人，采用毛霉菌种a s 3 1 1 为原料，菌悬液中加入2 0 的麦芽汁用发酵法由 扇贝裙边制取扇贝酱。3 0 恒温培养4 0 h 左右，然后置于2 0 3 0 后发酵5 7 天， 所得的产品氨基氮含量为o 7 。山东科技大学的纪蓓【2 3 】等人，以扇贝裙边为原料， 以从酱油曲精中分离纯化得到米曲霉作为菌种，经过固态发酵法生产天然调味酱。 制得的扇贝酱氨基态氮含量在o 6 4 0 6 9 之间，为淡黄色酱状物，入口细腻，香 鲜浓郁，有典型的海鲜风味。 以扇贝裙边和豆粕为原料发酵生产扇贝裙边酱的研究还未见报道，但它作为一 种新型发酵调味产品，类似于传统的鱼露发酵过程，可以作为扇贝裙边酱研究的参 考。 1 2 2 乳酸菌及酵母菌在调味品中的应用 在天然发酵的酱醪中存在大量乳酸菌和酵母菌，其对产品的风味和品质起着重 要的作用。大量研究表明，在我国传统的酱油和豆酱发酵的酱醪中分离出耐盐四联 球菌和鲁氏酵母菌，他们在酱类产品酿造中的呈味作用主要体现在色、香、昧等几 个方面。耐盐嗜盐四联球菌是酱类产品发酵过程中主要的乳酸菌，尤其在酱的后熟 阶段占绝对优势。嗜盐四联球菌在酱醪发酵过程中的主要作用有以下四点：一是生 成小分子有机酸，进而与酵母菌产生的醇类生成酯类呈味物质，赋予酱品独特的酱 香风味，同时掩盖酱品令人不愉快的味道，如豆腥味和霉味等【2 4 j 。二是产酸使酱体 的p h 值降低为4 8 。5 2 ，抑制有害微生物如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等的生长【2 5 2 6 1 。 4 扇贝裙边酱的多菌种阶梯发酵工艺及风味变化研究 三是为耐盐酵母的生长提供适宜的弱酸性环境，进而诱发醇类发酵【2 7 l 。四是抑制酱 体着色，具有保持酱体明亮、鲜艳色泽的功能。 目前耐盐四联球菌在豆酱和酱油的发酵中已得到广泛的应用，对产品的发酵工 艺以及风味物质分析都有了深入的研究。杨汝刹2 8 1 、林祖申t 2 9 j 、王夫杰d o 、谭周进 3 1 1 等人分别对耐盐乳酸菌在发酵酱品中的应用以及呈味分析进行了深入的研究。在 产品的增香研究中取得了一定的进展。在利用耐盐乳酸菌发酵海产品的研究中，国 内外也有相关报道，主要是用在鱼露发酵的研究。m o t o h a r uu c h i d a 等人1 3 2 j 使用酱 油用曲菌和耐盐四联球菌来发酵鲢鱼生产鱼露，结果表明，酱油曲的加入可以提高 鱼露质量和氨基酸含量，添加耐盐四联球菌可以降低发酵初期的p h 值，并且在鱼 露的发酵过程中起到了重要的作用。l i j u n g y i n 等人【3 3 】利用蛋白酶水解碎鲭鱼后再 用乳酸菌发酵，使其功能性得以改进，研究结果表明水解和乳酸菌发酵1 2 h 以后细 胞活力和抗氧化性明显增强。n a t t e e w a nu d o m s i l 等人洲从发酵1 至1 2 个月的鱼露 酱醪中分离出耐盐四联球菌，他们产生重要醛，即2 甲基丙醛，苯甲醛，贡献出肉 味和杏仁味。研究表明，耐盐四联球菌在鱼露发酵过程中挥发性化合物的形成起着 重要的作用。n a t t e e w a nu d o m s i l 等人【3 5 】利用耐盐四联球菌作为发酵剂来改善鱼露发 酵的风味，研究结果表明，接种耐盐四联球菌的鱼露总氨基酸含量很高，特别是谷 氨酸含量高。鱼露中主要的挥发性化合物是2 甲基丙醛，2 甲基正丁醛，3 基正丁 醛和苯甲醛。接种耐盐四联球菌发酵鱼露不仅可以使氨基酸和风味物质增加还可以 减少鱼露中二甲基二硫醚和生物胺的含量。t a k a s h ik u d a 等人p 6 】研究了通过添加耐 盐四联球菌来抑制发酵和腌制鱼中的组织胺积累，从而提高了产品的安全性。 国内学者将耐盐四联球菌应用到海产品发酵的研究目前还未见报道，有少量报 道乳酸菌用于海产品发酵的研究。中国海洋大学的徐莹【了7 】等人研究了接种植物乳杆 菌发酵对牡蛎成分的影响，研究表明，接种植物乳杆菌后牡蛎浆p h 在发酵第2 d 迅 速下降并一直处于酸性状态( p h w 4 ) ，能有效降低体系挥发性盐基氮的含量。蛋白 质被分解，氨基酸增加，而可溶性蛋白表现出波动变化，还原糖逐渐被消耗，植物 乳杆菌对牡蛎的发酵过程有重要作用。广东海洋大学的张妙霞【3 8 】等人分析了来自湛 江和汕头市场5 种鱼露中的乳酸菌种类，结果表明乳酸菌含量较高的样品亚硝酸盐 和挥发性盐基氮含量较低。乳酸菌发酵过程产生多种酶系，可降低亚硝酸盐含量， 而且乳酸菌可以抑制腐败菌的生长，从而降低产品中挥发性盐基氮含量。华南理工 大学的江津澍碍j 等人研究了缇制鱼露中的耐盐微生物( 耐盐乳酸菌m 1 、m 2 和耐 盐产蛋白酶菌t 1 ) 对其发酵初期挥发性风味物质形成的影响。结果表明，添加耐盐 微生物进行鱼露发酵，在发酵初期，总酸、氨基酸态氮、总氮、非酶褐变指数等理 化指标都明显优于未添加发酵剂的空白对照。并且对鱼露挥发性特征风味成分的形 成，尤其是挥发性酸的形成有积极的贡献，而自然发酵的鱼露则很难在发酵初期产 生特征挥发性风味物质。 鲁氏酵母菌是酱油酿造过程重要的增香酵母菌。国内外在提高酱油质量、改善 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 酱油风味以及香气成分的检测与分析方面已经进行了深入的研究【柏】。鲁氏酵母菌在 发酵酱品中的主要作用有三点：一是在酱醪发酵中产生乙醇、高级醇及芳香杂醇类 物质，在高盐环境中还能转化糖类物质生成多元醇及糖醇类风味物质。二是在酱醪 发酵中还可以产生呋喃酮类风味化合物。三是鲁氏酵母的谷氨酰胺酶能转化底物生 成谷氨酸而增强酱品的鲜味【4 l 】。鲁氏酵母菌已经广泛应用于酱油及豆酱的发酵工艺 中，而在发酵海产品加工中的应用只有零星报道。前橘健- - 4 2 】等人研究了用麦曲 和鲁氏酵母发酵生产低盐鱼露，酵母发酵产生乙醇可以抑制细菌生长，6 0 天完成发 酵过程，得到的产品含盐量是传统鱼露的一半，并且具有更多的风味物质产生。 c h r i s t i n ep a l u d a n - m i i l l e r 4 3 】等人研究了不同盐浓度下泰国发酵鱼中微生物组成，乳酸 菌和鲁氏酵母菌作为主发酵菌种被分离出来，结果表明，乳酸菌在9 盐浓度下会 受到抑制，从而影响了发酵的速度：鲁氏酵母菌的生长对发酵速率没有影响，但对 风味贡献很大。刘树割删等人利用复合蛋白酶、复合风味蛋白酶紫贻贝进行双酶水 解，同时采用产酯酵母发酵技术制备调味料，通过电位滴定法测定单菌株和多菌株 发酵对双酶水解贻贝肉产总酯的影响。结果表明：产酯酵母1 2 7 4 在双酶水解后， 接种量为5 ，发酵温度2 8 ，发酵时间7 2 h 时总酯含量为0 6 5 ，相同条件下， 产酯酵母1 2 7 4 和1 2 0 2 多菌株发酵时总酯含量为0 7 8 ，经产酯酵母发酵后的调味 料，酯香味浓郁，给予产品以发酵特有的风味。 在日本耐盐四联球菌和鲁氏酵母菌联合发酵生产酱油的工艺已经广泛应用，而 在国内也有了相关的报道。天津科技大学的曹小红【2 7 】等人研究了耐盐乳酸菌与酵母 菌在酱醪汁中协同作用的研究，结果表明耐盐乳酸菌可以促进鲁氏酵母的生长，但 在发酵前期鲁氏酵母的生长会抑制耐盐乳酸菌的生长。华南理工大学的黄紫燕【4 5 】 等人以传统发酵工艺制作鱼露，研究发酵过程中不同阶段的微生物的消长变化规 律，结果表明，乳酸菌和酵母菌是鱼露发酵过程中的优势菌，乳酸菌生长使环境p h 值下降，促进酵母菌生长，微生物的变化与各项理化指标及游离氨基酸的变化有密 切联系。s h 埘iy o s h i k a w a 倒等人进行了发酵鲑鱼酱过程中耐盐乳酸菌和耐盐酵母菌 的动力学研究，研究表明，耐盐四联球菌可以产生乳酸，用于抑制鱼酱的褐变，而 鲁氏酵母可以抑制耐盐乳酸菌的过量增长，避免产品过酸。同时鲁氏酵母还可以抑 制其他野生酵母的生长和不良风味的产生。 由此可见，耐盐四联球菌和鲁氏酵母依次加入发酵酱醪，不仅可以避免鲁氏酵 母茵对耐盐四联球菌生长抑制，又可以避免其过量增长导致产品过酸，耐盐四联球 菌发酵产生的酸性环境还可以诱发鲁氏酵母的生长。因此，利用米曲霉进行扇贝裙 边蛋白质发酵，耐盐四联球菌和鲁氏酵母改善扇贝裙边酱的风味是可行的。 1 2 3 挥发性风味物质的研究 海鲜酱的风味成分主要来源有以下四方面：一是由原料成分所产生；二是由米 曲霉代谢生成；三是由耐盐酵母和乳酸菌的代谢生成；四是酱醪成熟过程中化学反 6 扇贝裙边酱的多菌种阶梯发酵工艺及风味变化研究 应生成物等。酱品的香味为酯香、酱香、肉香、花香、醇香及水果香等，以酱香和 酯香为主。酱香主要是呋喃化合物和酚类；酯香主要是一些挥发性强的物质的气味， 主要是醇、酯、醛、酸、酮等。一些有特色的复杂香气成分不仅与原料有关，还因 为酱类产品不同于其他酿造物的独特生产方法 4 7 1 。 食品中挥发性风味物质的分析鉴定，对了解食品的化学组成、控制食品的感官 质量有着重要的意义，主要包括三部分：首先应尽量完全地从食品中抽提出香味组 分，然后借助现代仪器进行定性和定量分析，最后是对挥发性组分进行分析评价及 其对香气的贡献。目前应用较多的是利用顶空固相微萃取技术将样品中的挥发性风 味物质充分吸附，再结合气相色谱、质谱对其进行定性和定量分析。 目前，顶空固相微萃取( h s s p m e ) 和气相色谱质谱( g c m s ) 联用技术以被 广泛用于水产品以及调味品中挥发性风味物质的检测。s v e i n a m j a s 4 s j 等人利用 h s s p m e 和g c m s 联用技术分析鱼粉挥发性风味物质，分析了毗啶、吡嗪、芳香族 碳氢化合物、含硫化合物和氨基酸等物质。h a uy mc h u n g 【4 9 】等人利用气相色谱质 谱联用技术分析了冷冻虾夷扇贝和干燥虾夷扇贝的挥发性成分，分离鉴定出1 5 7 种挥 发性成分，酮、醇、醛、芳烃、杂环化合物、萘、酚类化合物、含硫化合物、萜类、 吡嗪、酯、烷烃、吡啶、呋喃和酸，且干燥扇贝较冷冻扇贝含有更多的挥发性成分和 更高浓度。a n u p a mg i r i l 5 0 】等人用气相色谱法分析了鱼酱、豆酱、鱼露、酱油的挥发 性风味物质。共检测出1 2 3 种挥发性化合物，主要包括醛，醇，酯，酮，呋喃，硫和 含氮的化合物，芳烃和脂肪酸等。芳香化合物对香气的贡献很大。而鱼露产品的特点 是氨、腥、坚果和奶酪的气味。酱油产品以坚果和奶酪的香气为主。利用酒曲发酵的 鱼酱可有效的提高产品的甜香味，减少了坚果、肉和腐臭的气味。b o g i mg i l t 5 l 】等人 用气相色谱质谱法分析了豆酱的风味物质。 乔鑫 4 7 1 等人采用顶空固相微萃取气质联用的方法对豆酱的挥发性成分进行分析 鉴定。共鉴定出化合物6 1 种，包括醇、酸、醛、酮、酯、酚、烷烃、含氮杂环化合物、 呋喃、以及其他化合物。肖宏艳 5 2 1 等人采用h s s p m e 和g c m s 联用技术分析了潮汕 鱼露在发酵1 年、2 年、3 年以及3 年后保温l 周时的风味成分，结果表明，挥发性的酸、 醇、醛、酮和含氮、含硫化合物相对含量在发酵过程中变化明显。乙酸、2 甲基丙酸、 丙酮、2 丁酮、吡唑和二甲基硫化物对潮汕鱼露的独特风味有积极贡献。金君【5 3 5 4 1 等人采用h s s p m e 和g c m s 联用技术对未发酵半干罗非鱼、经乳酸菌发酵半干罗非 鱼和酵母菌发酵罗非鱼中的挥发性物质进行研究，结果表明，在未发酵罗非鱼、乳酸 菌发酵罗非鱼和酵母菌发酵罗非鱼中分别检测出7 4 、7 1 和5 9 种挥发性物质，二者具有 显著差异，乳酸菌发酵半干罗非鱼中3 羟基2 丁酮的峰面积比例明显高于未发酵半干 罗非鱼。酵母发酵半干罗非鱼中苯乙醇相对含量明显高于未发酵半干罗非鱼。江津津 瞪5 】等人用带捕集阱顶空制样结合g c m s 联用技术分析潮汕鱼酱油的挥发性风味化合 物。鉴定出特征挥发性化合物共5 0 种，主要是其中酸、含氮化合物、醛、酯、含硫 化合物、烃、其他杂环类。杨荣华【5 6 】等采mi l s s p m e 和g c m s 联用技术分析了米曲 发酵贻贝蒸煮液的挥发性风味物质。在发酵前、后贻贝蒸煮液中分别鉴定出4 7 和5 5 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 种香气成分，发酵后贻贝蒸煮液中呈腥味的成分三甲胺含量大为下降，且产生了数十 种呈悦人香气的酚类、酯类、醇类物质，使整体香气协调。 1 2 4 营养成分的研究 评价食物营养价值的主要指标包括一般营养成分含量( 水分、灰分、糖分、蛋 白质、脂肪) 、氨基酸组成与含量、脂肪酸组成与含量，以及胆固醇含量等。目前 对贝类营养价值的研究也多是针对这些方面。氨基酸的组成和含量因其在评价食品 营养方面的重要作用最为研究者所关注。 扇贝裙边营养丰富，大量研究发现，扇贝裙边含有丰富的蛋白质、脂肪、维生 素、微量元素等营养成分。且氨基酸种类齐全，达1 8 种以上，8 种必需氨基酸的含 量约占总氨基酸含量的3 0 ，其中甘氨酸、谷氨酸及天冬氨酸、精氨酸等呈味氨基 酸的含量较高。此外，还含有氨基多糖、牛磺酸等多种生物活性物质，其营养价值 并不逊色于扇贝柱【5 7 1 。由此可知，扇贝裙边是酿造海鲜调味料的最好原料。 1 3研究的主要内容和技术路线 1 3 1 研究的主要内容 本研究以扇贝裙边为主要原料，利用灭好菌的豆粕与米曲霉沪酿3 0 4 2 制曲，对 扇贝裙边酱发酵后期添加耐盐四联球菌和鲁氏酵母菌改善扇贝裙边酱风味的工艺进 行探讨性研究，研制一种营养丰富、配比合理、口感鲜美的扇贝裙边酱，主要研究内 容包括： 1 扇贝酱蛋白质水解发酵工艺研究： 2 扇贝裙边酱的混合阶梯发酵加工工艺研究； 3 利用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用的方法，分析扇贝裙边酱的混合阶 梯发酵各阶段挥发性风味成分的变化； 4 扇贝裙边酱基本营养成分及理化指标的研究； 5 扇贝裙边酱游离氨基酸的组成的研究； 6 扇贝裙边酱的感官特性及微生物指标的测定。 扇贝裙边酱的多菌种阶梯发酵工艺及风味变化研究 1 3 2 研究的技术路线 研究的技术路线如图1 所示 图1 技术路线图 f i g 1t h et e c h n i c a lr o a d m a p 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 1 试验材料 2 1 1原料与主要试剂 2 材料与方法 扇贝裙边、贝柱及全贝：秦皇岛海东青食品有限公司提供； 豆粕：由河北保定槐茂有限公司提供； 中性蛋白酶：北京索莱宝科技有限公司