（发酵工程专业论文）细菌纤维素耐低温生产菌株的选育及其改性的研究.pdf

山东轻工业学院硕士学位论文 摘要 以本实验室保存的木醋杆菌m 1 2 为出发菌株，采用紫外诱变和氯化锂紫外复 合诱变的方式对原始菌株进行诱变处理，利用c m c 固体培养基，对诱变后的菌株 进行平板培养，记录菌落数，做出致死曲线，得出最佳诱变剂量。在此诱变剂量 下诱变原始菌株，经过初筛和复筛以及连续传代实验得到的一株耐低温、产酸少、 细菌纤维素产量高且遗传性状稳定的突变株u v 3 ，细菌纤维素产量比出发菌株提 高了2 7 2 。 首先通过单因素实验，分析培养基的碳源种类和浓度、氮源种类和浓度、有 机酸、无机盐等添加物质对产量的影响；确定培养时间、接种量、p h 值等发酵条 件。通过正交试验确定本实验室保藏的耐低温木醋杆菌的培养基成分以及各因素 的最佳组合：葡萄糖2 5 9 l 、酵母浸粉5 9 l 、蛋白胨3 9 l 、柠檬酸1 2 9 l 、磷酸氢 二钠2 2 9 l 、磷酸氢二钾l g l 、乙醇6 m l l 、p h5 0 、接种量8 ，发酵周期6 d 。 经验证实验验证，优化后的培养基发酵合成细菌纤维素产量达到7 6 9 l ，与基本培 养基相比，提高了3 5 7 。 在培养基中添加海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、聚谷氨 酸等水溶性高分子物质来研究其对细菌纤维素的影响，用扫描电镜和红外光谱对 其进行表征，同时测定细菌纤维素产量、含水量、复水率等指标和厚度、硬度、 剪切力等物理性质，从实验结果得出，添加水溶性物质的改性细菌纤维素在产量、 复水率、厚度等方面都远胜于原液发酵产物，而且在电镜观察时发现其结构改变 很明显，纤维束变粗，红外光谱测试的结果显示所加物质的特征峰都有明显的加 强，其中聚谷氨酸改性的细菌纤维素在理化性质方面变化最大，说明聚谷氨酸可 以较大程度的融入纤维结构中。进而可以得出结论添加水溶性物质可以明显地提 高细菌纤维素的产量，改善细菌纤维素的性能。 关键词：细菌纤维素；低温；诱变；改性 山东轻工业学院硕士学位论文 a b s t r a c t a c e t o b a c t e rx y l i n u ms t r a i nm 1 2w h i c h p r e s e r v e di no u rl a b o r a t o r yw a st h es t a r t i n g s t r a i n , t h eo r i g i n a ls t r a i nw a st r e a t e db yu l t r a v i o l e tr a ym u t a t i o na n dl i c l 一u l t r a v i o l e tr a y c o m p o s i t em u t a t i o n , a n dt h e nu s i n gp e t r id i s ht oc u l t i v a t et h eb a c t e r i u mw h i c hh a sb e e n i n d u c e dw i t hc m cs o l i dm e d i u m , b yr e c o r d i n gt h en u m b e ro ft h ec o l o n y , w ec a nm a k e t h el e t h a lc u r v e ，o b t a i n i n gt h eb e s tm u t a t i o nd o s a g e t h ep r i m i t i v es t r a i nw a st r e a t e d u n d e rt h i sd o s a g e ，u s i n gp r e l i m i n a r ys c r e e n i n ga n ds e c o n ds c r e e n i n ga sw e l la s c o n s e c u t i v ep a s s a g ee x p e r i m e n t s ，am u t a n ts t r a i nu v 3w h i c hc o u l dr e s i s tl o w t e m p e r a t u r ea n dp r o d u c el e s sa c i da n dm o r ec e l l u l o s e ，a n dt h eo u t p u to ft h ec e l l u l o s ei s a l s os t a b l e ，t h ey i e l do ft h eb a c t e r i a lc e l l u l o s ei n c r e a s e db y2 7 2 i nc o n t r a s tw i t ht h e o r i g i n a ls t r a i n f i r s to fa l l , t h r o u g hs i n g l e - f a c t o rt e s t ，w ea n a l y z e de f f e c to fc a r b o ns o u r c ea n d c o n c e n t r a t i o n , n i t r o g e ns o u r c ea n dc o n c e n t r a t i o n ，o r g a n i ca c i d s ，i n o r g a n i cs a l t sa n d o t h e rs u b s t a n c e sa d d e di nt h em e d i u mo nt h ey i e l do fb a c t e r i a lc e l l u l o s e ，c o n f i r m e d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ss u c ha st h et r a i n i n gt i m e ，i n o c u l u ms i z ea n dp hv a l u e b y o r t h o g o n a ld e s i g no fe x p e r i m e n t ，t h em e d i u mc o n s t i t u e n t sa n dt h eb e s tc o m b i n a t i o no f v a r i o u sf a c t o r so f t h el o w t e m p e r a t u r e - a c e t o b a c t e rx y l i n u m ，w h i c hw a sp r e s e r v e di no u r l a bw e r ea s c e r t a i n e d ：g l u c o s e2 5 9 l ，y e a s te x t r a c tp o w d e r5 9 l ，p e p t o n e3 9 l ，c i t r i c a c i d1 2 9 l ，n a 2 h p 0 42 2 9 l ，k 2 h p 0 4lg l ，a l c o h o l6 m l l ，f e r m e n t a t i o nt i m e6d a y s ， f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e2 5 c ，p h5 0 ，i n o c u l u ms i z e8 t h ec o n s e c u t i v ep a s s a g e e x p e r i m e n t sh a dp r o v e dt h a tt h ep r o d u c t i o no fb a c t e r i a lc e l l u l o s ew a s7 6 9 l ，i n c r e a s e d b y3 5 7 i nc o n t r a s tw i t ht h eo r i g i n a lm e d i a t h ee f f e c to nb a c t e r i a lc e l l u l o s ew a sr e s e r c h e dt h r o u g ha p p e n d i n g0 5 ，1 0 ，1 5 ， a n d2 0 9 lw a t e r - s o l u b l ep o l y m e rm a t e r i a l ，s u c ha ss o d i u ma l g i n a t e ，m e t h y lc e l l u l o s e ， c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e ，p o l y ( v i n y la l c o h 0 1 ) a n dp o l y ( g l u t a m i ca c i d ) ，r e s p e c t i v e l y ，i n t h ec u l t u r em e d i u m , i tw a sc h a r a c t e r i z e db ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ya n di n f r a r e d s p e c t r a , t h e nw ed e t e r m i n e di t sp r o d u c t i o n , w a t e rc o n t e n t ，r e h a b i l i t a t i o no fw a t e r ，a n d o t h e ri n d i c a t o r sa sw e l la sp h y s i c a lp r o p e r t i e s ，s u c ha st h i c k n e s s ，h a r d n e s s ，s h e a rs t r e s s t h u sw ec a nc o n c l u d et h a tt h em o d i f i e db a c t e r i a lc e l l u l o s ei sm u c hb e t t e rt h a nt h e p r o d u c to ft h eo r i g i n a lc u l t u r em e d i u mi nt h ep r o d u c t i o n , r e h a b i l i t a t i o n o fw a t e r ， t h i c k n e s sa n do t h e rr e s p e c t s t h ei n v e s t i g a t i o n so fa l lk i n d so fm o d i f i e db a c t e r i a l c e l l u l o s ew i t he l e c t r o nm i c r o s c o p yi n d i c a t e dt h e i rs t r u c t u r e sc h a n g e do b v i o u s l ya n dt h e a b s t r a c t d i a m e t e ro ff i b e rb u n d l e sb e c a m eb i g g e r t h er e s u ro fi rt e s ts h o w e dt h a tt h e c h a r a c t e r i s t i c p e a k so fa d d i t i o n a l m a t e r i a lh a v ei n c r e a s e do b v i o u s l y a n dp o l y - g l u t a m a t e m o d i f i e db a c t e r i a lc e l l u l o s ec h a n g e sl a r g e s ti nt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a l p r o p e r t i e s ，w h i c hs h o w e dt h a tp o l y ( g l u t a m i ca c i d ) c a ni n t e g r a t ei n t ot h ef i b e rs t r u c t u r e i ng r e a t e rd e g r e e t h e ni tc a nb ec o n c l u d e dt h a ta d d i n gw a t e r s o l u b l ep o l y m e rm a t e r i a l c a ni m p r o v e p r o d u c t i o n o fb a c t e r i a l c e l l u l o s e s i g n i f i c a n t l y , a n di m p r o v e i t s p e r f o r m a n c e k e y w o r d s ：b a c t e r i a lc e l l u l o s e ；l o wt e m p e r a t u r e ；m u t a t i o n ；m o d i f i c a t i o n l l 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 王浑迭 日期： 学位论文知识产权权属声明 年兰月坐日 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 圣海蒸鼓 导师签名：咎 吼学年上月丝日 日期： 孕 山东轻工业学院硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 前言 纤维素是地球上最丰富的聚合物，最主要分布于植物中，是形成植物和许多 真菌、藻类细胞壁的主要成分，是由d 葡萄糖以肛1 ，4 糖苷键连接而成的链状高 分子，直链间彼此平行，不呈螺旋构象，无分支结构，又称为b 1 ，4 葡聚糖【l 】。细 菌纤维素是一种由微生物合成的超微纯纤维素，与自然界中存在的植物纤维素相 比，具有纯度高、结晶度高和重合度高，吸水性强，抗张强度好，生物适应性强， 可在自然界直接降解等独特的性质，它是以纯纤维素的形式存在，而植物纤维素 的存在形式是与半纤维素和木质素等组成三级立体结构。利用微生物发酵生产细 菌纤维素，并将其应用于食品、医药、造纸和生物医学工程等领域，具有广泛应 用前景，是当今生物材料研究的热点之一。 从1 8 8 6 年b r o w n 对木醋杆菌合成细菌纤维素作了首次报道至今已有一百多年 的历史【2 】，但由于受到实验条件的束缚，多年来一直未受到足够重视。1 9 8 0 年起， 日本和美国等发达国家则投入了大量资金对细菌纤维素的合成、生产及应用进行 了深入研究，使细菌纤维素在食品、医药、化工、造纸、高级音响设备和精纺等 方面得到广泛应用【3 】。我国在该领域的研发开展较晚，目前只有部分高等院校和研 究单位从事此项研究。市售的产品仅有海南、广东等地的工厂利用椰子水生产的 椰果罐头和果冻，而高附加值的细菌纤维素产品则完全没有，因此我们有必要加 强这方面的研究。近十几年来随着分子生物学的发展和体外无细胞体系的应用， 细菌纤维素的生物合成机制已有了很深入的研究，同时在细菌纤维素的应用方面 也有了很大进展。 1 2 细菌纤维素的特性及结构特点 1 2 1 细菌纤维素的特性 传统食醋酿造过程中，常在醋液中生成类似凝胶膜状物，称为菌膜。经分析， 此类物质与天然纤维素结构非常相似，都是由葡萄糖以b 1 ，4 一糖苷键连接而成的高 分子化合物，因其由细菌合成故命名为细菌纤维素( b a c t e r i a lc e l l u l o s e ，b c ) 与天然 纤维素相比，细菌纤维素有许多独特的性质【4 5 6 】。 结构均一性：细菌纤维素是一种纯净的纤维素，不含杂质。结晶度高、分子 取向好、结构均一并且以单一纤维存在 7 】。 极佳的抗撕拉能力和形状维持能力：用细菌纤维素制成的膜有极好形状维持 第l 章绪论 能力和抗撕拉能力其弹性模数为一般纤维的数倍至十倍以上，抗撕拉能力是同样 厚度的聚乙烯和聚氯乙烯膜的6 倍，并且抗拉强度高。细菌纤维素的杨氏模量高 达1 5xl0 9 p a ，并且细菌纤维素的机械性能与生产纤维素的发酵方式以及膜的处理 方法( 包括加热和加压) 无判引。 很强的水和能力：细菌纤维素的直径只有0 1h m ，又可无限长地合成，它的表 面积3 0 0 倍于植物纤维。因此，它就具有比植物纤维更强的亲水性、粘稠性和稳 定性。细菌纤维素能结合比自身干重大6 0 7 0 0 倍的水，而棉花或木本植物纤维要 达到这水准需要经过好多工序加以改造才能实现，其成本也因此而大幅度提高。 形状可塑性及物理性质的可调控性：细菌纤维素可以形成菌膜，并可以制成 各种形状，如制成手套状等，而且可制得很薄，还能透气透水。细菌纤维素具有 生物合成时物理性能的可调控性，即可以通过调节培养条件得到各种性质不同的 纤维素。如木醋杆菌能以葡萄糖及乙酰葡糖胺合成n 一乙酰氨基葡萄糖，并以4 的质量比例把n 乙酰氨基葡萄糖联接在细菌纤维素中【9 1 。 良好的生物相容性：细菌纤维素具有较高的生物适应性，并且在自然界可直 接降解，不污染环境【1 0 1 。 1 2 2 细菌纤维素的结构特点 细菌纤维素是由吡喃葡萄糖单体以1 3 1 ，4 一糖苷键连接而成的直链多糖，相 邻的吡喃葡萄糖的6 个碳原子不在一个平面上，而是呈稳定的椅式立体结构，见 图1 1 ，几个邻近的1 3 1 ，4 葡聚糖链在分子内或分子间氢键的作用下形成不溶于水 的高分子聚合物。 图1 1 细菌纤维素的椅式结构 早在二十世纪四十年代，人们就用电镜观察到细菌纤维素由束状纤维组成， 这种束状纤维的宽度约为l o o n m ，厚度为3 - 8 n m ，每一束由许多微纤维组成i 1 1 】。 细菌纤维素的大小与植物纤维、人工合成纤维相比有很大的差异，其大小仅为人 工合成纤维的1 1 0 。 天然纤维素有两种不同晶体结构组成，纤维素1 0 【和纤维素i b 。纤维素1 0 【属于 三斜晶系( t r i c l i n i cc r y t a l s ) ，它的密度略小于纤维素i b ，而且经湿热处理后，纤维素 1 0 【会不可逆的转化为纤维素i p ，纤维素i d 属于单斜晶系( m o n o c l i n i cc r y s t a l s ) ，由 此可见，纤维素i a 是亚稳态结构，其稳定性逊于纤维素1 8 。在细菌纤维素中，纤 2 山东轻工业学院硕士学位论文 维素i a 为主要成分( 近6 0 ) ，而在其它来源的天然纤维中，纤维素i a 含量只占约 3 0 ，因此细菌纤维素与棉和麻的纤维素相比，对纤维素酶更敏感【1 2 】。但是细菌 纤维素的晶体结构与其特殊性之间的关系目前尚不清楚【1 3 】。不同的发酵条件所得 到的细菌纤维素的晶体也有所不同。振荡培养时得到的细菌纤维素，其纤维素i 的比例低于静止培养时得到的纤维素。 1 3 细菌纤维素生产菌株的筛选和选育 据文献【1 4 】报道，细菌纤维素是由醋杆菌属( a c e t o b a c t e r ) 、无色杆菌属 ( a c h r o m o b a c t e r ) 、气杆菌属( a e r o b a c t e r ) 、土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) 、产碱杆菌 属( a l c a l i g e n e s ) 、假单胞杆菌属( p s e u d o m o n a s ) 、根瘤菌属( r h i z o b i u m ) 叠球菌属 ( s a r c i n a ) 、动胶菌属( z o o g l o e a ) 等中的微生物合成的。尽管对于大多数细菌纤维素 产生菌来说，纤维素的生物合成途径及其调节机制是相同的，但纤维素的大分子 结构却依赖于其产生菌，其中木醋杆菌是最早发现也是研究较为透彻的纤维素产 生菌株，是目前已知合成纤维素能力最强的菌株，被确认为研究纤维素生物合成 过程和机制的模式菌株，根据产纤维素菌株的特性，可在腐败的水果、蔬菜、醋 及发酵饮料中进行样品采集并加以富集筛选出产纤维素菌，进而进行传统的驯化 ( 如紫外诱变法、化学诱变法、质子自杀法) 或者用基因工程方法加以改良，以期获 得优良菌株。 1 3 1 细菌纤维素菌株的分离和改良 国内产b c 菌株选育主要是从天然资源中分离纤维素产生菌，然后通过传统的 驯化方法改良。 刘四新等【1 5 , 1 6 】从表面长膜的变酸黄酒中分离到菌株w 3 9 ，初步鉴定为醋酸杆 菌属，以7 0 9 l 蔗糖为碳源在椰子水中浅盘培养1 6 d 获18 2 9 l 的纤维素( 湿重) 。 余晓斌等【1 7 】以木醋杆菌为出发菌株，通过紫外诱变方法获得一株产酸减少， 纤维素产量提高且稳定的菌株u v 3 ，纤维素产量由6 9 l ( 干重) 提高到l o g l ( 干重) 。 马承铸【1 8 】从1 5 0 份自然材料中分离出2 株高产纤维素菌：a x i 和a x _ i i ，经初 步鉴定分别为巴氏醋杆菌木醋亚种( a c e t o b a c t e rp a s t e u t i n u ss u b s p x y l i n u m ) 和汉森醋 杆菌( a c e t o b a c t e rh a n s e n i i ) ，这两株菌在2 8 。c 以5 0 l 蔗糖( 或葡萄糖) 为碳源，静 置培养4 5 d 产1 4 l 或1 6 9 l 干细菌纤维素。 熊强等【l9 】从1 6 0 份国产和进口水果样品中分离出产量高且生产性能稳定的菌 株f 一9 9 ，经鉴定为葡萄杆菌属的一个种( g l u c o n o b a c t e rs p ) 。 齐香君【2 0 】从水果样中分离到q a x 0 2 1 9 # ，3 0 c 静置培养产2 1 3 9 l 干细菌纤维 素。 采用基因工程法改良纤维素产生菌在国内开展较少，凌云【2 1 】构建了用于 第l 章绪论 x w s 0 5 菌株的葡萄糖脱氢酶基因缺失体敲除的重组质粒p l g k m ，但并未获得真正 的基因构建菌。 国外除采用传统驯化选育外，还采用基因工程方法改良获得优良菌株。目前 参与纤维素生物合成调节的8 个蛋白中，除焦磷酸化酶和纤维素合成酶外，鸟苷 酸环化酶、p d e a 及p d e b 、b c s a 、b c s b 、b c s c 、b c s d 都己经得到，每个蛋白 都可通过基因工程的方法获得高水平或低水平的表达，因此通过定向遗传操作， 可获得高产细菌纤维素菌株【2 2 1 ，日本在这方面研究较多，结果可观。 1 3 2 传统的选育方法 t o y o s a k i 等 2 3 】从大量果实和花中分离到一株能在搅拌培养条件下有效合成细 菌纤维素的a c e t o b a c t e rx y l i n u ms u b s p s u e n t a n sb p r 2 0 0 1 ，在带有倾斜挡板的摇瓶 和3 l 发酵罐中分别产细菌纤维素4 4 l 和7 7 9 l 。 由于对氨基苯甲酸能促进a c e t o b a c t e rx y l i n u ms u b s p s u c r o f e r m e n t a n sb p r 2 0 0 1 的生长，因此为进一步提高纤维素产量，i s h i k a w a 等【2 4 】尝试采用n 甲基n 硝基n 亚硝基胍诱变，选育出磺胺胍( 对氨基苯甲酸的结构类似物) 抗性突变菌株 b p r 3 0 0 1 e 产纤维素9 7 9 l ，超出出发菌株产量的4 0 。 由于在葡萄糖培养基中葡萄糖易被氧化成葡萄糖酸，使p h 降低，抑制菌种生 长和产纤维素，为此v a n d a m m e 等采用了质子自杀法即一种含有n a b r 和n a b r 0 3 ( 摩 尔比为5 ：1 ) 的琼脂培养基，利用在酸性条件下b r 。和b r 0 3 结合会释放出对细胞有毒 的b r 2 ，实现将不产酸的突变株和产酸的菌株加以分离的原理，成功分离出 a x y l i n u mk j 3 3 ，产纤维素量是出发菌株的两倍2 5 1 ；而s e t 等【2 6 】采用蔗糖玉米浆为 筛选培养基，从3 4 6 份自然材料( 水果、花、坚果、土壤、活性污泥和醋厂) 中分离 出4 株菌，这些菌摇瓶振荡培养产8 0 9 l 一9 7 9 l 细菌纤维素，比b p r 2 0 0 1 ( 1 8 9 l ) 高许多；而在果糖玉米浆培养基中摇瓶振荡培养产2 1 l 3 1 9 l 细菌纤维素， b p r 2 0 0 1 为0 9 9 l ，此外p h 不降，说明这些菌株具有较低的氧化葡萄糖能力。 1 3 3 基因工程法改良 表达编码非木醋杆菌的各种糖酶的基因，能扩大可利用碳源的范围，降低生 产成本，提高细菌纤维素产量。构建木醋杆菌b p r 2 0 0 1 葡萄糖脱氢酶缺失的变异 菌( g d i ) ，其不产葡萄糖酸，采用葡萄糖为碳源时产b c4 。1 l ，是野生菌种的1 7 倍，采用红薯浆酶水解液作碳源产5 0 9 l ，当添加乙醇能进一步增加纤维素产量至 7 0 9 l ，与b p r 2 0 0 1 用果糖作碳源产纤维素的量相刚2 7 】；而s e t y a w a t i 等将 v i t r e o s c i l l a h e m o g l o b i n ( v h b ) 在木醋杆菌中进行表达，可提高静置纤维素膜产量， 当减小氧气分压时可提高纤维素产量7 0 ，该表达菌在4 l 罐中得到稳定放大。 b a k a i 等【2 9 】构建了一株o r f 2 基因缺失的突变菌株m 2 2 ，o r f 2 基因位于纤维 素合成酶( b c s ) 操纵子上游，该菌株菌落形态与出发菌株a c e t o b a c t e rx y l i n u m 4 山东轻工业学院硕士学位论文 b p r 2 0 0 1 不同，所获得的纤维素是纤维素i 、纤维素i i 和无定形纤维素的混合物， 而采用含o r f 2 基因的质粒p s a - o r f 2 k 重构( c o m p l e m e n t ) 的突变株所产的纤维素 却与出发菌株a c e t o b a c t e r x y l i n u mb p r 2 0 0 1 结构相同，均为纤维素i ，这说明o r f 2 基因参与纤维素i 微纤维的生产和结晶。 b a e 等【3 0 】在产细菌纤维素的a c e t o b a c t e r x y l i n u mb p r 2 0 0 1 菌株中克隆了一段二 鸟苷酸环化酶( d g c l ) 基因，构建了一株d g c l 基因缺失的突变菌株d d ，与 a c e t o b a c t e rx y b n u mb p r 2 0 0 1 比较发现：d d 静置培养和摇瓶振荡培养获得的细菌 纤维素产量与a c e t o b a c t e r x y l i n u mb p r 2 0 0 1 几乎一致，但在发酵罐中却提高3 6 ， 这是由于d d 随机的结构特征使得在发酵罐中培养不会发生纤维素团聚，而产生 更均匀的悬浮颗粒，此外两种菌的纤维素丝带装配过程由于细菌纤维素形成机制 和超微结构的差异也不同。 1 3 4 耐低温菌种的选育进展 目前国内对细菌纤维素的应用在食品方面比较突出，其中广东、海南等地食 品厂以椰汁为原料生产细菌纤维素，制成“椰果”系列产品，口感爽滑，有减肥 效果，受到广大消费者的欢迎，企业的生产方法主要是通过浅盘静置培养的方式， 由于气候方面的影响，这种生产方式在夏秋季节能达到良好的效果，但在春东季 节则需要对室温进行控制，这增加了企业的生产成本，因此选育一株耐低温的高 产菌株对降低企业生产成本，提高细菌纤维素产量有重要意义，目前国内外还未 见这方面的报道。 1 4 细菌纤维素的生物合成 纤维素的发现己有一百多年的历史，对细菌纤维素生物合成的研究一直局限 于生理和形态学范畴，进展十分缓慢，直到近十几年来随着分子生物学的发展和 体外无细胞体系的应用和纤维素合成酶的纯化以及纤维素生物合成调节系统的发 现，大大加速了纤维素生物合成机制的研搿弘】。 1 4 1 细菌纤维素的生物合成途径 木醋杆菌纤维素合成机制研究比较透彻。其生物合成主要分为四个步骤：( 1 ) 在葡萄糖激酶的作用下将葡萄糖转化为6 磷酸葡萄糖；( 2 ) 在异构酶作用下将6 一磷 酸葡萄糖转化为1 一磷酸葡萄糖；( 3 ) 在u d p g 焦化磷酸酶作用下由1 磷酸葡萄糖生 成尿苷葡萄糖；( 4 ) 最后在纤维素合成酶作用下由尿苷葡萄糖合成p 1 ，4 糖苷链， 再装配形成纤维素【3 2 1 。 第1 章绪论 c e l l u l o s e c 。e ，l n l 。u h l 8 0 。s e e f s y n t h 8 s ei udpg蕊pyro油ph卜os幽ory|ase ruc。s8 一 i l ( i s u c r o s e 厂一 2 一如乇o g l u 舱t e 7ru磊!了。se叶gl“丁e 葡萄糖 柠檬酸 p h 蛋白胨 磷酸氢二钠= 接种量 乙醇 磷酸氢二钾。 3 4 4 验证实验 ( 1 ) 纤维素产量测定结果 基本培养基发酵生产的细菌纤维素产量为5 6 9 l ，优化培养基发酵生的细菌纤 4 2 山东轻工业学院硕士学位论文 维素产量为7 6 9 l ，提高了3 5 7 。 ( 2 ) 残糖测定结果 表3 5 残糖实验结果 由以上实验可知优化后的发酵培养基的糖利用率明显高于基本发酵培养基， 达到优化目的。 ( 3 ) p n 测定结果 分别测定各发酵残液的p n 值并计算p h 值的变化。结果如表3 6 所示。 表3 6 发酵液p r i 值测定结果 优化培养基的p n 值变化较基本培养基小，且其变化的绝对值也较小。故可以 说明该发酵培养基产酸少，有利于产细菌纤维素，达到了优化的目的。 3 5 本章小结 通过单因素法探讨了培养基成分和发酵条件对细菌纤维素产量的影响，确定 了能够获得较高纤维素产量的培养条件为：种龄2 4 h ，接种量8 ，初始p h 值为 6 0 ，培养周期为6 d ；通过正交试验确定了紫外诱变得到的耐低温木醋杆菌u v 3 静态发酵生产细菌纤维素的生产条件是：葡萄糖2 5 l 、酵母浸粉5 9 l 、蛋白胨 3 9 l 、柠檬酸1 2 9 l 、磷酸氢二钠2 2 l 、磷酸氢二钾l g l 、乙醇6 m l l 、p h5 0 、 接种量8 ，发酵周期6 d 。通过验证实验可知优化后的培养基细菌纤维素产量达 到7 6 9 l 与基本培养基相比提高了3 5 7 。 4 3 山东轻工业学院硕士学位论文 第4 章改性细菌纤维素的发酵生产及性能测定 4 1 前言 因细菌纤维素是在微生物发酵过程中逐渐形成的，易于在合成过程改变条件 进行调控。可通过在培养基中添加水溶性高分子化合物制成改性细菌纤维素。 t o k u r as e i i c h i 等在醋酸菌发酵制备细菌纤维素培养基中加入羧甲基纤维素或羧甲 基壳聚糖获得一定取代度的羧甲基细菌纤维素，制备产物具有较好的离子交换能 力，与原来的非细菌纤维素制备的羧甲基纤维素和细菌纤维素相比，其对铅和铀 酰离子有特殊的吸附能力。有人通过实验并证实了碳环上c 2 对其功能的贡献。 后来t a j i m ak e 坷i 研究发现培养基中部分水溶性的羧甲基纤维素的存在也有利于提 高细菌纤维素的产量。本课题选用海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙 烯醇和聚谷氨酸作为改性物质。目的是使得到的产物能够获得高产量、高含水量、 强韧性、高金属离子吸附强度等优良性状，以扩大细菌纤维素的应用范围。 4 2 实验材料 4 2 1 菌种 木醋杆菌m 12 ( a c e t o b a c t e rx y l i n u m ) ， 4 2 2 实验试剂 海藻酸钠 聚乙烯醇 甲基纤维素 本实验室保藏。 羧甲基纤维素钠 聚谷氨酸 其它见2 2 2 。 4 2 3 实验仪器 f r e e z o n6 型真空冷冻升华干燥机 i r p r e s t i g e - 21 傅立叶红外光谱仪 n b l x 4 0 0 b 型组织捣碎机 t d l 5 a 离心机 z h d 4 型纸张厚度计测定仪 t a x t p l u se x p o n e n t 3 2 型物性测定仪 其它见2 2 3 。 4 5 中国永嘉精细化工二厂 天津市化学试剂三厂 天津市科密欧化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 l a b c o n c oc o r p o r a t i o n 日本岛津公司 上海精密仪器有限公司 上海安亭科学仪器厂 长春市第一材料试验机厂 s t a b l em i c r os y s t e m s 第4 章改性细菌纤维素的发酵生产及性能测定 4 2 4 培养基 见2 2 4 。 4 3 改性细菌纤维素的发酵生产 改性细菌纤维素的生产主要是通过在培养基中添加各种不同量的水溶性化合 物来实现的，本次实验探究了o 5 9 l 、1 0 9 l 、1 5 9 l 、2 0 9 l 浓度的海藻酸钠( a s ) 、 甲基纤维素( m c ) 、羧甲基纤维素( c m c ) 、聚乙烯醇( p v a ) 、聚谷氨酸( p g a ) 添加到 发酵培养基中对木醋杆菌生产的细菌纤维素的改性效果。 4 3 1 改性培养基的配制 在木醋杆菌发酵培养基中，分别添加海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素、 聚乙烯醇、聚谷氨酸制成五种不同的改性发酵培养基，因此我们选择添加o 5 e d l 、 1 0 9 l 、1 5 9 l 、2 0 e d l 四个梯度上述水溶性化合物，以便确定合适的添加浓度。灭 菌待用【6 l 】。 4 3 2 细菌纤维素的发酵生产 ( 1 ) 菌种活化 将冰箱中保存的原始菌种取合适量转接到新的斜面上，3 0 c 恒温培养2 4 h ，达 到菌种活化的目的。 ( 2 ) 液体种子的制备 配制种子培养基，将活化好的菌种取适量转接入种子培养基，放入摇床中于 3 0 下以1 6 0 r r a i n 的转速培养2 4 h 。 ( 3 ) 细菌纤维素的发酵 以8 的浓度将种子接入发酵培养基中，接种时充分振荡以释放出菌体，以保 证菌种在发酵培养基中均匀分布，使产生的纤维素膜厚度均匀，3 0 恒温静置培 养6 d 。 4 3 3 纤维素膜的提取处理 ( 1 ) 湿膜处理 将细菌纤维素膜取出后，用水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜 浸泡于4 的n a o h 溶液中，1 0 0 煮沸2 0 m i n ，去除液膜中的菌体和残留培养基， 膜呈乳白色半透明。然后用蒸馏水多次冲洗，用p h 试纸轻压膜测p h 值为7 2 。 ( 2 ) 冷冻干燥处理 经以上处理后的湿膜先放入冰箱冷冻后，再放入f r e e z o n 6 型真空冷冻升华干燥 机中于一5 0 ，2 0 p a 压, 力下干燥1 2 1 6 h 后即成为冷冻干燥样品。 山东轻工业学院硕士学位论文 4 4 改性细菌纤维素的性能测定 4 4 1 产量测定 将处理过的纤维素湿膜，在8 0 。c 恒温下，干燥至恒重，产量以干膜重量为准。 4 4 2 含水量的测定 将提取处理后的纤维素湿膜经4 2 0 0 r m i n 离- 1 二, 2 0 m i n 后取出，所得膜定义为细菌 纤维素湿膜( m w d ) ，将膜置于6 0 8 0 。c 烘干至恒重，所得膜定义为细菌纤维素干膜 ( m d r y ) 。用电子天平对细菌纤维素精确称重。按公式： 细菌纤维素湿膜含水率( ) =m w e t 一m d q 1 0 0 m 删 ( 4 1 ) 可计算得各纤维素膜的含水量。 4 4 3 扫描电镜观察 细菌纤维素按4 3 3 中的方法处理后，制成冷冻干燥样品，先对样品进行喷金 镀膜，然后使用扫描电子显微镜观察其微纤维结构。 4 4 4 红外光谱测试 将处理过的细菌纤维素湿膜切碎，先利用组织捣碎机将样品打碎，再用高压 匀质机匀质l o m i n ，然后进行冷冻干燥，制成细菌纤维素粉末。取2 0 0 m g 样品与k b r 研磨，做成切片，再用i r p r e s t i g e - 2 1 型红外光谱仪测试。 4 4 5 物理性质的测定 使用z h d 4 型纸张厚度测定仪测定细菌纤维素膜的厚度，采用t a - x t p l u s 型 物性仪，使用p 5 碳头测定细菌纤维素膜的硬度，使用a c k b 碳头测定细菌纤维素膜 的剪切力。 4 4 6 冷冻干燥样品的复水率 取冷冻干燥样品放入l o o m l 蒸馏水中，使用磁力搅拌器搅拌2 h 后取出， 4 2 0 0 r m i n 离，1 二, 1 5 m i n 后称量得溶胀质量，然后放入8 0 。c 烘箱内干燥至恒重，称其质 量为干燥质量，按公式4 2 计算其复水率： 复水率( ) = 鲨篆君堕1 0 。 ( 4 2 ) 4 7 第4 章改性细菌纤维素的发酵生产及性能测定 4 5 结果与讨论 4 5 1 改性细菌纤维素的产量 毫 例 h - 雠 爨 妊 坦 最 00 5l1 522 5 水溶性物质添加量( g l ) 图4 1 细菌纤维素产量 + b c a s 一b c m c + b c p v a * _ b c p g a 一b c c m c 由图4 1 可知，在培养基中加入海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素和聚谷 氨酸生产的改性细菌纤维素在产量上都比普通的纤维素有所提高，其中以聚谷氨 酸改性的细菌纤维素( b c p g a ) 产量提高的最多，且在以1 5 9 l 的浓度加入时产量 最高，之后随添加浓度的提高而逐渐下降，可能是由于随添加浓度的加大，致使 培养基变粘稠，使溶氧率降低，影响菌体生长造成的。b c m c 、b c c m c 、b c a s 在0 5 9 l 、1 0 9 l 、1 5 9 l 、2 0 9 l 各浓度梯度上产量没有太大的变化趋势，其中 b c m c 和b c c m c 以1 5 9 l 时较高，b c a s 以1 0 9 l 时稍高。b c p v a 与标准细菌纤 维素的产量基本没有差别，且各浓度的产量变化也没有明显规律。各添加物的最 大产量出现在不同浓度值，这与添加物的物理性质有关。 4 8 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ( 山东轻r n 学院顾十学位论文 452 改性细菌纤维素的含水量 9 9 9 8 5 9 8 专9 75 篁 差9 7 9 65 9 6 9 55 0 05 1 , 01 52 , 0 水溶性化合物添加蕾( g 圈4 2 细菌纤维素含水量 b c 1 3 b c a s d b cp g a b c m c 日b c p v a b c c m c 细菌纤维素具有非常高的含水量，这是因为细菌纤维素含有大量羟基，水是 细菌纤维素一种强的润涨荆，水分子可以渗透到细菌纤维素非晶区表面，造成纤 维素链间氢键的断裂，并与纤维素分子形成新的氢键；另外细菌纤维素是由木醋 杆菌细胞外分泌到液体培养基中，而又大量聚集在一起形成的，以这种形式形成 的膜会包裹大量的水分；还有就是细菌纤维素具有纳米级结构，膜的组织间隙的 表面积很大，可以吸收大量的水分。正因为细菌纤维素的这些特性，添加水溶性 化台物可进一步提高细菌纤维素的含水量。由图4 2 可知，各改性细菌纤维素的含 水量都比原纤维素有不同程度的提高。其中，以b c - c m c 的提高最为明显，当添加 浓度为10 9 l 时最高可达9 85 8 。其次b c - p g a 当添加浓度为! 5 9 l 时含水量可选 9 81 ，b c - a s 在05 9 ，l 时达9 78 1 ，b c - m c 在20 9 l 时达9 75 5 ，b c p v a 的含水 最增加不明显，但也有一定增加，且基本符合同一变化趋势即随添加浓度增大 先升高到一虽大值后再逐渐下降。 第4 口艘性细茼! r 绯柰的笈醉生p 厦忡能删，z 4 53 改性细菌纤维素的扫描电镜观察 b c m c ( 10 9 l )b c p g a ( 10 9 e l ) 幽43 嫂性细曲纤维索电锐照片 由图43 可知，改性细菌纤维索与原细菌纤维素相比，微纤维结构发生了明显 的变化，纤维之间的孔径变大，由原先致密的网状结构变得松散且不规则，更有 利于水分子的进入和保持，所以现在认为这些结构的变化可能是使改性纤维素的 含水量增加的