分子生物学讲义 中山大学

重组与转座（recombination and transposition）1. 重组的类型n 同源重组（homologous recombination）n 位点专一重组（site-specific recombination）n 转座（transposition），又称异常重组（illegitimate recombination2. 同源重组（1）同源重组的形式n 常发生在同源染色体之间（分子间重组），也可发生在同一DNA分子内（分子内重组）2）Holliday 模型n 说明同源重组的一个经典模型，基于重组过程中有十字形的中间产物（3）RecBCD重组途径n 存于E. coli中，需要RecBCD蛋白（RecBCD protein，recB、recC、recD基因的产物）的参与n RecA 38 kD 的蛋白质，具多种功能，其中一种就是在重组中促进同源DNA单链的交换（主要是一单链与一双链中的同源单链交换）；交换过程需ATPn RecBCD 一种具多功能的酶依赖于DNA的ATPase（水解ATP，为DNA的解螺旋提供能量）DNA nuclease，可作用于单链或双链DNA，切割位点（GCTGGTGG） (chi): crossover hotspot instigatorDNA helicase活性 RecBCD的切点与底物（序列）有关，可在位点3端4 6 ntn RuvA和RuvB两者均具DNA helicase活性（RuvB还有ATPase活性），且两者一起才能与DNA很好地结合（RuvA先结合，然后RuvB才能结合）它们专门与Holliday junction这样一种结构结合，促使branch migration发生RuvA和RuvB与Holliday junction的结合位置十分特异n RuvC 解开Holliday junction所需的一种核酸酶，能特异地与Holliday junction结合，并在特异位点切开Holliday junctionRuvC是二聚体，有2个活性位点，因此能切开Holliday junction中的两条链切割位点必须有特异的序列，因此，必须通过branch migration到达特异序列后， RuvC才能起作用（Holliday junction两种解开方式的相对多寡取决于两对同源单链上所具有的RuvC切割位点的相对多寡）（4）减数分裂重组（meiotic recombination）真核生物中常见的重组，与细菌中的重组有不少相似之处，但在起始的步骤有较大的差异（有DNA双链断裂，double-stranded DNA break）（5）基因转换（gene conversion）多见于真核生物当两相似的序列（等位基因、非等位基因均可）靠在一起时，就有可能发生基因转换，即一DNA序列转换成另一相似的序列基因转换的机制是基于重组，即先交换一段DNA序列，然后进行修复，就会使某一序列的比例增加3. 位点专一重组（1）l噬菌体的整合与切除l噬菌体整合到宿主基因组需整合酶（Int，l的int基因编码）及宿主蛋白IHF，并通过同源区域attP（l）与attB（宿主）的重组而达成l噬菌体从宿主基因组切除需整合酶（Int）、Xis（l的xis基因编码）及IHF，是整合的逆过程附着（整合）位点（att sites） attP与attB只在它们的中间区域有一小段同源序列（15 bp，称为O）；attP的必需序列从152到+82（以O的中点为0），而attB只需25 bp左右的序列（包括中间的O）4. 转座（1）细菌转座子n 插入序列（insertion sequences，IS）最简单的转座子，只含有转座所必需的元件：两端有反向重复序列（inverted repeats, 15 25 bp），中间有编码转座所需的酶的基因（至少有2个，编码转座酶，即transposase）插入序列在转座时，其插入位点两旁会产生一小段正向重复（direct repeats）带有抗生素抗性基因的转座子 除了必要的转座元件外，还含有抗生素抗性基因，能赋予其携带者某种抗性n 转座的机制复制性转座（replicative transposition） 转座过程有DNA复制，结果一个转座子留在原位，另一个插入到新的位点保守性转座（conservative transposition） 转座子离开原位置，插入到新的位点；这种转座又称非复制性转座（nonreplicative transposition ）（2）真核生物的转座子n 玉米的Ds（dissociation）和Ac（activator） 最早发现（1940s）的转座子，与某些品种的玉米种子上的色斑变化有关（玉米种子的颜色由C基因编码的因子造成；若C基因突变，就没有色素产生，种子几乎白色；若部分细胞产生回复突变，就会在种子上形成颜色斑点）n 玉米的Ds（dissociation）和Ac（activator）Ac能自行转座，而Ds必须要有Ac的帮助才能转座Ac 或Ds插入到功能基因中，就会使该基因失活n Ds和Ac结构Ac与细菌的转座子相似，约4500 bp，两端有反向重复序列，中部含有转座酶基因Ds是Ac的衍生物（功能不全，不能自主转座），有Ds-a、Ds-b、Ds-c 3种n 反转录转座子（retrotransposons） 以RNA作为中介进行复制（转座），与反转录病毒（retroviruses）的复制相似，含有编码反转录酶的基因，能进行反转录；酵母中的Ty（transposon yeast）、果蝇中的copia等反转录转座子的两端有LTRs（long terminal repeats）原核生物的基因转录及表达调控1. 转录机器（装置）（transcription apparatus）（1）RNA聚合酶（RNA polymerase）n a（40 kD）n b（150 kD）， b（160 kD）n s（70 kD）：specificity factorn 核心酶（core enzyme）：b， b，2 an 全酶（holoenzyme）： b， b，2 a，s（2）启动子（promoter）n 聚合酶的结合位点（binding site），一般位于转录起始位点上游n RNA聚合酶与启动子的结合 （RNA polymerase/promoter binding） Closed promoter complex Open promoter complex，转录才能开始n Promoter structure 共同序列（consensus sequence）Pribnow box (-10 box, David Pribnow发现)-35 box（-10 box与-35 box的最佳距离为17 1 bp）n 下调突变（down mutation）n 上调突变（up mutation）n Promoter structure 强启动子还有一些额外的元件，如E. coli编码rRNA的rrn gene中的UP element（上游元件），可提高表达数十倍（3）转录起始（transcription initiation）Four steps:n Formation of a closed promoter complexn Conversion of the closed promoter complex to an open promoter complexn Polymerizing the first few nucleotides (up to 10) while the polymerase remain at the promotern Promoter clearance （4）延伸（elongation）n 核心酶起极其重要的作用，b亚基参与转录出的RNA的磷酸二酯键的形成n 转录的拓扑学：两种假说RNA polymerase 及新合成的RNA都围绕DNA旋转RNA polymerase前后的DNA反向旋转 第二种假说有较多的依据：拓扑异构酶（topoisomerase）的存在（5）转录终止（termination of transcription）n 聚合酶到达终止子（terminator）就会从模板上脱落n 终止子有两种（终止方式也有两种）intrinsic (r-independent) terminator (termination)r-dependent terminator (termination)n r-independent termination 较为简单，一段反向重复序列（inverted repeat）与一富含T的区域（T-rich region in the nontemplate strand）即为终止信号终止子只有一段反向重复序列（能形成hairpin结构）r是一种蛋白质（6聚体），可使RNA聚合酶的转录能力大大下降（具RNA-DNA解螺旋酶的作用，能解开转录复合体中RNA-DNA双链）2. 基因表达调控 原核生物基因表达的调控主要以操纵子（operon）的方式进行 Operon: A group of contiguous, coordinately controlled genes（1）乳糖操纵子（the lac operon）n lacZ: b-半乳糖苷酶（ b- galactosidase）基因n lacY: 半乳糖苷透过酶（galactoside permease）基因n lacA: 半乳糖苷乙酰基转移酶（ galactoside transacetylase）基因n lacI: 调节基因（regulatory gene）n Operator: 操纵区n Repressor: 阻遏子（阻遏物）n Inducer: 诱导物（异构乳糖，allolactose）（2）操纵子的发现n 发现过程b-半乳糖苷酶可被诱导（Monod, 1940s）半乳糖苷透过酶与b-半乳糖苷酶一起被诱导出来 （发现一种不能产生半乳糖苷透过酶的突变体）发现半乳糖苷乙酰基转移酶也是同时被诱导出来发现一种组成型突变体（constitutive mutants）构建局部（部分）二倍体（merodiploid，带有野生型与组成型突变的等位基因），进行“ PaJaMo”系列实验（Arthur Pardee, Jacob, Monod），发现乳糖代谢基本调控规律n 研究局部（部分）二倍体所得出的发现野生型（可被诱导型）等位基因是显性的，说明野生型等位基因能产生某种物质，使得与乳糖代谢有关的基因处于关闭状态，而在被诱导后才表达推测有一种可称为阻遏物（repressor）的物质存在；组成型突变体则是产生阻遏物的基因有缺陷既然有repressor，就应该有与repressor结合的DNA序列（operator）；若operator有突变，不能与repressor结合，则是一种显性的组成型突变体n 结论 通过阻遏基因（阻遏物）与操纵区，lacZ、lacY、lacA这3个结构基因是一起被调控的，它们组成了一个操纵子（the lac operon）后来的研究证实了Jacob与Monod的预言，并使操纵子的慨念进一步完善（3）阻遏的机制 两种假说n 聚合酶与阻遏物可一起结合在lac operon的启动子区，阻遏物的作用只是阻止转录从起始状态进入延伸状态n 阻遏物的作用是不让RNA聚合酶进入lac operon的启动子（得到最新实验数据的支持）（4）乳糖操纵子的正调控 n 阻遏物的调控是负调控，乳糖操纵子的调控还需正调控因子n 代谢物阻遏效应（catabolite repression）n cAMP在细胞中的浓度与葡萄糖的含量成反比，它与一种称为代谢物激活蛋白（catabolite activator protein，又称CAP，另一称呼是环腺苷酸受体蛋白：cAMP receptor protein，CRP）一起，起到正调控作用。因此，起正调控作用的是CAP-cAMPn 乳糖操纵子的启动子实际上是一种弱启动子，其 -35 box与原核启动子相应的共同序列相差甚大，因此才需要CAP-cAMP进行正调控；如果是强启动子（与共同序列十分相近），则不需要正调控，但这种情况会使得即使葡萄糖存在，乳糖操纵子也一样运作。（5）CAP的作用机制 n 通过对有关突变体进行分析，发现CAP-cAMP的结合位点在启动子的上游（与启动子紧密相邻），该位点称为激活物位点（activator site）。 CAP-cAMP结合到激活物位点后，就会促进RNA聚合酶与DNA形成open promoter complex（ CAP-cAMP 能加快closed promoter complex的形成，从而提供了更多形成open promoter complex 的机会），结果是促进转录。6）阿拉伯糖操纵子（the ara operon）n 像乳糖操纵子那样，也是一种有代谢物阻遏效应的操纵子n the ara operon 又称the araCBAD operon，即有控制基因C和结构基因B、A、D（编码阿拉伯糖代谢所需的酶）n 独特之处两个ara 操纵区： araO1和araO2，前者调控控制基因araC 的转录，后者控制启动子PBAD（在PBAD上游265与294 bp之间）CAP（catabolite activator protein）结合位点在ara 启动子（PBAD）的上游约200 bp处n araC 的自我调节（autoregulation） araO1起作用：当AraC（araC 的产物）含量升高，便与araO1结合，阻止进一步转录araC ，以免产生过多的AraC（7）色氨酸操纵子（the trp operon） n 合成代谢的操纵子，所编码的酶能把色氨酸前体分枝酸（chorismic acid）转化为色氨酸。色氨酸浓度高，则关闭；色氨酸浓度低，则开启n 具弱化子（attenuator），无CAP-cAMP调控n 色氨酸操纵子有5个结构基因（EDCBA）及1个调节基因（R）n 启动子（trpP）与操纵区（trpO）在结构基因的上游，且操纵区完全在启动子里面n 在调控中，色氨酸的作用是帮助阻遏物结合到操纵区，从而使操纵子关闭n 弱化作用（attenuation） 在阻遏作用的基础上（色氨酸操纵子的阻遏作用较弱），能再降低转录水平10 倍前导区与弱化子转录物的第一种较稳定的结构有一终止子（r-independent terminator），能使弱化作用发生，转录终止转录物的第二种较不稳定的结构没有终止子，转录能继续色氨酸的多寡决定形成哪一种结构（在转录与翻译偶联的情况下）n 在细菌中，当色氨酸操纵子的前导区转录后，翻译就开始n 核糖体到达色氨酸密码子色氨酸缺乏，核糖体不能前进，翻译受阻，前导区与弱化子转录物只能形成第二种结构；结构基因能转录色氨酸充足，前导肽的翻译能顺利完成，前导区与弱化子转录物能形成第一种较稳定的结构，导致弱化作用发生n 调控能达成的必要条件转录与翻译偶联，且速率大致相等每个结构基因的转录产物都有其起始密码子，核糖体从各个基因的mRNA的起始信号（密码子）开始翻译，即结构基因的翻译与前导序列的翻译无关n 细菌能符合这样的要求，说明其体系中各组分的协调性3. 基因表达调控的重大变化（1）宿主RNA聚合酶的变化 n 主要由s因子的改变引起n 枯草杆菌（Bacillus subtilis）被其噬菌体SPO1入侵后的情况SPO1早期基因（early genes）的表达用宿主本身的RNA聚合酶，仍可有很多宿主基因表达SPO1中期基因（middle genes）的表达宿主中基本上只有噬菌体的基因在表达SPO1后期基因（late genes）的表达（2）T7噬菌体编码的RNA聚合酶n T7基因的转录分3个阶段（在宿主E. coli中）Class I（共5个基因，其中一个编码一种噬菌体专一的RNA聚合酶）Class IIClass IIIn 先由宿主的RNA聚合酶，然后由T7自己的RNA聚合酶来达成3个阶段的转录（3）芽孢形成过程的转录控制（枯草杆菌）n 通过变换RNA聚合酶的s因子而达成每种s因子所识别的启动子都各不相同n 从营养（植物性）生长到产生内生孢子（芽孢）需关闭很多营养生长期的基因，并开启专门用于芽孢形成的基因n 营养生长期RNA聚合酶的s因子s43（sA）n 芽孢形成时RNA聚合酶的s因子至少有s29 (sE)、s30 (sH)、s32 (sC)4）具多启动子的基因n 枯草杆菌的spoVG基因芽孢形成所需的基因之一该基因有分别被sB和sE识别的启动子两个启动子互相重叠可被含sB或sE的RNA聚合酶转录n 鱼腥蓝细菌属（Anabaena）谷酰胺（glutamine）合成酶基因（glnA）NH4+充足时，细胞处于营养生长状态NH4+缺乏时，会产生一些能固氮的异形胞 (heterocyte)；在异形胞中，大部分营养生长的基因都关闭了，而固氮基因（nif）则开启glnA基因在营养生长时及固氮的异形胞中都必不可少glnA基因有两个启动子，可被不同的s识别n E. coli的谷酰胺合成酶基因（glnA）NH4+充足时，RNA聚合酶用s70 ，识别弱启动子P1NH4+缺乏时， RNA聚合酶用s54 ，识别强启动子P2，以合成出更多的谷酰胺（起到贮存NH4+的作用）双启动子的意义n 使基因在不同情况下都可表达，或不同情况下有不同的表达强度5）E. coli的热激基因（heat shock genes）n 热激反应（heat shock response）细胞处于较高的温度中所引发的反应正常的转录减少或停止，热激反应的转录物开始产生，以降低细胞的损伤程度n 分子伴侣（molecular chaperon）协助蛋白质正确折叠的一类物质（一般也是蛋白质），在热激反应中也会产生在热激状态下，分子伴侣的作用是帮助已部分变性（折叠已发生变化）的蛋白质重新正确折叠好n 在热激状态下，细胞还会产生蛋白酶，以降解不能重新折叠好的蛋白质n 热激反应所需的基因表达重大改变也是通过更换RNA聚合酶的s因子而达成s32（sH）代替s70（sA）sH并非在热激后才产生，细胞原来已有少量的sH存在，但处于一种不起作用的状态（被隔离）受热激后，这些sH能马上起作用，导致更多的sH以及分子伴侣和蛋白酶的产生（6）l噬菌体对E. coli的侵染n 溶菌模式（lytic mode）噬菌体DNA进入宿主细胞后，利用宿主的RNA聚合酶进行转录，进一步翻译产生噬菌体蛋白质噬菌体DNA进行复制，从而组装出许多子一代的噬菌体宿主细胞裂解，释放出这些子代的噬菌体n 溶原模式（lysogenic mode）噬菌体DNA进入宿主细胞后，进行一些早期基因的转录和翻译产生一种27 kD的蛋白质（l阻遏物， l repressor），该阻遏物通过与2个操纵区结合，使得l本身的大部分基因关闭，只剩下l阻遏物的基因在表达n 噬菌体DNA整合到宿主基因组中，与宿主DNA一起复溶原菌（lysogen）携带有整合在基因组中的噬菌体DNA的细菌n 原噬菌体（prophage）整合在宿主基因组中的噬菌体DNAn l噬菌体的基因组线状：在噬菌体粒子中的存在状况，两端有粘性末端（cos）环状：噬菌体DNA刚进入宿主后的存在状况n 溶菌模式的基因表达调控n 三个转录阶段前早期（immediate early）晚早期（delayed early）晚期（late）n 三个时期的基因在基因组中顺序排列n 用到抗转录终止（antitermination）机制n 抗转录终止（antitermination）的机制抗终止蛋白与mRNA或DNA上的特异位点结合，再改变RNA聚合酶，使其忽略有关的终止子与mRNA结合：抗终止蛋白N与DNA结合：抗终止蛋白Qn 溶原模式的建立晚早期部分基因的产物是进入溶原模式所需的整合噬菌体DNA到宿主基因组所需的蛋白质引起cI基因转录，产生l阻遏物（ cII 和 cIII 产物的作用）n cII 和 cIII 产物的作用cII的产物能帮助RNA聚合酶结合到PRE ，从而可开始转录cro的反义RNA及cI 的mRNA；前者能抑制cro mRNA的作用，后者可翻译出l阻遏物cIII的产物能延迟细胞内的蛋白酶分解cII的产物n 溶原模式的维持与cI基因的自我调节l阻遏物（cI 的产物）产生后，通过与操纵区OR和OL结合，可阻止更多的早期基因转录，又能促使RNA聚合酶以PRM为启动子转录cI 基因cI 基因的产物（l阻遏物）的浓度能调节cI基因本身的转录（自我调节）n 溶菌模式还是溶原模式？由cI与cro基因产物的竞争结果决定cI取胜，进入溶原模式cro取胜，进入溶菌模式n CII（cII 基因的产物）的浓度决定cI与cro谁胜谁负， CII 越多，越容易进入溶原模式n CII的浓度又取决于细胞内蛋白酶的浓度生长环境好（养分丰富），细胞内蛋白酶浓度高处于饥饿状态，细胞内蛋白酶浓度低细胞处于饥饿状态，有利于溶原模式的建立生长环境好，有利于溶菌模式的建立溶菌模式与溶原模式在不同条件下建立的生物学意义n 溶原菌进入溶菌模式的诱导溶原菌受到化学诱变剂或辐射作用后，其原噬菌体就会进入溶菌途径诱变导致DNA损伤，引发SOS应答（SOS response），其中recA基因起最重要的作用（RecA用于DNA损伤的重组修复）诱变的环境还会使RecA成为一种辅蛋白酶（coprotease），激活l阻遏物本身的蛋白酶活性，使其自我切割，从操纵区脱落，从而引发溶菌模式四、真核生物的基因转录及其调控1. 真核生物的RNA聚合酶n RNA聚合酶I（polymerase I）n 位于核仁n RNA聚合酶II （polymerase II）n 位于核质n RNA聚合酶III （polymerase III）n 位于核质1）三种RNA聚合酶对转录抑制剂的反应n a-鹅膏蕈碱（ a-amanitin）n 抑制polymerase II（低浓度）n 抑制polymerase II 和polymerase III（高浓度）n 放线菌素D（actinomycin D）n 抑制polymerase I（2）真核RNA聚合酶的亚基组成n Polymerase I、II、III都由多个亚基组成n 均有两个较大的亚基（ 100 kD）n 另有多个较小的亚基（大部分 50 kD）n 三种聚合酶都有一些共有亚基（common subunit）n 以酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 的Pol II为参照：Rpb5、Rpb6、Rpb8、Rpb10、Rpb12（3）RNA聚合酶II的结构n 研究得比较清楚的一种n 有12个亚基（Saccharomyces cerevisiae中）n Rpb1、 Rpb2、 Rpb3、 Rpb4、 Rpb5、 Rpb6、 Rpb7、 Rpb8、 Rpb9、 Rpb10、 Rpb11、 Rpb12 Rpb: RNA polymerase B (II)n 核心亚基（core subunits）n Rpb1, Rpb2, Rpb3，对聚合酶的活性必不可少n 分别与原核RNA聚合酶的b, b和a亚基同源，且功能也基本相同（Rpb3在聚合酶中也是有2个拷贝）n 共有亚基（common subunits）n 与Rpb5, Rpb6, Rpb8, Rpb10, Rpb12相应的亚基，在3种 RNA聚合酶中都存在n 在3种聚合酶中都存在，说明它们是起着十分重要的作用，但具体的功能不很清楚n 非必需亚基（nonessential subunits）n Rpb4, Rpb9，其基因的突变体在正常温度下仍有活力，但在较高或较低温度下则失去活力n Rpb4和Rpb7（必需的亚基）与启动子的识别有关（有点像s因子）n Rpb9的功能不甚清楚n Rpb7和Rpb11n 另类亚基（不属于上述3类）n RNA聚合酶的活性所需（Rpb7与启动子的识别有关）n 核心亚基Rpb1的特殊之处n 不均一性（heterogeneity）n 在细胞内，有210 kD和240 kD两种形式（IIa和IIo）；在体外，还有180 kD这种形式（IIb）n 与对a-鹅膏蕈碱的敏感性有关n 在体内，含IIa的聚合酶II为RNA polymerase IIA；含IIo的聚合酶II为RNA polymerase IIOn RNA polymerase IIA是与启动子结合时的形式n RNA polymerase IIO是延伸时的形式2. 真核RNA聚合酶识别的启动子n RNA聚合酶I识别的启动子（I类启动子，class I promoters）n RNA聚合酶II识别的启动子（II类启动子，class II promoters）n RNA聚合酶III识别的启动子（III类启动子，class III promoters）（1）RNA聚合酶II识别的启动子（II类启动子， class II promoters）n 与原核基因的启动子最相似n 可含有四类元件，前三类是核心启动子（core promoter）的元件n TATA区（TATA box）n 起始子（initiator）n 下游元件（downstream element）n 上游元件（upstream element）n TATA区（the TATA box）n 位于转录起始位点上游约25 bp（以中部计，在酵母中可达50 70 bp），共同序列为TATAAAA（in the nontemplate strand, similar to prokaryotic -10 box）n 功能：确定转录起始位点（一般是TATA区的第一个核苷酸后30 bp）；有时甚至是决定整个启动子是否有作用n TATA区（the TATA box）n 有些基因的TATA区序列与其共同序列相差较大，而只在某些类型的细胞中才表达的基因则有明显的TATA区n 有些基因甚至没有TATA区n 看家基因（housekeeping genes）n 控制发育的基因n 起始子（initiator）n 转录起始位点前后的保守序列n 共同序列为：PyPyANT/APyPyn Py: pyrimidinen N: any nucleotiden A: transcription start pointn 有些基因仅有起始子序列作为其启动子n 下游元件（downstream element）n 某些基因的启动子中存在n 位于转录起始位点下游，无共同序列n 上游元件（upstream element）n 在TATA区的上游n GC boxes：富含G和C，如GGGCGG（-47 -61 region, in the coding strand）和CCGCCC（-80 -105 region），可有2个或更多的拷贝n CCAAT box：共同序列为CCAAT（2）RNA聚合酶I识别的启动子（I类启动子， class I promoters）n 变化较II类启动子大，无甚保守序列（即随物种而异）n 有一定的结构特征n 核心元件（core element），转录必不可少n 上游控制元件（upstream control element, UCE），高效转录所需n 核心元件与上游控制元件之间的距离很重要（3）RNA聚合酶III识别的启动子（III类启动子， class III promoters）n 位于基因内部n 5S rRNA基因（+50 +83）n tRNA基因n 位于基因外部，类似RNA聚合酶II识别的启动子（含TATA box）n U6 snRNA基因n 7SL RNA基因n 7SK RNA基因3. 增强子与沉默子（enhancers and silencers）（1）增强子n 能增强转录的元件，但又不是启动子的一部分（无位置、方向的限制）n 增强子常在启动子的上游，但也可以在基因内部（如内含子中）（2）沉默子n 能抑制基因转录的元件，可远距离（无位置、方向的限制）影响（抑制）基因的转录n 沉默子的作用机制是通过影响染色质的结构（使其变得致密），从而使邻近的基因不能转录n 增强子与沉默子有时可以是同一DNA元件（取决于什么蛋白质因子与其结合）n 甲状腺素应答元件（the thyroid hormone response element）只与甲状腺素受体结合，是一沉默子与甲状腺素受体及其配体（甲状腺素）结合，是一增强子4. 真核生物的通用转录因子n 真核RNA聚合酶光靠自身不能与启动子结合，它们需要转录因子（主要是蛋白质）的协助n 转录因子有两类n 通用转录因子（general transcription factors）n 基因特异转录因子（gene-specific transcription factors）n 通用转录因子能使聚合酶结合到启动子上，形成预起始复合物（preinitiation complex），包括形成开启的启动子复合物（open promoter complex），但只能导致基础水平的转录（1）II类因子（class II factors）n Polymerase II 转录所需的通用转录因子n II类预起始复合物n 包含有RNA聚合酶II及6种通用转录因子：TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIHn TFIID在TFIIA的协助下，首先结合到TATA box，形成DA复合物，然后TFIIB再结合上去n TFIIF协助polymerase II 结合到DNA链上（-34 +17区域）n TFIIE、 TFIIH结合到复合体中，形成DABPolFEH预起始复合物n TFIID的结构及功能n TFIID本身是一个复合物，含1个TATA box结合蛋白（TATA box-binding protein, TBP）和8 10个TBP相联因子（TBP-associated factors, TAFs, or TAFIIs）n TATA box结合蛋白（TBP）序列非常保守的一种蛋白质（约38 kD），包含180个氨基酸的羧基末端，该末端是TATA box结合域（binding domain）TBP 是马鞍形的，结合到DNA双螺旋的小沟上，能使TATA box弯曲80n TBP相联因子（TAFIIs ）n 至少有8种，序列上也相当保守n 主要功能：促进转录与启动子的元件相互作用（起始子、下游元件）与基因特异转录因子相互作用TAFIIs中的TAFII250还有酶的功能，如作为组蛋白乙酰转移酶n TFIIA与TFIIB的结构及功能n TFIIA在酵母中有2个亚基，在果蝇和人中有3个亚基TFIIA可以看成是一种TAFII（与TBP结合，能稳定TFIID与启动子之间的结合）在体外体系中，TFIIA并非必不可少n TFIIB单亚基的因子（35 kD）能把TFIID与TFIIF/Pol II相连在一起，即是聚合酶II结合到预起始复合物所必需的能与一些基因特异转录因子相互作用，促进转录n TFIIF的结构及功能由2条多肽构成：RAP30与RAP70（RAP stands for RNA polymerase II-associated protein）；RAP30与E. coli的s因子有一定的同源性，能使TFIIF结合到Pol IITFIIF与Pol II结合后，能减少聚合酶与DNA之间非特异的相互作用，引导聚合酶到已结合有TFIID、TFIIA和TFIIB的启动子上n TFIIE有2个亚基（56 kD, 34 kD），每个亚基在TFIIE中都有2个拷贝（总分子量约为200 kD）能结合到DABPolF的复合体上，对转录有促进作用n TFIIE和TFIIH的结构及功能n TFIIH最后一个结合到预起始复合物的通用转录因子，结构、功能均复杂功能之一是使Pol II最大一个亚基的羧基末端域（CTD）磷酸化，即使Pol IIA变为Pol IIO，从而导致转录起始到转录延伸过渡具有DNA解螺旋酶（helicase）的活性，这是聚合酶离开启动子往前转录（promoter clearance）所需的n 延伸因子（elongation factors）n TFIIS能促进转录延伸，阻止聚合酶在转录过程中较长时间的暂停n TFIIF也有阻止聚合酶短暂停止的功能n RNA聚合酶II的全酶（the polymerase II holoenzyme）n RNA聚合酶II的所有亚基 + 部分通用转录因子 + 其他一些蛋白质因子4. 真核生物的通用转录因子（general transcription factors）（2）I类因子（class I factors）n Polymerase I 转录所需的通用转录因子n I类预起始复合物n RNA聚合酶In 2种通用转录因子（I类因子）n SL1n UBF（上游结合因子，upstream-binding factor）n SL1n 由TBP（TATA box结合蛋白）与3种TAFs（TAFIs，TBP相联因子）组成的复杂蛋白质n SL1并不直接与启动子结合，但它能加强UBF与启动子的结合，促进预起始复合物的形成n SL1还是rRNA基因转录的物种特异性的决定因素之一n UBFn 由2条多肽构成（97 kD和94 kD），而97 kD的多肽即具UBF的活性n 能与I类启动子的核心元件及UCE（上游控制元件）的位点结合，再与SL1一起，促进转录（3）III类因子（class III factors）n Polymerase III 转录所需的通用转录因子n III类因子有TFIIIA、TFIIIB、TFIIICn TFIIIB和TFIIIC是所有在基因内部有III类启动子的基因的转录所需的n 5S rRNA基因的转录还需要TFIIIAn TFIIIAn 一类含“锌指”（zinc finger）的DNA结合蛋白的成员n 锌指是4个氨基酸与1个Zn离子结合，再加上其他的氨基酸，构成手指状n 在TFIIIA中， 4个氨基酸是cys-cys-his-his，一连9个锌指n 锌指能使蛋白质与DNA紧密结合n TFIIIB和TFIIICn 两者是一起共同起作用的n TFIIIC结合到基因内部的启动子中（如果是5S rRNA基因，则先有TFIIIA结合到启动子区），再帮助TFIIIB结合到启动子上游区（转录起始位点上游），而TFIIIB则帮助Pol III结合在起始位点周围n 转录开始后，TFIIIC（或TFIIIA和C）被除去，而TFIIIB留在原位，可促进另一轮的转录n 具外部启动子的基因的转录因子n TFIIIB含有TBP（TATA box结合蛋白）及一些TAFIIIs，可结合到启动子的TATA box，从而促进转录n 可能还需要其他一些通用转录因子（4） TBP在3类转录因子中的作用n 与TATA box结合n 组织预起始复合物（特别是对于没有TATA box 的启动子），促进转录5. 真核生物的转录激活子（transcription activators）（1）激活子的基本结构n 一般有2个功能域（functional domain）n DNA结合域（DNA-binding domain）n 转录激活域（transcription-activating domain）n 许多激活子还有二聚体化域（dimerization domain）n DNA结合域的结构n 锌指（zinc fingers）不少激活子（如Sp1）都有该结构，锌指结构一般连续出现多次由1个a-螺旋与1反向平行的b层片构成， a-螺旋上的2个AA和b层片上的2个AA与1个Zn离子结合“指”上（a-螺旋上）的某些AA就决定了其与DNA结合的特异性n DNA结合域的结构n GAL4 蛋白质（the GAL4 protein）酵母中的一种激活子DNA结合域与锌指相似，但含有6个半胱氨酸和2个锌离子有一个与DNA进行识别的区域（a-螺旋），决定其与DNA结合的特异性n DNA结合域的结构n 核受体（the nuclear receptors）与甾体激素相互作用，组成激素-受体复合物，起激活子的作用核受体的DNA结合域含有2个锌离子，每一个锌离子分别与4个半胱氨酸结合，参与形成一指状结构其中一“指”（氨基末端的“指” ）上有专门用于识别DNA特异序列的a-螺旋n 同源异形域（homeodomains）在很多激活子中都存在，由基因中的同源异形框（homeobox）编码，而同源异形框一般是基因中的一个外显子，约180 nt，编码60AA，十分保守同源异形框最初在果蝇的发育调节基因中发现，这些基因的突变称为同源异形突变（homeotic mutation），会引起躯体结构的重大改变含同源异形框的基因又称为同源异形基因（homeotic genes, homeobox-containing genes）n 同源异形域（homeodomains）每个同源异形域含3个a-螺旋，第二、第三个形成一种“螺旋-转折-螺旋”（helix-turn-helix）结构，而第三个螺旋起到识别DNA特异序列的作用另外，同源异形域的氨基末端也插入到DNA的小沟中n bZIP和bHLH域（the bZIP and bHLH domains）又称碱性域（the basic domain），能与DNA结合及形成二聚体b表示碱性区；ZIP表示亮氨酸拉链（leucine zipper）；HLH表示“螺旋-环-螺旋”（helix-loop-helix）n bZIP每个单体构成亮氨酸拉链的一半：在一条a-螺旋中，每7个AA就有1个leucine，因而leucine都在螺旋的一面2个单体相互作用，就可构成一条“拉链”与DNA结合的部分是“拉链”下的碱性区，它们必须在bZIP形成二聚体后，才能与DNA特异识别、结合n bHLH与DNA的复合体结构和bZIP-DNA复合体相似helix-loop-helix为二聚体化域较长的螺旋有碱性区，能与DNA特异结合（1）激活子的基本结构n 转录激活域的种类n 转录激活域似乎无特定且明显的结构，但可分3类酸性域（acidic domains）：富含酸性氨基酸，如酵母GALA的激活域富含谷氨酰胺域（glutamine-rich domains）：富含谷氨酰胺，如Sp1中的2个激活域富含脯氨酸域（proline-rich domains）：富含脯氨酸，如CTF中的激活域（2）激活子的功能n 促进通用转录因子结合到启动子上促进TFIID结合到启动子（预起始复合物）促进TFIIB结合到预起始复合物促进TFIIF/Pol II、TFIIE结合到预起始复合物（2）激活子的功能n 促进RNA聚合酶II的全酶（holoenzyme）结合到启动子，形成完整的预起始复合物n 至少在一些基因中，激活子通过促进整个全酶结合到启动子区域而激活转录（3）增强子的远距离作用n 激活子是使增强子能远距离作用的原因n 4种可能性（第三、四种可能性较符合实际情况）n Coiling (change in topology)n Slidingn Loopingn Facilitated tracking (looping and tracking)6. 染色质结构与基因的转录（1）染色质的结构n DNA + 组蛋白（H3、H4、H2A、H2B） 核小体核心（nucleosome core） H1 染色小体（chromatosome） 核小体丝（nucleosome filament） 螺旋折叠 30 nm 纤维（30-nm fiber）n 核小体内的组蛋白（核心组蛋白）：八聚体n (H3-H4)2 四聚体1个n (H2A-H2B) 二聚体2个n H4：最保守的蛋白质n 核小体核心外的组蛋白n H1n 在间期核中，染色质主要以30 nm纤维的形式存在n 在分裂中期， 30 nm纤维进一步折叠，形成很多环状结构，附着在染色体的中央骨架（核基质，nuclear matrix）上（2）染色质结构对基因转录的影响n 组蛋白对5S rRNA基因转录的影响n 爪蟾（Xenopus laevis）的5S rRNA基因在单倍体中约有2万拷