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微流控芯片的表面改性研究及其在生物分离分析中的应用中文摘要 微流控芯片的表面改性研究及其在生物分离分析中的应用 摘要 微流控芯片结合了生物技术微电示微机械等技术，把实验室中许多仪器的 功能缩小到邮票或信用卡大小的芯片上来处理，从而在微型化的基础上成十倍 百倍地大幅度提高检测效率，降低检测成本微剜空芯片可应用于全部( 生物) 化学 分析领域，且其产业化程度尚处于起步阶段，因此有着更为广泛的适应性应耳j 前 景及发展空间微流控芯片的制作材料也从传统的玻璃或者硅材料转到高分子聚 合材料，大大地节约了成本，但是在聚合物材料应用过程中存在一些问题众多研 究结果表明，对高分子材料表面进行修饰改性可以改善它的性质，使聚合物材料 芯片更有利于用于实际生物样品分析本论文以聚合物材料聚甲基丙烯酸甲酯制 备的微流控分析芯片为研究对象，设计新颖的修饰方法对其进行表面改性，进行 了一系列表征实验和生物分子检测研究，探讨了芯片分析手段应用于生物分子的 分离分析的可能性，旨在能为生物分析提供了一个很有潜力的检测和科研平台 全文包括以下几个方面内容： 一概述了微流控分析技术及其在生物分析中的应用 本部分首先概述了微流控分析技术的一些发展情况，然后针对微流控分析芯 片研究的些相关内容，比如微流控芯片的制作材料加工方法进样技术，常用 的芯片分离分析技术和检测技术方面做了筒略的介绍，在此基础上对微流控分析 技术应用于生物分析做了些科学展望，同时指出微流控芯片应用于生物分析研 究面临的问题，最后讨论了本论文工作的目的和意义 二聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片蛋白质固定相制备及手性分离分析研究 本部分引言部分对蛋白质组学和生物分析研究中常用的分离分析方法和最 新技术进展进行了简单介绍，并针对芯片应用于生物分析存在的问题设计实验方 案本部分研究工作主要按照如下步骤展开，以高分子聚合物聚甲基丙烯酸甲 酯微流控分析芯片作为主要对象，成功地在芯片微通道内生物识别分子的有效固 定，并将该方法构建的具有蛋自质手性固定相的微流控芯片应用于氨基酸生物小 分子的分离分柝具体内容包括以下几个部分： ( 1 ) 聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 微流控芯片通道表面改性研究 通过高分子无规共聚反应合成了( 甲基丙烯酸丁酯) x “( 甲基丙烯酰氧基) 丙 基三甲氧基硅烷) y ( b m a h 一( m a o p t a s ) y ，首先使p m m a 材料表面硅烷化，成 功地在憎水且化学惰性的聚合物表面引入活性基团，为后续的生物识别分子固定 研究提供了广泛的可能性p m m a 微流控芯片采用热压法制作，通道内壁表面经 2 微流控芯片的表面改性研究及其在生物分离分析中的应用中文摘要 过化学改性方法引入的硅烷化活性基团与溶胶凝胶之间可进行缩合反应，在缩 合过程中可实现蛋白质等生物分子在芯片微通道内的固定 ( 2 ) 聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片在手性分离分析中的应用 采用上述固定方法，用a 1 2 0 3 溶胶凝胶将具有手性识别作用的蛋白质 牛血清白蛋白固定于p m m a 芯片微通道内，制备了蛋白质类手性固定相，并用 于对映异构体的手性拆分_ 系列实验结果表明，与常规方法相比，该方法具有分 离速度快，分离效率高等特点，并很好地解决了生物分子在分离分析过程中的非 特异性吸附问题 三聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片表面抗吸附的研究及其简单应用 本部分引言部分简述了一些生物相容性良好的材料并对其用于生物芯片通 道性质改性的研究进展情况进行了一些概述本部分实验部分利用共聚物材料( 均 含有生物相容性良好的单体) 对p m m a 基材表面进行改性研究，通过甲基丙烯 酸丁酪与聚乙二醇单甲基丙烯酸酯形成的共聚物m a ) 。- ( p e g m a ) n ，以及甲基 丙烯酸丁酯与异丁烯酰基丙烯酰基磷酸胆碱形成的共聚物( b m a ) 。( m p c ) o 来对 p m m a 高聚物材料微通道内壁进行修饰，通过一系列表征实验表明，在憎水的 易吸附且化学惰性的p m m a 聚合物通道壁成功构建了生物相容性良好的表面， 与没有经过改性的p m m a 芯片相比，用上述方法修饰改性后的芯片电泳可以更 有效地进行底物分离分析 关键词：微流控分析技术微流控芯片聚甲基丙烯酸甲酯手性固定相 修饰改性 微流控芯片的表面改性研究及其在生物分离分析中的应用英文摘要 1 1 崦s u r f a c em o d i 6 c a t i o no fm i c r o f l u i d i cc h i p s a n d a p p l i c a t i o n si nb i o a n a l y s i s a b s t r a c t m i c r o f i u i d i cd e v i c e sh a v e b e e nb e c o m i n gp o w e r f u lt o o l sf o rp e r f o r m i n g c h e m i c a lo rb i o l o g i c a la s s a y sd u et oi n c r e a s e ds p e e da n dr e l i a b i l i t ya tr e d u c e ds a m p l e c o n s u m p t i o n m i c r o f l u i d i cc h i pc o u l db eu s e di na n a l y t i c a lc h e m i s t r ye v e nt h ew h o l e b i o a n a l y s i s h o w e v e r , i t si n d u s t r i a l i z a t i o n n e e db ed e v e l o p e d n ef a b r i c a t i o n s u b s t r a t e sh a v eb e e nd e v e l o p e df r o mg l a s sa n ds i l i c o nt op o l y m e r st h a tc o u l ds a v et h e p e n s i o n , b u tt h e i ra p p l i c a t i o nh a ss o m ep r o b l e m m u c hr e s e a r c hh a ss h o w e dt h a tt h e m o d i f i c a t i o no fp o l y m e rs u r f a c ec o u l dc h a n g ei t sp h y s i o c h e m i c a lp r o p e r t y i nt h i s t h e s i sw ec e n t e r e dt h er e s e a r c hw o r ki np o l y ( m e t h y im e t h a c r y l a t e ) ( p m m a ) c h i p w e s y n t h e s i z e ds o m ec o p o l y m e rt om o d i f yi t sc h a n n e ls u r f a c e s f r o mas e r i e so f e x p e r i m e n t sa n dd e t e c t i o nr e s e a r c h e sw ef o u n dt h a tt h em o d i f i e dc h a n n e l sa r eu s e f u l f o rs e p a r a t i o no fm o l e c u l e s t h e s ep r o v i d eap o s s i b i l i t yf o rap o t e n t a lp l a t f o r mu s e d i nb i o a n a l y s i ss y s t e m 1 i n t r o d u c t i o no fm i c r o f l u i d i e sa n di t sa p p l i c a t i o ni nb i o a n a l y s i s ar e v i e wo nm i c r o f l u i d i e sa n di t sa p p l i c a t i o ni nb i o a n a l y s i si np r e s e n t e d a s p e c t s d e t a i l sr e v i e w e di n c l u d e ： ( 1 ) b r i e fi n t r o d u c t i o no fm i c r o f l u i d i c sd e v e l o p m e n t ( 2 ) s o m ei n t r o d u c t i o no fm i c r o f l u i d i c st e c h n o l o g i e s ，i n c l u d i n gt h ef a b r i c a t i o n m a t e r i a l sa n dt e c h n o l o g y , d e t e c t i o n ( 3 ) t r e n do f m i c r o f l u i d i c su s e di nb i o a n a l y s i s f 4 ) a i ma n dc o n c l u s i o no ft h i st h e s i s 2 t h ec o n s t r u c t i o no fp r o t e i ns t a t i o n a r yp h a s eo nm o d i f i e dp o l y ( m e t h y l m e t h a c r y l a t e ) ，a n do i l - c h i pe l e c t r o p h r o s i sf o rc h i r a is e p a r a t i o n t h ep r e f a c es e c t i o nr e v i e w e da p p l i c a t i o no fm i c r o f l u i d i cc h i p ，a l s os u m m a r i z e dt h e n e wp r o g r e s s e sa n di m p o r t a n ta c h i e v e m e n t so nt h ef i e l d so fm i c r o f l u i d i cc h i p w e c h o s et h ep m m as u b s t r a t ef o rf a b r i c a t i n gc h i p s ，a n du s e dap r o t o c o lt om o d i f yt h e s u b s t r a t e ，t h e ns u c c e s s f u l l yi m m o b i l i z e dt h ep r o t e i n si nt h em a t r i xo fa l u m i n as o l - g e l f o rt r y p o p h a ns e p a r a t i o n t h ed e t a i l e dp o i n t so ft h i st h e s i sa r ee x p a n d e da sf o l l o w s ( 1 ) t h r o u g ht h em e t h o do fh o t e m b o s s i n g , p m m am i c r o c h i pw a sf a b r i c a t e df o r 4 微流控芯片的表面改性研究及其在生物分离分析中的应用英文摘要 t h el a t e rr e s e a r c h c h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fp o l y ( m e t h y lm c t h a c r y l a t e ) m i c r o c h a n n e l s u r f a c eh a sb e e n e x p l o r e dt of u n c f i o n a l i z em i c r o f l u i d i cc h i ps y s t e m s ac r a f t c o p o l y m e rw a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e dt oi n t r o d u c et h es i l i a n ef u n c t i o n a lg r o u p s o n t ot h ep l a s t i cs u r f a c ef i r s t l y f u r t h e r m o r e ，t h r o u g has i l i c o w o x y g e n a l u m i n i n m b r i d g et h a tf o r m e db yt e t h e r i n gt ot h e s ef u n c t i o n a lg r o u p s ，as t a b l ep a t t e r n i n gn e t w o r k o fg e lm a t r i xc o u l db ea c h i e v e d t h u s ，a n c h o r a g eo fp r o t e i n sc o u l db er e a l i z e do n t o t h eh y d r o p h o b i cp m m am i c r o c h a n n e l sw i t hb i o a c t i v i t yp r e s e r v e da sf a ra sp o s s i b l e ( 2 ) e m p l o y i n gt h ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o dd e m o n s t r a t e d , b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) w a si n t r o d u c e dt ot h ef a b r i c a t i o no fc h i l ms t a t i o n a r yp h a s e s ( c s p s ) b ya l u m i n a s o l - g e ln e t w o r kp a t t e r n i n go np m m a m i c r o c h i p a sw e l la st h es u c c e s s f u ld e p r e s s i o n o fn o n s p c c i f i ca d s o r p t i o n ，t h eh i g h - p e r f o r m a n c es e p a r a t i o na n df a s t a n a l y s i so f a l l o s t e r i ci n t e r a c t i o nw a sc o n f i r m e dt h r o u g ham i c f o f l u i d i cp l a t f o r m i n t e g r a t i n g o n - c h i pe l e c t r o p h o r e s i sa n de l e c t r o c h e m c i a ld e t e c t i o n 3 t h ec o n s t r u c f i e no fb i o f o u l i n gm e m b r a n e so n t ot h ep m m 【ac h a n n ds u r f a c e s f o ra n t i - a b s o r p t i o n i nt h i ss e c t i o nw ei n t r o d u c e dt w ob i o c o m p a t i b l ec o p o l y m e rt om o d i f yt h ep m m a s u r f a c e s c o p o l y m e ro fb u t y l m c t h a c r y l a t e 侣m a ) a n d2 - m e t h a c r y l o y l o x y e t h y l p h o s p h o r y l c h o l i n e ( m p q ，c o p o l y m e ro fb m a a n dp o l y ( e t h y l e n e # y c 0 1 ) m e t h y l e t h e rm e t h a c r y l a t e ( p e g m a ) w e r ei n t r o d u c e dt ot h ew a l lo fp m m ac h a n n e lt o i m p r o v et h eh y d r o p h o b i ca n de a s yf o u l i n gp r o p e r t i e so fp m m ac h a n n e l t h i s p r o c e d u r eo f f e r s a ne f f e c t i v e a p p r o a c h f o ra l l a n t i - f o u l i n g s u r f a c e d e s i g n0 n m i c r o f l u i d i cc h i p s ，w h i c hi sp r o m i s i n gi nh i g h t h r o u g h p u ta n dc o m p l e xb i o l o g i c a l a n a l y s i s k e y w o r d ：m i c r o f l u i d i c s ，m i c r o f h i d i cc h i p ，p o l y ( m e t h y lm e t h a c r y l a t e ) ，c h i r a l s t a t i o n a r yp h a s e ，m o d i f i c a t i o n 5 第一章绪论 第一章绪论 分析测试是人类最频繁的科学技术活动之一，分析测试技术的创新在人类 发展的历史上对全世界的科学技术与经济发展起到了及其重要的推动作用。当 今，先进的分析检测手段已成为生命科学乃至整个现代科学技术发展的基础与源 头，而应当引起足够的重视。自m a n z 和w i d m e r 于2 0 世纪9 0 年代初首次提出 微型全分析系统的概念【1 1 ，此后十余年中该领域已发展成为世界上最前沿的科技 领域之一，目前其核心技术即是以微流控技术为基础的微流控芯片。2 0 世纪9 0 年代初毛细管电泳技术的发展为微型全分析系统研究取得突破提供了重要的条 件。m a n z 与加拿大的a l b e r t a 大学的h a r r i s o n 于1 9 9 2 年发表了首篇在微流控芯 片上完成的毛细管电泳分离的论文，展示了微型全分析系统的发展潜力【2 i 。当今， 微流控技术依然是一个很新的发展前沿领域。 针对当前我国学术界对英文“m i c r o f l u i d i c s ”一词尚无统一译法的现状，方 肇伦院士等主张将“m i c r o f l u i d i c s ”译成“微流控芯片”【3 】。根据大量的研究和 发现，他们将微流控技术( 学) 简捷定义为：在微米级结构中操控纳升至皮升体 积流体的技术和科学。并且根据微流控技术局限在分析检验时为了实现化学和生 物检验服务的目的，特意将上述定义所界定的该特定应用范畴定义为“微流控分 析系统”。微流控分析是当前分析科学发展的重要前沿领域，通过微加工技术使 分析系统微型化、集成化与便携化将使分析检验发生革命性的变化从而推动新世 纪科学技术的发展。有关技术在与生命科学相关的领域中的应用显示了强大的生 命力和极其广阔的发展前景。 本章内容将对微流控芯片涉及的一些技术做简单介绍，并对其在生物分析 领域的应用做简单的综述。 第一节微流控芯片的一些相关技术 微流控芯片通常是利用电渗流驱动液体在连接各元件的微细管道间流动， 它结合生物技术、微电子、微机械等技术，把实验室中许多仪器的功能缩小到芯 片上来处理。微流控芯片在装置上的主要特征是其容纳流体的有效结构( 包括通 道、反应室和其它某些功能部件) 至少在一个维度上为微米级尺度吼微流控芯 片的分析性能显著超过宏观条件下的分析体系，主要包括分析设备的体积减小， 分析设备更加集成化、自动化，分析效率的显著提高，试样和试剂消耗的显著下 降，降低检测成本【3 】。 一、制作技术简介 微流控分析芯片的制作，起源于半导体及集成电路芯片制作所广泛使用的光 6 第一章 绪论 刻( l i t h o g r a p h y ) 和蚀刻技术( e t c h i n g ) ，之后还发展了l i g a 技术、感应耦合等离 子体刻蚀技术等，但这两种技术设备昂贵，技术要求高，一般实验室难以完成。 迄今为止，微芯片还主要是通过湿法刻蚀技术在玻璃或硅材料上制作而成附】。 其中，硅材料由于易碎、成本较高、不透光、电绝缘性能不好而且表面化学行为 较复杂等缺点，限制了它在微流控芯片中的广泛应用。但是，由于其具有良好的 光洁度和成熟的加工工艺，可用作高分子聚合物芯片的模具材料。利用玻璃或石 英制作芯片需要真空溅射或蒸发沉积的金属镀膜技术，技术复杂，成本高，而且 复杂的加工工艺不能满足批量生产和应用的实际要求。与此相反，聚合物材料成 本低廉，品种繁多，加工方法简便多样，无论在小范围的研究型实验室、或是在 大批量的工业生产中，均能够很方便地实现一次性微装置系统的制作i 叫。另外 可对聚合物材料芯片通道表面进行改性，以提供合适的物理、化学或生物功能， 如制成亲水性，宜于溶液的装载；制成疏水性可用作毛细阀、酶或免疫分子的固 定和表面电荷的附着。聚合物具有多样化的理化性质，针对特定的应用可选择不 同的聚合物。所有这些特点赋予聚合物微芯片材料良好的商业应用前景而倍受重 视。 用于制作微流控分析芯片的高分子聚合物主要有三大类：热塑性聚合物、固 化型聚合物和溶剂挥发型聚合物。热塑性聚合物包括有聚酰胺( p i ) 、聚甲基丙烯 酸甲酯( p m m a ) 、聚碳酸酯( p c ) 、聚苯乙烯等；固化型聚合物有聚二甲基硅氧烷 ( p d m s ) 环氧树脂和聚氨酯等；溶剂挥发型聚合物有丙烯酸、橡胶和氟塑料等。 高分子聚合物基片上制作微通道的方法有模塑法、热压法、x 光刻蚀、激光烧蚀 法f 鲥2 1 。模塑法可用的材料有固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物：通过在阳模上 浇注液态的高分子聚合物，将固化后的高分子聚合物与阳模剥离后制得具有微通 道的基片，再将基片与盖片封接，得到微流控芯片；或通过缓慢地挥发去溶剂挥 发型聚合物而得到芯片。热压法作为种快速加工微流控芯片的技术，适用于一 些热塑性高分子聚合物材料：在热压装置中将聚合物基片加热到软化温度，通过 在阳模上施加定的压力，并保持3 0 6 0s ，可在聚合物基片上压制出与阳模凹 凸互补的微通道，然后在加压的条件下，将阳模和刻有通道的基片一起冷却后脱 模，就得到所需的微结构。x 光刻蚀和激光烧蚀法是细微加工的新方法：x 光刻 蚀用于加工制作高深宽比的聚合物芯片；激光烧蚀法可直接根据计算机c a d 的 数据在金属、塑料、陶瓷等材料上加工复杂的微结构，具有精度高的优点，但对 设备要求较高。 二、微流控芯片用作分离的一些技术1 3 1 1 迸样技术 7 第一章 绪论 在微流控分析芯片中，进样系统是样品处理过程的关键部分。微流控芯片电 泳分离、色谱分离、流动注射分析和某些免疫分析中都需要进样操作，即将一定 体积的试样注入到分离、分许通道中，用于定性或定量检测。在常规毛细管电泳 分离技术中，常用压力、虹吸和电动进样法，这些进样方法或者需要复杂的机械 操作，或者不能直接用于微流控芯片进样，总之不适合微流控进样操作。而色谱 和流动注射分析中，常采用压力驱动方式进样，迸样操作一般包括冲样和注样两 个过程。如果通过阀进行微流体流向的切换和注样体积的控制，在微流控芯片上 加工这种微型阀显然难度较大。电渗驱动溶液，可以进行无阀微流体流向切换操 作，目前在微流控芯片进样中已得到广泛应用，但电动进样存在电歧视效应等缺 点。有关进样的详细讨论可参阅相关专著【3 l 。这里仅作简单介绍。 目前，微流控芯片上主要有两种进样方式，即定容进样和定时进样，类似于 流动注射分析中的定容和定时进样。以下主要介绍在微流控芯片上的微流体进样 技术，不包括从外界宏观系统到微流控芯片的试样引入技术。 定容进样分为简单电动进样阀和电动夹流进样法以及压力定容进样。定时进 样法有t 形通道电动进样法、电动门式进样法、压力定时进样法以及光门进样 法。在此不做一一介绍，与此有关的详细讨论可参阅相关专著【引。 2 微流控芯片毛细管电泳分离技术1 3 1 电泳是指一定介质中，带电离子在电场作用下移动的现象。电泳现象已被广 泛应用于试样分离，其中毛细管电泳分离技术在d n a 、蛋白质等生物大分子的 分离测试中显示了突出的优越性，并在微分析系统的概念提出后很快在芯片上实 现，对该领域的发展起到了极大的推动作用：介电电泳是悬浮液中的中性微粒在 不均匀电场中由于极化效应而产生运动的现象，该技术常用于生物大分子和细胞 微流控芯片 图1 芯片毛细管电泳分离分析系统装置示意 第一章绪论 的分离；而自由流电泳是一种连续分离技术，常用于生物大分子和细胞的制备， 这两种电泳分离技术也在微流控芯片上得到一定程度的应用。 芯片毛细管电泳是以微流控芯片上的微通道作为分离通道的分离技术( 图1 所示) 。它的分离原理与常规毛细管电泳相同，均以高压直流电场作为驱动力， 从表面上看，它们的区别仅仅在于分离通道的不同。 3 微流控芯片电色谱分离技术1 3 1 液相色谱( l c ) 是现代分离分析领域的一个重要方法，已得到广泛应用，在 许多领域发挥了重要作用。然而液相色谱的分离柱效比毛细管电泳分离要低得 多，难以满足分离复杂样品的要求，为此，人们提出了毛细管电色谱( c e c ) 分离 技术。毛细管电色谱是在毛细管中填充或毛细管内壁涂渍、键合色谱固定相，或 原位色谱固定相，利用电渗流或电渗流结合压力流推动流动相，根据各组分在固 定相和流动相间分配系数的不同及电泳速率的差异而达到分离的一种微柱液相 色谱法。从装置上说，c e c 和高效液相色谱的主要不同在于使用高压电源产生 电渗流驱动流动相，而不是用高压泵产生压力流；c e c 与毛细管区带电泳的主 要不同在于使用含色谱固定相的毛细管柱，而不是裸柱。c e c 由于使用塞状流 型的电渗流代替抛物型压力流，因而具有毛细管区带电泳的高柱效特点；在分离 过程中使用色谱固定相，因而又具有高效液相色谱的高选择性特点。可见，c e c 集中了毛细管电泳的高效性和高效液相色谱的高选择性，对分析复杂样品有很大 的潜力。 和毛细管电泳相比，c e c 在微流控芯片上的应用要少得多。但c e c 用电渗 流驱动流动相，相比于l c 使用的压力流，它在微流控芯片上更容易实现，也更 容易小型化。色谱柱是c e c 的核心部件，目前芯片c e c 也大多针对柱技术进行 研究。c e c 使用色谱固定相，芯片电色谱按固定相的状态可以分为填充柱，开 口柱和整体柱三种。开口管柱芯片电色谱的柱子是通过化学修饰方法在微流控芯 片内壁形成色谱固定相而制得的。其制作简单，但管径通常较小，导致固定相负 载容量小、光学检测的光程短、易被堵塞，应用受到一定的限制。填充柱芯片电 色谱一般是通过微加工技术直接在芯片通道中形成围堰、围柱阵列或锥形通道等 微结构以固定填充床，不存在常规c e c 的柱塞，免除了因为柱塞的存在引起气 泡的产生进而会影响柱效的“柱塞效应”。填充柱固定相负载容量大，可供选择 的商品化填料种类多，但固定相微粒填充困难，在芯片上制备重复性好、柱效高 的填充柱仍然不易。整体柱芯片电色谱的制柱过程是通过微加工或原位聚合反 应等方法可以在微流控芯片通道中直接形成固定相，从而避免了填充的困难，而 9 第一章绪论 且也不用制作活塞。微加工制作主要受加工成本和负载容量的限制。原位聚合方 法可以避免填充固定相的困难，没有柱塞效应。利用单体的不同可以制备不同类 型的电色谱柱，制作简单，重复行和耐用性好，可以在选定的通道断引发聚合反 应，但是其研究较少，发展不快。 4 微流控芯片的检测技术踟 检测系统用于获取待测样品有关组分的组成及其含量等信息，是分析装置 中不可少的部分。检测系统的微型化始终是微流控研究领域中的重点和热点。 按照检测原理，微流控芯片系统中的检测器大致可以分为光学检测、电化 学检测、质谱检测等。 光学检测又可根据检测的光信号来源分为检测吸收光的吸收光谱检测、检 测受激后发射光的荧光检测、检测体系自身反应发光的化学发光检测等几类。 其中，激光诱导荧光( l a s e ri n d u c e df l u o r e s e e n e ，l n 9 是目前最灵敏的检测方法 之。l i f 具有灵敏度高、选择性好、响应速度快等诸多优点，故不但在其他 应用领域中使用广泛，也是在微流控系统研究中最先被使用而且现在仍然最常 使用的一种检测技术。 微流控分析系统中电化学检测系统的微型化、集成化研究近年来发展较 快。这是因为在芯片上制作电极比较容易，而电化学的浓度检出限又不会随检 测体积的减小而降低。此外，电化学检测器信号处理系统等外围设备比较简单， 易微型化。根据电化学检测原理的不同，在微流控分析系统中所采用的电化学 检测器主要有安培检测器、电导检测器和电位检澳4 器。安培检测器检测的是电 极电流。具有电化学活性的待测物在某个恒定电位下可在工作电极上产生氧化 或还原反应，反应产生的电子得失过程在系统中形成电流，这种氧化还原反应 所产生电流的大小和待测物的量间存在数学关系，对这一电流进行检测，结合 使用的电位就可对待测物进行定性和定量。有一定的选择性，在h p l c 和常规 毛细管电泳中有广泛的应用。由于其易集成的特点，在微流控分析系统中的应 用也备受重视，并主要应用于芯片电泳分离系统的检测。电导检测器是对溶液 电导率的改变进行检测，不要求待测组分在电极上具有电化学活性，故严格地 讲，它并不是一种电化学检测器。电位检测器是测定指示电极表面相对参比电 极的电势，依据该电势大小对样品进行测定的检测方法。在微流控系统中使用 电位检测的报道不多。 微流控系统与质谱检测器接口的设计与应用在进一步的开展中。质谱( m s ) 技术能够提供试样组分中分子的结构和定量信息。由于电喷雾离子化 ( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ，e s i ) 并f l 基体辅助激光解析离子化( m a u ) i ) 两种“软离 子”技术的发展，使其在特定条件下电离时依然可保持生物大分子的非共价相 第一章绪论 互作用，这对生物分子的组成和功能分析极为重要，故m s 是蛋白和多肽等生 物分子的研究工作中不可或缺的检测技术。当前使用接口将微流控芯片系统和 m s 联用进行m s 分析更为直接，目前主要面临的是接口技术的解决。 第二节微流控技术应用于生物分析的前景展望 无论从文献还是产业化趋势看，微流控分析系统的重点应用领域是生命科学 【3 i 。微流控分析系统由于其明显的应用优势，自出现以来即受到广泛关注，现已 成为当前科技发展的热点之一，目前全世界至少有3 0 多个重要的实验室正在从 事该领域的研究。生物医学的微流控芯片是当前的主要应用领域，研究内容主要 集中在( 1 ) 基因结构与功能的研究，包括d n a 测序、d n a 扩增、单核苷酸多 态性分析、基因的遗传诊断、基因突变检测等；( 2 ) 细胞分析，涉及细胞的分 类与筛选、胞内物质检测、活细胞的实时监控；( 3 ) 免疫分析。已建立的与基 因分析有关的工作平台主要集中在基因的扩增、分离和测序。1 9 9 5 年m a t h i e s 和w o o l l e y l l 3 】首次采用芯片毛细管电泳进行了基因测序研究，l o 分钟内测序约 1 5 0 个碱基，准确率达9 7 。1 9 9 8 年，英国科学家k o p p 和m a i i z l l 4 j 等提出了微 流控p c r 扩增方法，使整个扩增反应全部在流动中完成，从而大大地加快了扩 增速度。1 9 9 8 年，美国r a m s e y 小组【1 5 1 6 l 发表了在微流控芯片上包含细胞裂解， p c r 扩增和电泳分离的基因研究结果，首次完成了多个反应体系在微流控芯片 上的集成。当前发展的总趋势是主要应用玻璃和高聚物微流控芯片、激光诱导荧 光检测技术在生命科学应用中取得突破。 在生物化学领域，生物基因组的排序问题已开创了所谓的后基因时代，现在 俗称“蛋白质组学”。从分析的观点来看，蛋白质组学是一个极具挑战性的领域 1 1 7 1 。9 5 年后崛起的微分析系统研究有望促进使蛋白质组学研究的开展。 微流控芯片可应用于全部( 生物1 化学分析领域，且其产业化程度尚处于起步 阶段，因此有着更为广泛的适应性、应用前景及发展空间。比如在这种芯片上加 上微泵和微闸，就可以很容易地对生物细胞、溶剂、药物等进行各种生物化学和 分子生物学的研究。目前微流体芯片研究的主要方向包括稀有细胞的筛选、信息 核糖核酸的提取和纯化、基因测序、单细胞分析、蛋白质结晶、药物检测等。 微流控芯片研究具备重大潜力，仅经过十年左右的发展，已成为当前科技发 展的热点之一。然而，其投入却远远没有跟上其发展的需要，在微流控芯片的研 究与商品化等各方面都处于领先的美国也仅在9 0 年代中期才有较大投入，日本 从9 7 年开始才正式介入该领域。毕竟起步时间比较晚，其深入研究和市场化有 待于得到进一步的开展。近来，微流控芯片的研究与开发在我国已引起重视。然 而因资金有限，只能侧重最基础性的研究，目前尚难以将实际应用项目列入该重 第一章绪论 大项目研究计划，因此从多方面补充国家支持力度的不足是必要的。根据当前微 流控芯片的迅猛发展及其在生命科学领域中应用的激烈竞争形势，迅速开展微流 控芯片的应用基础性研究已刻不容缓。未来的与生命科学相关的微流控分析仪器 与设备的市场将有很大部分在中国，我们有必要通过加强应用基础研究与开发， 推出具有自主知识产权的微流控分析芯片来至少占领大部份自己国家的市场。 微流控芯片在分析仪器微型化、集成化和便携化方面的优势及其在生物医 学、高通量药物合成筛选、农作物的优选优育、环境检测和保护、卫生免疫、司 法鉴定、生物战剂的侦检和天体生物学研究等众多领域的应用提供了广阔的前景 1 3 】。 第三节微流控芯片分析在生物检测中存在的一些问题简介嘲 在微流控分析系统中，尤其是在微芯片毛细管电泳中，对于依赖e o f 重现 性的夹流或门式进样过程，e o f 的稳定性极为重要。稳定的e o f 可提高迁移时 间的精度，避免样品的反相渗漏，并确保注入样品塞体积的重现性。但是经验证 明在连续多次运行过程中，e o f 的稳定性并不令人满意。这主要是由于通道表 面对样品的吸附，以及缓冲溶液的组分改变了分离通道内表面的毫电势。为了解 决这一问题，常需要加入清洗和处理步骤，以更新微流控芯片的表面以获得稳定 的电渗流，或使用表面改性芯片。 通道表面性能的非均性导致了通道内不同区域的e o f 不同，尤其在通道 交叉处。在同一通道内e o f 的差异导致出现压力梯度，使得液流呈抛物线形而 非平头形，进步导致区带变宽，影响电泳的分离效能。 在芯片毛细管电泳中，由于使用的芯片材料多种多样和微通道网络的复杂 性，以及因不同的加工技术造成的通道截面形状的不同，比如传统的c e 是圆形， 出现了梯形，矩形和半圆形等，这些都使得微通道内表面改性较传统c e 更为复 杂和困难，给研究工作的开展提出了更大的挑战。 综合以上研究中面临的问题，对微流控芯片表面进行改性是实现微流体控制 的较为常用的方法。通过表面改性改变通道内壁表面的电荷密度或极性，改变 e o f 的大小或方向，对于实现控制电渗流和抑制分析物与管壁间的相互作用的 目的是非常有裨益的，以达到提高微流控芯片分析性能的目的。 第四节本论文研究工作的目的及意义 前文简述了微流控芯片技术及其在生物研究领域广泛的应用前景，但是将微 流控芯片最终用于生物分析还有很多的工作要做。针对微流控分析芯片应用中存 在的一些问题，为了提高微流控芯片的分析性能，对微流控芯片进行改性是非常 第一章绪论 必要的。改性对于改善反应器表面对生物分子的吸附和满足分析时电渗流稳定性 要求都非常重要。而且经常由于表面的吸附引起电渗流的改变，进而影响电泳分 离分析的重现性。本论文正是着眼于这一点来研究微流控芯片表面的改性，发展 了聚甲基丙烯酸甲酯聚合物材料表面的修饰新方法，为微流控芯片表面改性提供 新的理念和思路。实验结果表明成功实现了芯片微通道内生物识别分子的有效固 定，构建了蛋白固定相，将该方法应用于氨基酸等生物小分子的分离分析。利用 含生物相容性良好的单体的共聚物材料对聚甲基丙烯酸甲酯( 嗍a ) 基材表面进 行改性研究表明，在憎水的、易吸附且化学惰性的p a 聚合物通道壁成功构建 了生物相容性良好的表面，用该方法修饰改性后的芯片可以更有效地进行底物的 分离。为今后p m m a 微流控芯片的发展和应用做一些基础的探讨工作，旨在能 为生物分析提供了一个很有潜力的研究平台。 参考文献 【1 】m a n z ，丸；g r a b e r ，n ；w i d m e r ，h s e n s a c t u a t o r s 口1 9 9 1 1 ，j ，2 4 4 - 2 4 8 【2 】h a r r i s o n ，d j ；m a n z ，a ；f a n ，z h ；i m d i ，h ；w i d m e r , h m a n a l ( ? h e m 1 9 9 2 ， 6 4 1 9 2 6 - 1 9 3 2 【3 1 ( a ) 方肇伦微流控分析芯片的制作和应用北京：化学工业出版社，2 0 0 s 方肇伦等微流控分析芯片北京：科学出版社，2 0 0 3 【4 】h a r r i s o n ，d j if l u i d ，f ；s e i l e r , 磁；f a n ，z ；e f f e n h a u s e r , c s ；m a n z ，a ；【j 】 s c i e n c e ，1 9 9 3 ，2 6 1 ：8 9 5 8 9 7 【5 】e f f e n h a u s e r c s ，b r u i n gj m ，p a u l u s a 川e l e c t r o p h o r e s i s ，1 9 9 7 ，1 8 ：2 2 0 3 【6 】f i g e y s d ，p i n t o d f j 】a n a lc h e m ，2 0 0 0 , 7 2 ：3 3 0 a 3 3 5 a , 【7 】r o s s i e r j s ，y o u h n o v s k i n ，l i o n n ，d a m o c e ，b e c k e t s ，r e y m o n d e ， g i r a u l t h hi r z y b y l s k im a n g e w 【j 】c h e m i n t e t l ，2 0 0 3 ，4 2 ：5 3 【8 】l i o n n ，g e l l o n j o ，j e n s e n h g k a u b h h j 【j 】c h r o m a t o g xa ，2 0 0 3 ， 1 0 0 3 ：i i 1 9 【9 】p e t e r s o n ，d s ；r o l l r t ；s v e c f ；f r 6 c h e t j m j 【j 】a n a lc h e m ，2 0 0 3 ；7 5 ： 5 3 2 8 5 3 3 5 【1 0 r o b e r t s ，m a ；r o s s i e r , j s ；b e r c i e r , p ；g i r a n l t ，h f j 】a n a lc h e n l ，1 9 9 7 ；6 9 ： 2 0 3 5 2 0 4 2 【1 1 】m a r t ) n o v a ，l ；l o c a s c i o ，l e ；g a i t a n ，m ；k r a m e r , gw ；c h r i s t e n s o n r g ； m a c c r e h a n wa 【j 1 a n a lc h e m ，1 9 9 7 ；6 9 ：4 7 8 3 4 7 8 9 【1 2 b e c k e t , h ；d e i t z , w p r o c s p i e ，1 9 9 8 ；3 5 1 5 ；1 7 7 1 3 第一章绪论 【1 3 】w o o l l e y , a t ，m a t h i e s ，r a ；a n a lc h e m ，1 9 9 5 ，6 7 ：3 6 7 6