（生理学专业论文）大鼠听皮层nmda受体nr2b亚单位蛋白质经验—依赖性的表达.pdf

大鼠听皮层n m d a 受体n i g b 亚单位蛋白质 经验一依赖性的表达 张凌 生理学 听觉神经生物学 孙心德教授 摘要 以往研究表明，n m d a 受体m 毪b 亚单位表达量变化与动物出生后早期的发 育可塑性变化具有相关性。动物出生后的早期经验能够影响n r 2 b 亚单位的基因 表达。推测n r 2 b 亚单位与经验。依赖性发育可塑性密切相关，改变特定脑区 n r 2 b 亚单位的表达量，可能影响相应系统的发育可塑性。 本论文采用w e s t e r n - - b l o t t i n g 技术和免疫组织化学方法，研究了早期听觉剥 夺对大鼠听皮层n r 2 b 受体亚单位蛋白质的年龄一依赖性表达模式的影响，并比 较其与n r 2 b 亚单位m r n a 水平上的变化是否出现时间和空间上的一致。从蛋 白质水平上，对n m d a 受体亚单位n r 2 b 在脑的经验一依赖性听觉功能发育可塑 性中的作用做出评价，为阐明中枢听觉功能发育可塑性的分子机制提供理论依 据。 一、大鼠听皮层n m d a 受体亚单位n r 2 b 蛋白质的年龄一依赖性表达规律 应用免疫组织化学反应和蛋白质杂交技术( w e s t e r n b l o t t i n g ) ，在s d 大鼠生 后各个年龄段，观察听皮层n m d a 受体亚单位n r 2 b 的表达量变化，为研究 n r 2 b 亚单位在年龄依赖性脑听觉发育可塑性中的作用机制提供理论依据。 w e s t e r n - - b l o t t i n g 和免疫组化的结果均显示：生后各时间点听皮层神经元中均有 n r 2 b 亚单位阳性神经元的表达，数量随着年龄的增长逐渐递减，即在出生后就 有高水平表达，之后表达量呈现下调趋势，并逐渐降至成年的低水平。但在出生 后1 3 天( p 1 3 ) 至2 l 天( p 2 1 ) 有一个回升，出现一个短暂的过性表达高峰，随 生业向师 方 究 究 研专研导 后表达水平递减，至p 3 5 天左右稳定在一个低水平，并保持至成年。这表明在 s d 大鼠正常发育过程中，听皮层n r 2 b 亚单位在蛋白质水平上呈现年龄依赖性 表达规律，并且和m r n a 水平上的表达规律相一致，提示这种年龄一依赖j l 生表达 变化与听皮层功能发育相关联。 对n r 2 b 阳性神经元在大鼠听皮层分布规律的观察表明，其密度在听皮质表 层( 2 3 层) 最高，并且随着年龄的增长，该层n r 2 b 阳性神经元的密度下降幅度 较其它层为最大。 二、早期听觉剥夺对大鼠听皮层n r 2 b 受体亚单位年龄一依赖性表达模式的影 响 在大鼠生后1 1 天到1 2 天耳道刚打开之时，实施双耳堵塞，直到被检测时。 结果表明：听觉剥夺组动物中，n r 2 b 蛋白表达随生后天龄增加而下降的总趋势 与正常动物比较没有改变，p 1 4 到p 2 1 之间的表达水平与正常动物相比有明显下 降，其中p 1 4 天下降幅度最大，即正常动物在p 1 3 p 2 1 天之间的一过性高峰被听 觉剥夺抑制，这提示了n r 2 b 与大鼠在发育关键期内听觉功能发育的相关性。 对n r 2 b 阳性神经元在听觉剥夺组大鼠听皮层分布规律的研究表明，其层状 构筑的规律没有明显改变，仍为表层( 2 3 层) 最多，但表达量的下降幅度在各 层有所不同，其中第4 层下降幅度明显高于其它层，这与各层接受和发出信息的 功能是相关的。 关键词：n r 2 b 昕皮质；早期听觉剥夺；发育：w e s t e r n b i o t t i n g ；免疫组织化 学；可塑性 e x p e r i e n c e d e p e n d e n te x p r e s s i o n o fn m d a r e c e p t o r s u b u n i tn r 2 b p r o t e i n i nr a t a u d i t o r y c o r t e x m s c a n d i d a t e ： m a j o r ： r e s e a r c ha r e a ： a d v i s o r ： z h a n gl i n g p h y s i o l o g y n e u r o b i o l o g y o f h e a r i n g p r o f s u nx i n d e a b s t r a e t p r e v i o u ss t u d i e si n d i c a t e dt h a tt h ec h a n g e si nn r 2 be x p r e s s i o np a r a l l e l e dw i t h t h ed e v e l o p m e n t a lc h a n g e so f s y n a p t i ep l a s t i c r y , a n de a r i ye x p e r i e n c et h a ta f f e c t e d d e v e l o p m e n t a lp l a s f i c i t ya l s od e l a y e dt h ed e c l i n ei nn r 2 be x p r e s s i o na n d n m d a r p l a s t i c i t y 、i t l la g e t h u s i tw a ss u p p o s e d t h a tn r 2 bs u b u n i tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l e i ne x p e r i e n c e d e p e n d e n ta u d i t o r yc o r t e xd e v e l o p m e n ti na s s o c i a t i o n 、i mn m d a r c o m p o n e n t sc h a n g e s ，a n dc h a n g e si nn r 2 be x p r e s s i o nw o u l d a f f e c td e v e l o p m e n t a l p l a s t i c i t y u s i n gw e s t e r n b l o t t i n g a n d i r n m u n o h i s t o c h e m i s t r yt e c h n i q u e s ，o u rp r e s e n t r e s e a r c hs t u d i e dt h ee f f e c t so fe a r l y a u d i t o r yd e p r i v a t i o no nt h ea g e d e p e n d e n t e x p r e s s i o no f n r 2 bp r o t e i ni na u d i t o r yc o r t e x ( a c ) ，w h i c hi s c o m p a r e dw i t ht h e l e v e l so fn r 2 bm r n a t e m p o r a l l ya n ds p a t i a l l y t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tn m d a r e c e p t o rs u b u n i t n r 2 b p r o t e i np l a y s ac r i t i c a lr o l ei ne x p e r i e n c e d e p e n d e n t p l a s t i c i t y d u r i n ga u d i t o r yd e v e l o p m e n t , c o n t r i b u t i n g t ou n d e r l y i n gt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f a u d i t o r yd e v e l o p m e n t a lp l a s t i c i t y 1 a g e - d e p e n d e n te x p r e s s i o no fn m d ar e c e p t o rs u b u n i tn r 2 bp r o t e i ni nt h e r a ta u d i t o r yc o r t e x w es t u d i e dt h ee x p r e s s i o no fn m d a r e c e p t o rs u b u n i tn r 2 bp r o t e i ni na u d i t o r y c o r t e xo fs dr a t sd u r i n gp o s t n a t a ld e v e l o p m e n tf r o mp o s t n a t a ld a y1 ( p 1 ) t op o s t n a t a l d a y5 6 ( p 5 6 ) t h er e s u l t sr e v e a l e d ：f o rr a t s i nt h en o r m a l g r o u p ，t h ed e n s i t yo f n r 2 b - p o s f f i v e n e u r o n sc o u l db ed e t e c t e di nt h ea u d i t o r yc o r t e xd u r i n gd e v e l o p m e n t t h ep r o t e i ne x p r e s s i o no f n r 2 bw a st h eh i g h e s ta tb i r t h ，t h e nd e c l i n e dr a p i d l yw i t ha t r a n s i e n tp e a kb e t w e e np 1 3a n dp 2 1 i tr e a c h e dt h ea d u l tl o wl e v e lo np 3 7a n d r e m a i n e du n t i la d u l t t h ed i s t r i b u t i o np a t t e mo fn r 2 b p r o t e i ni na u d i t o r yc o d e x w a sa l s oe x a m i n e d ， r e v e a l i n g t h eh i g h e s td e n s i t yo f n r 2 b p r o t e i ni nl a y e r2 3 d u r i n gt h ep o s t n a t a ld a y s ， t h en r 2 b - p o s i t i v ec e l l sd e n s i t y o f l a y e r 2 3d e c l i n e dg r e a t e rt h a na n yo t h e rl a y e r s 2 ，t h ee f f e c t so fe a r l ya u d i t o r yd e p r i v a t i o no nt h ea g e - d e p e n d e n te x p r e s s i o n m o d e lo fn r 2 b p r o t e i n i na u d i t o r yc o r t e xo fs dr a t s t h eb i n a u r a lp l u g g i n gs t a r t e df r o mt h eo n s e to fe a ro p e n i n g ( p no rp 1 2 ) t ot h e d e c a p i t a t i o nd a y o fd e t e c t i o n w ef o u n dt h a tf o rr a t si nt h ed e p r i v e dg r o u p ，t h ew h o l e d e c l i n et r e n do f n r 2 b p r o t e i ne x p r e s s i o nw a s s i m i l a rt ot h a ti nn o r m a l g r o u p b u tt h e e x p r e s s i o nl e v e lf r o m p 1 4t op 2 8w a sm u c hl o w e rt h a nt h a ti nn o r m a lg r o u p 州也t h e m o s ts i g n i f i c a n tr e d u c t i o no np 1 4 t h a tm e a n st h et r a n s i e n tp e a kb e t w e e np 1 3a n d p 2 1f o rn o r m a lr a t sw a sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yb ya u d i t o r yd e p r i v a t i o n ，s u g g e s t i n g t h a tt h en r 2 bs u b u n i ta s s o c i a t e s 、i mt h ea u d i t o r yf u n c t i o n a ld e v e l o p m e n to fr a t si n c r i t i c a lp e r i o d a f t e r a u d i t o r yd e p r i v a t i o n t h ed i s t r i b u t i o nf e a t u r ed i d n tc h a n g e m u c h ，r e m a i n i n g t h eh i g h e s td e n s f f yo fn r 2 b p r o t e i ni nl a r e r 2 3 a n dc o m p a r e dw i t hn o r m a lr a t t h e p e r c e n to f r e d u c t i o no f a u d i t o r y - d e p r i v e dr a t sn r 2 bp r o t e i ni nt h el a y e r 4o f a ci s h i g h e r t h a no t h e rl a y e r sd u r i n g p o s t n a t a ld e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：n r 2 b ；a u d i t o r yc o d e x ( a c ) ；e a r l ya u d i t o r yd e p r i v a t i o n ；d e v e l o p m e n t ； w e s t e r n b l o t t i n g ；i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ；p l a s t i c i t y ；p r o t e i ne x p r e s s i o n 显逮硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 袁祟刚教授华东师范大学主席 周晓明教授华东师范大学 张季平教授华东师范大学 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果，据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：壅蓬日期：趔出矿 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 学位论文作者签名：- a 瞳 导师签名彦z 尹z 芗终 日期： 生生! 乡日期：星! 鱼竺丝 华东师范大学2 0 0 2 级硕士论文 第一章大鼠听皮层n m d a 受体亚单位n r 2 b 蛋白质的 年龄一依赖性表达规律 摘要 应用免疫组织化学反应和蛋白质杂交技术( w e s t e r n b l o t t i n g ) ，在s d 大鼠生 后各个年龄段，观察昕皮层n m d a 受体亚单位n r 2 b 的表达量变化，为研究 n r 2 b 亚单位在年龄依赖性脑听觉发育可塑性中的作用机制提供理论依据。 w e s t e r n b l o t t i n g 和免疫组化的结果均显示：生后各时间点听皮层神经元中均有 n r 2 b 亚单位阳性神经元的表达，阳性神经元的数量随着年龄的增长逐渐递减， 即在出生后有高水平表达，之后表达量呈现下调趋势，并逐渐降至成年的低表达 水平。但在出生后1 3 天( p 1 3 ) 至2 1 天( p 2 1 ) 有一个表达回跃，出现一个短暂 的过性表达高峰，随后表达水平递减，至p 3 5 天左右稳定在一个低水平，并保持 至成年。这表明在s d 大鼠正常发育过程中，听皮层n r 2 b 亚单位在蛋自质水平 上呈现年龄依赖性表达规律，并且和m r n a 水平上的表达规律相一致，提示这 种年龄依赖性表达变化可能与听皮层功能发育相关联。 研究n r 2 b 阳性神经元在大鼠听皮层的不同层次的密度和分布规律结果表 明，n r 2 b 阳性神经元密度在昕皮层呈现非均匀分布，以昕皮层表层的2 3 层分 布最高。并且随着年龄的增长，该层n r 2 b 阳性神经元的密度下降幅度较其它层 为最大。这可能与各层对信息传入及传出的功能相关。 关键词：n m d a 受体：n r 2 b ；大鼠；昕皮层：发育；免疫组化；蛋白杂交 ( w e s t e r n b l o t t i n g ) ；年龄一依赖性表达 日u舌 动物出生后神经系统的发育经历了一个不断发育、成熟的过程，表现出高度 的发育可塑性1 1 , 2 , 3 a , 5 , e 7 8 ，9 1 。近年来，应用细胞和分子生物学方法研究神经系统功 能发育已有不少报道【l o ，控”。现已知兴奋性氨基酸( e a a ) 是脊椎动物中枢神经 系统主要的兴奋性神经递质。离子型e a a 受体分为n m d a 型和非n m d a 型。 n m d a 受体是一种具有许多不同变构调控位点并对c a 2 + 高度通透的配体门控离 子通道，它由n r t 与n r 2 亚单位构成( 也有报道还有n r 3 亚单位存在【”1 ) ，其中 n r 2 亚单位可能是调节亚单位，不同的n r 2 亚单位组成的n m d a 受体电生理和 华东师范大学2 0 0 2 级硕士论文 药理特性有明显差别。目前研究认为，n m d a 受体与神经系统发育可塑性密切 相关，特别是其亚单位n r 2 b 在脑的功能发育中的作用倍受关注 1 4 , 1 5 , 1 6 , 1 7 , 1 8 l 。近 年来的研究发现n r 2 b 与中枢神经系统的许多高级活动特别是脑的认知功能密 切相关。以往有关动物出生后n m d a 受体亚单位n r 2 b 蛋白质在初级视皮质、 海马、小脑等脑区的表达已有一些报道，脑干、小脑、大脑皮层等相应脑区n m d a 受体亚单位m r n a 呈现年龄一依赖性的时空表达模式，表达模式与脑功能发育及 可塑性相判1 9 ，2 0 ，2 1 ，2 2 2 3 1 。然而，有关听皮层n r 2 b 亚单位生后表达与脑功能可塑 性相关的研究较少，特别是听皮层神经元n r 2 b 亚单位在蛋白质水平表达尚未见 详细报道。 本论文在本实验室已有基础上 8 , 2 4 , 2 扪，应用免疫组化和w e s t e r n - b l o t t i n g 技术， 考察了大鼠生后发育过程中，听皮层n m d a 受体亚单位n r 2 b 蛋白质的年龄- 依赖性表达规律，从功能蛋白的水平上对n m d a 受体n r 2 b 亚单位在脑的经验 一依赖性听觉功能发育可塑性中的作用做出评价，为进一步研究中枢听觉功能发 育可塑性的分子机制提供理论依据。 一材料与方法 1 实验动物处理 实验动物为8 0 只s d 大鼠( s p r a g u e - d a w l e y 品系) ，购自上海医科大学实验 动物中心，为清洁级。由本实验室饲养繁殖。用于w e s t e r n b l o t t i n g 检测的实验 动物分为出生后1 ，4 ，7 ，1 1 ，1 2 ，1 3 ，1 4 ，1 5 ，1 6 ，1 7 ，1 8 ，1 9 ，2 0 ，2 1 ，2 8 ， 3 5 ，5 6 天共1 7 组，每组4 只，取两个样本。用于免疫组化检测的实验动物分为 7 ，1 4 ，2 l ，2 8 ，5 6 天共5 组，每组2 只。 2 w e s t e r n b l o t t i n g 检测 2 1 取材 戊巴比妥钠( 5 0 m g k g b w ) 腹腔注射麻醉动物。立即剥离脑组织，分离出 听皮层a c ( a u d i t o r yc o r t e x ) ( 如f i g 1 所示) ，放入玻璃匀浆器中，加入1 0 倍体 积的匀浆缓冲液( 1 3 7m m o l ln a c l ，2 0m m o l lt r i s ，1 5m m o l l 矾酸钠，l n p 一4 0 ，1 0 g l y c e r o l ，1m m o l l p m s f ，1 0 “矾a p r o t o n i n ，0 2f _ g m ll e u p e p t i n ) ， 低温匀浆1 0m i n ，静置1h ，4 v 下以1 4 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，取上清保存在一7 0 9 c 冰箱中。上样前在样品中加入等体积的2 x s d s 上样缓冲液，l o o 煮沸5m i n 。 2 2 蛋白印迹 用5 的浓缩胶，7 的分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样量为6 0 “山。电泳结束后将蛋白转移至n c 膜上( 2 0 0 m a ，2 h ) ，用封阻液( t b s t + 5 华东师范大学2 0 0 2 级硕士论文 脱脂奶粉) 3 7 封阻2 h ，加n r 2 b 受体多克隆抗体( 兔抗大鼠，1 ：1 0 0 0 ，c h e m i c o n ) 4 c 孵育过夜，t b s t 漂洗后，加二抗( 抗兔，l ：1 0 0 0 0 ，康成) 3 7 孵育lh ， t b s t 漂洗，用e c l 试剂反应，k o d a k 胶片曝光3 0m i n ，冲洗胶片。 3 免疫组织化学法检测 3 1 取材 戊巴比妥钠( 5 0 m g k g b w ) 腹腔注射麻醉动物，开胸，左心室插针，剪开 右心房，进行体循环灌流。先灌流1 0m i n 灭菌生理盐水，再快速灌流4 多聚甲 醛1 0m i n ，然后放慢速度灌流2 0m i n ，取出脑组织，在4 多聚甲醛固定液中4 c 后固定2 h 。之后浸入4 c 的2 0 、3 0 梯度蔗糖- - p b s 至组织块下沉。冰冻切片 机切经过听区的大脑冠状切片，片厚2 0 1 x m ，贴至用a p e s 处理过的载玻片上， 3 7 过夜烘干。 3 2 免疫杂交 切片先后入3 过氧化氢溶液中( 0 3 t r i t o n x 1 0 0 一p b s 配制) ，室温3 0 m i n ；入封闭液( 1 0 绵羊血清一p b s ) 室温孵育1h ；吸去封闭液，加入稀释液( 1 0 灭活的小牛血清一p b s ) 配制的一抗工作液( 同上，1 ；2 0 0 0 ) ，4 c 过液；加生 物素化二抗( 1 ：5 0 ，华美) ，3 7 孵育2h ；加事先温育3 0m i n 的a b 液( s a b c ， 华美) ，在3 7 湿盒中温育3 0m i r a 临用前以d a b 稀释液( o 0 9 2 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 + o 0 2 6g 柠檬酸+ 5m 1 蒸馏水) 将d a b 溶解成0 5m g m l 的浓度，过滤，另加 3 0 过氧化氢至0 0 3 浓度后混匀，阴性对照切片除用一抗稀释液1 0 绵羊血清 代替一抗外，其余步骤同上。将所有切片晾干、脱水、透明、封片。 4 数据处理 4 1 w e s t e r n b l o r i n g 检测 将显龟胶片用凝胶成像系统进行扫描，用q u a n t i t yo n e 软件对胶片上各条带 进行灰度测量，然后以每张胶片上p 1 4 天的灰度值为对照，计算其它各天的相应 灰度值( r e l a t i v ee x p r e s s i o nl e v e l ) 。再用统计学的方法对各值进行比较。实验 数据以m e a n _ - ls e 表示，采用单尾t 检验进行显著性比较。 4 2 免疫组织化学检测 按z i l l e r s 的大鼠定位图谱划分法【2 “，结合本实验室有关听区定位的研究结 果，选取位于听皮层范围内且位置相近的至少2 0 张切片，在光学显微镜1 0 x 2 0 倍放大倍数下统计听皮层的阳性神经元数目。光镜的目镜内放置了有边长为 2 m m 网格的透明塑料薄膜，在每个视野内数出1 0 个固定格子内的阳性细胞数( 格 子的选取呈米字形，按皮层的分层每层两格) 。每个脑片左右侧分别数2 个视野。 再用统计学的方法得出各层单位面积内的平均阳性神经元数目。实验数据以 m e a n + s e 表示，采用单尾t 检验进行显著性比较。 华东师范大学2 0 0 2 级硕士论文 二结果 1 n r 2 b 亚单位抗体的特异性结合能力 w e s t e m - b l o t t i n g 检测结果显示( f i g 2 ) ，n r 2 b 亚单位多克隆抗体具有与n r 2 b 特异性结合能力，与l a n el 标准蛋白m a r k e r 比较，l a n e 2 只在1 7 5 k d 处出现一 条条带，与n r 2 b 亚单位的分子量相一致。 2 生后发育过程中听皮层n r 2 b 亚单位阳性神经元的形态 免疫组化检测结果显示( f i g 3 ) ，j 3 n d a b 显色后的脑片，肉眼即可看到整张 脑片染上棕黄色，层次分明，海马轮廓线条清晰，在光学显微镜下，n r 2 b 亚单 位阳性神经元细胞膜染棕黄色，显色部位为细胞质部分，细胞核未显色，使得整 个细胞呈空泡状。而在阴性对照实验的脑片上则没有任何着色的阳性细胞，只有 淡淡的背景棕色，看不到海马的轮廓。幼年期阳性神经元形态多样，有圆形、椭 圆形、梭形、多角形等，但生后三周以后皮层细胞形状多为圆形。阳性神经元胞 体直径多数在5 0 1 2 0 j m 之间，但在出生后不同天龄和所在听皮层的不同层次略 有不同。生后发育不同天龄中阳性神经元胞体直径大小结果显示( t a b l e 1 ) ，在 刚出生7 天( p 7 ) 时，阳性神经元胞体较小，随着天龄的增长，神经元直径也逐 渐增大，第p 1 4 、p 2 1 天时，神经元胞体直径最大，但成年后，神经元胞体直径又 逐渐变小。 3 生后发育过程中听皮层n r 2 b 亚单位蛋白质的年龄依赖性表达 3 1w e s t e r n - b l o t t i n g 结果 采用w e s t e r n b l o t t i n g 技术分别对出生后1 ，4 ，7 ，1 1 ，1 2 ，1 3 ，1 4 ，1 5 ，1 6 ， 1 7 ，1 8 ，1 9 ，2 0 ，2 1 ，2 8 ，3 5 ，5 6 天动物听皮层n r 2 b 亚单位的蛋白质表达进行 检测，结果显示( t a b l e 2 ，f i g 4 ，f i g 5 ) ，刚出生时听皮层n m d a 受体亚单位 n r 2 b 蛋白就有较高表达，其相对灰度值为5 0 3 2 1 0 2 6 4 7 5 ，之后表达量略有上 升，到第7 天( p 7 ) 蛋白表达高达5 6 6 1 4 2 2 2 1 8 4 ，为各天龄试验组中最高值。 之后，随天龄增长逐渐递减，p 5 6 天时相对灰度值即降至8 8 6 1 6 5 3 0 6 左右。然 而在出生后p 1 3 蟹j p 2 1 之间有个回升趋势。推测可能与此间听功能发育的“关键期” 有关，然后相对灰度值降至p 3 5 天的9 2 4 5 8 4 8 9 5 ，并保持低水平表达至成年。 3 2 免疫组化结果 用免疫组化技术分别对出生后7 ，1 4 ，2 1 ，2 8 ，5 6 天动物昕皮层n r 2 b 亚单 位的蛋白质表达检测显示( t a b l e 3 ，f i g 6 ，f i g 9 a ) ，n r 2 b 阳性神经元在出生 后第1 周( p 7 ) 密度最高，之后随着天龄的增加，阳性神经元密度逐渐递减，到 第3 周( p 2 1 ) 时阳性神经元密度较第1 周已下降了近4 5 ，从第3 周至成年动物 华东师范大学2 0 0 2 级硕士论文 ( p 5 6 ) 一直保持低水平表达。f i g 6 分别显示出生后p 7 ，p 1 4 ，p 2 1 ，p 2 8 ，p 5 6 各实验组听皮层阳性神经元的分布情况。各天龄中阳性神经元分布密度总结在 t a b l e 3 中，p 7 天时阳性神经元密度高达1 8 1 6 0 - x 0 5 8 ，而至e j p 2 1 天已递减到9 2 5 6 士2 6 0 。同时可见，两侧听皮层n r 2 b 阳性神经元分布密度基本一致，p 0 0 5 ( f i g 7 ，f i 9 8 ，f i 9 9 b ) 。 3 3 两种方法的检测结果都显示( f i g 1 0 ) ，大鼠昕皮层n m d a 受体亚单位n r 2 b 蛋白具有年龄一依赖性表达模式。其大体趋势都是随着年龄的增长，n r 2 b 亚单 位蛋白质的表达量降低，直至成年水平。 4 生后发育过程中，n r 2 b 亚单位阳性神经元在听皮层各层的分布 根据免疫组化的检测结果，听皮层n r 2 b 阳性神经元在动物生后的前2 周呈 现较明显层状分布趋势，分子层几乎未见阳性细胞，阳性细胞主要分布于表层 ( 2 3 ) 和第6 层。第4 层和第5 层也有不少阳性神经元，但都不及表层( t a b l e 4 ， f i g 1 1 ，f i g 1 2 ) 。表层细胞密度最大，胞体小；中间层阳性神经元胞体大，细胞 轮廓明显，密度较小；内层细胞胞体小，密度较大。我们参照g a m e s 等人应用 g o l g i c o x 技术及n i s s l 染色法对s d 大鼠皮层构筑研究结果 2 6 1 ，对应于本实验结 果，将n r 2 b 亚单位在听皮层各层表达变化趋势做了统计。从中可知，在前3 周内，n r 2 b 亚单位在2 3 层的分布密度下降最为显著，各天龄之间的差异都很 明显，p 0 0 5 ( f i g 1 3 ) 。 三讨论 1 n r 2 b 蛋白质在听皮层的年龄一依赖性表达及与听功能发育可塑性的关系 已有研究表明，n m d a 受体n r 2 b 亚单位表达具有年龄依赖性规律。早期 应用基因表达检测方法，免疫印记和免疫共沉淀等方法研究了n m d a 受体年龄一 依赖性表达规律，结果表明n r 2 b 亚单位在m r n a 和蛋白质水平上的表达量在 出生时就接近最高水平，在之后的前两个星期表达量略有升高，之后一直下降至 成年水平 2 7 , 2 8 , 2 9 , 3 0 】。l a u r i e 等人利用免疫杂交技术对新生大鼠的大脑研究表明， 出生时n r 2 b 就有很高的表达量，出生后保持持续增长，到2 0 天左右达到最高 水平，之后逐渐下降至成年水平1 2 9 1 。w a n g 等也在大鼠的小脑中得到类似的结果 【3 】。s h e n g 等人研究表明，n r 2 b 亚单位在生后第一天即在前脑有高水平表达， 其它脑区如嗅球、端脑、海马、体感皮质等在生后第1 0 一1 4 天出现表达高峰，之 后表达递减，到生后第2 1 天进入稳定的低表达水平，直保持到成年 2 0 , 2 1 。目 前对皮层n r 2 b 亚单位表达量的变化情况的研究主要集中在视皮层上【1 9 , 3 1 】，关于 华东师范大学2 0 0 2 级硕士论文 听皮层的研究相对较少，而且还只局限于检测听皮层上n r 2 b 亚单位m r n a 表达 量的年龄依赖性变化规律，在蛋白质水平上的检测至今还没有报道。h s i e h 等研 究了大鼠听皮层n r 2 b 亚单位m r n a 的表达情况，发现n r 2 b 亚单位m r n a 在 出生后4 天即有高水平的表达，之后逐渐升高，直到达到最高水平，然后缓慢下 降至成年水平【2 2 1 。我们实验室应用d i g 标记的原位杂交方法对听皮层n r 2 b 阳 性神经元密度检测表明，由生后第3 天阳性神经元的高密度表达，到生后第2 1 天，阳性神经元密度下降了近6 0 。但是，众所周知，在生物体内真正能发挥 功能作用的是蛋白质，而非基因水平，为此，本论文在我们实验室原有的基础上， 运用w e s t e r n b l o t t i n g 和免疫组化技术从时间和空间上对正常s d 大鼠听皮层 n r 2 b 亚单位的蛋白表达进行检测。 结果显示，在正常大鼠出生时n r 2 b 亚单位蛋白即有较高水平的表达，随后 其表达量略有上升，到生后第7 天( p 7 ) 到达最高点，之后表达量呈现下调趋势， 在p 1 3 p 2 1 天左右又略有回升，至p 3 5 天稳定在一个低水平，并保持至成年。这 与本实验室在m r n a 水平上的检测结果基本一致。即大鼠生后n r 2 b 亚单位就 有高水平表达，随着年龄增长，表达量逐渐下降至成年低水平。但在p 1 3 一p 2 1 期 间( 大鼠听觉发育关键期) n r 2 b 亚单位表达量又有所升高，表现出一过性高峰。 可见，生后发育过程中，大鼠听皮层神经元n r 2 b 亚单位蛋白质水平的表达和 m r n a 水平呈现相一致的年龄一依赖性的下调表达模式。 已知n m d a 受体是由n r l 和n r 2 两种亚单位形成的功能性寡聚体( 有报 道存在n r 3 a 和n r 3 b 亚单位【32 j ) 。其中n r l 是n m d a 受体的必需亚单位，而 n r 2 亚单位有n r 2 a ，n t 2 b ，n r 2 c ，n r 2 d 四种亚型，它们均不能单独形成 功能性受体，只有于n r l 亚单位结合后，才具有活性。不同亚单位结合的异寡 聚体，虽显示n m d a 受体的许多功能特性，但又表现出各自独有的性质。近年 来的神经生物学研究发现，由不同n r 2 亚单位组成的n m d a 受体中，由n r 2 b 亚单位组成的n m d a 受体在发育可塑性中扮演了举足轻重的作用【3 2 1 。 已有研究证实，在成年小鼠，n r 2 a 将取代n r 2 b 成为皮层和海马等脑区占 主导地位的n m d a 受体亚单位。s h i 等报道，动物出生后发育过程中，皮层n m d a 受体的组成和数量发生年龄依赖性的变化，n r 2 b 亚单位表达下降，同时n r 2 a 亚单位表达增加，相应的n m d a 受体介导的电流时程缩短，伴随可塑性下降 3 3 1 。 n a k a n i s h 等人的研究表明，n r 2 b 亚单位表达量变化与动物发育可塑性变化在时 间上平行出现 3 4 1 ，均提示n r 2 b 亚单位可能在发育中起重要作用。 n r 2 b 基因敲除研究表明，n r 2 b 基因敲除的小鼠，胡须相关的神经元的柱 状结构不能形成，脑干三叉神经核中主要感觉穿入末端的会聚也遭到破坏。同时 这种小鼠海马中突触n m d a 电流和长时程抑制( l t d ) 也消失【3 5 】。其它的n r 2 b 华东师范大学2 0 0 2 级硕士论文 基因敲除研究证实，n r 2 b 亚单位的缺失选择性地减少了f i m c a 3 突触的n m d a 兴奋性突触后电流和长时程增加( l t p ) 。相反，t i s e n 的研究中使n r 2 b 基因超 表达，使m d a 受体通道开放时间延长，诱导的l t p 增加，具有显著增强的学 习和记忆能力 1 ”。因此，有正常功能的n r 2 b 亚单位的表达量发生变化的同时 伴随着可塑性的变化。 本实验室所观察到的n r 2 b 蛋白表达在p 1 3 p 2 1 天之间的一过性高峰，推测 与听觉功能发育有着密切的关系。既然听觉发生在第2 周早期( 生后1 1 天，外 耳道打开) ，接下来的时期对于听觉经验驱动的可塑性则是最重要的【2 2 】。这就是 所谓的“关键期”，在此期间的n r 2 b 蛋白的高表达很可能对听觉的迅速发育起 着重要作用。相关的研究工作也有推测，如前脑过量表达n r 2 b 的转基因小鼠中， n m d a 受体活动加强，对1 0 - i 0 0 0 h z 刺激的突触加强也得到易化，在各种行为 测试中的学习和记忆能力也更强，表明n r 2 b 在介导可塑性和记忆形成的开始 ( 依赖于一定天龄) 中起关键作用【1 5 l 。另外有不少报道称，啮齿类动物感觉皮层 的胡须相关模式的发育和可塑性也由n m d a 受体依赖的神经元活动所介导，视 皮层的视觉优势柱也同样如此 3 6 , 3 7 , 3 8 j 。 n m d a 受体的发育性调节可能是突触可塑性和大脑功能定位图可塑性的一 种机n t l , 3 9 , 4 0 a “。一种有吸引力的模型是，丘脑皮层表达的n m d a 受体总量的发 育性下降而非亚基组成本身的变化调节，足以控制关键期的时间窗【4 2 1 ，尽管对此 尚有争议，但n m d a 受体在突触可塑性中的重要作用却不容质疑。而在n m d a 受体的众多亚单位中，n r 2 b 亚单位尤其重要，它是位于突触后致密物质上分子 量约为1 7 5 k d 的糖蛋白，c 一末端2 8 的酪氨酸残基能被磷酸化，是突触后致密 物质中最重要的酪氨酸磷酸化蛋白。n r 2 b 通过酪氨酸磷酸化调控自身的通道活 性，与含s h 2 结构域的蛋白质结合，参与突触后膜上的信号传导，改变突触强 度，导致可塑性的变化1 3 孤。 2 正常大鼠n m d a 受体n r 2 b 蛋白表达在听皮层的分布规律 从细胞的形态学来分析，皮层分为6 层，分别检测在不同年龄时各层的神经 元胞体大小和神经元分布密度。我们关于n r 2 b 蛋白在听皮层的层次分布特征的 结果与其他报道基本一致。结果显示：n r 2 b 亚单位阳性神经元在听皮层各层中 的分布密度不尽相同，以听皮层的2 3 层密度最高，第4 、5 层密度略有降低， 第6 层的密度又有上升，呈现明显的层状表达模式。这与生后发育中听皮层 m r n a 表达模式也极为相似【5 7 9 1 。h s i e h 等在大鼠听皮层观察到，n r 2 bm r n a 在听皮层第1 层几乎未见表达，第2 、3 层表达最高，第4 、5 层表达略有下降， 底层表达量又有上升【2 射。崔一蕾、卢静萍等应用原位杂交技术分别检测大鼠听皮 层n r l 和n r 2 bm r n a 表达，也获得相似的结果【2 ”。听皮层生后早期n r 2 b 华东师范大学2 0 0 2 级硕士论文 亚单位的高表达和层状表达模式，可能反映了听觉中枢神经元功能活动的差异。 哺乳动物初级听皮层2 3 层主要接受来自丘脑内侧膝状体的传入投射，同时也有 纤维投射到其它皮层结构，听皮层的3 、4 层主要接收内侧膝状体腹侧( m g v ) 的传入投射 4 4 , 4 5 , 4 6 。听皮层的5 、6 层则除接受内侧膝状体的中部( m g m ) 的投 射外，主要是向内侧膝状体和中脑下丘的传出性投射【4 7 , 4 8 】。大鼠外耳道打开是在 生后第9 天，生后第1 0 天已可以记录到听皮层神经元对声刺激的诱发反应。外 耳道打开之后，大量的外界声音信息传入中枢听觉神经系统，从而激活相关神经 网络和神经元突触连接的快速发育，特别是听皮层下行传出系统也将迅速完善。 可见，生后发育早期，听皮层n r 2 b 亚单位m r n a 水平和蛋白质水平的高表达， 可能反映了听皮层功能活动的状态。 华东师范大学2 0 0 2 级硕士论文 版图与说明 9 华东师范大学2 0 0 2 级硕士论文 t a b l e 1 a v e r a g eo f n r 2 bp o s i t i v eh e u r o h $ d i a m e t e r ( i i m ) i nr a ta u d i t o r y c o r t e xd u n n g p o s t n a t a ld e v e l o p m e n t p o s m