（应用化学专业论文）L高精氨酸盐酸盐及二肽的合成.pdf

东南大学硕士学位论文 摘要 氨基酸及其衍生物一肽的合成是近年来迅速发展起来的一个新研究领域，它们在医 药，化工、食品、农业等方面有着潜在应用价值，可用作为药物中间体、食品添加剂、化 妆品添加剂等，应用前景广阔。研究开发工艺简单、成本低、产品质量高且易于工业化生 产的氨基酸及其衍生物一肽的制备技术具有重要的理论和实际意义。 本文研究了l 一高精氨酸盐酸盐和三种甘氨酰二肽的制备工艺，并对采用的合成工艺作 了较为系统的研究，继而分别以l - 赖氨酸盐酸盐、甘氨酸、l 缬氨酸和l 苯丙氨酸为原料 制备了l 一高精氨酸盐酸盐和三种甘氨酰二肽。对产品进行熔点、旋光度、元素分析、红外 ( 瓜) 和高效液相色谱( 脚c ) 等相关表征和含量分析，确定合成产物即为目标产物，其 主要质量指标均已达到相关标准。经对反应影响因素的优化，得到了符合工业化生产的较 佳工艺条件。 以l 赖氨酸盐酸盐为原料，经过与二价铜配位、位氨基的胍基化和除铜三步反应制 备了l 高精氢酸盐酸盐。对原料配比及反应时间等影响因素进行了试验及优化，确定了较 佳工艺条件。最终得到的产品纯度大于9 9 ，反应总收率4 1 o 以上。 以甘氨酸为原料经过氯乙酰化制备了氯乙酰甘氨酸，氯乙酰甘氨酸在6 0 恒温反应条 件下氨解1 0 h 生成甘氨酰甘氨酸。反应总收率可达5 7 以上，产品含量 9 8 o 。 以l 缬氨酸为原料经过氯乙酰化制备了氯乙酰l 缬氨酸，氯乙酰l 缬氨酸在6 0 恒 温反应条件下氨解1 0 h 生成甘氨酰山缬氨酸。对氯乙酰化反应的影响因素进行试验及优 化，确定了较佳工艺条件。产品总收率可达7 5 左右，产品含量 9 9 0 。 以l 苯丙氨酸为原料经过氯乙酰化制备了氯乙酰l 苯丙氨酸，氯乙酰。苯丙氨酸在 6 0 c 恒温反应条件下氨解1 0 1 1 生成甘氨酰l 苯丙氨酸。对氯乙酰化反应的影响因素进行试 验及优化，确定了较佳工艺条件，产品总收率可达7 9 以上，产品含量 9 9 0 0 , 6 。 上述产品的工艺开发为其工业化生产奠定了基础。 关键词：l - 高精氨酸盐酸盐；甘氨酰甘氨酸；甘氨酰- l 瑚氨酸；甘氨酰山苯丙氨酸；氯乙 酰化；氨解 东南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h es y n t h e s i so f a m i n oa c i d sa n dt h e i rd e r i v a t i v e s - p 印廿d e sh a v et e p i d l yd e v e l o p e di n t oa n e wr e s e a r c hf i e l di nm e d i c m e ，c h e m i s 的, f o o di n d 懈t r ya n d 倒c i l l n l i nr e c e n ty e a r s t h e s e c o m p o u n d sh a v eb e e nw i d e l yu s e da st h ed r u gi n t e r m e d i a t e s ，f o o da d d i t i v e s ，c o s m e t i ca d d i t i v e s e t c a n dt h eo t h e rb r o a dp r o 罐a e c t s s or e s e a r c h e so l ll o o k i n gf o rt h er e a s o n a b l ew a yo f p r e p a r a t i o n o f a m i n oa c i d sa n dt h e i rd e r i v a t i v e s - - p e p t i d e sa r eo f g r e a tt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e t h i sp a p e rs t u d i e st h ep r e p a r a t i o nt e c h n o l o g i e so fl - h o m o a r g i n i n eh y d r u c h l o r i d ea n dt h r e e d i p e p t i d ec o m p o u d ss y s t e m a t i c a l l y t h es y n t h e s i s o f l - h o m o a r g i n i n eh y d r u c h l o r i d e ， g l y c y l g l y c i n e ，g l y c y l - l - v a l i n ca n dg l y c y l l - p h e n y l a l a n i n ew e r ea l s os t u d i e db yu s i n gl l y s i n e h y d r o c h l o r i d e ，四y c i n e ，l - v a l i n ea n dl - p h o n y l a l a n i n e a st h er a wm a t e r i a l r e s p e c t i v e l y f i n a l p r o d u c t sw c r ec h a r a c t e t i z e db ym e l t i n gp 0 “，o p t i c a lr o t a t i o n , i r , e l e m e n ta n a l y s i s ，h - n m r , h p l ca n dt h e i rm a i n q u a l i t i e sc o r r e s p o n d t ot h er e l a t e ds t a n d a r d s l - l y s i n eh y d r o c h l o r i d ea st h er a wm a t e r i a l ，t h ep r o d u c tl - h o m o a r g i n i n eh y d r u c h l o r i d ew a s o b t a i n e db yt h r e es t e p sr e a c t i o n s ：c o o r d i n a t i n gw i t l lc o p p e ri o n , g u a n i d a t i o na n dr e m o v i n g c o p p e r , t h ei n f l u e n t i a lf a c t o r so nt h es y n t h e s i sw e r es t u d i e da n do p t i m i z e d t h e nt h ef i n a l p r o d u c tw a so b t a i n e dw i t hy i e l do f o v e r4 1 a n dt h ep u r t yw a sm o r et h a n9 9 o c h l o r a c e t y l g l y c i n ew a sp r e p a r e df r o mg l y c i n ea n dc h l o r a c c t y l ec h l o r i n e g l y c y l g l y c i n ew a s o b t a i n e db ym e a n so fa m i n o l y s i sa tt h et p e m t u r eo f6 0 c t h et o t a ly i e l do fg l y c y l g l y c i n ew a s u pt o5 7 a n dt h ep u r i t yw a sm o r et h a n9 8 o g l y c y l - l - v a l i n ea n dg l y c y l - l - p h o n y l a l a n i n ew o r ep r e p a r e db yt h es 锄mp r o c e s s t h e “1 w m a t e r i a l sa ml - v a l i n ea n dl p h 铷洲a n i 肿r e s p e c t i v e l y t h et o t a l y i e l do ft h ep r o d u c t sw e r e 7 5 7 9 r e s p e c t i v e l ya n dt h ep u r i t yw e b o t hm o r et h a n9 9 o t h ei n f l u o n f i a lf a c t o r so i lt h e s y n t h e s i sw e r es t u d i e da n do p t i m i z e dt o o t h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e d e t e m m a e d t h e s er o u t e sl a i dt h ef o u n d a t i o nf o ri n d u s t r i a lp r o d u c t i o n k e yw o r d s ：l - h o m o a r g i n m eh y d r o c h l o r i d e ，g l y c y l g l y c i n e ，g l y c y l - l - v a l i n e ，g l y c y l - l - p h e n y l a l a n i n e ，e h l o r a c e t y l a t i o n ，a m i n o l y s i s 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：萄；享 日期： 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交 学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论 文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内 容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：恤导师签名：勾虹日期： 第一章绪论 1 1 氨基酸概述 第一章绪论 氨基酸是生物有机体的重要组成部分，在生命现象中起着至关重要的作用。随着生物 科学的进步，人类对生物体内的生理机能及代谢活动进一步了解，氨基酸在生物体的重要 生物机能越来越清楚。氨基酸是生命机体之营养、生命发展极为重要的物质，在生命体同 物质代谢调控、信息传递方面扮演重要角色。每个氨基酸至少有一个氨基和一个羧基，所 以它是一种两性化合物。按其存在形式，氨基酸可以分为天然氨基酸和非天然氨基酸。天 然氨基酸广泛存在于自然界中，是蛋白质的基本组成单元，而蛋白质不仅组成了生物的肌 肉、皮肤、头发及其它重要组织，而且作为酶、抗体、抗原、激素，对调节和维持生命起 着重要作用。氨基酸是羧酸分子中一个或一个以上氢原子被氨基取代后生成的化合物，其 取代的位置有a 、p 、t 之分。在蛋白质中发现的氨基酸有二十多种，它们都是羧酸分 子中a 一碳原子上一个氢原予被氨基取代而生成的化合物，故称为伍一氨基酸，结构通式如 下： 早p r k 臣。h 若r 不为氢原子，则该氨基酸具有不对称碳原子，因而具有光学活性。除甘氨酸外大 多数n 一氨基酸都具有不对称碳原子，均具有光学活性，存在d 一型和l - 型两种对映体【i 。 非天然氨基酸是人工合成的氨基酸，有的是在天然氨基酸中引入一些基团以改进其性 能，有的则与天然氨基酸完全不同，是分子设计的结果。非天然氨基酸主要应用于多肽的 研究中。近年来由于对氨基酸、多肽和蛋白质在生命活动中的作用的研究日趋深入，以及 越来越多的具有生物功能的活性多肽的发现，合成手段愈益成为研究结构与功能的关系十 分有用的方法。对于氨基酸，特别是特殊结构的氨基酸的需求越来越大，现有的氨基酸品 种已经远远不能满足需求，非天然氨基酸的合成可以缓解这一矛盾，所以它已成为一个非 常活跃的研究领域。 1 1 1 氨基酸的性质 n 一氨基酸都是无色晶体，易溶于水而难溶于无水乙醇、乙醚等有机溶剂。它们具有 较高的熔点，且大多在熔化的同时发生分解。由蛋白质水解得到氨基酸除甘氨酸外都具有 旋光性。它们的碳原子的构型都与l - 甘油醛相同，属于l 型。若用r - s 标记法，这些氨 基酸a 碳原子的构型都是s 型。但习惯上用d l 标记其构型。 氨基酸分子中含有氨基和羧基，它们具有氨基和羧基的典型性质。例如，羧基可以发 i 瓶 东南大学硕士学位论文 生酯化反应：氨基可以发生酰基化反应；氨基和亚硝酸作用可转变为羟基；等等。此外， 由于官能团的相互影响，氨基酸还有一些特殊的性质。 ( 1 ) 酸碱性：两性和等电点 氨基酸既含有氨基又含有羧基，它既可以和酸生成盐也可以和碱生成盐，氨基酸在水 溶液中又会离子化，可作为酸或碱。氨基酸在水溶液中时是一完全离子化的状态，在酸性 溶液中能和h 结合生成阳离子，在碱性溶液中能与o h - 结合而失去质子变成阴离子，是一 种两性电解质。当氨基酸所处环境显电中性的p i - i 值称为该氨基酸的等电点( p 1 ) 。 ( 2 ) 成盐反应 氨基酸与酸碱都能形成盐，并多能溶于水。与重金属形成的盐，多数不能溶于水。可 利用成盐的性质，进行分离，精制。如赖氨酸易吸潮，不易结晶，作成盐酸盐后则不吸潮 易结晶，便于保存。精氨酸与阿司匹林可制成注射剂等。 ( 3 ) 茚三酮反应 a 一氨基酸与茚三酮水合物共热，被氧化产生醛、氨、二氧化碳，而茚三酮水合物被还 原。在碱性溶液中还原的茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合为蓝紫色化合物。反应中产生 的二氧化碳以及颜色可用来定性定量氨基酸。 ( 4 ) 受热后的反应 由于氨基和羧基相对位置的不同，口一、p 一、t 一等氨基酸受热后所发生的反应也是不 相同的。 ( 5 ) 离子交换反应 氨基酸的阳离子与阴离子可以同溶解度小的电解质进行离子交换，生成不溶的氨基酸 盐。 1 1 2 氨基酸的来源 氨基酸生产方法主要有水解提取法、化学合成法、微生物发酵法以及酶合成法等。 1 1 2 1 蛋白质水解提取法 水解提取法是最早发展起来的生产氨基酸的基本方法。它是以蛋白质为原料，经酸、 碱或以蛋白水解酶水解后，再分离纯化各种氨基酸的工艺过程。由于氨基酸生产技术的进 步，由蛋白质水解液提取氨基酸的方法受到很大的冲击，但是在医用氨基酸的生产中仍有 其存在的价值。特别是在应用微生物技术相对比较落后、基本化工原料的品种缺乏、装备 较差的国家，许多药用氨基酸品种还得依靠提取法提供。 1 1 2 2 氨基酸的化学合成方法t 2 ，3 1 氨基酸都是低分子化合物，采用化学合成手段制造氨基酸占有一定的地位，特别是 以石油化工产品为原料时，价格低廉，成本低，适合工业化生产但由于应用化学合成 法所得的氨基酸都是外消旋体，其中d 一异构体不能为生物利用，故用化学合成法生产氨 2 第一章绪论 基酸时除考虑合成工艺条件外还需进行拆分才能得到l - 型产品。 ( 1 ) r 卤酸的氨化 c a l l o u r s 用n h 4 a c 处理n 一氯乙酸，首先合成了甘氨酸。此法适用于几乎所有的脂肪族旺- 氨基酸的制备，但一般收率较低，尤其是低碳链的旺- 卤酸，如氯乙酸在氮化中可以生成 二乙酸胺及三乙酸胺等副产物。但s h e e h a n 等采用邻苯二甲酰亚胺钾盐作为r 卤酸乙酯的氮 化剂，以d m f 为溶剂，可在较低的温度下及短时间内反应，其中间体经酸或肼水解便可得 到相应的r 氨基酸。其它常作为氨化剂的还有乙二酰亚胺和六次甲基四胺等，与a 一卤代羧 酸及其酯类反应，均具有反应迅速、经济、收率高的特点。 ( 2 ) a s t r e c k e r 合成法纠 此法合成氨基酸已有悠久的历史，是用醛或酮与h c n 或n h 4 c n 反应再经水解就可以 容易地得到相应的( ) 一氨基酸。由于方法改进，至今在氨基酸工业生产中仍有很大实用 价值，如：用甲醛、乙醛、异丁醛即可分别合成甘氨酸，丙氨酸、缬氨酸，用反应式表示： 逼咄墨牟伽二 当用n i h c i i k c n 分别代替其中的n h 3 与h c n 时，反应可连续进行。此法原理简单，价格 低，但反应条件苛刻且生成的氰化物有剧毒，产率也不高。为此，b u c h e r e r 改用( n h 4 ) 2 c 0 3 和n a c n 与醛反应先得到乙内酰脲，再经水解即可得到所需氨基酸，如d l - 蛋氨酸的合成： 竺竺3c h 3 s c h 2 c h 2 c t c h o 、_ 、o h c h 3 s c h 2 c h 2 c h c o o h 喝8 咀啦瓦石 k 、一一 t ( 3 ) 醛与具有活性亚甲基化合物缩合嘲 合成芳香族r 氨基酸大都采用芳香醛或者杂环的醛类化合物与具有活性亚甲基的乙酰甘 氨酸，在n a a c 和a t 2 0 存在下首先缩合生成氮杂内酯，然后经催化剂催化氢化还原，最后于 碱或酸性条件下水解，即可得到对应的氨基酸，用反应式表示： 下 c o ( 玛a c 2 0 - a f c h = f 一年= o 催化剂 a r c h o + 一一n a o a c 矗了 c h 2 c o o h n 心 h 2 l 艄h 2 一p f 2 0 o h i - i +2 卜+ a r c h 2 一c c o o h l t o k u d a 用此法合成d l - 7 酰苯丙氨酸时，曾将其氮杂内酯于碱性条件下以活性镍为催 化剂于4 7 m p a 压力下直接氢化水解获得成功，提高了收率。同样，芳香醛或杂环醛化合 物与具有活性亚甲基的乙内酰脲缩合，再经还原、水解也很容易得到相应的氨基酸。 此外，e t 本科学家赤崛【7 1 用甘氨酸铜盐与醛在碱性条件下缩合加成，再经脱铜的方法 合成了p 一羟基1 一氨基酸。如d l - 苏氨酸、d l 丝氨酸的合成，其反应迅速，操作方便，已 3 一 ， 时一 讲 i 东南大学硕士学位论文 为大工业生产所采用，反应原理是： 2 r c h o + c o ：2 弋n 、卢 h 2 o r 斡一p 一 r x a 洲f c 0 0 q 坞) 2 矿 c 0 2 h2nchcoohachn c h ( c o o c a h s ) ：一。一2 二二一一l h 2 c o 洲+ m z _ + 计( f 删) 。+ h z ( 置0 0 y ) 。+ 肽一卜芒删+ 蜮 1 1 2 3 微生物发酵法 氨基酸发酵法生产是1 9 5 7 年日本突破了谷氨酸发酵技术之后发展起来的，主要是借助 微生物具有合成自身所需各种氨基酸的能力，通过对菌株的诱变等处理，选育出各种营养 4 第一章绪论 缺陷型及抗性的变异株，以解除代谢调节中的反馈与阻遏，达到过量合成某种氨基酸的目 的。近年来，遗传学和生物工程技术被引进菌种选育后，氨基酸高产菌株不断出现，使发 酵法有了进一步的发展。目前有6 0 以上的氨基酸采用发酵法生产。但发酵法存在发酵液浓 度低、反应时间长、副产物较多、分离精制花费大、设备规模庞大、动力费用高等缺点。 1 1 2 4 微生物酶法 微生物酶法生产氨基酸始于2 0 世纪7 0 年代，是在有机合成法与发酵法的基础上发展建 立的，它是利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸的方法。它的特点：以化学合成 法、生物合成或天然存在的氨基酸前体为原料或基质，利用酶促反应直接制各各种氨基 酸，收率高，成本低。日本1 9 7 3 年用固定化菌体法成功进行天冬氨酸的生产，从此酶法生 产氢基酸为发酵工程的发展带来了新的生机“。近年来，固定化酶和固定化细胞的新技术 得到了迅速发展。利用这种新技术，在日本已能连续生产l - 天门冬氨酸、l - 丙氨酸、卜赖 氨酸等。另外，运用酶的可逆反应，即用水解酶由氨基酸中间体可直接合成l 氨基酸。 i i 3 氨基酸工业发展趋势及其应用 1 8 1 0 年，w o l l a s t o n 从膀胱结石中分离出胱氨酸。1 9 0 8 年日本人i k e d a 发现谷氨酸钠 是鲜味剂，随后氨基酸工业得到迅速发展。随着生物工程技术产业逐渐成为2 1 世纪全球的 主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目 前，世界上氨基酸的主要生产国家有日本、美国，德国、法国、中国等，日本在氨基酸方 面的研究、开发、生产技术、品种及产量上均眉世界领先地位。中国氨基酸的需求总量为 1 0 1 5 万吨( 实际产量为3 万吨) ，其中蛋氨酸5 万吨，赖氨酸6 4 万吨【l “。 我国自2 0 世纪5 0 年代起，氨基酸应用范围不断扩大，形成了一个朝气逢勃的新兴工 业体系。医药、日用化工、农业、冶金，环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐 年增加。近几年来，在研究、开发和应用氨基酸方面均取得重大进展，发现的新氨基酸种 类和数量已由6 0 年代5 0 种左右，发展到8 0 年代的4 0 0 种，目前已达1 0 0 0 多种。其中用 于药物的氨基酸及氨基酸衍生物的品种达1 0 0 多种世界氨基酸的需求量也越来越大，世 界氨基酸的年增长率为1 0 。氨基酸作为发展中的产业，市场潜力很大。前景十分诱人。 1 1 3 i 在医药行业的应用 以氨基酸为原料的激素、抗菌素、抗癌剂等生物活性多肽日益增多，在工业上已生产 的有谷胱甘肽、维生素b 6 、催产素、及泛酸钙等。近年来又开发了复方氨基酸制剂，如赖 氨酸一维生素滴剂等，具有促进儿童生长发育、治疗各种梅毒及提高血球数等疗效”】。氨 基酸衍生物和多肽的药用价值和发展前景无论在治疗肝脏疾病、心血管疾病，还是溃疡 5 东南大学硕士学位论文 病、神经系统疾病等方面，都已被广泛使用。如n 一乙酰半胱氨酸甲酯盐对支气管炎有很好 疗效【”】。市场对手性药物需求的日益增长也促进了药用氮基酸的增长。氨基酸被广泛用作 药物分子的活性结构模块而为药物分子引入手性。如苯丙氨酸是合成某些抗癌药物的中 间体等。脯氨酸是合成心血管药卡托普利、依那普利等a c e 抑制剂的主要中间体”】。 1 1 3 2 在饲料添加剂行业的应用 ，中国在饲料添加剂行业用的氨基酸主要有蛋氨酸和赖氨酸。其功效主要是：促进动物生 长发育；改善肉质，提高畜禽生产能力，增加产量；提高饲料利用率，节省蛋白质饲料， 降低成本。国际上配合饲料的发展趋势是以“维生素+ 矿物质+ 氨基酸”为主要添加剂，以 缓解蛋白质饲料资源供需矛盾。据饲料工业发展规划，届时所需的蛋氨酸为3 万吨以上， 赖氨酸2 5 3 o 万吨【l6 】蛋氨酸具有促进肾上腺素合成胆碱、抗脂肪肝的作用。主要用 于鸡饲料，亦可用于猪、牛的配合饲料；在目前鱼粉供应不足的情况下，蛋氨酸与豆类饲 料配合使用，还可以部分代替鱼粉。赖氨酸具有增强畜禽食欲、提高抗病能力、促进外伤 治愈的作用，是合成脑神经及生殖细胞、核蛋白质及血红蛋白的必需物质。 1 1 3 3 在化妆品行业的应用 氨基酸及其衍生物与人体皮肤结构相似，具有调节皮肤p h 和保护皮肤的功能，延缓 皮肤衰老。用氨基酸合成的氨基酸羧酸型两性表面活性剂，具有毒性低、刺激小、柔软、 抗静电、杀菌等性能，在洗涤用品、化妆品、纺织印染等方面有较大用途。氨基酸在日用 化工上的应用已有取代常用化工原料的趋势，如氨基酸和高级脂肪酸制成的表面活性剂、 抗菌剂，已成为最高效的添加剂而被广泛作用；待氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸的碳酸盐、聚 天门冬氨酸等制成的护发剂、染发剂、永久型烫发剂，已发展成为商品供应市场【l7 】【l q 。 1 1 3 4 在其他行业的应用 在轻工业方面，聚谷氨酸和聚丙氨酸正在被研制在具有良好保温性和透气性的人造皮 革和高级人造纤维【l ”。在生物工程方面，半胱氨酸等正被开发成新的保护剂，亮氨酸、胱 氨酸等正作为发酵工业中多种氨基酸生产菌的添中剂而被应用 在农业方面，一些氨基酸在体外并无杀菌功能，但它们能干扰植物与病原菌之间的生 化关系，使植物的代谢及抗病能力发生变化，从而达到杀菌的目的。另外以氨基酸为原料 合成的除草剂，作为无污染环境新型农药出现在田野上啪】。在贵金属提取和电镀工业方 面，天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸在溶金液中应用；谷氨酸等可用于电渡工业的电解溶 液，胱氨酸可用于铜矿探测，氨基酸烷基酯可用于海上流油回收等等2 2 , 2 3 2 4 ) 6 第一章绪论 1 2 肽的概述 肽在生物的生长、发育和代谢中起着重要作用，它是由具有一定序列的氨基酸通过酰 胺键相连的。两个氨基酸组成的叫二肽，三个氨基酸组成的叫三肽，依次类推。一般氨基 酸数目小于l o 个的叫小分子肽或寡肽，大于1 0 个的叫多肽。 1 2 1 肽的来源 多肽的合成是按设计的氨基酸顺序通过定向形成酰胺键得到目标分子，一个肤键的形 成，从表面上看是一个简单的化学过程，它指两个氨基酸组分通过肽键( 酰胺键) 连接， 同时脱去一分子水。 1 2 1 1 化学合成经典方法阎 多肽的合成策略有肽链逐步增长法和片段组合法。由于每个氨基酸分子既有氨基也有 羧基，如果将两种氨基酸混合在一起，加入缩合剂，将可能得到四种二肽的混合物。在温 和的条件下，肽键的形成是通过活化一个氨基酸的羧基部分，第二个氨基酸则亲核进攻活 化的羧基部分而形成肽。如果羧基组分的氨基未保护，肽键的形成则不可控制，可能形成 线性肽和环肽等副产物，与目标化合物混合在一起。 ( 1 ) 酰基叠氮物法 早在1 9 0 2 年，t h e o d o rc u r t i u s 就将酰基叠氮物法引入到肽化学中，因此它是最早的合 成方法之一。该方法的起始原料是通过肼解相应的酯得到的氨基酸酰肼，再用盐酸和亚硝 酸钠使酰肼发生亚硝化而转化为叠氮，同时除去水。然后与相应的氨基酸组分反应得到 肽。 h 2 n n h 2 o r 2 + h 2 n p 望酬￥码 ( 2 ) 酸酐法【2 日 在肽合成中，最初考虑应用酸酐要追溯到1 8 8 1 年t h e o d o rc u r t i u s 对苯甲酰基氨5 7 , 酸合成的早期研究。有机羧酸和无机羧酸皆可用于酸酐的形成。然而仅有几个得到了广泛 的实际应用，多数情况下，采用氯甲酸烷基酯。过去频繁使用的氯甲酸乙酯，目前主要被 氯甲酸异丁酯所替代。其机理如下图： h y n 佣+ c 。人o o 飓一y 葑 7 r r 3 - n h 2 。 蚕i # 东南大学硕士学位论文 h 。y n o n i r 3 + r 2 0 h + c 0 2 ( 3 ) 碳二亚胺法 碳二亚胺类化合物可用于氨基和羧基的缩合田捌。在这类化合物中n ，n 。二环己基碳 二亚胺( d c c ) 首先用于肽合成，并且现已广泛应用，d c c 相对比较便宜，而且可溶于肽 合成常用的溶剂。在肽键形成期间，碳二亚胺转变为相应的脲衍生物，n ，n - - 环己基脲 可以从反应液中沉淀出来。显然，碳二亚胺活化后的活性中间体氨解和水解速率不同，使 肽合成能在含水介质进行。 一 码一：n 剐一 鸡 鼍人斟r + 一 ( 4 ) 活化酯法口9 】 通过酯的氨解形成肽键的过程类似于酯的皂化。氨基化合物对化合物的羰基进行亲核 进攻形成四面体中间体，这一反应是限速步骤，吸电子基团有利于中间体的形成。肽键的 形成速率与离去基团的离去能力相关，例如强酸的共轭碱是很好的离去基团。在肽键形成 过程中，被诱导效应或过渡效应所稳定的离去基团能促进键的裂解。其过程如下： o 、j矿 玛n i - 1 2 + 码一叫+ r 3 0 h ( 5 ) 酰卤法 3 0 l 将氨基酸的羧基转化成酰卤，再与另一分子氨基酸的氨基反应，但在反应过程中酰卤 “过度活泼”且易发生氨基酸消旋等多种副反应而一直很少应用。 ( 6 ) 磷锚盐试剂法和脲筠盐试剂法p l 】 这两种方法是近2 0 年来在卜羟基苯并三唑( h o b t ，见图1 - 1 ) 和卜羟基一7 一氮杂苯并 三唑( h o a t - 见图卜1 ) 的基础上发展起来的。这类化合物包括0 卜- ( 7 一氮杂苯并三唑一1 一 y 1 ) 一1 ，1 ，3 ，3 - 四甲基脲铸六氟磷酸盐( h a t u 见图卜1 ) ，o 一( 7 - 氮杂苯并三唑基) 一三( 二甲氨 基) 磷六氟磷酸盐( a o p 见图卜1 ) ，卜苯并三唑氧三( 吡咯烷基) 磷六氟磷酸盐( p y b o p 见图 卜1 ) 和7 一氮杂苯并三唑氧三( 吡咯烷基) 磷六氟磷酸盐( p y a o p 见图卜1 ) 通常是在d m f 或乙腈中，在等摩尔酸的和一个叔胺的存在下使用这类试剂。一般来说，在多肽的合成中 使用这些试剂十分有效，没有明显的外消旋化或副产物形成 8 沁up 第一章绪论 o h i 气 矿 n n 礤i ￥+ o - l ( n m e o j 1 2 。1 2 多肽的固相合成法 p y b o p 图1 1 在肽的早期发展阶段，肽合成反应一般是在液相中进行的，并且应用这种传统技术完 成了包括小蛋白全合成的杰出工作。遗憾的是，液相合成很费力，并且需要具备在选择保 护基和缩合方法的策略和战略以及解决溶解性问题等诸多方面的知识。 1 9 8 4 年的诺贝尔奖获得者m c r r i f i e l d 在上一世纪六十年代创立了固相多肽合成( s p p s ) 法”】，经过4 0 多年的发展，现在s p p s 已成为多肽合成的常用方法。s p p s 是将要合成的 目标多肽的碳端氨基酸的羧基以共价键的方式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这 个氨基酸的氨基作为多肽合成的起点，与其它( 氨基被保护的) 氨基酸的羧基( 已被活化) 反 应形成肽键；不断重复这一过程，从而使多肽链增长，直到获得目标多肽最后用强酸同时 把所有保护基去掉并将多肽从树脂上解脱，得到目标多肽 多肽的固相合成法最大的优点就是不须纯化中间产物，合成过程可以连续进行在固相 合成基础上人们发展起来的“蛋白质自动合成仪”现在已成为蛋白质合成的重要工具。 固相合成法也有缺点，比如反应不是定量的，有副反应尤其是在最后去保护和把多肽 从树脂上解离下来的过程中副反应比较严重。 1 2 1 3 多肽的组合合成法 组合化学( c o m b i n a t o r i a lc h e m i s ( r y ) ，又称为组合合成，代表了在药物开发和优化上 与传统方法不同另一种策略和方法，可以分为平行、系统、反复地共价连接不同结构的 “构建单元”( b u i l d i n gb l o c k s ) ，一次性或批量地获得很大数量的类似化合物( 化合物库) 以 进行高通量药效筛选，寻找先导化合物的一种策略和方法。 组合化学研究的核心问题就是解决如何构建分子多样性的化合物库它与传统的化学合 9 q q 东南大学硕士学位论文 成在原理上有着本质的不同，其实质及最大优势就是能在短时问内合成大量的化合物的化 学合成，每次进行一个反应，生成一个化合物，经过分离、纯化，再进行下一个反应，以 此反复，最终得到目标产物组合化学利用组合论的思想，将各种化学构建单元( b u i l d i n g b l o c k ) 通过化学合成衍生出一系列结构各异的分子群体，并从中做出优化筛选。 与传统的合成方法相比，组合化学合成法最大的优点是可以同时制备大量不同结构的 多肽异构体，多肽的组合化学合成法虽然历史不长，但前景非常广阔有关多肽的组合化学 合成法可参见有关的专著【3 3 1 1 3 4 1 。 1 2 2 肽的工业发展趋势及其应用 在医药学领域，2 1 世纪将是肽的世纪，肽将成为心脑血管、神经系统、风湿等疾病与 保健药物的新一代希望性药品。近年来，人们发现，肽与氨基酸参与生命中的一切活动， 是沟通细胞与细胞之间、器官与器官之间有机联系的化学反应信使，细胞吸收营养等各种 新陈代谢主要都是通过肽和氨基酸的作用来完成的。 多肽在临床上使用非常广泛，主要用于治疗癌症、h i v 病毒和免疫系统功能减退、对 传统抗生素产生抗体的感染以及疫苗等。全球合成多肽原料药的产量在1 0 0 k g 左右，但销 售额达2 5 亿3 亿美元，而做成制剂的销售额则达2 5 亿3 0 亿美元。 ( 一) 提高矿物质元素的利用率 有些小肽具有与金属结合的特性，可与c a 2 + 、z 矿、c u 2 + 和f e 2 + 等离子形成螯合物，增加 其可溶性，从而促进c 矿、z n “、c u ”和f e 2 + 的被动转运及在体内的贮留 a 6 1 。 ( 二) 提高机体的免疫能力 小肽能够加强有益菌群的繁殖，促进菌体蛋白的合成，增强抗病力。有研究结果表明，小 肽能有效刺激和诱导小肠绒毛膜刷状缘酶的活性上升，并促进动物的营养性康复。j e l l e 研 究结果表明，旷酪蛋白水解产生的三肽和六肽可促进巨噬细胞的吞噬作用。 ( 三) 生理调节作用 小肽可直接作为神经递质，间接刺激肠道受体激素或酶的分泌而发挥作用。如b 一酪蛋白 水解生成的酪啡肽( 7 l o 个氨基酸残基) ，其氨基酸排列顺序与内源阿片肽的末端排列顺 序相似。从p 一酪蛋白水解产物中进一步纯化出的五肽( t y r p r o - p h e - g 1 y i l e ) 和四肽( t y r - p r o - p h e p r o ) ，在体外均有阿片肽的活性。 1 3 本文研究的内容和目的 氨基酸及其衍生物在医药领域应用日益广泛，市场需求量在逐渐扩大。目前国内外对 氨基酸制备的研究热点是生物法，但由于设备投资较高及工艺稍显复杂，而化学方法工艺 简单、设备投资少、产能大，适合本国氨基酸产业的迅速发展。本文采用化学法制各l 高 精氨酸盐酸盐、双甘氨肽、甘氨酰l - 苯丙氨酸、甘氨酰- l 缬氨酸。 本课题总的研究思路：充分利用国内资源丰富的基础氨基酸，结合原料来源及工艺特 i o 第一章绪论 点，研究开发氨基酸及其衍生物肽的化学合成方法，供进一步制备相应生化试剂及医药 中间体等。具体研究内容包括： ( 1 ) 以l 赖氨酸盐酸盐和o 一甲基异脲硫酸盐为原料制备l 高精氨酸盐酸盐，并对其制备 工艺条件进行试验优化，确定较佳了工艺条件。 ( 2 ) 以甘氨酸和氯乙酰氯为原料制备双甘氨肽，摸索了反应工艺条件。 ( 3 ) 以l 苯丙氨酸和氯乙酰氯为原料制备甘氨酰l 苯丙氨酸。通过对原料配比、反应温 度和反应时间等因素试验及优化，确定较佳了反应工艺条件。 ( 4 ) 以l 缬氨酸和氯乙酰氯为原料制备甘氨酰l 缬氨酸。通过对原料配比、反应温度和 反应时间等因素试验及优化，并寻求简便、高效、便于工业化生产的方法。 ( 5 ) 对所制备得到的产品进行熔点、旋光度、瓜、元素分析、1 h - n m r 和h p l c 等表征 和含量分析，并对相关产品进行质量检测。 第二章l 高精氨酸盐酸盐的合成研究 第二章l 一高精氨酸盐酸盐的合成研究 2 1l 高精氨酸盐酸盐概述1 3 7 删 l - 高精氨酸( h o m o a r g i n i n e ) 是一种强碱性氨基酸，极易吸收空气中的c 0 2 ，因此通常 将其制成盐酸盐保存。l 高精氨酸盐酸盐为白色粉末晶体，熔点2 1 3 2 1 5 c ，极易溶于 水，不溶于乙醇、乙醛、乙醚和四氢呋喃。比旋光度 a 】+ 1 9 o 1 0 。( c = 2 0 ，l m o l l h c i ) 分子式；c 7 h 1 妣0 2 - h c i ，分子量2 2 4 7 0 ，结构式为： 。 n h 从n h 2 1 il 一高精氨酸盐酸盐的合成方法 o l 高精氨酸是一种非蛋白氨基酸，作为医药中间体用于合成多肽，在临床上用作氨解 毒剂治疗因肝病引起的氨代谢障碍。因此无论从生化研究还是具体应用来看，l 高精氨酸 的合成和开发具有较好的发展空间。化学合成法就是利用有机合成和化学工程相结合的技 术生产或制备氨基酸的方法。它具有原料易得，操作简单，反应周期短等优点。目前己知 的制备l 高精氨酸盐酸盐的方法p 7 娜，4 1 有如下三种： ( 一) 以赖氨酸为起始原料，经过氨基保护、酰氯化，水解、催化加氢、胍基化、调 p h 值等过程制各l 高精氨酸盐酸盐。具体过程如下： n h c b z o n h c b z o h 2 c 1 2 i ：h 2 a 屯b h c o o h p c i 5 h c l _ c h 2 ( n h c b z n ) c h 2 c h 2 c h 2 c h ( n h c b z o ) c o c i r o 墨 _o-methylisoureach2(nh2)ch2ch2ch2ch(nncoc6hs)cooh二+ - 1 2 东南大学硕士学位论文 i - l - h o m o a r g i n i n e h c l n h c o c e h 6 该方法对赖氮酸的保护重复进行了两次而且催化加氢这一过程不易控制，具有反应条 件相对比较苛刻、反应的选择性差、步骤过多、副产物较多、总收率低、操作繁琐等缺 点。 ( 二) 随后在二十世纪四十年代k u r t zs t e v e n s 和b u s h 等人用一种简单的方法合成了l 高精氨酸盐酸盐。步骤描述如下： c h 2 ( n h 2 ) c h 2 c h 2 c h 2 c t h n h 2 h c lc u 2 ( o h ) 2 c 0 3 一一冒c u 强吗一 o一-methylisourea h 啦2 n - - r c = n h 心u o o k c i jc 删熙 - - - - - - ij，i 1l 6 。o 、，i 占h r h r w c h c h n h 占害n h 该方法条件温和、操作简单但操作过程中硫化氢的使用容易发生危险并且嗅鸡蛋气味 ( 三) 另外，i z u m i y a 也发明了一种比较简单的方法。步骤如下： c h 2 ( n ) c h 2 c h 2 c h 2 c h n h 2p m e t h y i i s o t h i o u r e ac h 2 ( n i ) c h 2 c h 2 c h 2 c h n h 2 c o o h 0 1 4 h 2 n - - c = n h c o o h ：i l - h o m o a r g i n i n e h c i 该方法在第一步用s - m e t h y l i s o t h i o u r e a 对l 赖氨酸的- n h 2 进行胍基化时，由于i 广赖 氨酸存在两个氢基在胍基化时，反应的选择性不强，条件难以控制容易产生副产物，导致 反应最终产率降低。 2 1 2 合成路线的选择 l - 高精氨酸盐酸盐虽然有些相关的合成报道，恒国内相关报道较少，鉴于此参考已报 导的合成方法，结合原材料、成本、工艺试剂等诸多方面情况的考虑。我们选择了一条反 应条件较为温和且经济合理、产品纯度高适合予工业化生产的合成路线。论文以l 一赖氨酸 盐酸盐为原料合成l 一高精氨酸盐酸盐，具体路线如下： 1 3 第二章l 高精氨酸盐酸盐的合成研究 c h 2 ( n h 2 ) c h 2 c h 2 c h 2 ：珊唧2 h c l c u 2 ( o f _ i ) 2 c 0 3 c 聊吗? 吗咀p 。 薄眦啦啦啦c h 飓 ( n l - h h sh c l _ - l - h o m o a r g i n i n e o h c l 2 2l - 高精氨酸盐酸盐的合成 2 2 1 主要仪器与试剂 名称规格生产厂家 l 一赖氨酸盐酸盐 分析纯 上海斐雅科技发展有限公司 。一甲基异脲硫酸盐分析纯浙江巨化新联化工有限公司 碱式碳酸铜分析纯上海振欣试剂厂 硫化铵分析纯上海振兴化工二厂 阳离子交换树脂 7 3 2 撑 中国医药集团 显微熔点测定仪x 4 型北京第三光学仪器厂 数字式自动旋光仪w z z 1 5 型上海精密科学仪器有限公司 傅立叶变换红外光谱仪i r - 4 4 0 型美国n i e o l e t 公司 高效液相色谱仪h p 1 0 5 0 型美国i - i p 公司 元素分析仪 c h n 旬- r a p i d 型 德国h e r a e u s 公司 2 2 2l - 高精氨酸盐酸盐的合成隅删 在装有机械搅拌的冷凝器、温度计的2 5 0 m l 的三口圆底烧瓶中依次加入1 0 9 ( 0 0 5 5 m o i ) l - 赖氨酸盐酸盐、5 0 m l 水、l o g ( o 0 4 5t 0 0 1 ) 碱式碳酸铜( c u 2 ( o h h c 0 3 ) 东南大学硕士学位论文 于11 0 加热搅拌回流反应l h ，冷却过滤除去过量的碱式碳酸铜得到蓝色二赖氨酸合铜溶 液。将其溶液转移至另一2 5 0 m l 的三口圆底烧瓶中并加入1 5 9 ( o 0 8 6 m 0 1 ) o 一甲基异脲硫 酸盐、4 m o f ln a o h 溶液1