（发酵工程专业论文）短梗霉多糖薄膜应用于微生物保藏的研究.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 y 7 2 6 一z 分f 摘要 短梗霉多糖是一种水溶性的胞外多糖。与其它微生物合成的高分子多糖相比， 它的特点是具有极佳的成膜性、氧气不渗透性、可热封性、粘结性、易自然降解 性等许多独特的物理化学和生物学特性。它无色无味，无毒无害，对人体和微生 物无副作用。 用该膜进行菌种保藏，制成多糖膜保藏片，保藏片的大小尺寸可以根据需要 进行调节设计。这样的保藏片占地面积小，携带方便，便于邮寄，使用也很方便。 对短梗霉多糖薄膜与微生物保藏相关的物理性质进行了表征。多糖薄膜具有 一定的机械强度，足以支撑膜片对微生物进行保藏：多糖薄膜有很好的阻隔氧气 的性能，透氧性大大低于塑料薄膜和玻璃纸；对多糖进行了热分析，多糖不具有 熔融的特性，但是可以用塑料膜热封机进行热封，多糖膜的热合牢度与它的含水 量有一定的关系。 用紫外线对多糖薄膜进行杀菌效果良好。将l o 的多糖溶液在1 2 1 1 2 6 ， 0 1 m p a 的条件下灭菌2 5 m i n 后，制成厚约0 0 2 o 0 3 m m ，该膜用紫外线的照射， 在2 0 c m 的照射距离下，5 分钟可以达到无菌的效果。 用短梗霉多糖制成膜片，对2 0 种微生物进行保藏，效果良好。保藏1 8 个月 后的存活数仍然可以达到1 0 8 的数量级；这些保藏后菌种的菌落形态以及在显微 镜下观察的细胞形态和保减前的结果一致。从所保藏的菌种中选取了黄色短杆菌、 酒精酵母和产口一葡萄糖苷酶细菌做代谢性能的检测，分别检测了黄色短杆菌的 产赖氨酸的能力、酒精酵母的产酒精的能力和产0 一葡萄糖苷酶细菌产1 3 一葡萄 糖苷酶的能力均不低于斜面保减菌的反应结果。 关键词：短梗霉多糖：微生物保藏；多糖薄膜 湖北工业大学硕士学位论文 a b s tr a c t p o l y s a c c h a r i d ep u l l u l a ni s ab i o d e g r a d a b l ew a t e r s o l u b l ep o l y s a c c h a r i d e t h e p o l y m e rw a sm a n u f a c t u r e di n t oo 0 2m m t h i c kf i l m p u l l u l a nf i l mi si m p e r m e a b l et o o x y g e n ，n o b t o x i c ，h e a t s e a l a b l ea n dg o o di nm e c h a n i c a ls t r e n g t h p u l l u l a nf i l mw a s m a d ei n t os m a l lp e a c e so fm i c r o o r g a n i s m sp r e s e r v a t i o nu n i ta n dp r e s e r v e df o ra p e r i o d o f t i m e p u l l u l a nf i l mp r e s e r v a t i o nu n i th a sm a n yv i r t u e s i tn e e dm o r el i t t l er o o mt o p r e s e r v ea n d i sc o n v e n i e n tt om a i la n dc u l t u r e i t ss i z ec a l lb ed e s i g n e df r e e l yb yu s e r s d i f f e r e n td e m a n d t h ef i l m sw e r es t e r i l i z e d b y u l t r a v i o l e ti r r a d i a t i o na tad i s t a n c eo f2 0 c mf r o mt h e u l t r a v i o l e tl a m p t h em i c r o o r g a n i s m si nf i l mw e r ea l lk i l l e da t5m i n u t e si r r a d i a t i o nt i m e t w e n t y s t r a i n so fm i c r o o r g a n i s mw e r ep r e s e r v e di nt h ep u l l u l a nf i l mu n i t sa n dn i n e t e e ns t r a i n s w e r es e l e c t e df o rl i v ec e l lc o u n t sa td i f f e r e n ts t o r a g et i m e t h el i v i n gc e l lc o u n t so f t h e s t r a i n sw e r em o r et h a n1 0 5 c e l l s 1 u n i ta n dr e l a t i v e l ys t a b l ei n1 8m o m h ss t o r a g e t h e c o l o n i e sa n dc e l l so ft h em i c r o o r g a n i s mp r e s e r v e db yp u l l u l a nf i l ma n db ys l o p eh a d n oo b v i o u sd i f f e r e n c eb y p h o t o g r a p h a s t r a i no f b r e v i b a c t e r i u m ( p r q d u c i n gl y s i n e ) ，a b a c t e r i u m ( p r o d u c i n g 日- - g l u c o s i d a s e ) a n day e a s t ( p r o d u c i n ga l c o h 0 1 ) w e r es e l e c t e d f o rm e t a b o l i cc a p a b i l i t yt e s ta f t e re i g h t e e ns t o r a g em o n t h s r e s u l t ss h o wt h a tt h e s t r a i n sf r o mt h ep u l l u l a nf i l mh a dm a i n t a i n e dt h ep r o d u c t i o nc a p a b i l i t y k e y w o r d s ：p u l l u l a n ；p u l l u l a nf i l m ；c u l t u r ep r e s e r v a t i o n 湖北工业大学硕士学位论文 第1 章前言 1 1 短梗霉多糖膜保藏菌种概述 本研究采用短梗霉多糖( p u l l u l a n ) 薄膜保藏菌种，在两层膜的中间涂上保护 剂和菌种，贴紧后以塑料膜套封。这种带有菌种的膜片可以用塑料热封机分隔成 很多小的菌种保藏单元，每个保藏单元相当于一个斜面试管。含有这种保藏单元 的膜片汇编成册，类似于集邮册的型式，每页可以插入很多张保藏膜片，那么一 册就可以保藏成千上万株菌种，占地面积很小，操作方便，不需要昂贵的设备， 便于微生物的分类研究。该薄膜隔氧性好，双层膜片携带菌种于低温保藏，可以 满足干燥、缺氧、低温、缺营养和添加保护剂等菌种保藏的环境要素。在菌种保 减册的封面上，详细的写上本册所保藏的菌种的详细的菌名及其所存放的页码， 并将每一本菌种保减册都编上号码，按一定的顺序存放在保藏室里。我们再将菌 种保藏册的号码及对应号码的保藏册上的菌种编写成册，放在菌种保藏室外面。 这样当我们需要某一菌种时，在菌种保藏室外就可先找到其存放的位置。 该方法进行菌种保藏，占地面积小，操作方便，容量大，不需要昂贵的设备， 适用于各级菌种保藏机构，也有利于微生物的分类学研究。具有微生物学和高分 子材料学交叉学科的特点。 创新之处是，创造一种新的菌种保藏方法用以取代现行的斜面保藏方法，逐 步取代其他的保藏方法。对微生物的保藏可能引起一次变革。 这种菌种保藏册每面可含多个保藏单元，每一个单元按我们的需要设计成含 有相应数量的保藏块，每个保臧块相当于一个斜面保藏试管或一个冷冻干燥保藏 管或一个液氮保藏管。这样，如果设计保藏册的每一面放1 2 个保藏单元( 每个单 元的尺寸大小为：7 c m 7 c m ) ，每个单元含有6 个保藏块( 每个保藏块的尺寸大小 为：2 o c m x 2 o c m ) ，那么保藏册的一面相就当于7 2 只目前所使用的保藏试管。 如果每一册设计为l o 页即2 0 面，那么就相当于1 4 4 0 只保藏试管。保藏这样一个 尺寸设计的保藏册所需要的空i 司大小为2 l c m 2 8 c m xl c m ，在这么小的空间内是 不可能保减多达1 4 4 0 只试管的。保藏册的大小、膜片和单元块的尺寸都可根据实 际隋况进行自由调节设计。只需一个冰箱大小的体积，就可傈藏成千上万种菌株。 菌种保减册按类划分，以一定的顺序编辑成册，如l 一5 册为细菌，6 1 0 册为酵 湖北工业大学硕士学位论文 _ _ - _ _ _ _ _ l - - l _ _ _ - i - - _ _ l _ l _ ii m l l i _ - _ _ _ - _ - - _ _ _ 母等，极为便于查找。保减册邮寄方便，便于携带。使用时，取出保藏片，无菌 操作剪下一个单元块，去掉外层塑料，保藏菌与多糖膜一起溶于培养基中即可生 长。 1 2 国内外菌种保藏研究的现状 人们在长期的实践中，对微生物的种子保藏建立了很多方法，各种方法所适 用微生物的种类和效果都不一样，具体应用中各有优缺点。但它们的原理基本是 相同的，即选用优良的纯种，最好是休眠体，创造个使微生物代谢不活泼，生 长繁殖受抑制，难以突变的环境条件”1 。其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营 养以及添加保护剂等o 。目前常规实验室菌种保藏方法有斜面移植法、矿物油覆 盖保藏法、沙土管干燥保藏法、蒸馏水保藏法等“。斜面移植法等保藏期短、占 地面积大、染菌机会多、菌种易退化。超低温用保护剂在一7 59 c 下保藏设备费用 较高，一般基层单位可能不具备条件，保藏管占据空间很大，运行的费用较高。 袭l l 列出了常用的些菌种保藏方法“1 。 文献上有关于用滤纸条和玻璃纸( c e l l o p h a n e ) 保藏菌种的报道“1 ，但是滤 纸条和玻璃纸不能做成有一定机械强度的膜片，且上述材料不能热封，隔氧性远 不及短梗霉多糖薄膜。用这两种材料不可能做成菌种保藏册。 在国际著名的美国a t c c ( a m e r 】c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n ) ，目前已改为 仪采朋蹦利，最有效的方法，即保藏划一般达5 1 5 年的冷冻干燥保藏法和保藏期 般达2 0 年以上的液氮保减法，以达到最大限度减少传代次数避免菌种退化。我 l 蝈c c c c m ( c h i n ac o m m i t t e ef o rc u ll u r ec o l l e c t i o nm i c r o o r g a n i s m s ) 的规模 j 为- _ j e 洲第。( 有1 4 力余株务种微生物) ，现在采用3 种保减法( 斜面传代法、 冷冻 _ ：燥法和液氮保藏法) 进行保捌”。 湖北工业大学硕士学位论文 表1 1 常用的菌种保藏方法州 方法优点 缺点 斜面和液体培养定期移 植保藏 矿物油覆盖低温( 冰箱) 保藏 蒸馏水保藏法 干燥法：干沙，土壤，硅 胶 滤纸保藏法 干燥冷冻保藏法 超低温( 用2 0 甘油作保 护剂在一7 5 的超低温 冰箱中) 超低温( 在液氮中一1 9 6 ) 简单易行、代价小、便于 观察检测，适宜各类菌种 在给定的条件下使菌株 接近于非活动状态，适宜 各类菌保藏时间延长 1 2 年 简单实用，效果较好 比矿物油覆盖保藏时间 长，适于产孢子的微生 物，保藏期卜1 0 年 一些小的圆状滤纸可用 来转移菌落，每次转移只 用滤纸即可 适用于大部分细菌，包括 放线菌及些真菌、酵 母，目前广泛使用，保藏 5 1 5 年 适用于大部分细菌、酵 母。包括放线菌和真菌， 代谢处于停顿状态，操作 方便，保藏期长 代谢处于停顿状态，保藏 时间可达2 0 年以上 保藏时间短3 - 6 个月，菌 种易退化 占据空向大，一变异、染 菌机会亦较多 适宜面不广，保藏期短， 水质有可能影响菌种保 藏的效果 对某些菌不适宜 准备工作比以上更麻烦 也许更易染菌 操作烦琐，技术要求较 高，对一些适湿的孢子真 菌不太适用 设备费用较高，一般的基 层单位难以达到 最初的费用很高，需稳定 的经济条件以保证液氮 的供应，如果使用液相保 存的话，暴罐在空气里就 会发生爆炸，需要很好的 练习使用 湖北工业大学硕士学位论文 但上述方法都很繁琐，技术要求高，设备昂贵，占据空间大，液氮保藏还有 爆炸的危险性，不利于微生物的分类学研究。 1 3 短梗霉多糖简介 短梗霉多糖是出芽短梗霉在发酵培养基中产生的一种胞外葡聚糖。该多糖含 a - 1 ，4 和n 一1 ，6 葡萄糖苷键“”。短梗霉多糖的化学结构是麦芽三糖( 极少数情况 下含有少量的麦芽四糖) 之间按a 一1 ，6 葡萄糖苷键相连接而构成聚合物“2 “”m ”。 短梗霉多糖为无定型分子，其分子量大小取决于聚合度( d p ) 的高低，其聚 合度一般为1 0 0 5 0 0 0 个葡萄糖残基，即分子量一般约为2 万1 0 0 万之间，平 均分子量为l o 万5 0 万“”“o “”。聚合度常受碳源种类、浓度、菌体培养时间及 其他环境条件的限制：延长培养时间可增大聚合度从而提高分子量“8 m 3 。不同培 养条件下形成的多糖分子量差异甚大，分别适合于不同的用途。选择理想的培养 条件配合优良的菌株，产生的多糖分子量可达1 0 0 万以上”。“。 与其它微生物合成的高分子多糖相比，它的特点是具有极佳的成膜性、氧气 不渗透性、成纤维性、可塑性、可热封性、粘结性、易自然降解性等许多独特的 物理化学和生物学特性”。用该多糖制成的薄膜与玻璃纸、聚丙烯薄膜、聚乙 烯薄膜相比，它具有更好的阻隔氧气的性能o ”“”。它无色无味，无毒无害，对人 体和微生物无副作用。 1 4 本课题研究的内容 第一、菌种保藏册的设计。 第二、短梗霉多糖的发酵生产及其膜的制备。 第三、短梗霉多糖及其膜的性能研究。 第四、菌种保臧结果的检测。 1 5 研究方案及可行性分析 1 5 1 技术路线： 湖北工业大学硕士学位论文 塑料膜( 选材) 短梗霉发酵 i 多糖提取 l 多糖物性检测 4 流涎法制膜紫外灭菌菌种( 细菌、酵母、霉菌、 放线菌等) 切割，成卷包扎( 作外封膜) i i l成卷、包扎 l 涂布 l 高温灭菌争制保藏片一 保护剂混合 l 热封 l 菌种保藏册( 选用塑料原保藏片插入菌种保藏册 料定制) 适当消毒 i 每3 个月取出一单元块进行菌种 性状分析与斜面保藏法比较 1 5 2 采取的有关方法 1 多糖发酵用a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s 为种子，流加糖法。 2 。多糖提取采用两水相摹取法除杂，溶剂沉淀。脱色浓缩。 3 采用流涎法制膜。 4 力学性能测定：拉伸强度和断裂伸长率测定按g b l 0 4 0 一9 2 进行。 5 热合牢合度测定：按z b y 2 8 0 0 4 规定进行。 6 透氧测定：按g b l 0 3 8 7 0 进行。 7 保减膜片外套的塑料膜用高温1 2 1 灭菌。 8 保藏菌效果分析：存活数的计数，观察菌落和细胞形态，发酵能力检测等。 湖北工业大学硕士学位论文 _ _ - _ i _ - _ _ l _ _ _ _ _ - _ - i _ - - - _ _ l _ l _ - - _ _ _ - _ l _ _ _ _ - - i i l - _ _ _ _ - l - - - _ _ _ l - l _ _ _ - l - _ 一 1 5 3 实验手段 1 发酵采用德国贝朗公司1 5 升自控发酵罐。 2 多糖提取采用膜滤器、萃取柱、层析柱、蒸发浓缩器等设备。 3 流涎成膜装置已有流涎喷头 4 力学性能测定采用x l l o o 拉力试验机 5 低温保藏采用一2 4 冰箱。 6 细胞形态观察采用计算机显微照相系统。 1 5 4 可行- 陛分析 在日本已经用短梗霉多糖作成薄膜食品，也称卡片食品，并已进入市场。本 实验室己制作出多糖薄膜，其透氧性，机械强度，卫生指标已分别检测。实验室 已制作简易的保藏膜片，该膜片以紫外线照射可达到无菌程度。这种膜片用塑料 膜套封后在一2 4 下保藏，多糖膜和塑料膜的物理性质都不受影响，已经在本实 验室得到验证。该膜片保藏黄色短杆菌， 个月后取出，黄色短杆菌产赖氮酸能力， 能力皆未下降。 产葡萄糖苷酶菌，k y e a s t 酵母菌，十八 细菌产葡萄糖酶的能力，酵母产酒精的 湖北工业大学硕士学位论文 第2 章发酵生产短梗霉多糖的研究 谷类、薯类等淀粉质原料可由出芽短梗霉( a u r e o b a s i a d i u mp u l l u l a n s ) 转化 生成短梗霉多糖( p u l l u l a n ) 。本章以玉米淀粉为原料，用不同舶方法预处理，配 制培养基进行多糖发酵，对淀粉水解方法，水解糖的d e 值及培养条件与多糖产 率等进行了比较，并且在发酵罐中获得较高的转化率和提取精制得到纯度较高的 多糖。 2 1 短梗霉多糖发酵 2 1 1 材料和方法 2 1 1 1 原料 玉米淀粉由湖北省农科院提供，淀粉酶为连云港酶制剂厂生产。 淀粉的酶水解：玉米淀粉加水调浆至1 1 b e ，1 0 0 c 糊化4 5 m i n ，加a 一淀 粉( 1 5 u g 淀粉) ，c a c l 2 0 1 ，9 0 c 液化至无碘色反应，过滤除渣，清液加糖 化酶( 1 0 0u g 淀粉) ，p h 5 0 ，6 0 ( 2 下糖化至要求的d e 值，活性碳脱色，树脂 脱盐。 淀粉酸水解：玉米淀粉加水调浆至1 1 b e ，用盐酸调p h l 5 ，o 1 5 m p a 表压， 水解3 0 m i n 。 d e = 还原糖含量千物质含量1 0 0 ，糖液中干物质含量用阿贝折光仪测 定，还原糖用费林法测定。 2 1 2 发酵 2 1 2 1 菌种 出芽短梗霉由罗得艾兰大学食品研究所赠与。 2 12 2 培养基 1 0 淀粉水解糖，酵母膏，( n h 4 ) 2 s 0 4 ，k 2 h p 0 4 ，n a c l ，m g s 0 4 7 h 2 0 ， 按要求分别调配。 2 1 2 3 三角瓶培养 湖北工业大学硕士学位论文 5 0 0 m l 三角瓶装量1 5 0 m l 于2 8 c t2 0 0 r p m 振荡培养5 d 。 2124 发酵罐培养 b i o s t a t cc1 0 自控发酵罐装量1 0 l ，1 2 1 灭菌1 5 m i n ，2 8 c 接种，接种量 2 ，通气量1 0 v v m ，d 0 1 5 ，搅拌培养7 d ，p h 和d o 值分别由l n g o dp h 电极 和溶氧电极监测。 2 1 3 分析 21 31 粘度测定 n d j 1 型旋转粘度仪。 2 1 3 ，2 多糖量 采用乙醇沉淀法。 2 1 3 3 生物量测定 发酵液离心，去除上清液，沉淀菌体，清水洗涤再离心，反复3 次，湿菌 体干燥至恒重。 2 1 4 结果与分析 出芽短梗霉可以利用葡萄糖、蔗糖等单糖和双糖为碳源转化为多糖，但利用 淀粉不完全水解来进行发酵，多糖转化率可以明显提高。水解糖不经处理或经过 脱色脱盐处理后配制培养基其发酵结果有很大的差别。水解糖d e 值和培养基初 始p h 值以及种子的种龄对多糖产率也有很大影响。 2 14 1 水解糖处理方法和d e 值对多糖产率的影响 表2 1 显示未经脱色脱盐处理的水解糖多糖转化率较低，一般不超过3 0 。 相对而言，d e 4 0 至5 0 之间的水解糖转化率略高。 表2 1 未经脱色脱赫的水解糖摇瓶结果( 1 0 水解糖，p h 6 5 ) 湖北工业大学硕士学位论文 由表2 - - 2 可见，经过脱色脱盐处理后的水解糖液，发酵转化率大幅提高，说 明该菌株对培养基中的色素杂质和无机离子浓度敏感，去掉色素和杂离子有利于 多糖的合成。酸法水解糖在d e 5 0 达到最高转化率5 7 ，而酶法水解糖在d e 4 0 达到最高转化率5 4 ，分别比未经脱色脱盐处理的水解糖提高转化率1 倍左右。 表2 2 经脱色脱盐的水解糖摇瓶结果( 1 0 水解糖，p h 6 5 ) d e2 03 04 05 06 07 0 214 2 培养基初始p h 值对多糖产率的影晌 d e 4 5 的水解糖液分别配制不同初始p h 值的培养基，发酵结果见表2 3 。 在p h 5 0 至p h 6 5 的范围内多糖的转化率随p h 值上升而增高，p h 6 0 p h 7 0 之间 多糖产率最高。低p h 值有利于菌体生长不利于多糖的积累，但较高的p h 值下产 生的多糖粘度有所下降。 表2 - - 3 培养基初始p h 值对多糖产率的影响 2 14 ，3 神龄对多糖产率的影响 一级种子培养3 6 h ，分别进行二级种子培养不同的种龄后，再分别按种摇瓶 发酵5 d ，所得多糖产率列于表2 4 。 表2 4 种龄对多糖产率的影响 出芽短梗霉有3 种生理形态，即酵母态孢子，厚垣孢子和菌丝。培养过程多 糖主要由酵母态细胞合成。种子培养前期生长速度快，细胞呈酵母态，4 0 h 以前 这种形态很少变化。4 0 h 前后接种，细胞数量大生长旺盛，接种后厚垣孢子和 菌丝态的细胞数量少，多糖产率高，见表2 4 。4 0 h 以后的种子细胞形态发生变 化，部分细胞开始衰老，随着种龄延长，多糖产率明显下降“”。 21 44 发酵罐发酵p h 值 湖北工业大学硕士学位论文 在自控发酵罐中进行多糖发酵，发酵过程各参数( p h 值，d o ，细胞干重，多 糖生成量) 的变化见图2 1 所示。 o 似孔5 髓钻i 埠t 鹌h t * l m 儿j m 仆 + - d o i o - m 敞 一虹艟喂，1 0i 1 1 。+ 多特制i ol i d - 。 - 一轱地1 0 p n 。 图2 1 发酵罐中各参数的变化 培养基初p h 6 3 ，发酵前期p h 值下降较快，接种后4 8 hp h 值降至3 5 以下， 6 4 11 2 hp h 值维持在3 2 左右，接近放罐时部分细胞自溶p h 值略有回升。 2 1 4 5 发酵罐发酵d 0 值 出芽短梗霉是好氧菌，发酵过程将值设定在1 5 可基本满足氧的供需平衡。 设定d 0 值过高将促进菌丝体的生长，对多糖的合成不利。 2 1 46 发酵罐发酵细胞量 发酵翦期短梗霉形态呈酵母状孢子，在第1 6 h 前后进入对数生长期，酵母态细 胞繁殖速度很快。6 4 h 后生长速度放幔，发酵后期酵母态细胞逐渐转变成厚垣孢子 和菌丝体，图2 一l 中显示从接种至1 2 8h 细胞量是不断增加的，由于细胞形态的转 变，细胞星增加不能代表细胞数增加。如果生物量过高。大量营养物质用于合成 细胞多糖的合成将会减少。 2 14 7 发酵罐发酵多糖产率 图2 l 显示发酵罐中多糖量随时间的变化。在前期和中期多糖生成量是随时 间而增长的，至1 4 4 h 超过5 0 9 l ，其后略有降低，短梗霉在发酵后期分泌短梗多糖 酶可使部分多糖降解，致使多糖量降低。 o 9 b 7 6 5 4 3 2 l o 湖北工业大学硕士学位论文 2 2 短梗霉多糖的提取精制 2 2 1 材料和方法 三兰吐脱色活性瑗脱色 板框过土机过滤滤渣去掉 7 3 2 阳离子交换树脂 7 17 阴离子交换树脂 。上沉淀 离心的转速为3 0 0 0 r p m ，时间为2 0 m i n s 。 活性炭的加量为2 ( m v ) ，脱色的时间为4 0 r a i n s 。 2 2 2 2 结果与分析 用离一t l , 机分离发酵液的目的是将发酵液中的菌体与菌丝去掉，方便后续步骤 i，ll 湖北工业大学硕士学位论文 的操作。用活性炭脱色的目的就是将多耱液中的色素去掉，由于活性炭的吸附能 力是有限的，不能完全将发酵液中的色素脱掉，因此后面进一步用阴阳离子交换 树脂进一步对它进行脱色处理，去掉引起多糖液带有颜色的离子。经过这一过程 的处理后，多糖液中的色素完全被去掉。用等体积的乙醇( 9 5 9 6 ) 沉淀多糖，得到 的多糖沉淀为白色。因为下一步是用该多糖制成无色透明的薄膜，因此不必将此 湿基干燥成粉末。 2 3 ，j 、结 短梗霉多糖的发酵生产技术基本成熟，多糖的产量可以达到5 0 9 l ，发酵得 到的多糖经过活性碳脱色、明阳离子交换树脂处理后的可以达到纯净、无色、透 明的短梗霉多糖，制成的膜无色透明，能达到菌种保藏的要求，为下一步的实验 提供了良好的基础。 湖北工业大学硕士学位论文 第3 章短梗霉多糖及其薄膜性能的研究 短梗霉多糖是出芽梗霉在发酵培养基中产生的一种胞外葡聚糖。与其它微生 物合成的高分子多糖相比，它的特点是成膜性、纺丝性好，易溶于水，能制成很 薄的膜，与其它水溶性高分子有许多相近的性质。短梗霉多糖膜有很强的阻隔氧 气的能力。因为多糖的基本结构单元是葡萄糖，这种膜也具有可食用性。目前， 世界上仅日本h a y a s h i b a r a 生化研究所可以少量生产短梗霉多糖，而多糖薄膜未 见生产。对多糖的流涎法制膜工艺，多糖薄膜的热学性能，某些重要力学性能， 水分含量影响及热封性等尚未见研究报道。本章对多糖及其薄膜性能进行了研究。 3 1 短梗霉多糖性能的研究 3 1 1 材料和试剂 试剂 葡萄糖( o e x t r a n ) 磷酸盐缓冲液( p h = 6 0 ) 短梗霉多糖( 本实验室自制) 主要仪器： s h i m a d z ud t 一4 0 热分析仪 31 2 多糖的热分析 用s h i m a d z ud t 一4 0 热分析仪对多糖进行热分析研究。以a 1 ：0 。作标准，升温 速率为2 0 q m i n ：n 。作为载体，流速为5 0 m l m i n 。 3 1 3 结果与分析 3 1 3 1 多糖的热分析 图3 一l 为短梗霉多糖和玻璃纸的t g 曲线，由t g 曲线可知，在4 0 。4 到17 1 9 之间多糖有较小的热失重，主要是多糖中的水分挥发造成。在1 7 1 9 到2 5 2 3 之间多糖比较稳定，质量变化较小。在2 5 2 3 到4 0 1 8 c 之间多糖的质量变化很 大，显然是因为热分解失去了大部分的质量。在4 0 1 。8 c 至q 5 4 4 8 c 之间失重较小。 湖北工业大学硕士学位论文 可能是少量难于热分解的物质进一步分解。玻璃纸的t g 曲线与之类似。 图3 - 1 短梗霉多糖和玻璃纸的t g 曲线 短梗霉多糖和玻璃纸的d t a 曲线如图3 - 2 所示。多糖在2 7 0 4 处，玻璃纸 在3 7 4 3 处各自出现了1 个吸热峰。对照t g 曲线，这两个吸热峰分别处在它们 的分解温度范围内，此外曲线中再没有出现其它的吸热峰或者放热峰，这表明短 梗霉多糖与玻璃纸类似，不存在熔融态，也不存在结晶态。 图3 - 2 短梗霉多糖和玻璃纸的d t a 曲线 湖北工业大学硕士学位论文 3 2 短梗霉多糖薄膜性能的研究 3 2 1 仪器 h i t a c h i 扫描电镜 x l 一1 0 0 拉力试验机 p c s 一3 0 0 型塑料膜封i ：1 机 3 2 2 短梗霉多糖膜的电镜扫描 短梗霉多糖膜的表面和横切面分别制片，用h i t a c h i 扫描电镜对它们分别进 行扫描。实验条件：真空喷金，真空度1 3 3 xi 0 1 p a ，加速电压3 5 k v ，电流2 0 m a 。 3 2 3 短梗霉多糖膜的力学性能测定 短梗霉多糖膜的拉伸强度和断裂伸长率测定按g b l 0 4 0 9 2 进行，采用x l - 1 0 0 拉力试验机，取i 型样条，拉伸速度为2 5 0 5 0 m m m i n ，试验5 个样品取平均值。 3 2 4 短梗霉多糖膜的热牢合度测定 按z b y 2 8 0 0 4 规定进行。用p c s 一3 0 0 塑料膜封口机将两张同向多糖膜热合在一 起，焊缝与膜纵向垂直，截取宽1 5 0 1 m m ，长i 0 0 + i m m 的样条5 片。试验速度 为3 0 0 2 0 m m m i n ，取平均值。 3 2 5 短梗霉多糖膜的透氧量测定 根据g b l 0 3 8 - - 7 0 进行。透氧量为： g土兰每鑫(硎bardayat stmo a ra a y ) 。 pj p 只、 7 3 2 6 短梗霉多糖膜的灭菌 采用紫外线照射法对两种前处理的短梗霉多糖膜进行灭菌处理，紫外线照射 距离为2 0 c m 3 0 c m 。第一种是先将8 短梗霉多糖容液于1 2 1 灭菌3 0 m i n ，然 后在未冷却之前制成薄膜 记为a ) ；第二种是将8 多糖溶液在低温下脱气2 4 h r ， 然后制成薄膜( 记为b ) 。用紫外线照射灭菌法对这两种不同前处理的短梗霉多糖 湖北工业大学硕士学位论文 薄膜。将薄膜剪成重量为0 1 克的膜片。在无菌室内，于固定的位置对多糖膜进 行紫外线照射。处理的时间分别为o m i n 、5 r a i n ，l o m i n ，1 5 n d n ，2 0 r a i n 。将不同 照射时间的薄膜片分别溶于装有5 m l 无菌的生理盐水的试管中，待膜片完全溶解 后，进行浓度梯度稀释，浓度梯度为1 0 1 0 - 。、1 0 - 。，各吸取0 1 m l 的溶液涂于 已编号的装有完全培养基的直径为9 c m 的培养皿中。置于恒温电热培养箱中培养， 培养条件为2 9 。每天观察培养皿中是否有菌落长出，并且以每皿长出1 0 4 0 个菌落为宜。 3 2 7 结果与分析 3 2 7 1 短梗霉多糖膜的s e m 照片 由于短梗霉多糖的非熔融性质，采用流涎法制膜，塑料薄板连续接膜，多糖 膜紧贴薄板干燥。图3 3 a 为多糖膜的正面s e m 照片，图中无明显的颗粒和孔洞。 多糖分子较好地定向排列，均匀分布，形成有序致密的膜基质。图3 3 b 是膜的横 切面s e m 照片。薄膜的横切面两侧表现出了不对称。干燥时与塑料板相贴的一面 有多糖沉积的痕迹，在于燥过程中由于膜面干燥收缩与塑料板面之间产生一定的 作用力，造成了多糖分子在两侧面的不均匀分布。 ab 图3 - 3 短梗霉多糖薄膜电镜扫描图片 3 2 7 2 短梗霉多糖膜的机械强度和透光性 力学性能和透光性如表3 - 1 所示。 湖北工业大学硕士学位论文 表3 1 多糖膜的机械性能与透光性 32 73 含水量对薄膜热封性能的影响 与塑料膜不同，多糖膜无熔融特性，但多糖膜可以在塑料膜封口机上热压焊 接。两多糖膜热压形成一定的热合牢度，不是熔融热合的结果，而是水在两膜的 热合过程中起到了关键作用。如图7 所示，多糖膜含水量在5 1 5 时热台牢度较 大，两膜间焊缝有均匀平整的压纹。膜的含水量低于5 时，热合牢度随含水量减 少而有所降低。含水量为1 o 0 5 时两膜虽然也可热台在一起，但膜间焊缝不 严，焊接线有皱纹。当含水量低于0 5 时，膜硬且脆，在热压封口机上不能熟台 在一起。这说明水在热压过程中起到粘接作用，在两片膜热压紧贴在一起时，膜 中的水分子受热运动，至两膜的空隙中，由于瞬时受热和水的作用，使两膜面具 有粘性，在热压机的压迫下，两膜沿压线很快粘接在一起，热压结束后，温度降 低，粘接面凝固形成一定的热合牢度。水分含量在1 8 以上时，膜的热台牢度降低。 由于膜含水量过高，两膜热压时，沿压线有较大收缩，可以观察到两膜焊接线有 不均匀的焊点痕迹，由此导致热合牢度减小。 图3 4 短梗霉多糖薄膜于其含水量的关系 3 2 7 4 短梗霉多糖膜的氧气透过量 多糖薄膜的氧气透过量见表3 2 。与玻璃纸、聚丙烯薄膜、聚乙烯薄膜相比， 湖北_ t - 业大学硕士学位论文 _ l l _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ - _ _ - - _ - _ - l _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - - - l _ _ _ _ _ - - - - i i i _ - - _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - 一 短梗霉多糖膜具有更好的阻隔氧气的性能。 表3 2 多糖膜透氧性比较“5 膜氧气透过量 ( c m 3 抽2 1 0 5 p a - d ) 3 2 75 短梗霉多糖膜紫外线灭菌的结果 从表中数据来看，用紫外线对短梗霉多糖膜的杀菌效果良好。短梗霉多糖膜 达到无菌的最短照射时间为5 m i n 。紫外线对a 、b 两膜的杀菌效果的差别还是比 较明显的。在涂有a 膜溶液的培养平皿中长出来的是单一的一种菌，这种菌的菌 落表面看起来比较光滑，湿润，边缘整齐。而涂有b 膜溶液的培养平皿中长出来 的是各种形态的菌落，有的表面光滑湿润，有的呈白色起皱，有的扁平。很明显， 经过高温处理后的多糖溶液制成的薄膜易于灭菌，仅需5 m i n 就可以达到完全无菌 ( 表3 3 ) 。而没有经过高温灭菌的多糖溶液制成的薄膜，在1 5 m i n 的时候才能达 到无菌( 表3 - 3 ) 。图3 5 是紫外线照射灭菌的结果。 表3 - 3 多糖薄膜紫外线照射灭菌结果 湖北工业大学硕士学位论文 3 3 小结 图3 - 5 紫外线灭菌的效果 短梗霉多糖与玻璃纸类似，不存在熔融态，也不存在结晶态，它的成膜性好。 采用流涎法可以制得厚度为0 0 2 0 0 3 m m 的无色透明的多糖薄膜。膜的阻隔氧气 的能力很好，具有一定的机械强度。在含水量为1 0 左右时，膜具有良好热封性 能。多糖先用湿热灭菌，制成膜后，用紫外线对其杀菌，达到无菌效果的最短照 射时间仅为5 m i n 。短梗霉多糖膜的这些性质使膜具备了进行菌种保藏研究的可能 性。 湖北工业大学硕士学位论文 第4 章短梗霉多糖膜的菌种保藏研究 4 1 菌种保藏册的设计 根据本实验室的需要我们将菌种保藏册设计成( 图4 1 1 0 ) 的形式。保藏 册的每一面与相册类似，可插入1 2 张多糖膜单元片( 图9 ) ，每一片含有6 个密 封的保藏单元块( 图l o ) ，那么每页含有1 4 4 个保藏单元块，每个单元相当于一 个斜面试管或一个冷冻干燥管或一个液氮保藏管。这样保藏册的一页就相当于 1 4 4 只保藏管。保藏册的大小，单元片和保藏块的尺寸都可设计调节。 曷仁 l ! 鲤 。i 图4 - 1菌种保藏册外部示意图及大小尺寸( 单位：m ) 图4 2 菌种保藏册的厚度图4 3 菌种保藏册的内部 示意图及厚度尺寸结构示意图及尺寸 图4 4 菌种保藏膜单元及 保藏块结构示意图及尺寸 保藏册可按类划分，如1 5 册细菌、6 1 0 册酵母等( 如图4 1 ) 。只需一个冰 箱大小的体积，就可保藏成千上万菌株。保藏片邮寄方便，便于携带。使用时取 出保藏片，无菌操作剪下一个单元块，去掉外层塑料，保藏菌与多糖膜一起溶于 1剐ll上 一圜 湖北工业大学硕士学位论文 培养基中即可培养生长。 4 2 外包装塑料材料的选择 塑料材料选材的标准： ( 1 ) 能耐高温高压和低温冷冻。塑料材料的用途是用来倮藏菌种的，因此必 须达到菌种保藏的无菌要求。在实验室通常使用的比较普遍的灭菌方法是高温高 压湿热灭菌，条件通常是1 2 1 ，0 1 m p a ，维持1 5 2 5 m i n 。这样就要求所选用的 塑料膜能经得住这个条件。 ( 2 ) 有良好的热封性能。现在市场上有很多能经得起高温的塑料材料，但是 并不是每一种材料都能够用塑料封口机进行热封。 ( 3 ) 对微生物没有毒性。 综合上述三个条件的要求，选择了由武汉市天虹纸塑彩印有限公司生产的一 种塑料膜，市场名称为蒸煮袋。这种塑料膜是用来包装食品后，直接可以在高温 下加热。蒸煮袋在1 2 1 ，0 1 m p a ，维持3 0 m i n 的灭菌条件下，不变形，膜的阻 隔水汽的能力保持不变，热封性能保持不变。 4 3 菌种保藏单元片的制作 先将少量的甘油涂布在已灭过菌的短梗霉多糖膜片中的一端上，然后在将菌 种涂抹在上面，对折( 使涂有菌种的一面向里面) ，将其四边用塑料热封机封好， 放入无菌的塑料袋中，封好塑料袋的口，这样一个完整的短梗霉多糖薄膜保藏块 就制备好了。我们制作的短梗霉多糖薄膜保藏单元片包含有六个这样的保藏块， 将保藏片放入菌种保藏册中，置入低温保藏即可。 4 4 菌种保藏单元片的实物图片 按我们的需要设计成图中的保藏块， 个冷冻干燥保藏管或一个液氮保藏管。 重量及尺寸大小的数据。 每个保藏块相当于一个斜面保藏试管或 表4 1 给出了保藏单元片和保藏块的 湖北工业大学硕士学位论文 a 产朊酵母 c 热带假丝酵母 e 放线菌 b 毕赤酵母 d k y e a s t f 黄色短杆菌1 湖北工业大学硕士学位论文 g 黄色短杆菌2h 假单孢菌 i 枯草芽孢杆菌1 j 保加利亚乳杆菌 k 产b 一葡萄糖瞢菌 m 谷氨酰胺 1 苏云金杆菌 n e c o l i 湖北工业大学硕士学位论文 0 枯草芽孢杆菌2 q 黑曲霉 s 产红色素霉菌 p 分枝杆菌 l 木霉 t 红 曲 图4 5 保藏膜片实物图片( a t ) 2 4 湖北工业大学硕士学位论文 表4 - l 实物图中保藏单元片和保藏块的重量及大小尺寸 往：保减片a 一一包括塑料膜和含有菌种的多糖膜 保藏片b 一一含有菌种的多糖膜。 4 5 小结 这种菌种保藏册的优点是占地面积小，保藏成本低，不要昂贵的设备，操作 方便，安全，便于菌种交流和邮寄，便于微生物分类学的研究。 湖北工业大学硕士学位论文 第5 章菌种保藏效果的检测 采用短梗霉多糖膜片保藏各种微生物菌种，主要包括酵母、霉菌、放线菌和 细菌等四大类微生物细胞，共保存了2 0 种微生物菌种。本章毒要是对所保藏的菌 种在保藏一段时间后进行了存活数检测、菌落和细胞形态观察以及e 一葡萄糖苷 酶菌、产赖氨酸的黄色短杆菌和k y e a s t 酵母菌的发酵能力的实验。 5 1 保藏菌种的存活数的计数实验 存活数是衡量菌种保藏的结果好坏的指标之一，一个好的保藏方法，在一定 的保减期后，应该有一定数量的存活数。因此，我们对短梗霉多糖膜片保藏的1 9 种微生物进行了存活数的计数实验，包括了四大微生物一酵母菌、霉菌、放线 菌和细菌。在这些所进行实验的微生物中，还有一些是工业上已经规模化应用的 微生物。 5 1 1 材料和试剂 培养基1 ：蛋白胨1 o ，酵母膏1 o ，蔗糖0 1 ，氯化钠0 5 ，琼脂2 o ， p h7 0 ( 用氢氧化钾调p h 值) 培养黄色短杆菌l ，黄色短杆菌l ，3 0 。c 3 z 培养基2 ：牛肉膏1 o ，蛋白胨1 o ，葡萄糖0 1 ，氯化钠0 5 ，琼脂2 ， p h7 0 7 2 培养谷氨酰胺菌，2 8 3 0 培养基3 ：牛肉膏0 3 ，蛋白胨o 5 ，氯化钠0 5 ，琼脂2 ，p h7 0 培养苏云金杆菌，3 0 培养基4 培养基5 牛肉膏o ，3 ，蛋白胨1 ，葡萄糖2 3 ，氯化钠o 5 ，琼脂2 ， d h7 2 7 4 培养产b 一葡萄糖苷酶菌，3 2 c 牛肉膏0 ，5 ，蛋白胨1 0 ，氯化钠0 5 ，琼脂2 ，p h7 o 7 2 培养桔草芽孢杆菌1 ，枯草芽孢杆菌2 ，假单孢菌，分枝杆菌，保加利 亚乳杆菌，2 8 3 2 。c 培养基6 ：蔗糖3 o ，硝酸钠o 2 ，磷酸氢二钾0 1 ，氯化钾o 0 5 ，硫酸 湖北工业大学硕士学位论文 镁0 0 5 ，硫酸皿铁0 0 0 1 ，琼脂2 ，p h 自然 培养产红色素霉菌，2 8 培养基7 ：尹红美兰培养基 培养e 。c o l i ，3 2 培养基8 ：蛋白胨2 ，酵母浸出汁1 ，葡萄糖2 ，p h6 o 培养k y e a s t ，毕赤酵母，产朊酵母，2 8 3 0 培养基9 ：葡萄糖3 ，酵母膏0 1 ，磷酸氢二钾0 6 ，磷酸二氢钾0 2 ，七 水硫酸镁0 0 0 4 ，四水氯化锰0 0 0 0 6 7 6 ，六水三氯化铁0 0 0 0 2 ， v 。，0 0 0 0 4 ，硝酸钠0 1 5 4 ，氯化钠o 2 ，p h7 0 培养a p 酵母，2 8 3 0 培养基1 0 ：可溶性淀粉3 0 ，蔗糖6 o ，蛋白胨2 。5 ，p h5 。5 6 0 ( 用乳 酸调节) 培养红曲，2 8 3 0 培养基1 1 ：可溶性淀粉2 ，磷酸氢二钾0 0 5 ，硫酸镁0 0 5 ，硫酸亚铁 0 0 0 1 ，硝酸钾0 1 ，氯化钠0 0 5 ，p h7 2 培养放线菌，2 8 3 2 培养基1 2 ：蔗糖3 0 ，玉米浆o 1 ，酵母膏0 1