基于磁分离的全自动核酸工作站的软件设计与实现-生物医学工程硕士论文

学校代码：! Q 垫 分类号：坠1 8 密级： 公珏 UDC ： 21 ：靼 学号：! 壁3 3 Q 隶初 大 誓 硕士学位论文 川I II II I III I I I l l I W F 2 8 0 6 0 3 6 基于磁分离的全自动核酸工作站的 软件设计与实现 研究生姓名： 导师姓名： 申请学位类别王堂亟学位授予单位盔直太堂 级学科名称生翅医生王猩论文答辩H 期! ! ! ! 生县3 Q 旦 级学科名称学位授哥E l 期! ! ! ! 生 旦旦 答辩委员会主席扬壹熬授 评 阅 人 2 0 1 3 年5 月3 0F 1 隶劫大粤 硕士学位论文 基于磁分离的全自动核酸工作站的 软件设计与实现 本论文得到国家重点基础研究发展计划一纳米研究重大科学研究计划( 2 0 1 0 C B 9 3 3 9 0 3 ) 、国家艾滋 病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项( 2 0 1 3 Z X l 0 0 0 4 1 0 3 0 0 2 ) 和国家自然科学基金 ( 6 1 2 7 1 0 5 6 、2 1 2 0 5 0 1 3 、6 1 2 0 1 0 3 3 ) 资助。 D E S I G NA N DI M P L E M E N TO FA SO F T W A REFO RA U T O M A T I CN U C L E I C A C I DW O R K S T A T I O NB A S E DO N M A G N E T I CSE P A R A T I O N AD i s s e r t a t i o nS u b m i t t e dt o S o u t h e a s tU n i v e r s i t y F o rt h eA c a d e m i c D e g r e eo f M a s t e ro fE n g i n e e r i n g B Y Z h a n g B o - b o S u p e r v i s e db y P r o f H eN o n g y u e D e p a r t m e n to fB i o l o g i c a lS c i e n c e & M e d i c a lE n g i n e e r i n g S o u t h e a s tU n i v e r s i t y M a v2 0 1 3 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个入在导师指导下进行的研宠工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加阻标注和致谢的地方夕 ，论文中不包含其他入已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书丽使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：逋迪舀期；垒皇堕：蔓! 公 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中匿科学技术信息研究所、因家图书馆有权保窝本人所送交学位论文纳复印 件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括 以电子信息形式刊登) 论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布( 包括以电 子信息形式刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：嫩导师签名： 摘要 中文摘要 在核酸变异位点的高通量检测中，需要对大量核酸样本进行处理和分析。但传统 针对人样本核酸序列的生物检测技术无法满足实时分离、分析和检测的需要。基于磁分 离的核酸样本处理方法可以充分利用磁性纳米颗粒所具有的磁分离、磁聚集、超顺磁性 及生物相容性等特性，显著提高大样本核酸检测的效率，降低实时处理的难度，使得高 通量核酸的检测与分析变得更加方便和快捷。为使基于磁分离技术的核酸样本检测方法 更好地应用于临床分子诊断，提升整个实验过程的自动化程度是迫切需要解决的一个工 程性课题。为此，本文开发了一套操作简便、功能强大、能够实现大批量核酸样品全自 动处理的系统控制软件。论文的研发思路和主要工作如下： ( 1 ) 根据基于磁分离的全自动核酸工作站的功能需要，对系统控制软件进行了需求 分析，提出了软件平台的整体设计方案，并按照模块化思路将系统任务划分为图形界面 接口模块，功能指令模块、上下位机通信模块以及流程控制模块等四个功能块。 ( 2 ) 在软件总设计基础之上，为实现实验工作流自动化，从界面接口出发，分析并 设计了实验功能指令模块；对整个系统的通信方式进行描述并设计了通信协议格式；最 后，利用自定义串口通信类对实验流程进行了控制，使得控制命令的发送接收可以有序 进行，顺利实现生化实验工作流的自动化完成。 ( 3 ) 将论文研发的控制软件植入磁分离全自动核酸工作站，通过核酸提取实验对系 统软件的自动化工作流进行测试和验证，并与传统手工核酸提取实验结果进行比较分 析。结果表明在本软件系统控制下的核酸工作站进行核酸提取的结果正确，重复性好， 说明核酸工作站软件系统工作流的自动化控制效果良好，能够满足全自动核酸工作站的 应用需求。 关键词： 核酸检测；磁分离；全自动核酸工作站；系统控制软件；自动化工作流 摘要 I I A b s t r a c l A b s t r a c t I nh i g h t h r o u g h p u td e t e c t i o no fn u c l e i ca c i dm u t a t i o nl o c i ，d e t e c t i o na n da n a l y s i sf o r l a r g ea m o u n t so fn u c l e i ca c i ds a m p l e si sn e e d e d H o w e v e r , v a r y i n gd e g r e e so fd e f e c t sa r e e x p o s e di nt r a d i t i o n a lb i o l o g i c a lt e c h n o l o g yf o rs e p a r a t i o n ，a n a l y s i sa n dd e t e c t i o no fal a r g e n u m b e ro fn u c l e i ca c i ds a m p l e s M a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sh a v ec h a r a c t e r i s t i c so fm a g n e t i c g a t h e r i n g ，m a g n e t i cs e p a r a t i o n ，s u p e r p a r a m a g n e t i s m a n d b i o c o m p a t i b i l i t y , w h i c h c a n c o m b i n eo rs e p a r a t en u c l e i ca c i dr a p i d l y , a n dm a k ea n a l y s i sa n dd e t e c t i o no fn u c l e i ca c i d b e c o m ec o n v e n i e n ta n de f f i c i e n t ，e s p e c i a l l yf o rm a s s i v es a m p l e s T om a k eb e t c e ru s eo f n u c l e i ca c i ds a m p l e sd e t e c t i o nm e t h o db a s e do nm a g n e t i cs e p a r a t i o nt e c h n i q u ei nc l i n i c a l m o l e c u l a rd i a g n o s t i c ，i th a sb e c o m eap r e s s i n gp h y s i c a ls u b j e c tt oi m p r o v et h ea u t o m a t i o no f t h ew h o l ee x p e r i m e n tp r o c e s s F o rt h i s p u r p o s e ，as i m p l eo p e r a t i o na n dp o w e r f u lh o s t c o m p u t e rs y s t e m ，w h i c h c a n a c c o m p l i s hp r o c e s s i n go fl a r g eq u a n t i f i e so fs a m p l e s a u t o m a t i c a l l yw a sp r o p o s e d S p e c i f i cw o r kc a nb ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： ( 1 ) B a s e do nt h er e q u i r e da n a l y s i so fa u t o m a t i cn u c l e i ca c i ds a m p l e sp r o c e s s i n gs y s t e m ， w ep r o p o s e dt h eo v e r a l ld e s i g np r o j e c to fs y s t e ms o f t w a r e ，t h e nd i v i d e dt h ew h o l es o f t w a r e p r o j e e ti n t of o u rm o d u l e sa c c o r d i n gt om o d u l a rd e s i g nm e t h o d ：e x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e f u n c t i o nm o d u l e ，g r a p h i ci n t e r f a c em o d u l e ，c o m m u n i c a t i o nm o d u l ea n dp r o c e s sc o n t r o l m o d u l e ( 2 ) B a s e do nt h es y s t e mr e q u i r e m e n t ，w ed i v i d e de x p e r i m e n t a lp r o c e d u r ef u n c t i o n m o d u l e ，d e s i g n e d a n d i m p l e m e n t e dt h eg r a p h i ci n t e r f a c em o d u l e ，i n t r o d u c e dt h e c o m m u n i c a t i o nm o d u l ea n dd e s i g n e dc o m m u n i c a t i o n p r o t o c o lf o rd i f f e r e n tc o n t r o lb o a r da n d u t i l i z e ds e l f - d e f i n e ds e r i a lp o r tc l a s st oc o n t r o le x p e r i m e n t p r o c e s s ( 3 ) W ec o m p a r e dr e s u l t so fD N Ae x t r a c t i o ne x p e r i m e n tu s i n gm a n u a lo p e r a t i o na n d i n s t r u m e n to p e r a t i o n ，r e s p e c t i v e l y T h er e s u l t so fD N Ae x t r a c t i o nu s e dt h es e l g d e s i g n e d i n s t r u m e n ti n d i c a t eg o o ds t a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y , m e a n i n gt h es y s t e ms o f t w a r eh a d p r e f e r a b l ec o n t r o le f f e c t ，a n dt h ee x p e c t e dg o a lc a nb ea c h i e v e d K e y w o r d s ：n u c l e i ca c i dd e t e c t i o n ；m a g n e t i cs e p a r a t i o n ；f u l l a u t o m a t i cn u c l e i ca c i dw o r k s t a t i o n ； s y s t e mc o n t r o ls o f t w a r e ；a u t o m a t i cw o r k f l o w I I I A b s t r a c t 目录 目录 中文摘要。I A b s t r a c t I I I 目录v 第一章绪论1 1 1 课题背景1 1 2 核酸技术的研究现状1 1 2 1 核酸概述1 1 2 2 基于磁性纳米颗粒的核酸分析检测2 1 3 全自动核酸工作站研究现状6 1 3 1 国外发展现状6 1 3 2 国内研究现状9 1 3 3 现阶段主要存在问题9 1 4 本课题的目的及主要研究内容1 0 第二章全自动核酸工作站软件总体设计1 1 2 1 前言1 1 2 2 自动化工作站总体构成1 1 2 2 1 系统总任务1 1 2 2 2 硬件平台基础1 3 2 3 自动化工作站软件系统分析1 5 2 3 1 用户需求分析1 5 2 3 2 系统需求分析。1 6 2 4 自动化工作站软件总体设计1 8 2 4 1 软件开发平台搭建1 8 2 4 1 1 开发环境选择1 8 2 4 1 2 开发工具选择。1 9 2 4 1 3 软件设计方法选择1 9 2 4 2 自动化工作流的实现过程2 0 2 4 3 软件框架结构：2 1 2 4 4 软件设计方案探讨2 3 2 5 本章小结。2 3 第三章自动化工作流的设计与实现2 5 3 1 引言2 5 3 2 图形界面接口设计2 5 3 2 1 基于X t r e m eT o o l k i tP r o 的界面编程。2 5 3 2 2 工作台配置界面设计2 6 3 2 3 实验流程编排界面设计2 7 3 3 实验指令集划分2 8 3 3 1 软件指令分析2 8 3 - 3 2 功能指令类的设计3 1 3 3 3 功能指令类参数界面3 2 3 4 上下位机通信设计3 5 3 4 1 串口通信概述3 5 V 日录 3 4 1 1 串行通信方式3 5 3 4 1 2 串行通信接口标准一3 6 3 4 1 3 串口通信协议3 6 3 4 2 系统通信方案总设计3 7 3 4 2 1 系统拓扑结构3 7 3 - 4 ，2 2 通信方式3 7 3 4 2 3 通信协议数据帧格式3 8 3 4 3 上位机通信编程3 9 3 4 - 3 1 控件M S C o m m 串口编程3 9 3 4 3 2C S e r i a l P o r t 类串口编程工具3 9 3 5 工作流自动化设计4 0 3 5 1 功能指令序列化4 0 3 5 2 线程间通信方式4 2 3 5 3 自动化工作流实现方式。4 3 3 6 ，J 、结4 5 第四章可编程生化实验过程自动化验证4 7 4 1 引言4 7 4 2 人工D N A 提取实验4 7 4 2 1 样本来源4 7 4 2 2 实验试剂。4 7 4 2 3 实验仪器4 8 4 2 4 实验方法4 8 4 3 全自动核酸工作站D N A 提取实验4 8 4 3 1 样本来源4 8 4 3 2 实验试剂4 9 4 3 _ 3 实验仪器4 9 4 3 4 实验方法4 9 4 3 4 1 实验台准备4 9 4 3 4 2 软件实验台布局设置5 0 4 3 43 实验方法5 0 4 4 结果与讨论5 2 4 5 小结5 3 第五章总结与展望5 5 参考文献5 6 硕士期间发表论文和专利申请6 l 致谢6 2 V I 第一章绪论 1 1 课题背景 第一章绪论 进入二十一世纪以来，国际国内对于生命信息和疾病诊断研究投入了大量的人力财 力，使得生命科学研究和医学技术不断进步。2 0 0 3 年人类基因组计戈l J ( h u m a ng e n o m e p r o j e c t ，H G P ) 的完成，更使得生命科学进入一个蓬勃发展的全新时代。而作为遗传信息 载体的核酸，由于其对生物的遗传、变异和蛋白质的合成具有的极其重要的作用，与生 物的生长、发育，疾病等生命活动息息有关，使得其分析检测成为了生命科学研究、临 床检测等领域最重要的研究热点之一【l 】o 不论是在人体核酸变异位点的高通量检测中，还是快速疾病分子诊断中，我们都需 要对核酸进行高准确性、高通量、高灵敏的分析【2 卅。但大部分情况下，对核酸序列的 操作仍依靠传统的手动分步操作实现样品分离、样品处理分析等，单次检测样本数量有 限，对于核酸分析的周期和效率有着很大的影响。同时，由于人为操作的失误，也可能 导致实验结果的偏差，产生不良影响，甚至是严重错误的病理判断。因此我们急需要自 动化工作平台以提高效率。 目前，虽然已有技术平台能够实现高通量的核酸提取、检测、分析，但却有着各自 的不足和局限性【5 8 J 。首先，现有的技术平台功能相对单一，只能单独用于某一功能， 如核酸提取或检测等，不利于实验的同步进行。其次，现有的自动化核酸工作站，基本 为国外垄断，国内所购设备基本为进口，花费大，如需使用配套试剂盒，更是大大增加 了成本。 综上所述，无论是在生命科学研究还是大规模临床检测当中，我们都需要一个能够 完成大规模位点分析，大量样本分子诊断等的集多种功能于一体的全自动生物大分子检 测平台。该平台能够完成常用生化实验的设计实现，大幅度提高生化实验的自动化程度， 简化用户的操作使用，为加速我国生命科学研究进展，同时也为医疗事业的发展做出贡 献。 1 2 核酸技术的研究现状 1 2 1 核酸概述 核酸是广泛存在于细胞核内的一种生物大分子，是生物体遗传信息的携带者 束m 学碗学f t * i 和传递者，最早由瑞士化学家F M i e s c h e r 发现”I 。根据化学组成不同可分为脱氧核 糖核酸( D N A ) 和核糖核酸( R N A ) 。其中，D N A 含有生物物种所有的遗传信息，而 R N A 是蛋白质合成的场所。1 9 5 3 年，英国科学家J a m e s W a t s o n 和F r a n c i s C r i c k 发 现并提出D N A 双螺旋结构模型( 图卜1 ) ，成为人类生命科学发展的转折点1 1 0 i ，生 物学随即进入到一个全新的基因时代。 照 图】- If a l 电予显徽镜下的人炎D N A ；( b ) D N A 的结构照J t 由于含有全部遗传信息，核酸迅速发展成为各个学科的热门研究对象。其中 以解读生命密码、疾病产生机制及生老病死等生命现象为目的的人类基因组计划， 更是与曼哈顿原子弹计划和阿渡罗计划并称为三大科学计划】。随着核酸的研究 不断深入人们对核酸结构和功能的认知越来越清晰，对于其在生物体内的作用 机理也有进一步的认识。不断的认识和掌握，吸引了各领域专家们对于核酸的关 注。而其纯生物太分子，无毒副作用，易降解等特点，也使得核酸在生物医学、 食品、农业等多个行业的应用前景越来越广泛【l2 - 1 6 。 在生物医学领域，对于核酸研究的不断深入，有助于了解生命本质，探究疾 病产生的机制。近年来，核酸分析在遗传诊断传染检测，亲子鉴定基因监测 等方面变得越来越重要，并在鉴别敏感基因与常见病的关系等大规模基因研究中发挥 着重要作用。核酸的分析主要包括了核酸分离和扩增、基因多态性检测、D N A 测序等。而随着基因组学不断进步，核酸分析的相关技术也随之发展，更新更 简单更快捷的技术不断出现，为核酸在生物医学领域的应用发展提供了新途径。 I2 2 基千磁性纳未颗粒的核酸分析检测 磁性纳米颗粒( M N P 曲是处于纳米级( 0 1 0 0r i m ) 的一类颗粒材料( 图1 - 2 ) 一般由 磁性元素构成，如铁，镍，钻及他们的氧化物( F e m 0F e 2 C 0 0 4 、C r 0 2 等) 1 1 9 i ，目前使 用最广的是铁及其氧化物。磁性纳米颗粒既其有纳米材料所特有的性质如小尺寸效应、 $ 镕 量子尺J 教应、表面效应等，同时还具有磁响应性及超顺磁性，可以在恒定磁场F 聚集 和定位、在交变磁场下吸收电磁波产热I “I 。 一 圈I - 2F e ，o 礁性纳米颗粒电镜照片 由于磁性纳米材料与其它材料相比所表现出的卓越的性能，使得它在工业领域应 用广泛，比如催化剂，银行支票的磁性油墨，磁记录载体、雷达波吸波材料等“I 。同 时又凼为这些特性，磁性纳米颗粒在生物医学领域得到了更多的研究和应用，主要包括 有生物分离、D N A 铡序t 单核苷酸多态垲A ( S N P ) 检测、核磁共振成像( M R t ) 、药物载体 以及疾病诊断治疗等方面2 5 。q 。 ( 1 ) 磁性纳米颗粒用于核酸分离提纯 随着核酸研究的不断深入，对核酸的需求量也不断增多，如何快速、简便、 经济地得到更多核酸己成为+ 个亟待解决的基础性要求。由于核酸总是与各种蛋 白质结台在一起，因此想要得到纯粹的核酸就必须对核酸进行分离提纯，同时需 要保证核酸分子的结构完整性，并排除其它分子污染m l 。目前，对于D N A 的分离 提取方法相对较多，有传统的酚一氯仿法、碱裂解法，煮沸裂解法等1 2 + , 3 1 l ，也有新兴的离 心枉法等。 采用酚氯仿法虽然提取到的D N A 纯度较高，但操作步骤多且繁琐，耗时长，容易 造成样本的污染丢失，得到的D N A 产量偏少。不太适合大批量提取m , 3 0 I 。碱裂解法和 煮沸裂解法提取D N A 原理类似，这两种方法提取的D N A 量多，且操作相对简单，但 是提取结果不稳定【3 1 - 3 2 。总之，传统的D N A 提取法均耗时较长，结果却不甚理想，对 于大量样本的处理无能为力不适用于批量提取和自动化操作。 离心柱法D N A 提取试剂盒以低廉的价格和相对便捷的操作，逐渐取代了传统D N A 提取方法，但离心柱法提取D N A 同样需要较多的样本，耗材多，对于微量样本作用有 限，同时提取过程中需要反复离心，不利于高通量、自动化操作“1 。为了更好的解决这 一问题，研究人员提出了基于磁性纳米颗粒的D N A 提取法l “- 3 s 】。其基本原理如图1 3 所示： 彳1 挈警挈乡 0 9 一曰一导+ 四一0 葛“I I 一 一 J L _ ； 1 忆 图1 4 P C R 原理圈 P C R 技术自河世以来不断地推陈出新出现了很多衍生技术，包括定量P C R 、原位 P C R 、多重P C R 、免疫P C R 、P C R 芯片等1 3 9 - 4 ”。而随着纳米技术的不断发展，将纳米 粒子与P C R 扩增技术相结合的新方法已成为新的一个研究热点。 T o m o k o 等4 3 I 睫用由脂膜包裹的磁性纳米颗粒田M P ) 与P C R 产物相结合，实现了 A L D H2 ( a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e2g e n e ) 的单核W 酬( S N P ) 分型，其中A L D H2 碎 片通过生物索链亲和素相互作用在磁性纳米颗粒表面形成共轭对( 图l 一5 ) 。在荧光显微 4 第章绪论 镜F 观察P C R 产物一B M P 复合粒子，纯f f T ( A L D H 2 。1 + I ) ，杂合T ( A L D H 2 + 1 2 ) ，和 突变体( A L D H 2 2 t 2 谨因型在每个颗粒的二二种荧光模式下被辨别。 刚。5 折“啪“焉蔫P 9 C R 强黧戮。B M 冲P 1 斧产物结合黼“( b ) 和产物结合后的 1 清华大学的谢欣，张旭等人1 对磁性纳米粒子进行了羧基修饰，使得它可以同时作 为D N A 吸附和P C R 扩增的同柑载体，实现了在一只离心管中完成D N A 的提取和扩增 整个操作过程。对微量唾液样品中H L A 基因扩增产物进行基因分型实验，取得了良好 的效果。 碰性纳米颗粒与P C R 技术的结台，为P C R 技术的进一步发展提供了更广阔的思路 和方法，对于基因片段扩增，目标产物的分离纯化、基因分型等方面的应用发展提供了 技术支持。而磁性纳米颗粒快速分离、生物降解、无毒环保等特性，使得其在现如今的 机械化社会的使用率更高，更适合自动化工艺，大大拓宽了P C R 技术的应用前景。 ( 3 ) 磁性纳米颗粒用于核酸检测 如前所说，核酸在生命科学和诊断学领域应用广泛特别是在基因测序，疾病检测 等领域。核酸检湖0 的方法非常多，并不断有新方法被开发出来。传统的核酸检测方法是 采用核酸杂交技术进行检测，虽然采用放射性标记的探针可以提高检测的敏感性，但仍 然偏低，不能满足临床需要l ”4 ”。近年，基于P C R 技术的检测技术迅速发展，主要为 利用各种扩增放大技术提高检测的灵敏度。 E l e f f h e r i a 等【4 ”人使用酶基因作标记物将很高的放大因素引入分析技术中，因为每 一个独立的基因标记物可转录出许多酶分子，每一个酶分子每分钟催化许多产物分子形 成。但该方法需要转录翻译步骤以从基因标记物产生活性酶，这增加了方法的复杂性。 Z h a n g 等口q 提出了一种基于A u - C u S 复合纳米颗粒信号放大的核酸检预4 分析技术。 他们采用夹层式方法，将目标D N A 一端与修饰有D N A 探针的A u C u S 复合纳米颗粒相 连，另一端与A u 电极相连，通过测定铜离子浓度量化目标D N A 浓度，通过结合鲁米 诺一H 2 0 2 - C u 2 + 产生化学发光进行检测。结果证明此方法具有高灵敏性、高选择性以及稳 东m 学 f t 论z 定性，可成为g ：物检测的一个a i 错选择。 J o s e p h s o n 小组使用F e 2 0 j F e 3 0 4 ( 3n m ) 磁性纳米颗粒进行了寡核苷酸分型实验( 图 l 6 ( a ) ) 。他们设计了与目标D N A 的前、后半段互补豹两条寡核好酸固定于F e 2 0 3 F e 3 0 4 磁珠表面。将S N P 位点扩增产物的一条单链作为连接寡核苷酸与磁珠进行杂交，通过 观察是否有沉淀出现以判断单核苷酸多卷性( s N P ) 的基因型。对比实验结果显示试管中 m 现明显的棕色沉淀物( 图1 6 ( b ) ) 。 怕) j 高。，。露 j _ - V ：、“AB ，o 、。 7 0oo O 22 。_ ； 图I - 6 ( 砷磁性纳米粒子分型；( b ) 与磁性纳米粒子探针结合的寡核苷酸效粜”1 1 3 全自动核酸工作站研究现状 人类基因组、功能基因组的研究不断深入，大规模样品制备及检测已经成为制约其 发展的瓶颈所在。传统实验方法需要耗费大量人力财力，但其效率、稳定性却很难达到 所需，且许多试剂会对人体造成伤害。因此，随着方法学的4 i 断推进，相关样品批量处 理仪器适时m 现m 】。目前，国外已有数家公司的样本处理系统进入市场，国内一些公司 也开始各展所长研发相应方法及自动化设备，并已有相应的产品上市。 13 1 国外发展现状 自从上世纪8 0 年代检验科率先使用自动化样本处理装置来处理他们成千上万的样 本以来，更多功能的实验室自动化装置被设计、生产并投入使用。其后，随着计算机 技术的高速发展，对硬件的开发逐渐转为过程控制软件的设讣，以控制和组合更多的自 动化组件。这样的软件在管理运输，存储，试剂检索，以及支持自动化重复和后续的测 试分析方面是非常重要的【州。将计算机系统与实验室自动分析仪和自动样本转运单元相 结合，成为实验室发展的必然趋势矧。 始创于1 8 9 6 年的罗氏公司( R o c h eG r o u p ) 是制药和诊断领域世界领先的健康医疗公 司之一。罗氏诊断作为罗氏中国的一个重要分支，更是诊断学领域的市场领导者。罗氏 产品分布从科学研究、临床实验室系统到病忠白我监测，拥有C o b a s 系列生化分析仪以 6 及M a g N A 系列核酸纯化系统等多种产品。图卜7 ( 劬为罗氏新开发出的M a g N gP u r e9 6 高 通量全自动快速核酸纯化系统。 M a g N AP u r e9 6 核酸纯化系统将M a g N Ap u r e9 6 和L i g h t C y c l e r4 8 0 实时定量P C R 系统组台，完成了从样本前处理到定量分析的一体化流程，可以很快获得大量高重复性 核酸样本，最大体积为lm L 。该系统采用全电脑控制方式，提供配套软件。可安装于 W i n d o w s 操作系统。软件界面如图l - 7 f b ) 所示。控制软件采用图形界面，输入的数据和 独立运行的信息均被储存管理。 围l - 7 M a g N A P u r e9 6 高通量全自动快速校酸纯化系统 德国E p p e n d o r f 是一家专注于研发和销售实验室的液体处理、样品处理和细胞处理 的仪器、耗材和服务的生命科学公司。其产品广泛应用于学术科研和商业机构如制药、 生物技术以及化学分析、临床实验室、法医检测等。 E p p e n d o f f 的e p M o t i o n 系列工作站是可实现不同需求的液体处理系统。其中， e p M o t i o n5 0 7 5M C ( 凰l - 8 ) 整合了热盖梯度P C R 仪，可以在一个封闭的环境中实现全自 动的P C R 扩增。e p M o t i o n5 0 7 5M c 工作站的软件完全整合入e p M o t i o n5 0 7 5M C 系统中， 所有的编稗和操作可通过一个操作面板进行摔制。 瑞士T e c a n 是全球领先的生物制药、l 临床诊断领域自动化及解决方案供应商，其液 体处理技术处于全球领先地位。F r e e d o m E V O 系列全自动工作站提供了精确可靠的移液 操作，它可以整合多种实验设备，实现诸如药物筛选、核酸蛋白提取等实验过程的自动 化，继而实现核酸自动化高通量、标准化的检测( 罔1 - 9 ) 。 m m 学砸半f 论女 F r e e d o mE V O 系列可提供网种具有不同容最的：E 作舟( 7 5 、1 0 0 、l5 0 和2 0 0c m ) ， 每种均具有基础构建模块，可进行精确可靠的激体处理段简单易用的E - 1 动L 操作。每种 平台均可结合众多可选的机械臂、液体处理工具和应用选项，这些均由界面直观的软件 驱动，可随着用户应用需求变化而卅级演化。 丁作站 H a m i l t o n 公司是一家以液体处理技术为核心产业的公司，它将自动化操作与液体处 理融合在起。M i c r o l a b S T A R 生物样品自动处理工作平台是用户定制型自动化实验 操作平台，可以实现自动加样、试剂分配、超微量移液以及相关振荡、孵自等操作。 如果整台第三方设备，可实现整个实验流程的全自动化。 H a m i l t o n 软件设计能够编辑自动化实验步骤，并训以随时根据需求变化进行修改。 为了充分满足编程应用的需求，M i c m l a b V e c t o r 软件提供从简单到复杂编程的不同工具。 H a m i l m nM i c r o l a b S T A R 工作站模块式设计能使研究工作者根据实验要求来配置其系 统。目前，H a m i l t o nM i c r o l a b S T A R 被广泛地运用于基础生物医学研究，临床医学诊 断，化工化妆品工业和法医箍定等领域。 尉藿 此外，还有众多全球知名公司拥有着可以满足不同类型实验室需求的各类型全自动 工作站。例如英国T A P 公司的C e l l o 系统、H o m e b a s e 系统，O L Y M P U S 公司的O L A 系 列A & T 公司的C L I N I L O G 系统，及B e c k m a nC u R e r 公司的B i o m o k 系列等均占有 较高的市场份额。 第章绪蹬 I3 2 国内研究现状 在倒内，实验操作自动化和信息化发展较晚，且被加工制造所制约，使得自动化设 备大部分局限于单纯的某一功能，且与计算机应用的结合相对较少唧I 。其中，液体工作 站仪有上海复1 3 科技有限公司的F R 9 5 0 的生物实验自动移液工作平台上海永创医疗 器械有限公司的S F 2 液体样本处理系统( s F 2 等寥寥几家，均为电脑全控制的自动化设 备，采用全中文软件界面，符合国内用户需求。 图I - 1 1 ( 时F R - 9 5 0 牛物实验自动移液工作平台：( b ) S F 2 液体样本处理系统 除上述液体工作站外，国内自动化生化仪器均为单一功能的自动化设备，主要有： 厦门致善L a b - A i d 8 2 0 全自动核酸提取仪，西安天隆N P 9 6 8 全自动核酸提取仪、厦门欧 达科M P 1 2 0 核酸自动提取仪；杭州博日L i n e G e n e9 6 0 0 实时荧光定量P C R 仪，西安天 隆T L 9 8 8 实时荧光定量P C R 仪，珠海黑马H e m a9 6 0 0P C R 仪；上海比朗B i o L u m I I 荧 光检测仪，北京原平蜡M o d u l u s 荧光检测仪等。 1 33 现阶段主要存在问题 综上可知，国外自动化设备的发展不断向全自动、微量化等方面发展，可采用钡j 定 技术和可测反应类型不断增多，通道不断增多。随之，控制软件系统的功能得到极大增 强，并且在不断发展【5 ”。但是国外现有实验室设各自动化更着重于某一功能的实现，譬 如核酸的自动提取。而仪器的自动化程度越高，其复杂程度就越高，使用难度也增大， 相应地，其配套控制软件的开发难度也不断增加。 而国内自动化核酸榆测设备的硬件大多依赖进口，同时缺少自主知识产权的软件系 统，使得仪器价格昂贵，维护不便。因此，发展具有自主知识产权的全自动多功能核酸 检测设备，研发优质的系统平台软件能有效降低成本，减少进r l 依赖，从而更好地满足 国内H 益增长的分子诊断设备的需求，而且具有良好的市场潜力和应用价值唧I 。 东南大学硕士学位论文 1 4 本课题的目的及主要研究内容 随着对基因组学，诊断学等学科的深入研究，生化技术不断发展，对核酸的提取、 检测要求越来越高。而随着方法学的不断进步，相应仪器的自动化程度也不断发展，而 基于软件全控制的自动化设计更成为未来自动化设备的必然趋势【5 9 1 。本文中，主要工作 为设计基于磁分离的全自动核酸工作站控制软件，实现生化实验工作流自动化，具体内 容包括以下方面： ( 1 ) 软件的总体设计：对全自动核酸工作站进行了需求分析，选择了合适的软件 开发环境、软件开发平台及软件设计方法。依照结合生化实验步骤，明确了软件的T 作 流程，并在此基础之上，制定了整个软件系统的开发任务，并对工作任务进行了划分。 ( 2 ) 软件自动化工作流的设计：首先，为实现更好的人机交互，设计操作简单， 功能齐全，美观大方的图形界面。其次，采用面向对象的设计方法，对系统涉及的功能 指令进行整合，抽象成单独的实验指令类供用户自由组合，完成生化实验的自由设计。 之后，对软件的通信模块进行设计。采用串口通信方式，通过自定义串口通信类确保了 上下位间的通信。最后，文中通过对指令类的序列化以及线程间的通信实现整个生化实 验的自动化执行。 ( 3 ) 软件的自动化工作流验证：本文中采用磁珠法D N A 提取实验对全自动核酸工 作站控制软件的控制效果进行了验证，并将实验结果与手动D N A 提取结果进行了比较 分析。一方面，验证了系统控制软件的自动化实现；另一方面，实现了基于磁分离的自 动化核酸工作站在生化实验中的应用。 1 0 第二章全自动核酸工作站软件总体设计 2 1 前言 第二章全自动核酸工作站软件总体设计 核酸作为遗传信息的载体，一直是人们探寻生命起源，探究生老病死