（内科学专业论文）cox2、bfgf在胃癌中的表达及临床意义.pdf

导师：王庆才教授 中文摘要 目的 本研究采用免疫组化技术s p 法检测胃癌( g a s t r i cc a r c i n o m a ) 手术标本石 蜡切片组织中c o x 2 、b f g f 在胃癌及癌旁正常组织的表达，探讨其表达与肿 瘤临床病理特征及与血管生成之间的关系，为临床抗肿瘤血管生成治疗提供 理论依据。 材料与方法 随机收集并选择我院( 泰安市中心医院) 2 0 0 9 年1 月2 0 0 9 年8 月期间资 料完整的手术切除并经病理证实的3 8 例原发性胃癌患者组织( 均为首次手 术) 及3 6 例患者癌旁5 e m 组织标本，后者作为对照组。每例切片4 张，应用免 疫组化s p 法测定c o x 2 和b f g f 的表达情况，用抗c d 3 4 单克隆抗体来标记血 管内皮细胞计数单位面积中的微血管数目，结果用s a s9 0 统计分析炉 o 0 5 作 为有统计学意义的判断标准。 结果 ( 1 ) c o x 2 在胃癌组织中表达率为7 1 0 5 ，而癌旁5 c m 组织阳性表达率 为0 ，癌旁5 c m 组织中未检出c o x 2 的表达。 i 、期胃癌患者组织中c o x 2 阳性表达率明显高于i 、i i 期阳性表 达率，二者相比较有统计学意义( p o 0 1 ) 。有淋巴转移者阳性表达率高于 无淋巴转移者，二者比较有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 ( 2 ) b f g f 在胃癌患者组织中阳性表达率为6 0 5 3 ，而癌旁组织中阳性表 达率为2 7 7 8 ，相比较有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 胃癌患者组织中i 、i i 期b f g f 阳性表达率为2 2 2 2 ；i i i 、i v 期阳性表 达率为7 2 4 1 ，二者相比较有统计学意义( p o 0 1 ) ；有淋巴转移者阳性表 达率( 7 1 4 3 ) ，明显高于无淋巴转移者( 3 0 0 0 ，二者相比较有统计学意 义( p o 0 5 ) 。 ( 3 ) 胃癌患者组织中c d 3 4 标记的微i 缸管密度( m v d ) 结果显示，在有淋 巴结转移的癌组织中，其m v d ( 5 2 19 士l3 7 3 ) 高于无淋巴结转移组 ( 3 6 3 8 4 - 1 2 0 5 ) ；漫润到深层组织的癌组织的m v d ( 5 3 9 6 4 - l8 8 2 1 高于未漫涧癌 组织的m v d ( 2 8 7 5 4 - 15 7 3 ) ，经统计学处理，差异均有显著统计学意义( p o 0 5 ) 。 ( 4 ) 胃癌组织中c o x 2 、b f g f 表达与m v d 关系密切。随着c o x 2 、b f g f 表达强度的增加，m v d 呈升高趋势。 结论 1 c o x 2 在胃癌组织中高表达，c o x 2 表达与肿瘤分期、淋巴转移相关， 但与年龄、性别、分化程度及漫润深度均无关。 2 b f g f 在胃癌组织中表达高于癌旁组织，b f g f 表达与肿瘤分期、淋巴 转移相关，但与年龄、性别、分化程度及浸润深度均无关。 3 提示c o x 2 、b f g f 二者在肿瘤血管生成方面可能有协同作用，m v d 、 c o x 2 、b f g f 三者联合检测可能有助于判断胃癌分期及淋巴转移情况。 关键词胃癌；免疫组织化学；环氧合酶2 ；碱性成纤维因子：微血管密度 t h ee x p r e ss i o na n dc l i n i c a l s i g n i f i e a n c eo f c o x 2a n db f g fi ng a s t r i cc a r c i n o m a p o s t g r a d u a t e ：j i n gf u c h u n t u t o r ：p r o f e s s o r w a n gq i n g c a i s p e c i a l i t y ： m e d i c i n e a b s t r a c t o b j e c t i v e t h ee x p r e s s i o no fc o x 一2 ，b f g fw a sd e t e c t e di nt h e s u r g e r yg a s t r i c c a r c i n o m ap a r a f f i nt i s s u e sa n dn o r m a lc a r c i n o m a a d ja c e n tt i s s u e sb yu s i n g i m m u n o h i s t o c h e m i s t r i a ls pm e t h o d ，w h i c hw a st oi n v e s t i g a t et h ec o r r e l a t i o n a m o n gt h ee x p r e s s i o n ，t h ec l i n i c a lp a t h o l o g i cc h a r a c t e r i s t i ca n da b o u ta n g i o g e n e s i s ，a n dt op r o v i d et h et h e o r yb a s i sf o rt h et u m o ra n t i a n g i o g e n e s i st r e a t m e n t m a t e r i a l sa n dm e t h o d s t h ee x p r e s s i o no fc o x - 2 ，b f g fw a sd e t e c t e di n3 8c a s e so fs t o m a c h c a r c i n o m a t o u st i s s u e sa n d3 6c a s e so fn o r m a lc a r c i n o m a a d ja c e n tt i s s u e s ( w h i c h w a so v e r5 c mf a r e r ) a l lo ft h et i s s u e s c h o o s i n g 4 p i e c e se a c h s l i c ew e r e c o l l e c t e dr a n d o m l yf r o mp r i m a r ys u r g i c a lp r o c e d u r e si no u rh o s p i t a l ( t a i a n c i t yc e n t r a lh o s p i t a l ) f r o mj a n u a r y2 0 0 9t oa u g u s t2 0 0 9 ，w h i c hw e r ec o n f i r m e d b yp a t h o l o g ya n dt h ed a t aw a si n t a c t ，a n dt h el a t t e rw a sl o o k e da s ac o n t r o l g r o u p t h ec d 3 4m o n o c l o n a la n t i b o d yw a sm a r k e dm i c r o v a s c u l a rn u m b e ro f v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l lc o u n tp e ru n i ta r e a t h er e s u l t sw e r ea n a l y s i s e db ys a s 9 0 ，a n dp 0 0 5w a sr e c o g n i z e da st h ec r i t e r i o no fs t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e r e s u l t s ( 1 ) c o x 一2w a sh i g h l ye x p r e s s e di ng a s t r i cc a r c i n o m at i s s u e sw i t h71 0 5 ， w h i l ei tw a se x p r e s s e da s0i nc a r c i n o m a - a d j a c e n tt i s s u e s ( w h i c hw a so v e r5 c m f a r e r ) ，n o tb e i n gd e t e c t e dt h ee x p r e s s i o no fc o x - 2i nt h e m t h ep o s i t i v er a t eo fc o x - 2i ns t a g e si i i 一w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n t h o s ei n i i i ( r e s p e c t i v e l yp 0 01 ) t h e r ew a sas i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s t a t i s t i c a l l y ( p 0 o1 ) t h ep o s i t i v er a t e o fc o x 一2i nm e t a s t a t i cg r o u pw a s h i g h e r t h a nt h a ti nn o n - m e t a s t a t i c g r o u p ( p 0 0 5 ) t h e d i f f e r e n c e sw e r e s i g n i f i c a n ts t a t i s t i c a l l y t h ee x p r e s s i o n o fc o x - 2w a sn o tr e l a t e dt ot h e p a t i e n t sa g e ，s e x ，t u m o rs i z e ，t u m o rl o c a t i o n ，d i f f e r e n t i a t e dd e g r e e sa n dt h e d e p t ho fi n v a s i o n ( p 0 0 5 ) 3 ( 2 ) t h ep o s i t i v er a t eo fb f g fi ng a s t r i cc a r c i n o m at i s s u e sw a s6 0 5 3 w h i l ei tw a se x p r e s s e dw i t h2 7 7 8 i nc a r c i n o m a a d j a c e n tt i s s u e s t h e r ew a s s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) t h ep o s i t i v er a t eo fb f g fi ns t a g e si i i i n g a s t r i cc a r c i n o m at i s s u e sw a s2 2 2 2 ，w h i l et h ep o s i t i v er a t eo fb f g fi ns t a g e s i i i 一 i n g a s t r i cc a r c i n o m at i s s u e sw a s7 2 41 t h e r ew a sn od i f f e r e n c e s t a t i s t i c a l l y ( p 0 01 ) t h ep o s i t i v er a t eo fb f g fi nm e t a s t a t i cg r o u p ( 71 4 3 ) w a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h a ti nn o n m e t a s t a t i c g r o u p ，a n dt h e r ew a sa d i f f e r e n c es t a t i s t i c a l l y ( p 0 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fb f g fw a sn o tr e l a t e dt ot h e p a t i e n t ss e x ，a g e ，t u m o rs i z e ，t u m o ri o c a t i o n ，d i f f e r e n t i a t e dd e g r e e sa n dt h e d e p t ho fi n v a s i o n ( p 0 0 5 ) ( 3 ) t h er e s u l to fm i c r o v e s s e ld e n s i t y ( m v d ) m a r k e dw i t hc d 3 4r e v e a l e d t h a tm v d ( 5 2 19 + 13 7 3 ) w i t hl y m p hn o d em e t a s t a s i si nt h et u m o rw a sh i g h e r t h a n t h a t ( 3 6 3 8 士1 2 0 5 ) w i t h o u tl y m p hn o d em e t a s t a s i s ；m v d ( 5 3 9 6 4 - 1 8 8 2 ) i n f i l t r a t e dt ot h ed e e p g r o u po fc a r c i n o m aw a sh i g h e rt h a nt h a t ( 2 8 7 5 + 15 7 3 ) w i t h o u ti n f i l t r a t i o nt ot h e d e e po n e s t a t i s t i c a l l y ，t h ed i f f e r e n c ew a s s i g n i 行c i a n t ( p 5 c m ) 标本，后者作为对照组。患者术前均未接受 放、化疗治疗，并排除以下所有情况( 长期服用或正在服用非甾体类消炎药、 免疫抑制剂、激素类药物、前列腺素及类似物、长期酗酒) ，同时依据病人 性别、年龄大小、肿瘤大小、肿瘤部位、分化程度、浸润深度及淋巴结转移 进行分组。其中男2 5 例，女l3 例，年龄3 4 , - - , 7 2 岁，平均5 4 8 岁。所制切片按 全国胃癌协作组标准由两位病理科医师一致确认，组织学病理类型：高分化 腺癌7 例，中分化腺癌9 例，低分化腺癌2 2 例。淋巴结转移情况：淋巴结转移 阳性2 8 例，无淋巴转移者10 例。根据19 9 6 年国际抗癌联盟( u i c c ) 胃癌p t n m 分期法进行临床分期：i i i 期8 例、i i i i v 期3 0 例，其中未浸透浆膜者8 例，穿 透浆膜者3 0 例。全部标本均在手术时收集保存，病变切除后立即行无菌操作， 为防止交叉污染，先取癌旁正常胃组织，再取胃癌组织。胃癌组织标本取自 癌灶中央非坏死的部分，而癌旁5 c m 组织标本则取自远离癌灶且经病理组织 学检查无癌细胞侵润的癌旁胃组织，收集胃癌组织及其切缘的癌旁组织各3 8 例，后来有2 例癌旁组织发现有癌细胞予以去除，胃组织标本切除后均立即 用1o 福尔马林固定，常规石蜡包埋，最后作石蜡连续切片待免疫组化检测。 每例取一张切片作常规病理组织检查h e 染色，进行病理分析，另外取3 张切 片行免疫组织染色。 2 主要试剂 鼠抗人c o x 2 单克隆抗体( 即用型)( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 鼠抗人b f g f 单克隆抗体( 浓缩型)( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 鼠抗人c d 3 4 单克隆抗体( 浓缩型)( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 辣根酶标记山羊抗小鼠二抗( 北京中杉金桥生物技术有限公司) e d t a 抗原修复缓冲液( 1 m m ，p h 9 0 ) ( 北京中杉金桥生物技术有限公司) d a b 显色试剂盒( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 其余试剂为泰安市中心医院中心实验室提供 l o 3 主要仪器 r m 2 1 3 5 石蜡切片机 b s l 2 4 s 型电子天平 g b l1 1 2 4 1 - 8 9 电热恒温水箱 i x 7 1 荧光倒置显微镜 b 1 6 0 台式离心机 j y - 8 7 5 医用净化工作台 微量移液枪 m d f 一3 8 2 ( 一8 0 0 c ) 低温冰箱 y x q g 0 2 手提式电热压力蒸汽消毒器 数码凝胶图像处理系统 海尔普通冰箱 4 实验溶液试剂的配置 德国l e i c a 公司 s a r t o r i u s 公司 北京医疗设备厂 日本o l y m p u s 公司 河北白洋离心机厂 苏州净化设备厂 德国e p p e n d o r f 公司 日本三洋 山东安得医疗科技有限公司 g e n eg e n i u s 青岛海尔集团 p b s 平衡盐溶液：成分为n a 2 h p 0 4 - 1 2 h 2 02 9 0 9 + n a h 2 p 0 4 2 h 2 03 0 9 + n a c l8 5 0 9 + 双蒸水10 0 0 m l ，使用时双蒸水稀释l0 倍，高温高压灭菌，备用。 0 0 1 m o l 1 柠檬酸盐缓冲液：柠檬酸三钠3 o g + 柠檬酸o 4 9 。 d a b 显色底物溶液的制备：试剂盒中a 、b 、c 试剂各l 滴加入1m l 蒸馏水。 5 方法( 免疫组化s p 法) 5 1 石蜡切片的制备 准备好染色架、镊子、毛笔等，取1o 福尔马林液固定的组织常规组织 处理，石蜡包埋、病理切片在我院( 泰安市中心医院) 病理科进行，将目标 样本蜡块制成4 弘m 的病理切片，每份石蜡切片均是先作苏木素伊红( h e ) 染色，再在光镜下对切片进行形态学观察，进行核对组织及相应的病理诊断， 最后在低倍显微镜下用油性笔标出癌组织丰富区域中的目标区域，并将切片 与目标样本蜡块进行相比较，然后在目标样本蜡块相应部位上进行标记。 病理石蜡切片制作过程：( 1 ) 取材；( 2 ) 固定；( 3 ) 脱水、透明及浸蜡：7 0 乙醇1 5 小时一8 0 乙醇1 5 小时一9 0 乙醇1 5 小时一9 5 乙醇( i ) 1 5 小 时一9 5 乙醇( i i ) 1 5 小时_ 10 0 乙醇( i ) l 小时一10 0 乙醇( i i ) l 小 时一二甲苯( i ) 15 分钟_ 二甲苯( i i ) 15 分钟_ 石蜡( i ) o 5 小时一石蜡 ( i i ) l 小时_ 石蜡( i i i ) 1 小时；( 4 ) 包埋；( 5 ) 修切蜡块即切去组织周围过 多的石蜡，一般留下约2 m m 宽度的蜡边为宜，两边必须平行，将修整好的 蜡块固定；( 6 ) 将切片刀装在刀架上，后将蜡块装在切片机固定装置上，将载 玻片擦洗干净后，在其表面涂上适量粘附剂；( 7 ) 调整切片厚度水平在4 9 m ， 进行病理切片；( 8 ) 展片及捞片，调好展片器内的水温，也可以加些酒精到 水中；( 9 ) 烤干；( 1o ) 备用。 注意问题：( 1 ) 切片时刀刃倾斜度适中，不要过大或过小，一定要在 显微镜下检查石蜡切片刀的刀口有否损坏；( 2 ) 在修整蜡块时要注意观察 在蜡块中的组织位置，以免把需要的组织修掉。( 3 ) 务必保证切片机的转 轮匀速转动；( 4 ) 展片时，一般以低于石蜡熔点l0 15 。c 左右的水温为宜， 可以根据石蜡熔点适当调整水温，捞片时动作要轻而快；( 5 ) 烤片的时间 要准时，烤片温度要适宜，不宜太高。 5 2苏木素伊红染色( h e 染色) ( 1 ) 染色前切片脱蜡，水洗切片常规用二甲苯( i 、i i ) 脱蜡，经各 级乙醇至水洗：二甲苯( i ) 5 分钟_ 二甲苯( i i ) 5 分钟一无水乙醇2 分钟 一9 5 乙醇1 分钟_ 8 0 乙醇1 分钟_ 7 5 乙醇1 分钟一蒸馏水洗2 分钟。 ( 2 ) 苏木素染色5 分钟，自来水冲洗，盐酸乙醇分化3 0 秒钟( 提插数下) ， 自来水浸泡l5 分钟，最后置伊红液2 分钟。 ( 3 ) 常规脱水，透明，封片： 9 5 乙醇( i ) 1 分钟_ 9 5 乙醇( i i ) 1 分钟_ 无水乙醇( i ) 1 分钟_ 无水乙醇( i i ) 1 分钟_ 二甲苯( i ) 1 分钟_ 二甲苯( i i ) 1 分钟_ 中性树脂 封固。 ( 4 ) 显微镜下观察，核定组织及病理类型。 注意事项：( 1 ) 染色前熟练掌握染色液的配制方法；( 2 ) 根据实验室 的实际情况、染色时室温及染液的新鲜程度适当调整染色时间长短； ( 3 ) 因为伊红分为水溶和醇溶两种，所以注意脱水时机把握，水溶的应脱水前进 行染色，而醇溶的则使用与溶解伊红相同浓度酒精开始脱水：( 4 ) 切片在 6 0 0 c 烤箱内烘烤半个一小时再进行二甲苯脱蜡，切片烘烤后就不容易产生 脱片现象，有利于脱蜡操作；( 5 ) 二甲苯脱蜡的效果在切片在二甲苯内放 置的时间，以及二甲苯的使用次数和脱蜡时的温度，染好的切片必须透明， 显微镜下易观察，利于封片；( 6 ) 切片酒精脱水时，在高浓度的酒精中可 以适当增加脱水时间，而在低浓度酒精中的浸泡时间则不宣太长，以免使得 脱水不彻底，最终影响二甲苯的透明效果；( 7 ) 浸泡在酸性分化液内时间 适宜，不要过度分化，以免把组织染色的结构脱色。 5 3免疫组织化学染色( s p 法) 免疫组化染色步骤如下： ( 1 )石蜡切片脱蜡和水化 石蜡切片在6 0 恒温箱中烤片l 小时。 二甲苯脱蜡i ，浸泡1o 分钟；二甲苯脱蜡i i ，浸泡10 分钟：10 0 酒精i ，浸泡3 分钟；10 0 酒精i i ，浸泡3 分钟；9 5 酒精，浸泡5 分 钟；9 0 酒精，浸泡5 分钟；8 0 酒精，浸泡5 分钟；7 0 酒精，浸泡 5 分钟；用p b s 液洗片5 分钟。 ( 2 ) 每张切片加入过氧化物酶阻断溶液( 3 0 双氧水1 份+ 蒸馏水9 份充分 混合) ，室温下孵育l0 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。p b s 浸泡洗片 3 次，每次5 分钟。 ( 3 ) 微波修复抗原：采用在微波炉里加热，0 0 1 m 枸橼酸钠缓冲溶液 ( p h 6 0 ) 至沸腾后将组织切片放入，断电，间隔5 1o 分钟。之后再将烧杯 放于微波炉中，通电至沸腾1 2 次后拿出烧杯，自然冷却，取出片子。p b s 洗片3 次，每次5 分钟。 ( 4 ) 每张切片滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育2 0 分钟，甩去多余液 体。 ( 5 ) 每张切片滴加一抗，c o x 2 ( t 作浓度1 ：5 0 ) b f g f ( 工作浓度1 ：10 0 ) c d 3 4 抗体( 工作浓度1 ：10 0 ) ；湿盒中孵育，置4 冰箱中过夜。阴性对照 片用p b s 液替代一抗。p b s 洗片3 次，每次5 分钟。 ( 6 ) 每张切片滴加生物素化二抗，室温下湿盒内孵育2 0 分钟。p b s 洗3 次 每次2 分钟。 ( 7 ) 除去p b s ，每张切片滴加链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶溶液，室 温下湿盒内孵育反应10 分钟，p b s 洗4 次，每次5 分钟。 ( 8 ) d a b 显色：除去p b s ，每张切片滴加新鲜配制的d a b 溶液，在光学 显微镜下观察3 8 分钟，以细胞质棕黄色着色为显色，达最佳显色效果后， 蒸馏水冲洗浸泡终止反应。 ( 9 ) 苏木素复染：将上述染色后切片立即置于苏木素液中持续1 分钟，取 出用自来水冲洗2 分钟。 ( 10 ) 切片脱水透明：将上述切片依次经8 5 浸泡5 分钟、9 5 浸泡5 分钟、 10 0 酒精浸泡5 分钟，二甲苯持续3 0 分钟透明。 ( 1 1 ) 封片：在组织切片干燥后直接用中性树胶封片加盖玻片，显微镜下观 察结果。 结果判断：每张切片均由两名没有参与实验的病理科医生协助判断免疫 组化结果，显微镜下观察染色结果。 c o x 一2 、b f g f 细胞阳性染色判断标准：为棕黄色颗粒沉淀。每例标本 选择5 个有代表性的高倍视野，每个视野数2 0 0 个肿瘤细胞，计算阳性细胞 百分比，取平均值，参照w a c h t e r s 等【4 】的方法来分析免疫组化蛋白的表达水 平，即阴性表达：不表达或阳性细胞数 1o 。 c o x 2 阳性染色不仅见于胃癌上皮细胞的胞浆，而且见于血管内皮细胞的胞 浆，棕黄色颗粒弥漫分布于整个胞浆或沿胞膜周边呈线状分布。b f g f 阳性表 达位于胞质、胞浆和血管内皮细胞内，呈黄色到棕黄色颗粒状弥漫分布。 以p b s 缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知蛋白阳性表达组织切片作 为阳性对照，每一批实验都设有阳性、阴性对照，在同一条件下行s p 染色。 微血管密度( m v d ，c d 3 4 标记) 计数判断标准如下：采用抗c d 3 4 单克 隆抗体来标记血管内皮细胞计数单位面积中微血管的数目，即微血管密度 ( m i c r o v e s s e ld e n s i t y ，m v d ) ，用来衡量肿瘤血管生成的活跃程度。参照 w e i d e r 法先在l0 0 倍显微镜下选取肿瘤微血管数量最丰富的区域，然后在 2 0 0 倍视野镜下范围计算5 个视野里血管数目，取其平均数目作为m v d 。 6 统计学处理 全部数据中，计数资料用卡方检验，计量资料用t 检验，p 0 0 5 有统计 学意义，用s a s9 0 统计分析。 1 4 辨认、高度不规则的腺体所组成的，或单个细胞孤立排列或是多个细胞形成 或大或小的实性条索，在其中可见粘液分泌或者形成腺泡状结构。本组实验 包括高分化型( 9 例) 、中分化型( 7 例) 和低分化型( 2 2 例) 。 二、胃癌组织及癌旁正常组织中c o x 2 、b f g f 、c d 3 4 表达与m v i ) 计数情 况及其相关性分析 1 c o x 2 、b f g f 的表达情况 阳性细胞的分布形式有三种：( 1 ) 弥散分布：这一种分布是典型的图片 表现，即在病变区域中多数细胞呈阳性染色；( 2 ) 点灶状分布：阳性细胞聚 集于上皮或者癌的某些点灶状区域；( 3 ) 散在分布：仅在一些单个细胞中呈 散在的阳性分布。在实验中，我们还观察到在同一肿瘤组织内不同切片甚至 同一张切片可以看到有的区域呈阳性表达，其他区域呈阴性表达。 1 1c o x 2 、b f g f 在胃癌组织及癌旁组织中的表达 可以看到胃癌患者组织标本中c o x 2 阳性表达主要位于细胞胞浆内， 呈棕黄色的颗粒状物质，呈弥漫性的分布于整个胞浆，部分标本阳性反应细 胞沿胞膜周边呈线状或灶性分布，血管内皮细胞的胞浆中亦有散在表达。3 8 例胃癌患者组织中阳性表达率为7 1 0 5 ( 2 7 3 8 ) ；而3 6 例癌旁组织中未见阳 性表达( 0 3 6 ) ，显示胃癌患者组织中的c o x 一2 阳性表达率高于癌旁组织中 的阳性表达率( z 2 = 4 2 9 6 3 ，p 0 0 5 ) ；从年龄分布来看， 6 0 岁患者组织中b f g f 阳性表达率为 7 5 0 0 ( 1 3 2 0 ) ，二者相比较无统计学意义( ) c 2 = 0 3 5 3 7 ，p = 0 5 5 2 0 ，p 0 0 5 ) 。 表2 1c o x 2 、b f g f 在胃癌组织中的阳性表达与性别的关系 1 6 1 3c o x 2 、b f g f 在胃癌组织中的阳性表达与临床t n m 分期的关系 表3c o x 2 、b f g f 在胃癌组织中的阳性表达与临床t n m 分期关系 由表3 中可以看出，在3 8 例胃癌患者组织中临床分期为i 、i i 期共有9 例，i i i 、期共有2 9 例。其中i 、i i 期患者组织c o x 2 阳性表达3 例，其 阳性表达率为3 3 3 3 ( 3 9 ) ；i i i 、i v 期患者组织阳性表达2 4 例，其阳性表 达率为8 2 7 6 ( 2 4 2 9 ) 两组间相比较有统计学意义( x 2 = 8 17 7 7 ，p = 0 0 0 4 3 ， p o 0 1 ) 。其中i 、i i 期患者组织b f g f 阳性表达2 例，其阳性表达率为2 2 2 2 ( 2 9 ) ；i i i 、i v 期患者组织阳性表达2l 例，其阳性表达率为7 2 4 1 ( 2 1 2 9 ) 两组间相比较有统计学意义( x 2 = 7 2 4 2 1 ，p = 0 0 0 7 1 ，p 0 0 5 ) ； 5 c m 胃癌b f g f 阳性表达17 例，阳性表达率为5 8 6 2 ( 17 2 6 ) ，二者相 比较无统计学意义( z 2 = 0 8 1 3 4 ，p = 0 3 6 7 1 ，p 0 0 5 ) 。 1 5c o x 2 、b f g f 在胃癌组织中的阳性表达与肿瘤位置的关系 表5c o x 2 、b f g f 在胃癌组织中的阳性表达与肿瘤位置关系 1 7 从表5 中可见，在3 8 例胃癌患者中根据肿瘤发生的不同位置进行分类 比较：在胃窦、胃体和贲门处组织中c o x 2 的阳性表达率分别为6 6 6 7 ( 14 2 1 ) 、7 2 7 3 ( 8 11 ) 、8 3 3 3 ( 5 6 ) ，相比较无统计学意义( f = 5 8 7 3 3 ， p = 0 1 111 ，p 0 0 5 ；在胃窦、胃体和贲门处b f g f 的阳性表达率分别为4 7 6 2 ( 10 2 1 ) 、4 5 4 6 ( 5 11 ) 、5 0 0 0 ( 3 6 ) ，相比较无统计学意义( z 2 = 4 5 3 6 9 ， p = 0 18 7 2 ，p 0 0 5 ) 。 1 6c o x 2 、b f g f 在胃癌组织中的阳性表达与淋巴转移的关系 表6c o x 2 、b f g f 在胃癌组织中的阳性表达与淋巴转移的关系 由表6 中可以看出，在3 8 例胃癌患者中发生淋巴转移2 8 例，无淋巴转 移l0 例。c o x 2 在胃癌组织中有淋巴转移者的阳性表达率为8 5 7 1 ( 2 4 2 8 ) ， 明显高于无淋巴转移者( 3 0 0 0 ，3 1 0 ) ( f = 1 1 1 2 0 3 ，p = 0 0 0 0 9 ，p o 0 1 ) ， b f g f 在胃癌组织中有淋巴转移者的阳性表达率7 1 4 3 ( 2 0 2 8 ) ，高于无淋 巴转移者( 3 0 0 0 ，3 1 0 ) ( z 2 = 5 2 9 3 3 ，p = 0 0 2 1 4 ，p 0 0 5 ) 。无论c o x - 2 还是b f g f 在胃癌中淋巴转移方面，两组间相比较均有统计学意义。 2 c d 3 4 在胃癌组织及癌旁组织中的表达与m v d 计数 2 1c d 3 4 主要表达于血管内皮细胞胞浆，呈棕色或棕黄色颗粒分布。胃 癌组织的m v d 计数为4 5 2 6 - 4 - 11 6 4 ，明显高于癌旁组织m v d 计数，后者为 2 9 8 2 4 - 5 7 1 ，( p 0 0 5 0 0 5 3 0 7 9 + 9 2 8 o 0 5 o 0 5 2 8 7 5 4 - 1 5 7 3 0 0 5 5 3 9 6 + 18 8 2 从表7 中可以看出，胃癌组织中m v d 计数与t n m 分期、浆膜浸润程度、 淋巴结转移有统计学意义( p o 0 5 ) 。( 见表7 ) 。 3 胃癌组织中c o x 一2 、b f g f 表达与m v d 计数的关系( 见表8 、9 ) 1 9 表9胃癌组织中b f g f 表达与m v d 计数的关系 ( 爻表示胃癌组织的平均m v d 值) 从表8 、9 可以看到，c o x - 2 的阳性表达与m v d 关系密切( p o 0 5 ) ，m v d 大于均值者c o x 2 表达的阳性率明显高于m v d 小于均值者；b f g f 的表达 与m v d 关系密切( p 3 8 k b ，定位于第四号染色体2 6 - - 2 7 带，编码序列是由包 括三个外显子和插入其中的两个内显子而构成。因为上游有不同的起始密码 子，它可以产生分子量约为18 2 5 k d 的多种异构体，而a u g 起始所产生的 18 k d 的b f g f 则被认为是其活性的主要形式，它含有一百四十六个氨基酸， 定位于细胞浆中，对细胞迁移、有丝分裂和增殖均有促进作用，不过在生物 进化上却具有高度保守性：而由c u g 起始所形成的分子量约为2 2 、2 2 5 、2 4 k d 的b f g f 则是定位于细胞核，可能与细胞生长有关，但是没有发现有促进细胞 迁移的作用。 天然的b f g f 多广泛存在于脑、心脏、肝脏、视网膜、肾脏、骨组织、下 丘脑、肾上腺、胎盘等组织中，其中以脑和垂体中的含量为最高。在体外培 养的一些细胞诸如血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、少突胶质细胞和某一些 肿瘤细胞也能够产生一定含量的b f g f 。正常情况下在血清和体液中b f g f 浓 度非常低或者不存在。在细胞内合成的b f g f 需要把它分泌到细胞外才能够发 挥其生物学作用。由于b f g f 基因( 即m r n a ) 没有信号肽序列，所以其翻译 产物会因缺乏信号肽从而无法进入内质网或高尔基体中，即它不能进行外分 泌，不过其翻译产物可以以自分泌或旁分泌的形式出现在细胞外。 b f g f 的生物学活性较为广泛，被认为是极有生物活性的血管生成因子之 一，它不但具有促进细胞分裂、促进细胞分化的作用，而且还能够促进血管 生成和胚胎发育，参与伤口愈合、促进组织修复、促进神经组织生长和再生、 促进动脉粥样硬化的斑块形成等体内多种病理生理过程，同时又在肿瘤的发 生、发展和转移的过程中起着重要作用，具体体现在如下几个方面： ( 1 ) 参与组织损伤修复作用( 包括皮肤、骨再生、神经组织等) ，机体 组织损伤后，局部b f g f 表达会相应增加，这样不仅可以使单核细胞、中性粒 细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等通过趋化作用向机体损伤部位聚集，而且还 能够对血管以及肉芽组织生成具有促进作用，对软组织以及骨组织中与损伤 修复重建有一定相关性的各种细胞的分裂增殖具有至关重要的促进作用。研 究发现，b f g f 对烧伤皮肤创面愈合有明显促修复作用。而b f g f 作为丝裂原 和趋化因子可作用于成纤维细胞和内皮细胞【8 】，又可作为潜在的血管形成因 子、神经营养因子而同时作用于2 个不同环节( 即成纤维细胞增殖使肉芽组 织形成和新生毛细血管化) 使烧伤皮肤创面愈合。骨科方面：b f g f 能使骨 折早期出现的急性非特异性反应，生化表现有血磷、血清碱性磷酸酶浓度升 高，而血钙浓度降低。同时还发现在发生骨折后l0 n 时出现生化表现为降钙 素、甲状旁腺激素升高等信息，通过血液循环到达损伤区而发挥作用【9 1 。此 外，b f g f 还能通过上调血管内皮细胞生长因子( v e g f ) 的表达，促进新生血 管的形成，进而促进新骨形成【1 0 】。 ( 2 ) 促进细胞增殖和血管新生：b f g f 作为在血管形成过程中主要的促 血管生成因子之一，对多种中胚层和神经外胚层来源的细胞诸如血管内皮细 胞( e c ) 、成纤维细胞、上皮细胞、血管平滑肌细胞( s m c ) 等具有趋化作 用，同时对有丝分裂也起着促进作用，它不但在体内，而且在体外都能明显 促进新生血管形成；b f g f 通过对血管内皮细胞以及血管平滑肌细胞促分裂作 用及通过其表型改变诱导尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂在血管内皮细胞 产生而在血管新生早期起到中心作用；b f g f 还可以利用诱导细胞内的血管内 皮细胞生长因子受体2 的表达水平来相应地提高血管内皮细胞生长因子发挥 其血管诱导能力进而促进新生血管形成。i s h i k a w a 等j 发现，在稳定地转染了 垂体瘤转化基因( 即p t t g ) 的n i h 3 t 3 细胞中，b f g f 的浓度明显高于未受到转 染的n i h 3 t 3 培养液。还发现如果在含有n i h 3 t 3 细胞的条件培养液中把人脐 静脉内皮细胞进行培养后，可以看到血管内皮细胞增生出现、血管内皮细胞 移位现象及血管状结构的形成，但如果改变条件，比如在培养液中加入抗 b f g f 抗体，则会看到静脉内皮细胞就不会具有血管形成的那些结构特征。 ( 3 ) 在胚胎发育中的作用：作为细胞问信号分子在胚胎发生发育和分 化过程中的多个阶段都有不同的重要作用，它既可以促进卵巢颗粒细胞增 殖、抑制卵巢颗粒细胞分化，从而促进排卵，也可以促进睾丸分泌睾酮等。 m a r t i n o u 等【1 2 】使用免疫组化及原位杂交两种方法在3 15 天的鸡胚胎中观察 到b f g f 及b f g f m r n a 在中胚层中表达的最为明显。 ( 4 ) 对神经系统的作用：b f g f 具有神经营养作用，b f g f 广泛存在于中 枢及外周神经系统中，对神经组织也具有促进生长分化、维持神经组织存活的 作用，目前b f g f 广泛的神经营养活性已经日益引起人们重视，并且已经在治 疗脑血管病和脑外伤所引发的缺血性中枢神经损伤、及其他原因引起的神经 2 6 损伤、神经退行性病变等多个临床领域陆续得到应用，疗效明显。 ( 5 ) 其它作用：影响免疫细胞活性、调节内分泌作用、造血作用( 包 括巨核细胞生成、粒细胞生成和干细胞的存活) 等。 b f g f 各项功能的发挥与各种受体以及结合蛋白的相互作用紧密相关。这 些受体和结合蛋白较多，大体有如下几类：一系列位于细胞膜上和细胞间基 质中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖( h e p a r a ns u l f a t ep r o t e o g l y c a n s ，h s p g s ) ；具 有酪氨酸激酶活性的细胞膜受体( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o re c e p t o r s ，f g f r s ) ，其 中还可能有一些游离的f g f r 片断存在；分泌型的f g f 结合蛋白 ( f g f b i n d i n gp r o t e i n ，f g f b p ) ；富含半胱氨酸的f g f 受体( c y s t e i n e r i c h f g f r e c e p t o r ，c f r ) 。b f g f 发挥其生物学效应主要是通过具有酪氨酸激酶活 性的膜受体( f g f r s ) 实现的，但同时还会依赖于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 ( h s p g ) 发挥作用；而其它各种受体和结合蛋白质则可能在b f g f 功能发挥 的过程中也起着不同的协同作用，以使b f g f 能够更好地发挥其功能。一般认 为，f g f r 是b f g f 发挥其生物学活性的基础。 已有一些对b f g f 与肿瘤之间的关系研究，b f g f 具有促使体内多种细胞 生长、繁殖并刺激新生血管生成等多种作用，尤其是在肿瘤的发生、发展中。 肿瘤细胞分泌b f g f ，以自分泌或旁分泌形式作用于癌细胞和血管内皮细胞， 对其分裂有促进作用，从而刺激肿瘤血管生成。已知b f g f 受体( f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o rr e c e p t o r ，f g f r ) 有4 种( 分别是f g f r l 、f g