（微生物学专业论文）小克银汉γ亚麻酸高产突变株的快速筛选及发酵条件优化.pdf

西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：硷窒主、指导教师签名： 交扩1 形年月g 日 年月日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：；余摩萋 训年g 月6 日 小克银汉y 一亚麻酸高产突变株 的快速筛选及发酵条件优化 摘要 y 一亚麻酸( 下l i n o l e l l i ca c i d ，g l a ) 是一种人体必需的具有多种生理功能的 多不饱和脂肪酸。与化学合成法和动植物提取法相比，利用微生物发酵法生产 g l a 具有明显优势和潜力，因此积极选育油脂产量和g l a 产量高的突变菌株并 探索其最适发酵条件，具有重要经济意义。 本文以小克银汉霉c o ( n 砌曙 口m 8 嚣口8 c f n “z 口m ) 为出发菌株，经5 氟尿 嘧啶和紫外线复合诱变，采用抗失水苹果酰肼与抗低温( 1 5 ) 相结合的筛选方 法，获得突变株c 2 3 ，经初步摇瓶发酵，其生物量为2 4 7 0 l ，油脂含量为4 3 3 2 ， 油脂产量为l o 7 3 9 ，l ，油脂中g l a 含量为1 2 3 0 ，g l a 产量为1 3 2 l ，上 述指标比出发菌株c 0 分别提高了3 5 7 、1 4 7 4 、2 3 6 4 、4 5 7 和3 8 8 9 。 通过单因素实验及正交实验，采用2 5 0 m l 三角瓶、5 l 和5 0 l 全自动发酵罐 对突变株c 2 3 发酵生产g l a 的发酵条件进行了优化，并采用超临界c 0 2 萃取法提 取油脂。研究发现突变株c 2 3 发酵生产g l a 的最佳碳、氮源分别是葡萄糖和硝 酸铵，发酵培养基起始葡萄糖浓度为l o o l ，硝酸铵浓度为4 矿。，5 l 种子罐接 种量为1 0 6 孢予m l ，培养4 8 h 的种子液以1 0 的接种量移接到5 0 l 发酵罐，通 风量为3 0 u m i n ，搅拌速率为3 0 0 r m i n ，发酵液p h 值维持在5 5 ，当发酵进行到 6 0 h 、8 4 h 和1 0 8 h 时，分别补糖1 5 l 。发酵前1 3 2 h ，发酵温度为2 8 ，然后降 温至2 0 发酵4 8 h ，最后降温至1 5 发酵1 2 h ，结果生物量、油脂产量和g l a 产量分别达4 9 8 8 9 ，l 、2 2 4 5 班和3 0 3 扎。 关键词y - 亚麻酸( g l a ) ，小克银汉霉，突变株，发酵，超临界c 0 2 萃取 f a s ts e l e c t i o na n df e r m e t a t i o nc o n d i t i o no fh i g h y i e l d i n g m u t a n ts t r a i n so f 起始p h 值 硝酸铵浓度( 表1 3 ) 。随葡萄糖浓度增加，油脂产量提高，这是由于油脂积 累需要较多碳源。虽然较高浓度葡萄糖有利于油脂积累，葡萄糖不能得到充分利 用。当硝酸铵浓度不大于4 9 ，l 时，油脂产量随其浓度增加而增加；但当硝酸铵 浓度大于4 l 时，油脂产量减少。过于丰富的氮源不利于油脂积累，在一定范 围内，碳氮值越高越有利于油腊合成。这与有关丝状真菌发酵生产油脂的实验 和理论是一致的。随起始p h 值提高，油脂产量明显增加，当起始p h 为7 时， 油脂产量最大。起始p h 值对油脂含量影响不大，但通过影响生物量而影响油脂 产量。 综上所述后续实验可以l o o g l 的葡萄糖为起始糖浓度，4 班的硝酸铵为起 始氮源，发酵过程中通过添加缓冲剂改善发酵液酸度，促使葡萄糖充分利用，发 酵中后期通过补加葡萄糖，提高碳氮比，有效提高油脂产量。 2 2 培养条件对发酵的影响 2 2 1 温度对发酵产脂的影响 培养温度对发酵来说极其重要，温度对生长和生产的影响是各种因素综合表 现的结果。温度对发酵的影响结果见图l o 。从图1 0 可看出，突变株c 2 3 菌丝生长 和油脂、g l a 合成的最适温度不一致。在1 0 时由于温度过低，突变株c 2 3 几乎 没有生长。2 5 3 0 适合于菌丝生长，2 0 左右适合于细胞积累油脂。g l a 含量则随温度升高而降低。 5 0 芎4 0 删 耋3 0 兰 毫2 0 v 型1 0 圳 o 2 0 弓 j 1 5 冀蟹一生物量( g 几) 3 o 一油脂含量( ) ，。耄：鎏麓。 隹 5 酱 想 1 0i bz 0z 53 u3 b 温度( ) 图1 0 温度对发酵的影响 f 谤1 0n l ee 腩c to f t 咖p e r a i l l 】啼o nf b m e n t a l i o n 6 脱氢酶是合成p u f a 的限速酶，当6 位脱氢酶受抑制时，就会妨碍菌丝体 内亚油酸向g l 久转化。6 、1 2 脱氢酶活化温度在低温条件下，体外最适活性 温度为l o 【9 4 1 ，温度越高g l a 产率越低，超过4 5 g i a 的生成量很低。低温膜 流动性较低的情况下，6 脱氢酶被活化。在生理温度( 2 8 ) 下菌丝生物膜的膜脂 中不饱和脂肪酸以油酸为主：而在适应低温的过程中，高不饱和脂肪酸( 亚油酸和 亚麻酸) 的比例增加。说明在生理温度( 2 0 2 8 ) 下，膜的流动性主要由油酸提 供；而在低温下，膜的流动性主要由高不饱和脂肪酸的含量调节【9 5 】。膜流动性与 脂肪酸脱氢酶的关系密切：温度降低，可导致膜的流动性下降；而经过一定时间 低温适应后，膜的流动性会有所提高，同时高不饱和脂肪酸含量增加。说明在低温 处理过程中脂肪酸脱氢酶被活化，较低的膜流动性，可能是脂肪酸脱氢酶活化的 真正原因；而膜脂不饱和度的提高，致使膜脂凝固点减低，可能是膜流动性提高的 原因 95 1 。 鉴于此，我们在实验中采取首先采用较高温度( 2 8 ) 使其菌丝大量增殖， 再降至2 0 使其积累油脂，最后再降至1 5 使饱和脂肪酸和低不饱和脂肪酸向 多不饱和脂肪酸转化，从而得到较高油脂产量和g i a 含量，实验结果表明：首先 采用2 8 培养8 4 h ，再降至2 0 培养4 8 h ，最后再降至1 5 培养1 2 h 可提高g l a 产量( 图1 1 ) 。 兰 3 0 3 2 5 蚓 叁2 0 甍1 5 乏 1 0 3 唧 5 誊 o 2 1 6 1 2 0 8 0 4 o 蚓 + l 葡萄糖 硝酸铵( 表1 2 ) 。当葡萄糖浓度在1 4 0 l 以下时，随着葡萄糖浓度升高，生物量相应增加，但当葡萄糖浓度达到1 8 0 叽 时，生物量有所降低。在筛选高产菌株时发现突变株c 2 3 能耐受较高糖浓度，在 2 0 0 9 ，l 的高葡萄糖浓度下能够生长，但是过高糖浓度使发酵液渗透压较高，对 突变株c 2 3 生长不利。通过测定发酵过程中残糖浓度，发现起始加入1 0 0 9 ，l 葡 萄糖时，最终残糖在3 0 9 ，l 以上，起始加入14 0 l 和1 8 0 l 葡萄糖时，最终残 糖高于5 0 班，碳源不能得到充分利用，造成巨大浪费。随着硝酸铵浓度增加， 生物量也相应增加。此菌株在发酵过程中高度产 x 参考文献 1 e i b e m e r a l w u d e 咖a y e f s c h e m u m s c h a u f e t t e i n d ，1 9 2 7 ，5 4 ：3 1 2 【2 l 叫j 只c h e m s o c 1 9 4 9 ：2 7 t 8 。 3 胡尉望，谢笔钧食品化学【m 科学出版社，1 9 9 2 ，1 0 0 1 0 2 【4 】b a i p 啦k e l a p p e le n v i o mm i c r o b i a l m 】1 9 9 3 ，5 7 ( 4 ) ：6 5 7 0 5 】h e i d u 出k a a ，kl l l f i a r c h p h a 蚰【m 1 9 9 1 ，2 5 7 ：3 3 ， 6 】m e a d ，jf n l em e t a b o l i s mo f p o l y u f l s a t u r a t e df h t l ya c i d s p r o 铲e s si nt h ec h e m i s t r yo f f a t sa n d o t h e r1 i p i d s 【m 】p e 瑁锄o np r e s s ，0 x f o r d ，1 9 7 1 ，1 6 1 1 9 2 【7 】a s a is ，n o d am ，y a m a 咖r am ，e ta 1 c o n l p a r a t i v es t l l d yo ft h e c e l l u l a r f a n y a c i d so f m e 删c i l l i n r e s i s t a l l t a l l ds u s c 印l i b l es t a p h y o c o c c u sa u r e u s j 】a p m i s ，1 9 9 3 ，1 0 l ( 1 0 ) ：7 5 3 7 6 1 8 g i a l a r e i l o s b o u r b o u l i se j ，g r e c k ap ，d i o n y s s i o u a s t e r i o ua ，e ta 1 m v i 廿oa c t i v i t y o f p o l y u n s a n 珊t e df 吾t t y a c i d so np s e u d o m o m s 解n i g i n o s a ：r e l a t i o n s h i pt ol i p i dp e r o x i d a t i o n f j 】p m s t a a n d i n sk u k o te s s e n t x 【2 7 佐野敏郎月见草中腊肪酸组成分析 j 油化学，1 9 9 0 ，3 9 ( 4 ) ：2 2 0 2 2 5 2 8 h o 曲证d ec h 疵a 王u s e so f e s s e n t i a lf a t t ya c i d m 1 e 出mp r e s s ，m o n 魄a i ，l o n d o n ，1 9 8 2 2 9 11 h i f l e fh ，hj 、矾i l e j a o c s ，1 9 8 8 ，6 5 ( 5 ) ：7 5 5 3 0 】w h i p k e y a j a o c s 1 9 8 8 ，6 5 ( 6 ) ：9 2 9 【3 1 】w o l f rb ，k l e i m a l lr o i lc h e m s o c i e t m 】1 9 8 3 ，6 0 ( 1 0 ) ：1 8 5 8 3 2 肖正春y 一亚麻酸新资源糙草 j 中国野生植物1 9 8 9 ，5 ( 2 ) ：2 0 2 1 3 3 李京民含y 一亚麻酸新油源：微孔草脂肪酸的分离与鉴定 j 中国粮油学报，1 9 9 0 5 ( 2 ) ：4 1 4 3 【3 4 】e y w i l lj ，b l o c kk j b i 0 1c h e i i l 【j 】1 9 6 2 ，2 3 8 ：1 6 1 8 【3 5 】z “c o h e n o v e f p r o d u c t i o n g l a a n de p ab ya l g a e 【m 】p 1 a n tp h y s i o l ，1 9 9 2 ，9 8 ( 2 ) ：5 6 9 5 7 2 【3 6 h i m n om ，ym i u r a a p p lb i o c h e mb i o t e c h m 】1 9 9 0 ，2 4 ( 1 ) ：1 8 3 1 9 1 3 7 】a l ( i 强s e t o c u l 嘶c o n d i t i o n sa c te i c o s a p e n t a e n o i ca c i dc o n t e n t o f c h l o r e l l a 曲u t l s s l m a j 】j a o c s ，1 9 8 4 ，6 l ( 5 ) ：1 3 2 4 【3 8 】y o n g m 锄i t c h 丑i ，w o m e g a - 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f a n ya c i d d e s a n l r a s eg e n e 丘o m 且 乜o p “s 口肭扫“j 【j 】f e d e r a 矗o no fe u r o p e a nb i o c h e m i c a ls o c i e t i e s ， 2 0 0 4 5 5 6 ：8 l 8 5 5 1 d 硼g s l l e n gw b i ，m i n c h u n “，m i n x i nz h a n ge ta li d e 埘f i c a t i o na i l dc h a r a c t c 也矗o no f 1 2 一f a 牡y 扯i dd c s a t l l r a s eg e n e 丘o m 丑艇；叩w s 口肼担搬【j lf c d e r a t 岫no f e u r o p 。a nb i o c h e 戚c a l s o c i 嘶e s ，2 0 0 4 ，5 7 3 ：4 5 5 0 5 2 s u p a p o np 船s o m ，k 0 b k u ll a f o t e n g ，s a n s a i l a l l 】l cr a d l a d a w o n ge ta 1 h e t e r o l o g o u se x p r e s s i o n o f 脑c 。rm 姒f f 1 2 一f 嘶a c i dd e s a n l r a s eg ei 1 1 勋 r 鲫砂忙甜c 台耀v 括招e 【j 】b i o c h e 枷c a l a i l db i o p h y s i c a lr e s e a k hc o 圩h n u n i c a t i o n 1 9 9 9 ，2 6 3 ：4 7 5 1 【5 3 陈波，张玲，贺新生等，用抗性筛选法选育r 亚麻酸( g l a ) 高产菌株 j 微生物学通 报，2 0 0 3 ，3 0 ( 1 ) ：5 3 5 6 5 4 】k a t e s m ，托u k s i s a m e l l l b 瞄n ef 1 u i d i t y 【m 】，n e wj e r s e y ：h u m a i l p r e s s ，1 9 8 0 ：1 5 0 【5 5 】0 s 锄uh i n l i a g 姗m l i l l 0 1 e n i ca c i dp r o d u c 矗o nb yal 0 wt e m p e r a t u r e r e s i s l a l l tm u t a n t 。f 协姚措黝，a m 癣期泐口f e n n e n t a h o n a n d b i o e n g i n e e 血g ，1 9 9 6 ，8 2 ( 2 ) ：1 1 9 - 1 2 3 【5 6 】杜冰，潘力，林炜铁等多不饱和脂肪酸发酵的代谢调控 j 食品与发酵工 业，2 0 0 0 ，2 6 ( 5 ) ：5 2 5 5 f 5 7 】王啸，邱树毅，何腊平u v 、l i c l 复合诱变深黄被孢霉选育多不饱和脂肪酸高产菌株 j 食品科学，2 0 0 4 ，2 5 ( 4 ) ：5 0 5 2 5 8 】林娟微生物油脂的开发研究中国优秀博硕士学位论文数据库，2 0 0 l ， ( 5 9 】h a n s s