（内科学专业论文）脂联素与非酒精性脂肪肝炎的关系探讨.pdf

l，靠 目录 中文摘要1 英文摘要4 研究论文脂联素与非酒精性脂肪性肝炎的关系探讨 前言8刚舌萏 材料与方法8 结果1 5 附图1 7 附表2 3 讨论2 4 结论2 8 参考文献2 8 综述脂联素与非酒精性脂肪性肝病的研究进展3 1 个人简历j 3 8 中文摘要 脂联素与非酒精性脂肪性肝炎的关系探讨 摘要 非酒精性脂肪性肝病( n o n a l c o h o l i cf a t t yl i v e rd i s e a s e ，n a f l d ) 是病 理改变与酒精性肝病相似但无过量饮酒史的临床病理综合征，其疾病谱包 括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎( n o n a l c o h o l i cs t e a t o h e p a t i t i s ， n a s h ) 、脂肪性肝纤维化肝硬化，甚至并发肝癌，严重威胁人类健康。 近年我国n a f l d 的发病率呈逐渐上升趋势，n a s h 作为单纯脂肪肝向非酒 精性肝纤维化发展的必经阶段，其发病机制尚未完全清楚，因此亦缺乏有 效的防治策略。脂联素由脂肪细胞分泌，是目前发现的唯一与血脂水平呈 负相关的胶原样细胞因子，具有调节脂代谢、调节糖代谢、抗炎等作用。 脂联素有两种受体：a d i p o r l 矛i a d i p o r 2 ，其中a d i p o r 2 在肝脏中表达丰富， 提示脂联素可能参与n a s h 发生发展过程。噻唑烷二酮类药物( 罗格列酮) 为特异性p p a r y 激动剂，我们的前期研究发现其具有改善蛋氨酸胆碱缺 乏( m e t h i o n i n e c h o l i n ed e f i c i e n td i e t ，m c d ) 饮食诱导的小鼠肝脂肪变、炎 症及肝纤维化，但脂联素在此模型中的变化及其在n a s h 进展中的作用及 机制尚不清楚。本研究采用m c d 饮食建立小鼠n a s h 模型，以罗格列酮进 行干预实验，探讨脂联素在n a s h 发病及进展中的作用及作用机制，为 n a f l d 的靶向性药物基因治疗提供新的途径。 目的：采用蛋氨酸胆碱缺乏( m c d ) 饮食建立小鼠n a s h 模型，应 用罗格列酮进行干预治疗，观察脂联素、t n f 、i l 6 的表达变化与疾病 进展的关系，以明确脂联素在n a s h 发病中的作用及作用机制，以及 p p a r 3 激动剂调节脂联素表达、阻滞n a s h 进展的作用，为临床选择靶向 性治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物或基因治疗提供理论依据。 方法：选用8 周龄健康雄性c 5 7 b l 6 j 小鼠3 0 只，随机分为3 组，每组 1 0 只。模型组采用m c d 饲料，对照组给予胆碱、蛋氨酸充足的饲料，罗 格列酮干预组应用m c d 饲料加罗格列酮( 5 0 m g k g d ) ，共喂养3 周。血清 丙氨酸氨基转移酶( a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e ，舢一t ) ，甘油三酯( t r i g l y c e r i d e ， t g ) 采用日本o l y m p u sa u2 7 0 0 全自动生化分析仪测定；采用苏木精一伊 红( h e m a t o x y l i n e o s i n 。h e ) 染色及m a s s o n 染色观察肝组织病理学改变； 中文摘要 红( h e m a t o x y l i n e o s i n ，h e ) 染色及m a s s o n 染色观察肝组织病理学改变； 肝组织脂联素表达采用免疫组织化学染色方法检测；t n f 0 【、i l 6m r n a 和蛋白表达分别采用r t - p c r 和w 色s t e mb l o t 检测。 结果： l 动物一般情况：对照组小鼠活泼、毛发有光泽，体重逐渐增加。模 型组和罗格列酮干预组小鼠体重均下降，尤以模型组明显。对照组、模型 组和干预组小鼠体重、肝湿重分别为：2 6 0 0 + 1 0 0g 、1 4 1 4 + 0 6 8g 、 1 4 3 1 4 - 0 8 1g ，o 8 9 + 0 1 2g 、o 5 3 + 0 1 0g 、0 5 6 士0 1 0g 。模型组、罗格列酮 干预组小鼠体重、肝湿重较对照组明显下降( p 值均 o 0 5 ) 。对照组、模型组和干预组小 鼠肝脏指数分别为：0 0 3 4 + 0 0 0 5 、0 0 3 8 士0 0 0 6 、0 0 3 9 + 0 0 0 8 ，各组相比 无统计学差异( 尸 o 0 5 ) 。 2 血清生化学改变：对照组、模型组和干预组小鼠血清a l t 、t g 水 平依次为：5 0 7 8 + 1 0 0 3u l 、1 6 1 5 6 士2 8 2 3u l 、8 3 5 6 + 1 2 2 7u l ；0 5 4 + 0 2 9 m m o l l 、0 9 7 士0 8 1 m m o l l 、0 7 6 0 1 3m m o l l 。模型组小鼠血清a l t 、 t g 均显著高于对照组( p o 0 1 ) ，而罗格列酮干预后可明显降低a l t 、t g 水平( p o 0 1 ) 。 3 肝组织病理学变化：肉眼观察：对照组小鼠肝脏为红褐色，明亮有 光泽。模型组小鼠肝脏体积明显减小，整个肝脏呈浅黄色，与周围组织有 粘连，切面油腻、无光泽。罗格列酮干预组小鼠肝脏体积亦有缩小，为红 褐色、有光泽。光镜观察：对照组小鼠肝脏肝小叶结构正常，肝板排列整 齐；模型组肝细胞弥漫性水样变，呈现大泡性为主的肝细胞脂肪变，以腺 泡3 带明显，小叶内可见点状或灶状肝细胞坏死伴以单个核细胞为主的混 合性炎细胞浸润，可见少量分叶核白细胞。汇管区及窦周纤维组织增生不 明显( f 2 3 g 23 s 01 ) 。罗格列酮干预组小鼠肝损伤较模型组明显减轻， 脂肪变肝细胞明显减少，炎症、坏死及纤维化程度明显减轻 ( f 1 g l - - 2 s 0 1 ) 。 4 肝组织t n f 仅m r n a 的表达：与对照组相比，模型组t n f qm r n a 表达明显增强( o 8 2 + 0 1 7v s 1 2 6 + 0 3 3 ，p o 0 5 ) ，而罗格列酮干预组表达 较模型组减弱( 1 2 6 + 0 3 3v 8 0 9 4 + 0 1 4 ，p 0 0 5 ) ：差异具有统计学意义。 5 肝组织t n f 0 【蛋白水平表达情况：与对照组相比，模型组t n f 0 【蛋 中文摘要 达较模型组明显减少( 1 21i - 0 0 5v s 0 8 3 1 - 0 0 3 ，p 0 0 5 ) ，差异具有统计 学意义。 6 肝组织i l 6m r n a 表达情况：与对照组相比，模型组i l 6 m r n a 表达显著增加( o 3 4 i - 0 0 1v s o 8 9 1 - 0 0 1 ，p 0 0 1 ) ，而罗格列酮干预组表 达较模型组明显下降( o 8 9 ：d 9 0 1v s 0 5 7 士0 0 3 ，p 0 0 5 ) ，差异具有统计 学意义。 7 小鼠肝组织i l 一6 蛋白表达情况：与对照组相比，模型组i l 6 蛋白表 达显著增加( o 4 6 ：l - 0 0 1v s 0 9 1 i - 0 0 1 ，p o 0 1 ) ，而罗格列酮干预组表达 较模型组明显下降( 0 9 1 i - 0 0 1v s 0 7 9 - 1 - 0 0 2 ，p 0 0 5 ) ，差异具有统计学 意义。 8 肝组织脂联素的表达变化：对照组小鼠肝组织脂联素在小叶中央静 脉周围及窦内皮细胞有少量表达；与对照组相比，模型组肝脏脂联素表达 明显增强，且多表达于脂肪变肝细胞胞浆、炎症细胞浸润区枯否细胞胞浆 及窦内皮细胞胞浆中， ( 1 4 6 ：l - 0 2 7v s 1 5 2 4 i - 0 3 6 ，p 0 0 1 ) ；罗格列酮干 预组脂联素阳性表达较模型组明显减少( 1 5 2 4 + 0 3 6v s 9 4 6 i - 0 7 4 ，氏 o 0 5 ) ，差异具有统计学意义。 结论： l 非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝组织中脂联素表达明显上调，并与 t n f 0 【及i l 6 表达呈一致趋势，提示在n a s h 小鼠肝脂肪变及炎症的发生 及进展中，脂联素可能通过代偿性表达增加来拮抗炎性因子的表达，从而 阻止疾病的进展。 2 罗格列酮可上调p p a r ? 基因的表达，进一步上调脂联素表达水平、 抑制炎症因子t n f 0 【、i l 6 的表达，从而延缓或阻止n a s h 的发生与进展。 关键词：非酒精性脂肪性肝炎；罗格列酮；脂联素；肿瘤坏死因子0 l ； 白细胞介素6 英文摘要 t h ed i s c u s s i o no ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e na d i p o n e c t i o na n d n q , n a l c o h o l i q n o n a l c 0o l i cs t e a t 。o l l e o a t i t l s a b s t r a c t n o n a l c o h o l i cf a t t yl i v e rd i s e a s e ( n a f l d ) i sac l i n i c a la n dp a t h o l o g i c a l s y n d r o m ew h oi ss i m i l a rw i t ha l c o h o l i cl i v e rd i s e a s ei np a t h o l o g i ch i s t o l o g y b u ti nt h ea b s e n c eo fs i g n i f i c a n ta l c o h o lc o n s u m p t i o n t h es p e c t r u mo fi t i n c l u d e s s i m p l el i v e rs t e a t o s i s ，n o n a l c o h o l i cs t e a t o h e p a t i t i s ( n a s h ) a n d f i b r o s i s c i r r h o s i si no r d e r e v e ni tc a np r o g r e s st oh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a s oi ti sc o n s i d e r e da sag r e a tt h r e a ta g a i n s tp e o p l e sh e a l t h t h ep r e v a l e n c eo f n a f l di si n c r e a s i n gy e a rb yy e a r n a s h ，a sak e yp r o c e s sf r o ms i m p l e s t e a t o s i st of i b r o s i s c i r r h o s i s ，h a sn o tb e e nc l e a r l yk n o w ni ni t sp a t h o g e n e s i s ， s oa ne f f i c i e n t a p p r o a c hh a s n o tb e e nf o u n db yn o w a d i p o n e c t i n ，a g e l a t i n - b i n d i n gh o r m o n es e c r e t e db ya d i p o s et i s s u e ，i st h eo n l yc y t o k i n ew h o i sn e g a t i v e l yc o r r e l a t e dw i t hl i p i dl e v e li nb l o o ds e r u m a d i p o n e c t i np l a y sa n i m p o r t a n t r o l ei n r e g u l a t i n gl i p i d m e t a b o l i s ma n d g l y c o m e t a b o l i s m ， a m e l i o r a t i n gi n f l a m m a t i o n t w oa d i p o n e c t i nr e c e p t o r sh a v eb e e nf o u n d s of a r ： a i p o r la n da d i p o r 2 a d i p o r 2m o s t l ye x p r e s s i si nl i v e r s oi t i ss u p p o s e d t h a ta d i p o n e c t i nm a yp a r t i c i p a t ei nt h ef o r m a t i o na n dd e v e l o p m e n to fn a s h t h i a z o l i d i n e d i o n e s ( r o s i g l i a z o n e ) i s t h e s p e c i f i ca g o n i s t o fp e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e dr e c e p t o rg a m m a ( p p a r t ) o u rp r e v i o u s r e s e a r c h s h o w e dt h a tr o s i g l i a z o n ec o u l di n h i b i t et h eh e p a t i cs t e a t o s i s ，i n f l a m m a t i o na n d f i b r o s i s c i r r h o s i so fm i c ei n d u c e dw i t hm e t h i o n i n e c h o l i n ed e f i c i e n t ( m c d ) d i e t b u tw h a ti st h er o l eo fa d i p o n e c t i ni nt h em o d e li sn o tc l e a r i nt h i ss t u d y w a st oi n v e s t i g a t ee f f e c to fa d i p o n e c t i ni nm c df e e d i n gm i c ea n dr o s i g l i a z o n e t r e a t e dm i c e ，w h i c hm a yp r o v i d ean e wa p p r o a c ho fn a s ht h e r a p yt h r o u g h g e n em o d u l a t i o n o b j e c t i v e ：i nt h i s s t u d y , e x p e r i m e n t a l n o n a l c o h o l i c s t e a t o h e p a t i t i s m o d e l sw e r ee s t a b l i s h e d b yf e e d i n g m a l ec 5 7 b l 6 jm i c ew i t h m e t h i o n i n e c h o l i n ed e f i c i e n t ( m c d ) d i e t t h et r e a t m e n tg r o u pm i c ew e r e 4 英文摘要 a d m i n i s t r a t e dw i t hm c dd i e tc o m b i n e dw i t hr o s i g l i a z o n e t h ee x p r e s s i o no f a d i p o n e c t i n ，t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - 0 【( 1 1 n 1 7 - 0 【) a n di n t e r l e u k i n 一6 ( i l 一6 ) w e r e d e t e c t e dt oc l a r i f yr o l ea n dm e c h a n i s mo fp p a r ya g o n i s t ，r o s i g l i a z o n ei n n a s h t h i ss t u d yw i l lp r o v i d ea nt h e o r e t i c a lb a s i sf o rt a r g e tg e n et h e r o p yo n n a s h m e t h o d s ：e x p e r i m e n t a lm o d e l so fn a s h w e r ee s t a b l i s h e db yf e e d i n g m i c ew i t hm c dd i e t t h i r t yh e a l t h ym a l ec 5 7 b l 6 jm i c ew e r ef e dw i t h m e t h i o n i n e - c h o l i n es u p p l e m e n t e dd i e tf o ro n ew e e k ，a n dt h e nw e r er a n d o m l y d i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s ：c o n t r o lg r o u p ，w e r ef e dw i t hm e t h i o n i n e - c h o l i n e s u p p l e m e n t e dd i e t ，m o d e lg r o u p ( m c dg r o u p ) ，w e r eg i v e nm c dd i e t ， t r e a t m e n t g r o u p ( m c d + rg r o u p ) ，u s e d m c dd i e tc o m b i n e dw i t h r o s i g l i t a z o n e ( 50 m g k g d ) f o r3w e e k s s e r u ma l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e ( n e t ) a n dt r i g l y c e r i d e ( t g ) w e r et e s t e d b ye n z y m i cm e t h o d w i t ha u t o m a t i c b i o c h e m i s t r ya n a l y z e r t h eg r a d eo fh e p a t i cs t e a t o s i s ，i n f l a m m a t i o na n d f i b r o s iw e r eo b s e r v e db yh e m a t o x y l i na n de o s i n ，a n dm a s s o nt r i c h r o m a t i s m s t a i n e dp a r a f f i n e m b e d d e dl i v e rt i s s u e si s o l a t e df r o mm i c e a d i p o n e c t i n e x p r e s s i o n i nt h el i v e rw a se x a m i n e d b yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t h e e x p r e s s i o no f t n f aa n di l - 6m r n aa n d p r o t e i nw e r ea n a l y z e db yr t p c r a n dw e s t e r nb l o t ，r e s p e c t i v e l y r e s u l t s ： 1t h ec o m m o nb e h a v i o ro fm i c e ：c o n t r o lm i c ew e r ea c t i v e ，t h e i rh a i rw a s b r i g h ta n dw e i g h ti n c r e a s e dg r a d u a l l y b o d yw e i g h to fm i c ei nm o d e lg r o u p a n d r o s i g l i t a z o n eg r o u pd e c r e a s e dr e m a r k a b l y b o d yw e i g h ta n dl i v e rw e i g h t i nc o n t r o lg r o u p ，m o d e lg r o u pa n dt r e a t m e n tg r o u pw e r er e s p e c t i v e l y ： 2 6 0 0 + 1 0 0 g 1 4 1 4 4 - 0 6 8 g ，1 4 3 1 士0 8 1g ，o 8 9 士0 1 2go 5 3 4 - 0 1 0g o 5 6 4 - 0 10g b o d yw e i g h ta n dl i v e rw e i g h ti nm o d e lg r o u pa n dt r e a t m e n t g r o u pw e r en o t e d l yd e c r e a s e dc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ( b o t hp v a l u e o 0 5 ) 2t h et e s to fb i o c h e m i c a lm a r k e r so fs e r u m ：a l tl e v e lw a sm a r k e d l y 5 英文摘要 e l e v a t e di nm c dd i e tm i c ec o m p a r e dw i t hc o n t r o lm i c e ( 5 0 7 8 士10 0 3u lv s 161 5 6 士2 8 2 3u l ，p o 01 ) a n das i g n i f i c a n tr e d u c t i o nw a sn o t i c e da f t e r r o s i g l i t a z o n et r e a t m e n t ( 1 6 1 5 6 土2 8 2 3u lv s 8 3 5 6 士1 2 2 7u l ，p o 0 1 ) s o d o e st h et h r e eg r o u p s s e r u mt gc o n t e n t ，c o n t r o l ：0 5 4 士0 2 9m m o l l ，m o d e l s ： 0 9 7 士0 81m m o l l ，t r e a t e dg r o u p ：0 7 6 士0 13m m o l l ，p o 0 5 3l i v e rh i s t o p a t h o l o g y ：m a c r o s c o p i co b s e r v a t i o n ：l i v e r si nc o n t r o l g r o u pw e r ei nr e d d i s h b r o w n ，w i t hb r i g h tg l o s s l i v e r si nm o d e lg r o u pw e r e m u c ，hs m a l l e rt h a ni nc o n t r o lg r o u p t h ew h o l el i v e r sw e r ei nl i g h ty e l l o wa n d a d h e r e dw i t ho t h e rt i s s u e s t h ec u ts u r f a c el o o k e dr e d d i s h b r o w nw i t h o u t g l o s s l i v e r si nt r e a tg r o u pw e r el i t t l es m a l l e rt h a ni nc o n t r o lg r o u pa n dl o o k e d r e d d i s h - b r o w nw i t hg l o s s 1 i g h tm i c r o s c o p eo b s e r v a t i o n ：h i s t o l o g yo ft h e l i v e r sw e r en o r m a li nc o n t r 0 1m i c e h e p a t i cp l a t e s1 0 0 k e dw e l l h o w e v e r , s e v e r es t e a t o h e p a t i t i sw a sd e v e l o p e di nm i c ef e dw i t hm c dd i e t ，t h e h e p a t o c y t e sp r e s e n t e ds e v e r em a c r o v e s i c u l a rs t e a t o s i sa n dl a c a t e dm a i n l yi n z o n e3n e a rt h ec e n t r a lv e i n s s p o t t yn e c r o s i sa n dc o n f l u e n tn e c r o s i sc a nb e s e e ni n h e p a t i c l o b u l a r s w h e r em i x e d i n f l a m m a t o r y i n f i l t r a t i o nw i t h l y m p h o c y t e sa n dp o l y m o r p h o n u c l e a rm a yt a k ep l a c e t h e r ew e r e n o to b v i o u s h e p a t i cf i b r o s i si np e r i s i n u s o i d a la n dp o r t a la r e a s ( f 2 3 g 2 - 3s 0 - 1 ) t h ed e g r e e o f h e p a t i c s t e a t o s i sa n di n f l a m m a t i o ni s d r a m a t i c a l l y a m e l i o r a t e d b y a d m i n i s t r a t e dr o s i g l i t a z o n ei nm c ：df e dm i c e ( f1g1 2s 0 1 ) 4t h ee x p r e s s i o no ft n f am r n aw a sd r a m a t i c a l l yi m p r o v e di nm c d f e da n i m a l sc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ( o 8 2 + 0 17v s 1 2 6 士0 3 3 ，p o 0 5 ) ，w h e r e a sw h i c hw a sd r a m a t i c a l l yd e c r e a s e di nr o s i g l i t a z o n et r e a t e d a n i m a l s ( 1 2 6 士0 3 3v s 0 9 4 士0 1 4 ，p o 0 5 ) 5t h ee x p r e s s i o no ft n f 0 【p r o t e i nw a si n c r e a s e d i nm c dm i c e c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ( 0 4 7 士0 0 6v s 1 21 土0 0 5 ，氏o 0 5 ) ，w h e r e a s w h i c hw a sd r a m a t i c a l l yd e c r e a s e di nr o s i g l i t a z o n et r e a t e dm i c e ( 1 21 士0 0 5v s o 8 3 4 - 0 0 3 ，尸 o 0 5 ) 6t h ee x p r e s s i o no fi l 一6m r n aw a su p r e g u l a t e di nm c dg r o u p ( o 3 4 士0 01 v s 0 8 9 士0 01 ，p 0 01 ) a n dc o u l d b ed o w n - r e g u l a t e d b y r o s i g l i t a z o n e ( o 8 9 士0 0 1v s o 5 7 士0 0 3 ，氏o 0 5 ) 6 英文摘要 7t h ee x p r e s s i o no fi l 6p r o t e i nw a su p r e g u l a t e di n m o d e la n i m a l s f o 4 6 士o 0 1v s 0 9 1 ：e 0 0 1 ，p o 0 1 ) a n d c o u l db ed o w n r e g u l a t e db y r o s i g l i t a z o n ei nt r e a t m e n tg r o u p ( 0 9 1 i - 0 0 1v s 0 7 9 ：t - 0 0 2 ，氏o 0 5 ) 8h e p a t i ca d i p o n e c t i ne x p r e s s i o n ：p o s i t i v ee x p r e s s i o nw a sp r e s e n t e d a r o u n dc e n t r a lv e i n sa n di ne n d o c h y l e m ao fp e r i s i n u s o i d a lc e l l si nt h el i v e r so f c o n t r o lg r o u p b u ti nm o d e lg r o u pp o s i t i v ee x p r e s s i o n s a r ed r a m a t i c a l l y e r t h a n c e da n dm a i n l ye x p r e s si nt h ee n d o c h y l e m ao fs t e a t o s i sh e p a t o c y t e s ， k u p f f e r c e l l si ni n f l a m m a t o r yi n f i l t r a t i o na r e a sa n dp e r i s i n u s o i d a lc e l l s ( 1 4 6 士 0 2 7v s 15 2 4 + 0 3 6 ，p 0 o1 ) c o m p a r e dw i t hm o d e lg r o u p ，t h ee x p r e s s i o no f a d i p o n e c t i nw a sd e c r e a s e db yu s i n gr o s i g l i t a z o n e ( 1 5 2 4 + 0 3 6v s 9 4 6 + 0 7 4 ，氏0 0 5 ) c o n c l u s i o n ： 1t h ee x p r e s s i o n so fa d i p o n e c t i ni sd r a m a t i c a l l ye n h a n c e d i nl i v e r so ft h e m c df e dm i c e ，w h i c hw a sc o n s i s t e n tw i t he x p r e s s i o n so ft n f qa n di l - 6 ， w h i c hi n d i c a t e st h a ta d i p o n e c t i nt h r o u g hc o m p e n s a t e du p 。r e g u l a t i o nm i g h t p r e v e n te x p r e s s i o no fi n f l a m m a t o r yf a c t o r sa n d i n h i b i tn a s h p r o g r e s s i o n 2r o s i g l i t a z o n ec o u l du p r e g u l a t ep p a r 7e x p r e s s i o n ，f u r t h e ru p 。r e g u l a t e a d i p o n e c t i ne x p r e s s i o n ，d o w n r e g u l a t ee x p r e s s i o no f t n f - 0 【a n di l - 6 t h u s ， r o s i g l i t a z o n ec a ni n h i b i th e p a t i cs t e a t o s i s ，i n f l a m m a t i o na n df i b r o s i s i n d u c e d b ym c d d i e tb ym o d u l a t i n gp p a r 7 ，a d i p o n e c t i na n dr e l a t e di n f l a m m a t o r y f a c t o re x p r e s s i o n k e y w o r d s ：m u r i n e ；n o n a l c o h o l i c s t e a t o h e p a t i t i s ；r o s i g l i t a z o n e ； a d i p o n e c t i n ；t n f - a ；i l - 6 研究论文 脂联素与非酒精性脂肪性肝炎的关系探讨 - 上- t 釜 刖 罱 非酒精性脂肪性肝病( n a f l d ) 的发生与肥胖、高血压、胰岛素抵 抗、2 型糖尿病有密切关联，人们逐渐意识到n a f l d 是肝相关性疾病甚至 肝相关性死亡的重要原因【l 】，非酒精性脂肪性肝炎( n a s h ) 作为该病的 限速步骤，其发病机制尚不十分清楚，目前以d a y 等的“二次打击 学说 ( t h et w o - - h i th y p o t h e s i s ) 2 1 最为普遍接受，其中，第一次打击指各种原 因导致的肝脏脂肪蓄积，肝细胞脂肪变性；第二次打击由于氧化应激所致。 就第一次打击而言，当脂肪转出甘油三酯的功能达到饱和时，过量的游离 脂肪酸( f r e ef a t t ya c i d ，f f a ) 就会促使脂肪肝形成。近来人们对脂联素 及其受体的研究日益成为热点，其中a d i p o r l 在全身各组织均可见表达， 以骨骼肌表达最丰富，a d i p o r 2 则在肝脏表达最丰富【3 】。脂联素通过与受 体结合作用于靶细胞，参与了脂肪代谢过程、周围组织对胰岛素的敏感性、 炎症细胞产生等多各环节。而脂联素的增加对n a f l d 有何作用及其作用 机制近年来亦备受相关学者所关注，该研究将对n a f l d 的发病机制及其 防治策略提供理论依据。罗格列酮( r o s i g l i t a z o n e ) 作为胰岛素增敏剂， 已广泛应用于临床2 型糖尿病的治疗，但其对非酒精性脂肪性肝病中的作 用【4 】及其作用机制尚有待进一步研究。本实验采用高脂、蛋氨酸胆碱缺乏 ( h i g hf a t ，m e t h i o n i n e c h o l i n ed e f i c i e n td i e t ，m c d ) 饮食建立小鼠n a s h 模 型【5 】，应用罗格列酮干预治疗，以免疫组织化学染色方法检测脂联素在肝 组织中表达变化。采用r t - p c r 和w b s t e mb l o t 分别检测n 吓0 【与i l 6m r n a 和蛋白表达变化。以明确脂联素在n a s h 发病中的作用，探讨罗格列酮延 缓或阻止n a s h 发生和进展的作用及其机制，为临床选择靶向性治疗非酒 精性脂肪性肝纤维化的药物提供依据。 材料与方法 1 材料 1 1 脂肪性肝炎小鼠模型的建立： 7 8 周龄健康雄性c 5 7 b l 6 j 小鼠3 0 只，体质量2 0 2 5 9 ，由中国医学 研究论文 科学院实验动物研究所提供。在室温及稳定湿度条件下，以d l 一蛋氨酸 ( 3 9 k g ) 和氯化胆碱( 2 9 k g ) 充足的饲料分笼喂养i n 后随机分为3 组， 每组1 0 只，模型组( 以m c d 组表示) 采用m c d 饲料喂养；对照组( 以c o n t r o l 组表示) 给予胆碱、蛋氨酸充足的饲料喂养；罗格列酮干预组( 以m c d + r 组表示) 以m c d 饮食加罗格列酮( 5 0 m g k g d ) 喂养。3 周后在深度麻醉 下处死动物，留取血清及肝组织标本。 1 2 标本的制备： 实验动物禁食1 2 d 时，在深度麻醉下，一1 1 , 脏取血，4 离心分离血清， 用于血清丙氨酸氨基转移酶( a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e ，a l t ) ，甘油三酯 ( t r i g l y c e r i d e ，t g ) 的测定。留取部分新鲜肝组织进行恒冷冰冻切片，部 分肝组织以1 0 中性甲醛固定，备做病理切片，其余肝组织用液氮快速冷 冻、置于8 0 0 c 冰箱保存，备提取蛋白、r n a 。 1 3 药品及试剂： m c d 饲料及补充胆碱、蛋氨酸的饲料均购于美国m p 公司，罗格列酮 ( 文迪雅) 购自葛兰素史克制药有限公司。 t r i z o lr e a g e n t 液、随机引物( n 9 ) 、m m l v 反转录酶、5 x b u f f e r 、d n t p 混合物、r n a 酶抑制剂、1 0 x b u f f e r 、t a q 聚合酶、d n a l a d d e r ( m a r k e r ) 均购于北京赛百盛公司。引物序列依据g e n eb a n k 设计由北京赛百盛公司 合成。山羊抗小鼠脂联素多克隆抗体、山羊抗小鼠n 盯0 t 多克隆抗体、兔 抗小鼠i l 6 抗体均购于s a n t ac r u z 公司。辣根过氧化物酶标记的鼠抗山羊 i g g 抗体、小鼠抗兔i g g 抗体、浓缩型d a b 试剂盒、p v d f 膜购于北京中杉 生物技术有限公司。其余化学试剂均为进口或国产分析纯。 1 4 仪器： 基因扩增仪( m tt 2 2 0 ，t 公司，美国) ；台式高速离心机( e p p e n d o r