（植物学专业论文）盾叶薯蓣离体成花及其影响因素的研究.pdf

华中农业人学2 0 0 8 年硕i j 学位论文 摘要 盾叶薯蓣( d i o s c o r e az i n g b e r e n s i sc h w r i g h t ) 作为我田特有的植物，具有悠久 的药川历史，其磐蓣皂甙元含量最高达1 6 1 5 ，足目前世界上簟株皂甙元含量最高 的薯予贞种。自2 0 世纪7 0 年代，在盾叶薯蓣品种改良、皂索提取与快速繁殖等方面 取得了重要进展，并且形成了较完善的快速繁殖技术体系。本研究建立了较稳定的 盾叶薯蓣离体成仡实验体系，比较了影响离体成花的多种因素，并较系统地观察了 盾叶薯蓣的离体成仡过程。 主要研究结果如下： 1 盾叶薯蓣离体成花的主要影响因素 1 ) 外植体的影响。为了比较盾叶薯蓣各种外植体离体成花的差异，以田问编号为 4 7 3 的盾叶薯蓣的成熟花序、花蕾、幼嫩花序、带幼嫩花序的茎段、营养茎段为外 植体，进行离体成花的诱导培养。结果表明：不同外植体离体成花能力不同，成熟 花序离体成花率最高，达7 1 6 7 ；营养茎段不具备离体成花的能力。其他具备离体 成花能力的外植体为：幼嫩花序，离体成花率为5 8 3 4 ；单个花蕾，离体成花率为 4 5 0 0 ；带幼嫩花序的腋芽，离体成花率为3 0 0 0 。 2 ) 不同居群离体成花的差异。为了比较盾叶薯蓣不同居群离体成花能力的差异，以 田间编号为3 2 3 ，4 7 3 ，5 8 8 ，1 8 5 ，3 1 等五个居群为实验材料，比较其成熟花序离 体成花率的差异。其中3 2 3 离体成花率最高( 9 0 0 0 ) ，3 1 号最低( 3 3 3 3 ) 。结 果表明：五种居群离体成花能力的差异具有统计学意义。 3 ) 培养基成分对盾叶薯蓣离体成花的影响。以编号为3 2 3 的盾叶薯蓣成熟花序为外 植体，研究培养基中激素种类及其配比、铁盐浓度、蔗糖浓度和培养基p h 值对离 体成花的影响： 激素：单独使用b a 能够诱导盾叶薯蓣离体开花，当b a 浓度为2 0m g l 时离体 成花率最高，为8 8 6 7 ，当单独使用k t 、i a a 、i b a 、n a a 、2 , 4 d 时不能诱 导其离体成花。适当浓度的i a a 、i b a 、n a a 与细胞分裂素组合时，离体成花 率无显著变化，但再生花，i 长发育状况得到明显改善，最佳激素组合为2 0m e g l b a + 0 2m g ln a a ，离体成花率为9 1 6 7 。在培养基m s + 6 0m g lk t + 0 6m e g l n a a 中，离体成花率最高为3 8 3 4 。在培养基m s + 2 0m g lb a + 0 2m g ln a a 中加入一定浓度的g a ，可使盾叶薯蓣的离体成花率由8 6 6 7 降低到5 5 左右。 实验中观察到g a 可使再乍花提前歼放，并使花序轴：常f n j 延长。 铁盐浓度：当培养基中铁盐浓度为i f 常m s 铁盐浓度l 4 和l 2 时，离体成花率 分别为8 6 6 7 和8 3 3 3 ，j f 常m s 铁盐浓度时离体成花率为8 3 3 3 ，当铁舱 浓度为正常m s 铁盐浓度的二倍和四倍时，诱导率分别为5 0 o o 和4 3 3 3 ：随 华中农业人# 2 0 0 8 年硕i 。7 q ：, i 论文 铁盐浓度的升高，再生花序i l ；现的时【i j 推迟儿数量减少；当培养基中铁盐浓度低 于正常m s 铁盐浓度时，再乍花序不能形成小花。 培养基p h 值：盾叶薯蓣的离体成花率随培养基的p h 值的升高而降低，最佳p h 值为5 8 。6 0 。 蔗糖浓度：盾叶薯侦的离体成花率随蔗糖浓度的升高i n i 降低，适良的蔗糖浓度为 l - 5 一4 5 。 2 离体f 耳生仡序的继代培养。 盾叶薯蓣的四种外植体( 成熟仡序、幼嫩花序、带幼嫩花序的吝段和单个花蕾) 经离体成花诱导后均产生致密愈伤组织，这些愈伤组织上有些只有仡序，有些包含 花序和营养芽。将愈伤组织上的花芽和营养芽去掉，经继代培养后，其上只有营养 芽产生。而离体诱导再生的花序经过同样的培养可以再次产生致密愈伤组织及新的 花序，再生花序的诱导率与原成熟花序的诱导率无显著差异。 3 盾叶薯蓣离体再生花序的发生及发育 1 ) 再生花序的起源：取培养0d 、ld 、3d 、5d 、7d 、1 4 d 、2 5d 和3 0d 时的外植 体及各发育时期的花序，切片观察表明，盾叶薯蓣离体花序主要起源于花序上着生 小花的苞片和花被片的表层细胞。培养7 天左右，花蕾及花蕾与花序轴交界处发生 膨胀，2 0 天左右在膨胀处形成小的突起，3 0 天左右形成致密愈伤组织，并在其表面 长出丛生状花序，培养1 0 0 天左右多数小花在试管里正常开放。 2 ) 再生雄花的发育：试管雄花的花药具有4 个花粉囊，花粉囊内的小孢子母细胞经 过减数分裂形成小孢子四分体，随后小孢子发育形成二细胞型成熟花粉粒。表明离 体再生的盾叶薯蓣雄花具有和自然花相同的发育过程，并能够在离体状态下正常发 育形成成熟花粉粒。 关键词：盾叶薯蓣；离体成花；形态发生 华中农业人学2 0 0 8 年硕l 学位论义 a b s t r a c t d i o s c o r e az i n g b e r e n s i sc h w r i g h t ，an a t i v em e d i c i n a lp l a n ts p e c i e si nc h i n a ，h a sa l o n gh i s t o r yi na p p l i c a t i o no fm e d i c a lm a t e r i a l s t h eh i g h e s tc o n t e n to fd i o s g e n i nw a s r e p o r t e dt ob e16 15 f r o m19 7 0 su pt on o w , m a n yp r o g r e s s e sh a v eb e e nm a d ei n b r e e d i n g ，d i s t i l l i n gt e c h n i q u e so fd i o s g e n i na n dr a p i dp r o p a g a t i o n i no u rs t u d y , w e e s t a b l i s h e das t a b l es y s t e mo fi n d u c i n gi n f l o r e s c e n c e si nv i t r o ，w h i c hp r o v i d e dan e w k n o w l e d g ea b o u tf l o w e rf o r m a t i o na n df u r t h e ro p p o r t u n i t yf o rb r e e d i n g t h em a i nr e s u l t s a r ea sf o l l o w s ： 1 f a c t o r so fi n d u c i n gi n f l o r e s c e n c e si nv i t r o 1 ) e x p l a n t s i no r d e rt oc o m p a r et h ei n d u c ed i f f e r e n c ed u et oe x p l a n t s ，m a t u r e i n f l o r e s c e n c e s ，b u d d s ，i m m a t u r ei n f l o r e s c e n c e s ，s h o o tw i t hi m m a t u r ei n f l o r e s c e n c e s a n ds h o o tw i t h o u ti n f l o r e s c e n c e sw e r es a m p l e df r o ms t r a i nn o 4 7 3 t h er a t e so f e x p l a n t so ni n d u c i n gi n f l o r e s c e n c e si nv i t r oi nd i f f e r e n te x p l a n t sw e r ec a l c u l a t e d t h e i n d u c i n gr a t ef r o mm a t u r ei n f l o r e s c e n c e sw a st h eh i g h e s t ( 71 6 7 ) ，f o l l o w e db yt h e i m m a t u r ei n f l o r e s c e n c e s ( 5 8 3 4 ) ，t h ea x i l l a r yb u d ( 4 5 0 0 ) ，a n dt h e nt h es h o o t w i t hi m m a t u r ei n f l o r e s c e n c e s ( 3 0 ) n o n eo fi n f l o r e s c e n c e sw a si n d u c e df r o mt h e v e g e t a t i v es h o o t nv i t r o 2 ) o r i g i no ft h ee x p l a n t i no r d e rt oc o m p a r et h ei n d u c i n gc a p a c i t yo fd i f f e r e n t p o p u l a t i o no fd z i n g b e r e n s i s ，5p o p u l a t i o n s ，i n c l u d i n gn o 3 2 3 ，n o 4 7 3 ，n o 5 - 8 8 ， n o 18 5a n dn o 31w e r ec h o s e na sd o n o rp l a n t m a t u r ei n f l o r e s c e n c e sf r o mt h e s e5 p o p u l a t i o n sw e r ee x c i s e da se x p l a n ta n di n o c u l a t e di ns a m em e d i u m t h er e s u l t i n d i c a t e dt h a ti n d u c i n ge f f i c i e n c yh a sg r e a tv a r i a n c ei np o p u l a t i o n n o 3 2 3s h o w e d t h eh i g h e s tr a t e ( 9 0 0 0 ) o ni n d u c i n gi n f l o r e s c e n c e si nv i t r o ，a n dn o 3 0w a st h e l o w e s t ( 3 3 3 3 ) 3 ) m e d i u m n o 3 2 3w a sc h o s e na se x p e r i m e n t a lm a t e r i a lt or e s e a r c ht h ef a c t o r s i n f l u e n c i n go ff l o w e ri n d u c i n g nv i t r o ，t h a tw e r eh o r m o n e ，c o n c e n t r a t i o no f f e 2 + - e d t aa n ds u c r o s e ，p hv a l u e h o r m o n e w h e no n l yo n eh o r m o n ew a su s e d b ah a dt h ea b i l i t yo ni n d u c i n g i n f l o r e s c e n c e si nv i t r o ，t h eh i g h e s tr a t e ( 8 8 6 7 ) w a so b t a i n e dw h e n2 0m g lo f b aw a sa d d e di n t ot h em e d i u m ，k t , 队a ，n a a ，i b a ，2 , 4 dd i dn o th a v et h e a b i l i t yt oi n d u c ei n f l o r e s c e n e e si nv i t r o c o m b i n a t i o no fb aw i t hi a a ，i b a ， n a ah a dn oe f f e c tt op r o m o t ei n f o r e s c e n c ei n d u c e ，b u ti tc o u l di m p r o v et h e g r o w t hc o n d i t i o no ft h er e g e n e r a t e di n f l o r e s c e n c e s t h eb e s tc o m b i n a t i o no f h o r m o n ew a sb a ( 2 0m g l ) a n dn a a ( 0 2m g l ) s u p p l e m e n to fg a d e p r e s s e d t h er a t eo fi n f l o r e s c e n c ef o r m a t i o nb u tp u ta h e a dt h ea n t h e s i sa n dp r o l o n g e dt h e 华中农业人学2 0 0 8 年硕 j 学位论文 n o d el e n g t ho ft h er a c h i d e s f e 2 + _ e d t a w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ff e 2 + e d t aw a sl 4m s f e 2 + ，l 2 m s f e 2 + ，1m s f e 2 + ，2m s f e 2 + ，4m s f e 2 + ，t h er a t ew a s8 6 6 7 ，8 3 3 3 ， 8 3 3 3 ，5 0 0 0 ，4 3 3 3 l o w e rc o n c e n t r a t i o no ff e 2 + - e d t ai n c r e a s et h er a t e o ff l o w e rf o r m a t i o nw h i l et h eh i g h e rc o n c e n t r a t i o np r o m o t e dt h ev e g e t a t i v e g r o w t h s u c r o s e t h er a t eo f i n d u c i n g i n f l o r e s c e n c e si nv i t r or e d u c e dw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fs u c r o s ew a si m p r o v e d t h ea p p r o p r i a t ec o n c e n t r a t i o no fs u c r o s e w a s1 5 一4 5 p hv a l u e t 1 1 er a t eo fi n d u c i n gi n f l o r e s c e n c e si nv i t r or e d u c e dw h e nt h ep hv a l u e w a si m p r o v e d t h eo p t i m u mp hv a l u ew a s5 8 6 0 2 s u b c u l t u r eo fr e g e n e r a t e di n f l o r e s c e n c e s d e n s ec a l l u sw a sp r o d u c e dw h e ne x p l a n t s ，m a t u r ei n f l o r e s c e n c e s ，b u d d s ，i m m a t u r e i n f l o r e s c e n c e sa n ds h o o tw i t hi m m a t u r ei n f l o r e s c e n c e sw e r ei n d u c e di nv i t r o s o m eo ft h e d e n s ec a l l u so n l yc o n t a i n e di n f l o r e s c e n c e s ，a n do t h e r sc o n t a i n e di n f l o r e s c e n c e sa n d v e g e t a t i v eb r a n c h e s i n f l o r e s c e n c e sa n dv e g e t a t i v eb r a n c h e sw e r ee x c i s e df r o mt h ed e n s e c a l l u sa n dt h e nt h ed e n s ec a l l u sa n de x c i s e di n f l o r e s c e n c e sw e r es u b c u l t u r e di n t on e w m e d i u m t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ed e n s ec a l l u sw o u l dn ol o n g e rr e g e n e r a t en e w i n f l o r e s c e n c e s ，b u tt h es u b c u l t u r e di n f l o r e s c e n c e sm a i n t a i n e dt h ec a p a c i t yo ff o r e s c e n c e i n d u c e m e n ta sw e l la st h a tf r o mt h ei n f l o r e s c e n c e si nv i v o 3 d e v e l o p m e n to fi n f l o r e s c e n c e sf o r m a t i o ni nv i t r o 1 ) t h ee x p l a n t sw e r es a m p l e dw h e nc u l t u r e d0d ，1d ，3d ，5d ，7d ，1 4d ，2 5d ，3 0d d e v e l o p m e n to ft h ei n f l o r e s c e n c e sf o r m a t i o nw a si n s p e c t e dw i t hm e t h o do fp a r a f f i n s e c t i o n t h ei n f l o r e s c e n c ef o r m e di nv i t r ow e r ei n i t i a t e df r o mt h es u r f a c ec e l l so ft h e b r a c ta n dp e r i a n t h t h ep o s i t i o no fb u dc o n t a c t e dw i t hr a c h i se x t e n d e dw h e nt h e e x p l a n t sh a db e e nc u l t u r e da b o u t7d a y s s m a l lt u b e r sf o r m e da tt h ee x t e n d e d p o s i t i o nw h e nt h ee x p l a n t sh a db e e nc u l t u r e da b o u t2 0d a y s d e n s ec a l l u sw a s p r o d u c e dw h e nt h ee x p l a n t sh a db e e nc u l t u r e da b o u t3 0d a y s ，a n dt h e nm u l t i p l e i n f l o r e s c e n c e sw e r ef o r m e df r o mt h ed e n s ec a l l u s m o s to fs m a l lf l o w e r sw e r e f l o w e r i n gw h e nt h ee x p l a n t sh a d b e e nc u l t u r e da b o u t10 0d a y s 2 ) w eo b s e r v e dt h ep r o c e s so fr e g e n e r a t e dm a l ef l o w e r sf o r m a t i o na n dg r o w t h r e g e n e r a t e dm a l ef l o w e rh a sf o u ra n t h e r s t e t r a d sf o r mt h r o u g ht h em e i o s i so fm o t h e r c e l l so fm i c r o s p o r e 。a tl a s t ，m a t u r et w on u c l e u sp o l l e n sf o r mb ym o t h e rc e l l so f m i c r o s p o r e s ot h ep r o c e s si st h es a m ea si tg r o wi nv i v o k e y w o r d s ：d i o s c o r e az i n g b e r e n s i sc h w r i g h t ；f l o w e r i n gi nv i t r o ；m o r p h o g e n e s i s i v ，每中农业人学2 0 0 8 年硕 j 学位论义 缩略语表 v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学俺论文 是否保密否 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：杨玻 时间：加g 年1 月乡汐日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密 的论文) 在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名：扬破导师签名： 涉睫豸l 谷 签名日期：加胗j 年，7 月多口日签名日期：舻g 年，月2o 日 华中农业人学2 0 0 8 年顺l ：学位论文 1 前言 1 1 课题的研究目的与意义 盾叶薯蓣( d i o s c o r e az i n g b e r e n s i sc h w r i g h t ) 作为我国特有的植物，具有悠久 的药用历史。自2 0 世纪7 0 年代中期，在盾叶薯蓣品种改良、皂素提取j 快速繁魑 方丽取得了重要进展，并且形成了一套较完。海的快速繁殖体系。本课题研究盾叶簪 蓣的离体成花现象，系统地观察盾叶薯蓣的离体成花过程，重点探讨不同居群与外 植体、培养基激素及其配比、蔗糖浓度、铁盐浓度、培养基p h 值等因子对盾叶薯 蓣离体成花的影响，试图建立较稳定高效的盾叶薯蓣离体成花实验体系，为进一步 研究其花器官属性及成花机理奠定基础。 1 2 盾叶薯蓣的研究概况 盾叶薯蓣，别名黄姜、火头根，是单子叶植物纲薯蓣科薯蓣属多年生草质缠绕 藤本，其叶盾形，雌雄异株，根状茎中皂甙元含量最高平均值为5 9 3 ，单株最高 可达1 6 1 5 ，是目前世界上单株皂甙元含量最高的薯蓣种。皂甙元具有溶血、降血 脂、抗菌、消炎等作用，是合成甾体激素类药物的重要原料，也是生产盾叶冠心宁、 地奥心血康等的重要原料，因此，盾叶薯蓣具有“药用黄金”的美誉。 盾叶薯蓣为我国的特有种，主要分布于陕西( 秦岭以南) 、山西、甘肃天水、四 川、重庆、云南、湖南、湖北、河南等省市，垂直分布为海拔1 0 0 1 5 0 0 米。由于多 年无计划采挖，导致野生资源严重枯竭，逐步引起广大学者的重视，并开始系统的 研究。周雪林等( 1 9 8 2 ) 对野生盾叶薯蓣的资源进行了调查，发现野生盾叶薯蓣以口l j 川瓮地和云贵高原为界町以分成不连续的西片，片主要分布云南和四j i i 的西南部； 另一片主要分在湖南、湖北、陕两南部、甘肃东南部和四川东部。他们所做的另外 一项工作是观察盾叶薯蓣的生物学特性，总结了一套适大f h 种植的栽培技术。李向 民等( 2 0 0 5 ) 进行了种质资源普查和收集、土壤营养元素和黄姜皂素含量的相关研究， 为提高皂素含量提供了科学依据。张友德( 1 9 9 9 ) 等研究总结出来影响盾叶薯蓣高产 高含的生态主导因子，在有性繁殖和良种选育方面取得了重要进展，实现了单产 # 中。仪业人学2 0 0 8 年硕i j 学化论义 2 5 0 0 3 0 0 0 公) ? f i r ( 2 年生) ，含量 高达2 一2 5 。 自2 0 世纪7 0 年代中期以来，凼内外的一些研究者干j j ) t j 植物组织培养技术对盾 叶薯蓣进行了快速繁殖和- 占种改良。植物组织培养技术，为盾叶磐颅的资源保存、 品种改良和快速繁殖等提供了契机和方法。【q 川生物所最与l 进行了盾叶兽蓣愈伤组 织诱导和培养的影f 究，随后不同学者分别以根状茎、幼茎、叶片为材料对盾叶薯蓣 进行了脱分化舀养并得到了愈伤组织，但结果霭复。盹彳i 佳，缺少对甚【人i 魁、光暗培 养条件、材料的生理状态等的系统研究( 任建伟等，1 9 9 3 ；跚碧霞等，1 9 9 9 ；徐向丽 等，2 0 0 0 ；易志军等，2 0 0 1 ) 。李明芳等( 2 0 0 2 ) 探讨了激素肘愈伤组织细胞生长和薯 蓣皂甙元含量的影响。王志安等( 2 0 0 2 ) 以不同外植体为材料诱导 f 来愈伤组织，并 经分化培养得到了再生植株，但脱分化的时问较长，组织易褐变、死亡，分化的苗 容易变异，不适于快速繁殖。在倍性育种方面，王志安等( 1 9 9 5 ) 以种子为材料、李 运合等( 2 0 0 5 1 以微块茎为材料采用秋水仙素进行染色体加倍获得了四倍体植株。周 嫒等( 2 0 0 5 ，2 0 0 6 ) 1 ：l , 较了离体诱导的四倍体盾叶薯蓣与二倍体原种的生物学习性和 育性差异；经测定四倍体的一些抗性生理指标显著高于二倍体；薯蓣皂甙元含量也 明显高于二倍体。这些研究为盾叶薯蓣高产和高皂素含量的育种提供了一条新途径。 闫立霞等( 2 0 0 7 ) 通过花药培养获得了单倍体植株，郭永兵等( 2 0 0 7 ) 贝j j 通过胚乳培养获 得了3 倍体植株。毕世荣等( 1 9 9 7 ) 采用平板培养法建立了盾叶薯蓣细胞克隆系，试 验了1 8 种不同培养环境对植板率的影响，其中以添加耦合低聚糖的植板绿最高。刘 艳丽等( 2 0 0 8 ) 对盾叶薯蓣的原生质体分离进行了初步研究。范俊强等( 硕士学位沦 文) 对盾叶薯蓣的优质愈伤组织诱导进行了的研究，并在此基础上初步尝试遗传转 化的工作。 总之，前人已对盾叶薯侦这一重要药源植物的资源分布、薯蓣皂甙元含量及提 取工艺、分类、植物化学、引种栽培、形态解剂、综合利用、组织培养等方面进行 了较深入的研究。在盾叶薯蓣组织培养方面，愈伤诱导及植株再，e 、丛生芽诱导及 快速繁殖、细胞与原生质体分离、倍性育种、遗传转化等方面取得了一些成果，而 生殖器官的离体再生末见报道。 1 3 植物的花发育概述 世界一卜种子植物有3 0 万种左右，其中9 0 以上是丌花植物。开花是被予植物 华中农业人学2 0 0 8 年硕i j 学位论文 生活史中的重要现象，是物种得以生存繁衍的主要过程，它不仅关系着物种的延续， 且与人类生活息息相关。近年来，由于分子生物学、分子遗传学和动物发育研究的 发展及其潜在商业价值的刺激( c o e ne ta 1 ，1 9 9 2 ；w e i g e le ta 1 ，1 9 9 5 ) ，人们再次对植物 的花发育产生浓厚兴趣，出现了植物发育遗传学研究热潮( 李宪利等，2 0 0 2 ) 。 前， 对花发育的研究已深入到分子水平，人们利用屣囚工程和组织培养技术产生突变体 并克隆与成花有关的苯囚，已构建起花器官发育的遗传模型。 有花植物的生活周期可分为胚胎发生阶段( e m b r y o g e n e s i s ) 和胚后器官发7 匕阶段 ( p o s t e r nb r y o i co r g a n o g e n e s i s ) ，后者又以开花为界分为营养生长( v e g e t a t i v eg r o w t h ) 和 生殖生长( r e p r o d u c t i v eg r o w t h l2 个阶段。营养生长从种子萌发开始，是茎端分生组 织不断分化出叶及侧枝的过程；生殖生长是高等植物生活史中的重要阶段，以花的 出现为主要标志。作为执行生殖过程的重要器官的花的形成发育( 即成花机理) 更为 生物学家和农学家关注。 植物成花过程可分为4 个阶段( k o o m n e e fe ta 1 ，19 9 8 ) ：( 1 ) 成花诱导：植物经过 一定的营养生长后，在自身内因和环境外因诱导下从营养生长向生殖生长转变，进 而形成花序分生组织；( 2 ) 由花序分生组织逐步形成花分生组织；( 3 ) 由花分生组织 产生花器官原基：( 4 ) 花器官的成熟：即花器官原基形成后，雌蕊、花药等的成熟 过程。花发育的每一个过程都伴随着基因的差异表达，分子生物学技术的发展给深 入研究花发育机制提供了契机。 1 4 植物离体器官发生控制机理研究进展 植物离体器官发生是指在培养条件下，离体的组织或细胞分化形成不定芽、根 或花芽等器官的过程( b o n g a ，1 9 8 8 ) 。它不仅可在生产上快速无性繁殖植物，而且也 是进行植物基因工程的前提和基础( 谷瑞升等，1 9 9 9 ) 。同时，由于离体条件下植物 器官再生的环境因素比较容易控制，因此它也是研究植物发育问题的主要实验系统 之一。因而，深入研究植物离体器官发生的机理既具有重要的实践价值又具有重要 的理论意义。 1 4 1 植物离体器官发生的研究历程 离体条件下诱导器官的形成在约一个世纪前就已经获得成功。1 9 0 8 年，w i n k l e r 华中农业人学2 0 0 8 年顾i ：学位论文 通过培养长叶蝴蝶草( t o r e n i a a s i a t i c a ) 的叶切段，观察到了花芽从叶切段上的直接再 生( w i n k l e r ，1 9 0 8 ) 。2 0 世纪3 0 5 0 年代，根和营养芽等营养器官的直接再生在许多 植物中获得了成功。这一时期，w h i t e ( 1 9 4 3 ) 通过培养番茄的根尖，获得了恨尖的大 量离体再生；s k o o g 和t s u i ( 1 9 4 8 ) 贝o 诱导了营养芽的直接形成。离体生贿器官的再生 从2 0 世纪7 0 年代初开始进入快速发展时期。1 9 7 3 年，t r a nt h a n hv a n ( 1 9 7 3 ) 通过烟 草( n i c o t i a n a t a b a c u m ) 的簿层培养诱导了花芽的直接再生，这种离体乍殖器官发生系 统被广泛应用于生殖生理和- 殖发育分子机理的研究( k a u r s a w h n e ye ta 1 ，1 9 8 8 ； t i b u r c i oe ta 1 ，19 8 8 ；m e e k s w a g n e re ta 1 ，19 8 9 ) 。随后h i c k s 和m c h u g h e n ( 19 7 4 ) 在烟 草胎座组织的培养过程中成功获得了再生的柱头和心皮状结构。1 9 8 8 年，陆文梁等 以风信子( h y a c i n t h u so r i e n t a l i s ) 为材料获得了花被片、雄蕊和胚珠的直接再生( l ue t a 1 ，1 9 8 8 ) ，后来又通过小麦( t r i t i c u m s a t i v u m ) 稃片和颖片的培养获得了小穗的离体再 生( l u ，1 9 9 2 ) 。进入2 0 世纪9 0 年代以来，花序和果实的离体再生也在多种植物中取 得成功( l ue ta 1 ，1 9 9 4 ；l ie ta 1 ，1 9 9 9 ；l u ，2 0 0 2 ，2 0 0 3 ) 。迄今为止，被子植物中包 括营养器官和生殖器官在内的几乎所有的器官都可以在离体条件下得到再生。 1 4 2 离体器官发生的规律性 通过对离体器官发生的研究，发现在植物器官离体发生过程中有规律可循。首 先，可通过调节培养基中生长素与细胞分裂素的浓度比例而得到不同植物器官，浓 度比高时易于诱导根的形成，浓度比低时促进芽的分化，浓度比处于中间值时则易 导致细胞无规则增殖形成愈伤组织( s k o o ge ta 1 ，1 9 5 7 ) 。最近l o 余年的研究还发现植 物器官再生的种类受内外两种因素的控制，即外植体的来源和外施激素的种类和浓 度。外植体的来源即分离外植体的器官在植物个体发育中所处的分化时期。分化时 期越早，来源于这种器官的外植体在培养时形成的细胞的再分化潜能越低，再生器 官的种类越少；反之则越多。这表明外植体来源的器官在植株个体发育中形成的时 期决定了其细胞在离体培养中能再生的器官的种类。外源施加的激素的种类和浓度， 尤其是生长素，对离体器官的再生有重要作用。对于植株分化花芽前形成的各种器 官，分化时期越早，再生这种器官需要的z e 长素浓度越低；而对于植株分化花芽后 形成的器官即花器官，分化时期越晚，则获得这种器官的再生所需要的生长素浓度 越低( 陆文棵，2 0 0 5 ) 。上述规律性的发现对指导不同种类植物的不同器官的再e 具 4 华中农业人学2 0 0 8 年硕f j 学位论文 有重要价值。 离体器官可以通过直接和间接两条途径得到再生，前者不经过愈伤组织阶段， 后者首先形成愈伤组织，然后通过愈伤组织产生离体器官。般认为离体器官发生 由三个连续的时期组成：第一个时期，细胞对激素作 j 谚 别、脱分化、获得向器官 发育的潜在能力；然后，脱分化的细胞在激素的作用下向特定器。自发育；第三个时 期足器官的形态发生阶段，此时已不再需要激索诱导( s u g i y a m ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。上述三 个阶段的划分对探索激素诱导离体器官发生的分子机理具有重要价值。 1 4 3 离体生殖器官的发生 植物的生活周期可以分为两个阶段t 营养生长阶段和生殖生长阶段。生殖生长 是植物生活周期中的关键环节。通过遗传学和分子生物学的研究，发现在拟南芥中 至少有5 条途径参与调控拟南芥的开花时间。随后，在花序分生组织的侧翼形成花 分生组织，进而分化产生各种花器官原基。a bc 模型、a bcd 模型、a b c d e 模 型以及四聚体模型的提出为了解花器官发育的分子机理奠定了坚实的基础( c o e ne t a 1 ，1 9 9 1 ；c o l o m b oe ta 1 ，1 9 9 5 ；t h e i s s e ne ta 1 ，2 0 0 1 ；h o n m ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。近年来，离 体生殖器官再生系统的建立为进一步了解单个生殖器官发育的调控机制提供了便 利。 植物生殖器官的离体发生也有两条途径：直接发生和间接发生。第一类再生系 统已经在烟草、风信子、黄瓜等多种单双子叶植物中成功建立。陆文棵等以风信子 为材料，先后报道了以风信子花被片为外植体成功诱导了花芽、花被片、雄蕊、心 皮和胚珠的直接再生，建立了风信子的各种离体生殖器官再生系统。在风信子的花 器官再生系统中，以花被片为外植体，在高浓度细胞分裂素和生长素条件下，能诱 导花被片的不断再生；当外植体从含高浓度激素的培养基转移剑含低浓度激素的培 养基上时，能够诱导再生花芽中形成子房和胚珠( l ue ta 1 ，1 9 9 1 ；l ue ta 1 ，1 9 9 9 ， 2 0 0 0 ) 。第二类再生系统也已经在单子叶植物小麦、水稻和双子叶植物花叶千年木中 获得成功。以小麦幼穗的内稃和外稃为外植体，可以先形成愈伤组织，然后从愈伤 组织e 直接再生小穗及雌蕊状结构( l u ，1 9 9 2 ) 。以小麦的未成熟胚为外植体可首先诱 导愈伤组织的形成，然后在愈伤组织上直接再生雌g 蓝( w ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 。再生雌蕊除 了具有单生胚珠，还发现了双! 仁胚珠，离体雌蕊的再生频率与小麦的基因型有密切 乍叶i 农业人学2 0 0 8 年硕 ：学位论丈 的联系。 迄今为止，共彳r 包括仡叶千年木( l ue ta 1 ，1 9 9 9 ) 、高m 参( l i ne ta 1 ，2 0 0 5 a ) 、 竹子( l i ne ta 1 ，2 0 0 5 b ) 、合欢( t a y l o re ta 1 ，2 0 0 5 ) 、南非醉茄( s a r i t h ae ta 1 ，2 0 0 7 ) 、 风信子( 陆文操等，1 9 9 4 ) 、荞麦( y o n g s a ke ta 1 ，2 0 0 1 ) 、西洋$ 卜鹃( l i ue ta 1 ，2 0 0 7 ) 、 * 瓜( w a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 、烟草( h i c k se ta 1 ，1 9 7 4 ) 和小麦( w ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 等约 3 0 多个科的1 0 0 多+ , l q c t 物实现了离体成仡( 房。泣品等，2 0 0 7 ) 。 1 4 4 影响生殖器官离体再生的因素 目前离体成花研究主要是通过研究各种因子对植物花的发育过程的影响，从而 阐明其调控机理。在所有影响因子中主要研究的足外植体、外源激素、营养条件等 对离体成花的影响。 陆文棵等在风信子花芽分化研究中发现取自营养器官的外植体只能形成营养 芽，而取自生殖器官的外植体则容易分化成花芽( l ue ta 1 ，1 9 9 9 ) 。同一外植体在整 体植株上所处的部位不同，其再生能力差异也很大。这是由于生长年龄和生理年龄 不同，导致细胞间分化程度的差异。如烟草茎段外植体，靠近顶端区比近基部的外 植体更容易分化出花；沿茎基部向上，分化根芽能力不断下降，而分化成花芽能力 不断上升，这可能是成花物质积累程度不同所致( 房立晶等，2 0 0 7 ) 。另外不同的基 因型也影响着植物的试管成花。伍碧华等对4 5 种基因型的小麦进行了离体单性雌花 再生，发现仅有5 种基因型获得了单性雌花的离体再! k ( w ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 。l i n 在高丽 参( l i ne ta 1 ，2 0 0 5 a ) 、竹子( l i ne ta 1 ，2 0 0 5 b ) 等体外成花的研究中发现细胞分裂素 尤其是b a 对离体成花有着关键作用，但w a n g 等在苦瓜的离体成花研究中发现k t 能促进花芽特别是雌花的形成，b a 则促进枝芽和雄花的形成( w a n g e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 另外，不同浓度的细胞分裂素对花芽分化的影响也不同，一些研究者发现适当浓度 的b a 能促进花芽分化，但当浓度不合适时，则抑制花芽分化。在盾叶薯蓣离体成 花巾，单独使刚各种激素，只有b a 能够诱导成花( 待发表的资料) 。陆文棵在对风 信子离体培养中发现，单独使用2 ，4 d 只能诱导愈伤组织的分化，不能诱导任何其 他器官分化。但当培养基中含有b a 时，花芽的分化随b a 浓度的升高而升高。n a a 取代2 ，4 d 结果也基本相同( 陆文棵，1 9 8 6 ) 。有实验表明，诱导风信予花被片再生 花芽实验中，花被再7 卜花芽过程中，必须有外源细胞分离索的参与，而生长素并不 6 7 ；中农业人学2 0 0 8 年硕f ：学位论文 是决定因素，来源不同部位的外植体对生长素的要求存在由花被下部到花被上部递 增的规律或梯度差异( 陆文棵等，1 9 9 4 ) 。h a n d r o 等( 1