（微生物学专业论文）微、纳米生物功能磁性材料的构建及在酶固定化中的应用.pdf

中文摘要y - 6 6 3 6 62 中文摘要 固定化酶具有稳定性好，使用次数多等独特优点，已被用于生物 反应器，生物催化，和生物传感器等众多领域。用于制各固定化酶的 方法很多，其中共价结合法因具有结合牢固的优点，而被广泛采用， 但是由于选择应用的载体类型不同，固定化酶的酶学性质也会随之不 同。本研究首次提出了以纳米级磁性f e 。0 。粒子为核心，苯乙烯( s t 卜一 丙烯酸( a a ) 共聚物为高分子壳层，合成了表面带羧基的磁性高分子复 合微球，然后将这种微球用二氯豫砜进行活化处理，在其表面形成了 反应性酰氯基团，该基团可以与游离酶的氨基形成肽键，从而将游离 酶固定化。通过这类载体制备的固定化酶的酶活回收率在7 6 以上， 而由一般载体制备的固定化酶的酶活回收率在4 5 6 5 之间，这表明 活化后的磁性高分子复合微球是一类可以应用于酶固定化领域的高 效载体。本研究的独特之处可概括如下： 1 优化了纳米级磁性f e 。0 。粒子的制备工艺。以氨水( n h 。h 。0 ) 作沉 淀剂，用共沉淀法制备出了反应型纳米级磁性f e 。0 。粒子，经透射电 镜观察测得其粒径分布在2 0 6 0 n m 。采用边沉淀边熟化的方式，优化 出了最佳的制备流程。 2 采用分散聚合法，以上述反应型纳米磁性f e 3 0 。粒子为核心，苯乙 烯( s t 卜丙烯酸( a a ) 共聚物为高分子壳层，合成了表面带羧基的磁性 高分子复合微球。在合成过程中，充分考虑到水分补偿问题，防止了 中文摘要 凝胶的产生。 3 建立了f r e u n d l i c h 等温吸附模型。根据酶液浓度与载体吸刚最的 关系，结合时间与吸附量的关系，建立了f r e u n d l i c h 等温吸附模型， 并获得了该模型的动力学参数( 1 9 k ，n ) 。 4 在制备固定化酶的过程中不需加入交联剂( 如：戊二醛等) 。 此外，考察了影响固定化木瓜蛋白酶酶学性质的因素，并与游离 酶进行了比较。结果表明：由于木瓜蛋白酶直接固定于微球表面而没 有剩余空间，这给固定化酶提供了更高的稳定性，所以固定化木瓜蛋 白酶在热稳定性与储藏稳定性方面优于游离酶。固定化酶的最适反应 温度是8 0 。c ，最适p h 是8 0 ，操作半衰期是2 8 天，固定化酶的酶活 回收率在7 6 以上，通过米氏方程测定了固定化酶和溶液酶的米氏常 数，分别为2 1 6 4 1 4 7 和7 0 8 3 6 。 关键词：共沉淀法，纳米级磁性f e 3 0 。粒子，分散聚合，磁性高分 子复合微球，固定化酶，f r e l d n d l i c h 等温吸附模型 i i a b s t r a c t a b s t r a c t i m m o b ili z e de n z y m eh a sb e e na p p li e dt on u m e r o u sf i e l d s i n c l u d i n gb i o r e a e t o r s ，b i o c a t a l y s t sa n db i o s e n s o r sb e c a u s eo f i t sa d v a n t a g es u c ha sg o o ds t a b i l i t ya n dr e u s a b i l i t y t h e r e h a v em a n ym e t h o d sf o rp r e p a r a t i o n o fi m m o b i l i z e de n z y m e c o v a l e n tc o m b i n a t i o nh a sb e e nw i d e l ya d o p t e db e c a u s e o fi t s e x c e l l e n c eo fc o m b i n a t i o nf a s t n e s s b u te n z y m a t i cp r o p e r t i e s o fi m m o b i l i z e de n z y m ea r e d i f f e r e n ti nc o n n e c t i o nw i t ht h e d i f f e r e n tt y p eo fv e c t o rt h a th a sb e e ns e l e c t e d i nt h i ss t u d y i th a sb e e np u tf o r w a r dt h a tt a k i n gr e a c t i v en a n o m e t e rm a g n e t i c f e ： 0 4p a r t i c l e s a s m a g n e t i cn u c l e u s ，a n d t h ec o p o l y m e ro f s t y r e n e ( s t ) 一a c r y l i ca c i d ( a a ) a sm a c r o m o l e c u l a rs h e l l ，w e c o u l d s y n t h e s i z e ，m a g n e t i c p o l y m e rc o m p o s i t e m i c r o s p h e r e s c o n t a i n i n gc a r b o x y lg r o u p so nt h e i rs u r f a c e ，t h e nm i c r o s p h e r e s a r ea c t i v a t e db yt h i o n y l c h l o r i d e ，t h es u r f a c eo fs u c hm a g n e t i c c o m p o s i t em i c r o s p h e r e s t h u s p r o d u c e d h a dr e a c t i v ea c i d c h l o r i d eg r o u p sw h i c ht h e nr e a c tw i t ht h ef r e ea m i n og r o u p so f t h ef r e es o l u b l ee n z y m e st og i v ep e p t i d eb o n d s ( 一c o n h 一) f i n a l l ye n z y m e i sc o v a l e n t l yi m m o b i l i z e d t h e r e c l a i m e d e f f i c i e n c y o fi m m o b i l i z e de n z y m e t h a ti s p r e p a r e db y t h i s v e c t o riso v e r7 6 ，b u to t h e r sa r eb e t w e e n 4 5 a n d6 5 。i ts h o w s a b s t r a c t t h a ta c t i v a t e dm a g n e t i cp o l y m e re o m p o s i t em i e r o s p b e r e si sa n e f f i c i e n tv e c t o rt h a tc a nb ea p p l i e di m m o b i l i z a t i o nf i e l d t h e p a r t i c u l a rw o r k sa r es u m m a r i z e da s f o l l o w s lt h eb e s tp r e p a r a t i o nc i r c u i tw a so p t i m i z e d n h ：1 h 2 0w a sc h o s e n t oa c ta s p r e c i p i t a t i n gr e a g e n t r e a c t i v en a n o m e t e rm a g n e t i cf e 3 0 4p a r t i c l e sw e r ep r e p a r e db y c o p r e c i p i t a t i o nm e t h o d ，t h ep a r t i c l e ss i z ed i s t r i b u t i o nw a s b e t w e e n2 0 n ma n d6 0 n mt h r o u g ht h ed e t e c t i o no ft r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) t h eb e s tp r e p a r a t i o nc i r c u i t w a s o p t i m i z e dt h r o u g ht h ec o m b i n a t i o np r o c e s s o fp r e c i p i t a t i o na n d a g l n g 2w i t h d i s p e r s i o n p 0 1 y m e r i z a t i o n ，t a k i n g a b o v er e a c t i v e n a n o m e t e rm a g n e t i cf e 3 0 4p a r t i c l e sa sn u c l e u s ，a n dt h ec o p o l y m e r o fs t y r e n e ( s t ) 一a c r y l i ca c i d ( a a ) a sm a c r o m o l e c u l a rs h e l l ，w e c o u l d s y n t h e s i z e ，m a g n e t i cp o l y m e rc o m p o s i t e m i c r o s p h e r e s c o n t a i n i n gc a r b o x y lg r o u p so nt h e i rs u r f a c e i nt h ep r o c e s s o f s y n t h e s i z e ，m o i s t u r ec o m p e n s a t i o n w a sf u l l yc o n s i d e r e da n dg e l w a sp r e v e n t e d 3f r e u n d l i c hi s o t h e r m a la d s o r p t i o n m o d e lw a se s t a b l is h e d t h e m o d e lw a sb a s e do nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec o n c e n t r a t i o n o ff r e e l ys o l u b l ee n z y m ea n da d s o r p t i o nq u a n t i t y o ft h ev e c t o r ， c o m b i n e dw i t h t i m ea n da d s o r p t i o n ， s o m ek i n e t i c i v a b s t r a c t p a r a m e t e r s ( 1 9 k ，n ) r e l a t e dt ot h ep r o c e s sw e r eo b t a i n e db yu s i n g t h em o d e l 4i m m o b i l i z a t i o n p r o c e s s h a sn ou s ef o r c o u p l i n gr e a g e n t ( e g ：9 1 u t a r a l d e h y d e ) a p a r t f r o mt h e s e ，t h ef a c t o r si n v o l v e dw i t ht h e e n z y m i c p r o p e r t i e so ft h ei m m o b i l i z e dp a p a i n w e r es t u d i e di nc o m p a r i s o n w i t hf r e e l ys o l u b l ep a p a i n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r m a la n d s t o r a g es t a b i l i t i e so ft h ei m m o b i l i z e dp a p a i nw e r eh i g h e rt h a n t h o s eo ft h ef r e e l ys o l u b l eo n e ，a n dt h a tp a p a i nd i r e c t l yw a s i m m o b i l i z e do n t ot h em i c r o s p h e r e s s u r f a c ew i t h o u ta n ys p a r e s p a c ep r o v i d e d ah i g h e rs t a b i l i t y t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e ，t h e p ha n ds t o r a g es t a b i l i t y w e r e8 0 。c ，8 0a n d2 8d a y sr e s p e c t i v e l y t h er e c l a i m e de f f i c i e n c yo fi m m o b i l i z e de n z y m et h a ti sp r e p a r e d b y t h i sv e c t o ri so v e r7 6 ，t h em i c h a e l i s m e n t e nk i n e t i c c o n s t a n t sw e r ee v a l u a t e df o rt h ei m m o b i l i z e da n dt h ef r e e l y s o l u b l ee n z y m e s ，t h e yw e r e2 1 6 4 1 4 7a n d7 0 8 3 6 ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：c o p r e c i p i t a t i o nm e t h o d ， n a n o m e t e rm a g n e t i cf e 3 0 4 p a r t i c l e s ，d i s p e r s i o n p 0 1 y m e r i z a t i o n ， m a g n e t i cp o l y m e r c o m p o s i t em i c r o s p h e r e s ，t h e i m m o b i l i z e de n z y m e ，f r e u n d l i c h i s o t h e r m a la d s o r p t i o nm o d e l v 第一章引言 第一章引言 1 1纳米级磁性f e 。0 。粒子 1 1 1 超微磁性粒子的定义及应用 随着纳米技术的不断发展，人们对纳米材料的性能提出了越来越 高的要求，超微磁性粒子是指粒径在5 - 1 0 0 n m 的粉末材料，应属于准 零维范畴( 尺寸介如原子、分子与宏观固体间) 。磁性纳米粒子由于 具有磁性与流动性两者合一的独特性质，因而在巨磁电阻、磁性液、 磁记录、软磁、永磁、磁致冷、巨磁阻抗材料以及磁光器件、磁探测 器等方面具有广阔的应用前景m 3 1 。除此之外，在生物技术领域，用 磁性纳米粒子制成的磁性液已经被广泛地应用于磁性免疫细胞分离 【4 ，核磁共振的照影【5 1 ，以及药物控释等6 1 领域。 1 1 2 磁性纳米粒子的研究现状 近年来有关磁性纳米粒子的制各及性质研究受到很大重视7 1 。制 备磁性氧化铁纳米粒子及其复合材料的基本方法有溶胶一凝胶法8 l ( s o l g e l 法) ，强迫水解法【9 ，共沉淀法，微乳液法1 1 1 ，水热合成法 12 1 ，汽化冷凝法 1 3 1 以及气溶胶喷射热解法1 4 1 等。在已报道的各类磁 性纳米粒予中，有关磁性f e ，o 。纳米粒子的制备方法及应用研究尤其 受到重视 1 5 q9 】。在传统的制备方法上加以改进，如调整反应物组成、 结构等就可获得理想的效果。f e l t i n 等人谰微乳液法以f e c l 2 与表 面活性剂十二烷基硫酸钠( s d s ) 反应，通过控制s d s 的浓度及反 第一章引言 应温度制得了粒径为3 7 1 1 6 n m 的球形f e 3 0 4 纳米粒子，与传统法相 比，该方法在反应物浓度极低及室温下就可获得稳定的纳米粒子； c a r u s o 等人在苯乙烯( p s ) 乳液微球上通过选择性沉积制各了多 层f e 3 0 d 聚电解质纳米复合材料，形成了以p s 为核，f e ，o d 聚合物为 壳的复合结构，这一发现为胶体技术的应用开拓了新的可能性；s h e n 等人【2 1 1 首先应用化学沉淀法，利用氨水将f e 2 + 与f e 3 + 沉淀，然后用脂 肪酸使生成的f e 3 0 。粒子在水中重新悬浮，这一过程可以利用双层脂 肪酸表面活性剂的保护使粒子不发生团聚，克服了单一应用共沉淀法 制备纳米粒子容易团聚的缺点。 通过控制适当的反应条件，就能够制备出直径从几个纳米到几十 个纳米级的磁性f e ，o 。粒子，由于共沉淀法所需设备简单、程序简便， 所以在实验中通常采用此法，共沉淀法有两种：一种是m a s s a r t 水解 法【2 2 l ，即将摩尔比为2 ：l 的三价铁盐( f e 3 + ) 与二价铁盐( f e 2 + ) 的 混合溶液直接加入到强碱性的水溶液中，铁盐在强碱性水溶液中瞬间 水解结晶形成磁性f e 3 0 4 纳米粒子；另一种是滴定水解法2 啦3 1 ，该方 法是将稀碱溶液滴加到摩尔比为2 ：1 的三价铁盐( f e 3 + ) 与二价铁 盐( f e 2 + ) 混合溶液中，使铁盐溶液的p h 值逐步升高，达到6 7 时， 水解生成磁性f e 3 0 。纳米粒子。用m a s s a r t 合成法和滴定水解法能够 制备粒径为5 - 1 0 n m 的磁性f e 。0 。纳米粒子“，其中通过m a s s a r t 合成 法得到的磁性f e 。0 。纳米粒子呈现从球形到立方体形的多种形状，而 由滴定水解法合成的磁性f e 。0 。纳米粒子则主要为球形结构，粒子大 小比较均匀，在这两种方法中，后者由于在反应过程中反应条件容易 第一章引言 控制，所以比较简捷和优越。在共沉淀法中都会涉及一个粒子熟化的 过程，通过不断的实验摸索，本研究优化出了最佳的纳米级磁性f e 3 0 。 粒子的制备工艺。 我们相信，经过该领域科研工作者的共同努力，必将开发出更多 性能优异的磁性材料，为科学的发展及社会的进步做出更大的贡献。 1 2 磁性高分子复合微球 1 2 1 磁性高分子复合微球的研究现状 高分子无机物复合材料由于其特殊的用途而引起普遍重视，例如 核为无机物，壳为有机物的高分子微球，用于激光打印机，油漆、药 物释放、医疗诊断等诸多方面 2 5 - 2 7 1 ，其制备方法有机械法，化学法 2 8 - 3 4 。磁性高分子微球作为这类复合材料中的种，它的研究开始 于2 0 世纪7 0 年代末，作为种新型的功能材料，其表面高分子壳层 上的活性基团能与许多有机物和具有生物活性的物质( 如：细胞、免 疫蛋白、生物酶、核酸等) 发生偶联，同时，又因微球内部含有纳米 级磁性粒子，因此被广泛地用作分离材料和固相载体，在生物医学、 细胞生物学和生物工程等领域有着广阔的应用前景 3 5 , 3 6 。目前合成这 种磁性高分子复合微球有两种方法 3 7 】：一种是包埋法，利用有机或生 物高分子包埋磁粉，这是合成天然高分子微球的常用方法，包埋是将 磁性粒子分散于高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段 得到磁性高分子微球。一般而言，包埋法得至4 的磁性微球，其磁性粒 子( 磁核) 与外壳层的结合主要通过范得华力( 包括氢键) ，磁粒表 面的金属离子与高分子链的螯合作用以及磁性粒子表面的功能基团 第一章引青 与高分子壳层功能基团形成共价键。利用包埋法制备的磁性微球，方 法简单，但所得的粒子粒径分布宽，形状不规则，粒径不易控制，壳 层中难免混杂一些诸如乳化剂之类的杂质，用于免疫测定，细胞分离 等领域会受到很大的限制。另一种是单体聚合法，指在磁性粒子和单 体存在的条件下，加入引发剂和稳定剂聚合而成的核壳式磁性高分 子复合微球。单体聚合的方法主要可以分为：悬浮聚合，分散聚合， 乳液聚合( 包括无皂乳液聚合，种子聚合) 。单体聚合法成功的关键 在于确保单体的聚合反应在磁粒表面顺利进行。一般而言，磁性粒子 为亲水性，对于亲水性单体如戊二醛，单体容易接近磁性粒子，聚合 容易在磁性粒子表面进行，而对于大多数油性单体如苯乙烯、甲基丙 烯酸、甲基丙烯酸甲酯等，聚合反应则难以在磁性粒子表面顺利进行。 通过分散聚合法合成出来的超顺磁性高分子微球能与靶物质结合，均 匀地分散在一定的基液中，形成具有高度稳定性的胶态液体材料，所 以它既有液体流动的性质，又有固相材料的磁性，在外加磁场的作用 下，固液相的分离十分简单，再通过一个简单的沈脱程序就可得到高 纯度的靶物质。 本研究采用分散聚合的方法合成了表面带羧基的亚微米磁性高 分子微球，在此之前曾有在微球表面包被羟基曲明和醛基。”3 的报道，但 未见有在微球表面包被羧基的专门报道，丘广明等人“伽曾从一个侧面 ( 结合其它基团) 做过一些探讨，但是也未见其专门论述过，而且因 制备的微球粒径过大( 2 4 u m ) 和表面羧基含量偏低( o 0 2 9 4 m m o l m 1 ) ， 所以限制了这种微球的应用。由于国内外的研究者都没有考虑过合成 第一章引言 反应中水分补偿的问题，我们在聚合反应中首先考虑到这一问题( 每 两个小时加8 m ld d h ：o ) ，本研究重视了这样一个很容易忽视的问题， 从而保证了反应能在水溶液中j i 瞑利进行，避免了凝胶的生成。 制备表面功能化的高分子微球最常用的方法是非均相体系中的 共聚，因此磁性高分子微球的表面功能化可通过单体共聚反应及表面 处理得到。m a t s u m o t o 等 4 1 , 4 2 1 报道了制备带羧基的聚合物胶乳的方法， 产物中羧基主要悬挂在胶乳的表面。然而，通常的共聚方法，即使是 采用亲水性极强的共聚单体，如丙烯酸，绝大数的羧基还是处于胶粒 内剞4 3 l 。为了使羧基定位于胶粒的表面，较为有效的处理方法是将胶 粒表面的酯基直接用碱水解m 1 1 。而本研究中制备的磁性高分子微球克 服了上述不足，制备出了表面富含羧基的磁性高分子复合微球。表面 带有乙烯基的单分散高分子微球可用种子分散聚合方法制各，在聚 苯乙烯种子存在下进行苯乙烯与二乙烯基苯的分散聚合。同样的方法 可用于制各表面带有氯甲基的单分散高分子微球 4 5 】。除此之外，还可 在微球表面带上其它功能基团如羟基、氨基、醛基。 1 2 2 磁性高分子复合微球的特性 磁性高分子复合微球具有如下特性： ( 1 ) 表面效应和体积效应。表面效应是指超细微粒的表面原子数 与总原子数之比随着粒径变小而急剧增大，表面原子的晶体场环境和 结合能与内部原子的不同，具有很大的化学活性，其表面能大大增加。 这是由于表面原子的周围缺少相邻的原子而具有不饱和性，易与其它 原子结合而稳定下来。可见表面效应是一种影响化学特性的因素。体 第一章引言 积效应是由于超细微粒包含的原子数减少而使带电能级加大，会使物 质的一些物理性质因能级间歇的不连续而发生异常。上述两种效应可 具体反映在比表面激增，微球官能团密度及选择性吸附能力变大，达 到吸附平衡的时间大大缩短，粒子的稳定性大大提高 4 6 1 。 ( 2 ) 磁效应。具有磁性可使磁性高分子复合微球在外加磁场作 用下容易进行分离和磁性导向。 ( 3 ) 生物相容性。磁性高分子复合微球在生物工程，特别是在生 物医学工程中的应用，有一个很重要的方面就是生物相容性。多数生 物高分子如多聚糖、蛋白质类具有良好的生物相容性。它们在人体内 安全无毒，可降解，不与人体组织器官产生免疫原性，这种性质在靶 向药物中更为重要。 ( 4 ) 功能基特性。磁性高分子复合微球含有多种反应活性功能 基团，如羟基，羧基，氨基等，可连接具有生物活性的物质，如免疫 蛋白，酶。 1 3 固定化酶 1 3 1 固定化酶的定义及优点 酶在水溶液中，一般很不稳定，作为催化剂，酶液只能一次性地 起作用，若是用于医学或化学分析领域，酶必须很纯，如此一次性使 用，必然耗资很大。为了克服这种缺点，人们开始探索将游离酶与不 溶性载体联结起来，使之成为不溶于水的酶的衍生物，同时又能保持 或大部分保持原酶固有的活性，在催化反应中不易随水流失。这样制 备的酶，曾被称为水不溶酶( w a t e r i n s o l u b l ee n z y m e ) 、固相酶 第一章引言 ( s o l i dp h a s ee n z y m e ) 等。后来发现，一些包埋在凝胶内或置于超滤 装置中的酶，本身仍是可溶的，只是被限定在有限空间不能自由流动 而已。因此，在1 9 7 1 年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固 定化酶”( i m m o b i l i z e de n z y m e ) 这一名称。所以，固定化酶，是指 经过物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失，而又能发挥催化 作用的酶制剂。 酶是一类特殊的生物催化剂，能够催化构成细胞代谢的所有反 应，生物体内的各种化学反应均是在酶催化下进行的。同一般的催化 剂相比，酶有以下几个特点：l 、催化效率高；2 、专一性强；3 、反 应条件温和；4 、酶的活性是可以调控的。虽然酶在生物体内能够催 化许多化学反应，但用作工业催化剂仍存在缺陷。由于酶是由蛋白质 组成，其高级结构对所处的环境十分敏感，所以一般情况下，对热、 强酸、强碱、有机溶剂等均不够稳定，在反应中易失活，而且酶中常 带有杂蛋白及有色物质，造成产物分离提纯困难，限制了酶在酶促反 应中的广泛应用。2 0 世纪6 0 年代发展起来的酶固定化技术既克服了 上述不足，又在一定程度上保持了酶特有的催化活性，从而成为生物 技术中最为活跃的研究领域之一。与游离酶相比，固定化酶具有下列 优点“”：( 1 ) 固定化酶可以多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定 性提高，因而单位酶催化的底物量大增，用酶量大减，亦即单位酶的 生产力高。( 2 ) 固定化酶极易与底物、产物分开，因而产物溶液中没 有酶的残留，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。( 4 ) 固定 化酶的反应条件易于控制，可以装柱( 塔) 连续反应，宜于自动化生 第一章引言 产，节约劳动力，减少反应器占地面积。( 5 ) 比游离酶更适合于多酶 反应体系。( 6 ) 辅酶固定化和辅酶再生技术，将使固定化酶和能量再 生体系或氧化还原体系合并使用，从而扩大其应用范围。经过三十多 年的研究和发展，固定化酶技术已取得了长足的进步，先后开发了多 种性能多样的载体材料“”3 ，取得了丰硕的成果。 1 3 2 固定化木瓜蛋白酶的研究现状 虽然大部分酶包括蛋白酶在生物技术领域起重要作用，但是由于 低恢复度、低重复使用率以及在溶解状态下容易失活而使它们的作用 受到限制。而固定化酶在如快速终止反应、产物控制和许多工程设计 等方面优于原酶。近年来有许多关于酶固定化方法的报道”。“，成功 的酶固定化技术必须满足载体具有很强的结合能力，耐用，高效和低 廉。而木瓜蛋白酶作为一种合适的模型，经常被用于研究比较各种固 定化程序的优劣。 木瓜蛋白酶( e c3 4 2 2 2 ) 是种硫醇类蛋白酶，因其具有良 好的特性和结构晴”1，因此可以将其作为比较各种酶固定化方法优 劣的理想模型，而且由于固定化木瓜蛋白酶在工业和医药方面有很大 的潜在用途n ”刚，所以对它的固定化也研究得较多，各种固定化方法 都在木瓜蛋白酶的圃定中作了一些尝试呻“3 ，通过共价结合法制备的 固定化酶由于结构和构象的改变对酶活有相当大的影响m ，6 “，选择 应用不同类型的载体，即使采用同样的方法( 如：共价结合法) ，制 备的固定化酶的酶学性质也有所不同，其中最重要的一个衡量参数是 固定化酶的酶活回收率，而且用共价结合法对载体的要求是必须能重 第一章引言 复使用、不减少酶固定化产量。磁性载体在酶固定化中的应用则是一 个很不错的尝试哺8 。7 。国内有较多作者“1 。7 即将木瓜蛋白酶作为研究对 象，对各种固定化方法进行了比较，但是不论采用哪种方法，制备的 固定化木瓜蛋白酶的酶活回收率一般在4 0 一6 5 之间，因此在工业应 用上还是会受到一定的限制。为了提高固定化木瓜蛋白酶的酶活回收 率，我们通过查阅相关文献未发现有用磁性复合微球活化后再固定化 木瓜蛋白酶的研究报道，故而考虑将表面带羧基的磁性高分子复合微 球经二氯亚砜活化后用于固定化木瓜蛋白酶中的研究”，通过此法获 得的固定化酶的酶活回收率在7 6 以上，这就从一个侧面说明这种活 化后的磁性高分子复合微球是一类可应用于工业生产上的高效载体。 本研究采用共沉淀法制备了纳米级磁性f e 3 0 。粒子，运用分散 聚合的方法，合成了表面带羧基的磁性高分子复合微球，带c o o h 的磁性微球经二氯亚砜激活后制备出了固定化木瓜蛋白酶，活化的载 体和酶迅速共价结合并保持很高的酶恢复活性，而且磁性微球能方便 快速地从反应溶液中分离。本研究在没有使用交联剂的情况下，对木 瓜蛋白酶的固定化进行了深入的研究，发展了游离酶的固定化技术， 为生物反应器，生物催化和生物传感器等领域提供了理论和技术基 础。 第二章纳米级磁性f e 。n 粒子的制各及分析 第二章纳米级磁性f e 。0 。粒子的制备及分析 纳米级磁性f e 3 0 4 粒子的制备方法及应用研究日益受到重视 1 5 - 1 9 】，是 目前纳米材料领域和功能材料领域的一个热点，其制各方法较多，如机械 粉碎法、共沉淀法、湿式( 溶液) 氧化法等，各种方法都有利有弊，但是 以共沉淀法最简捷和优越，通过控制适当的反应条件，就能够制各出直径 从几个纳米到几十个纳米级的磁性f e 3 0 4 粒子。共沉淀法有两种：一种是 m a s s a r t 水解澍2 2 1 ，即将摩尔比为2 ：1 的三价铁盐( f e 3 + ) 与二价铁盐( f e 2 + ) 的混合溶液直接加入到强碱性的水溶液中，铁盐在强碱性水溶液中瞬问水 解结晶形成磁性f e 3 0 4 纳米粒子；另一种是滴定水解法【2 1 ，2 3 1 ，该方法是将 稀碱溶液滴加到摩尔比为2 ：1 的三价铁盐( f e 3 + ) 与二价铁盐( f e 2 + ) 混 合溶液中，使铁盐溶液的p h 值逐步升高，达到6 7 时，水解生成磁性f e 3 0 。 纳米粒子。在这两种方法中，后者由于在反应过程中反应条件容易控制， 所以比较简捷和优越。在共沉淀法中都会涉及一个粒子熟化的过程，通过 不断的实验摸索，本研究采用边沉淀边熟化的方式，优化出了最佳的纳米 级磁性f e 3 0 4 粒子的制备工艺。 第二章 纳米级磁一眭f e ，0 。粒子的制备及分析 2 1 材料与方法 2 1 1 合成纳米f e 。0 。晶体所需药品及试剂 f e c lz - 4 h z 0 ( a r ) ；f e c l s 6 i t z 0 ( a r ) ：n i t 。h 。0 ；均为国产分析纯试剂。 2 1 2 制备原理 将二价铁盐和三价铁盐按一定比例混合，加入沉淀剂( n h 广h ：o ) ，搅 拌反应一段时间，磁性分离，干燥即得纳米级磁性f e 。0 粒子，反应式为： 8 0 h 一+ f e 2 + + 2 f e ”_ f e ，o 。0 + 4 h ：0 ，由反应式可看出反应的理论摩尔 比为f e “：f e ”= 1 ：2 。但由于二价铁盐容易氧化成三价铁盐，因此实 际比应低于1 ：2 。虽然该法原理比较简单，但是影响f e 。o 。晶体的磁性及 粒径的因素较多，如：铁盐的类型、沉淀剂的种类及加入方式，除此之外， 反应终点的p h 值、熟化等处理都有影响。经过不断摸索，本研究探索出 了较佳的制备流程。 2 1 3 制备流程 z 0 控制终点d h = 9 0 广 区互 _ 一是蔷嚣1 屯亟立驾匝巫 亟固斗 磁铁吸附 _ 叫脱水卜_ 叫冷冻干燥卜_ 斗1 纯净纳米f ea o 。晶体l i - - - - - - - - _ ji - - - - - - - - - - - - - - - - - - - _ 一i - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - _ 一 2 1 4 制备过程 用分析纯的f e c l 。6 h 。0 ( a r ) 和f e c l 。4 h ：0 ( a n ) ，分别配制成 0 5 m o l l 的f e c l 3 溶液和0 5 m o l hf e c l 。溶液按f e ”：f e ”= 1 7 5 ：1 ，分别 第二章 纳米级磁性f e 。0 。粒子的制各及分析 加入3 5 m 1 0 5 m o l l 的f e c l 。和2 0 m 1 0 5 m o l l 的f e c i 。溶液于2 0 0 m l 烧杯 中混匀，8 0 。c 水浴熟化，并在搅拌( 搅拌速度为3 0 0 4 0 0 转分钟) 作用下 加入n h 。h 2 0 直至p h = 6 5 ，此为f e 。0 4 胶状物的等电点。1 5 m i n 后继续缓慢 加入n h 。h 2 0 调p h 至9 5 ，其余条件保持不变，反应约3 0 m i n 后停止，用 强磁铁吸住烧杯底部，倾去上层废液，用双蒸水反复冲洗直至中性，然后在 磁铁吸附下脱水，冷冻干燥，留待电镜观察。 2 1 5 样品分析 采用透射电子显微镜( t e m ) 直接观测磁性纳米粒子的大小及形态，所 用仪器为日立一6 0 0 透射电镜。电子加速电压为6 0 一l o o k v ，电镜样品是将 磁性f e 。0 。粒子的分散液用乙醇稀释后，滴在涂炭铜网上挥发至干而成。 2 2 结果与分析 2 2 1 纳米级磁性f e 。0 。粒子的结构与形态 圉1f e ，o ；绡米晶体粒子的t b m 照片 f i g 1t e mp h o t o g r a p h so ff e 3 0 n a n o p ar t i c l e s 图1 表示的是由共价沉淀法制备的磁性f e 。0 t 纳米粒子的透射电镜照 片，从图1 可以看出f e 。0 。粒子主要为球形结构，粒子大小较为均匀。粒 1 2 第二章 纳米级磁性f e ：0 。粒子的制备及分析 径的估算可以通过从图1 中随机抽取1 0 个大小不一致的粒子进行粒径的 测定，结果如表1 所示，粒径分布在2o 60n m 之间，抽样的平均粒径 是3 8 5 n m ，这说明通过共沉淀法制备的磁性f e 。0 粒子是纳米级的，这符 合后续实验的要求。 表1f e ，0 ，粒子粒径的估算 t a b l e1 e s t i m a t i o no ff e 3 0 4p a r t i c i e ss i z e 2 3 讨论 ( 注：实际粒径= 图形粒径1 0 平均粒径= 实际粒径1 0 其中 1o 。是t e m 的放大倍数；10 是随即抽取的数目) 用g a s s a r t 合成法和滴定水解法能够制各粒径为5 - 1 0 n m 的磁性f e 。0 纳米粒子心“，其中通过m a s s a r t 合成法得到的磁性f e 。0 纳米粒子呈现从 球形到立方体形的多种形状，而由滴定水解法合成的磁性f e 。0 纳米粒子 则主要为球形结构，粒子大小比较均匀。本研究采用的化学共沉淀法制备 的磁性f e 。0 纳米粒子实际上是滴定水解法，由化学共沉淀法制备的磁性 f e 。0 纳米粒子，最初的反应产物中有一部分是非晶体的，只有经历一个 熟化( 8 0 c ) 的过程，才能形成晶体结构。因此温度在磁性微粒的生成过 程中起着重要作用，对f e 3 0 。微粒进行熟化处理是必不可少的一步，而且 熟化温度是非常关键的。根据文献口“，制备完成后需再经历一个熟化的过 程，但经过我们的具体实验发现，经过这种方法处理后磁性f e 。0 t 纳米粒 子丧失了磁性，一个可能的原因是熟化时间没有设置好，以致产生了没有 1 1 第二章 纳米级磁性f e 。0 。粒子的制备及分析 磁性的r f e z 0 ，。所以本研究采用边沉淀边熟化的方法，制备的磁性f e 。0 。 纳米粒子在纳米级范围内( 2 0 6 0 n m ) ，在反应过程中进行熟化，促进了 f e 。0 。微粒中掺杂的杂质在高温下的溶解分离，这也有利于提高f e 。0 。微粒 的纯度，从而提高其磁性，当熟化温度高于1 0 06 c 后，部分f e 。0 。氧化成 f e 。0 。而造成微粒的磁性下降，与其它制备方法比较而言，我们制各的磁 性f e 。0 。粒子具有很好的磁感应，而且粒径符合后续实验的要求，拓展了 磁流体的应用前景。 虽然滴定水解法具有简便，反应条件温和以及反应过程易于控制的优 点，而成为合成中的首选，但是影响f e 。0 。晶体的磁性及粒度的因素较多， 如：铁盐的类型、沉淀剂的种类及加入方式，除此之外，反应终点的p h 值、熟化等处理都有影响，本研究经过反复实验摸索出较佳的反应工艺 过程，搅拌速度在3 0 0 4 0 0 转分钟，氨水分两次滴加，而且要不断地检 测反应液中的p h 值，观察是否符合实验要求并及时作出调整，最重要的 是边沉淀边熟化，这既省略了反应后的熟化过程，也不会导致实验的失败。 用磁铁分离反应液时，在上清液会出现一层油膜样的物质，必须用滤纸尽 量除尽才能得到超纯净的磁性f e 。0 。纳米粒子，否则就会影响后续的合成 实验。另外除尽磁性f e 。4 纳米粒子中的水样后要进行干燥，通常使用红 外干燥法，但我们建议使用冷冻干燥法，因为冷冻干燥法能保持磁性f e ：瓯 纳米粒子的原始构象，使其物理和化学性能保持良好。另外，制备的纳米 级磁性f e 。0 。粒子由于粒径较小而容易发生团聚现象，但是s h c n 等人1 首先应用化学沉淀法，利用氨水将f e 2 + 与f e 3 + 沉淀，然后用脂肪酸使生成 的f e ，o 。粒子在水中重新悬浮，这一过程可以利用双层脂肪酸表面活性剂 第一二章纳米级磁性f e ，吼粒子的制备及分析 的保护使粒子不发生团聚，克服了单一应用共沉淀法制备纳米粒子容易团 聚的缺点。 目前对磁性f e 。0 。纳米粒子表征的分析测试方法有：( 1 ) x - 射线粉末 衍射法( x r d ) ；( 2 ) 透射电子显微镜( t e m ) ；( 3 ) 扫描电子显微镜( s e m ) ； ( 4 ) 超导量子干涉仪( s q u i d ) ；( 5 ) 原子力显微镜( a f m ) 。 第三章 磁性高分子复合微球的制各及分析 第三章磁性高分子复合微球的制备及分析 磁性高分子复合微球是一种性能优良的功能材料。它的研究开始 于2 0 世纪7 0 年代末，作为一种新型的功能材料，其表面高分子壳层 上的活性基团能与许多有机物和具有生物活性的物质( 如：细胞、免 疫蛋白、生物酶、核酸等) 发生偶联，同时，又因微球内部含有纳米 磁性粒子，因此被广泛地用作分离材料和固相载体，在生物医学、细 胞生物学和生物工程等领域有着广阔的应用前景【3 3 j 4 1 。目前合成这种 复合微球有两种方法1 ：一种是包埋法，另一种是单体聚合法。但是 不管采用哪种方法都没有考虑过合成反应中水分补偿的问题，我们在 聚合反应中首先考虑到这一问题( 每两个小时加8 m ld d h 。0 ) ，本研 究重视了这样一个很容易忽视的问题，从而保证了反应能在水溶液中 顺利进行，避免了凝胶的生成。 通过查阅相关文献，未见有专门合成表面带有羧基的磁性高分子 复合微球的报道。通常的共聚方法，即使是采用亲水性极强的共聚单 体，如丙烯酸，绝大数的羧基还是处于胶粒内部4 3 1 。为了使羧基定位 于胶粒的表面，较为有效的处理方法是将胶粒表面的酯基直接用碱水 解 。而本研究中制各的磁性高分子微球克服了上述不足，制备出了 表面富含羧基( 3 0m m o l g ) 的磁性高分子复合微球，并将其应用于 质粒d n a 分离领域 8 l 】。 第三章 磁性高分子复合微球的制备及分析 3 1 材料与方法 3 ，1 1 合成表面带羧基的磁性复合微球所需试剂 纳米级磁性f e a 0 一粒子( 0 ：2 0 6 0 n m ) ，本实验室合成：苯乙烯( s t ) ： c p ：丙烯酸( a a ) ：a r ；单体使用前经减压蒸馏除去阻聚剂；聚乙 二醇( p e g ) j ( 撕= 4 ，0 0 0 ；过硫酸