（生态学专业论文）基于srap和issr分析的拟环纹豹蛛种群遗传多样性研究.pdf

中文摘要 本文用s r a p 和i s s r 标记技术对采自湖南、江西、湖北、云南等 4 省境内5 个不同地理环境的拟环纹豹蛛( 砌砌口芦p “如口玎刀“肠砌 b 6 s e n b e 唱e ts t r a n d1 9 0 6 ) 种群遗传多样性进行研究，分析了不同生态因 子对拟环纹豹蛛种群遗传多样性的影响。主要结果如下： ( 1 ) 建立了适合狼蛛种群研究的i s s r 和s r a p 两种有效的分子 标记体系 本文将i s s r 和s r a p 分子标记方法引入了蛛形学领域，进行不 同地理区域拟环纹豹蛛种群的遗传多样性研究。实验结果表明：i s s r 和s 凡廿是研究狼蛛遗传多样性有效的分子标记方法；筛选出的8 对 引物对拟环纹豹蛛d n a 扩增出的谱带清晰、多态性高。 ( 2 ) 酒精长期保存的拟环纹豹蛛标本，一般情况下不宜作为分 子标记物提取的材料 实验中，试图通过提取酒精长期保存标本的d n a 来为实验提供 更丰富和便利的材料，但其结果表明：酒精长期保存的标本需要先置 换出体内的酒精才能提取d n a ，但扩增出的带偏小、且不清晰，说 明其基因组已被降解，已不太适合于作分子生物学实验材料。 ( 3 ) 拟环纹豹蛛的自然种群具丰富的遗传多样性，且不同生境 内的种群遗传多样性存在差异 在优化后得到的反应条件下，s r a p 和i s s r 两种标记系统均能 对拟环纹豹蛛d n a 扩增出大量清晰带，带的大小为3 0 0 5 0 0 b p 左右， 其中多态性条带占6 3 5 。7 4 ，显示其具丰富的遗传多样性。在各地 理种群中，s r a p 和i s s r 两种标记方法得到的结果显示的一致性是： 湖南长沙雷锋镇种群遗传多样性最大，云南高黎贡山福贡种群遗传多 样性最小。 s h 撇o n 多样性指数、n e i7 s 基因多样性指数等均显示5 个地理拟 环纹豹蛛种群存在一定程度的遗传分化：在5 个地理拟环纹豹蛛种群 变异来源中，2 4 6 2 2 7 9 9 的变异来源于种群间；7 5 3 8 7 2 0 1 的变 异来源于种群内。这说明地理种群内的变异大于地理种群间的变异。 ( 4 ) 生态因子影响不同地理环境拟环纹豹蛛种群的遗传分化 种群的遗传矩阵显示：在s r a p 分析中，云南福贡与湖南吉首地 理种群的遗传距离最大( o 3 2 1 7 ) ，湖北武汉与湖南长沙地理种群的 遗传距离最小( o 2 1 6 6 ) ；在i s s r 分析中，云南福贡与湖北武汉地 理种群的遗传距离最大( o 3 0 3 7 ) ，湖南长沙和湖北武汉地理种群遗 传距离最小( o 2 0 6 6 ) 。说明由于不同生境的差异使拟环纹豹蛛不同 地理种群间产生了较明显的遗传分化。 不同生态因子与种群遗传多样性的相关性分析结果表明：不同地 理种群的拟环纹豹蛛的遗传多样性与海拔成显著负相关，与积温成正 相关；各种群的多态位点百分率、s h a n n o n 指数、n e i 基因多样性指 数在这些方面也表现出一致性：即均随海拔的升高遗传多样性降低， 随积温的增加遗传多样性增加；我国华南、西南地区降雨量较充沛， 因此种群遗传多样性与年均降水的相关性不显著。同时经聚类分析发 现：处于高海拔的云南福贡种群与其它种群的分化明显，说明高海拔 可成为拟环纹豹蛛或蜘蛛分布的障碍，造成地理种群在d n a 上存在 差异，最终可能导致新种的形成。 ( 5 ) 两种标记方法所得的拟环纹豹蛛种群变异来源基本一致， 但i s s r 标记的结果稍高于s r a p 标记 从标记结果比较：多态性扩增带数目、多态位带百分率、有效等 位基因数，i s s r 标记显示的结果高于s r a p 标记。从遗传多样性指 数上比较：n e i 多样性指数、s h a n n o n 多样性指数以及多态性位 点，i s s r 的结果高于s r a p 标记。这些说明s r a p 和i s s r 两种标记 方法均可用于拟环纹豹蛛或其它蜘蛛的遗传多样性分析。 关键词：s r a p 标记i s s r 标记遗传多样性生态因子地理种群 拟环纹豹蛛 a b s t r a c t t h i sp a p e ri n v e s t i g a t e dt h eg e n e t i cd i v e r s i t yo ft h ew o l fs p i d e r r 如s 口 ，s p 即如口h 以以励f nb 6 s e n b e r g e te ts t r a n d19 0 6 ) b yu s i n gt h e i s s ra n ds r a pr e a c t i o n s y s t e m sa n da n a l y z e dt h e e f f e c tw h i c h e c o l o g i c a l f a c t o rc a 而e do n g e n e t i cd i v e r s i t y t h e w o l fs p i d e rw a s c 0 1 1 e c t e d 舶mf i v eg e o g r a p h i c a lr e g i o n si nh u n 锄，j i a n g ) 【i ，h u b e ia n d m a np r o v i n c eo fc h i n a ( 1 ) t h ee s t a b l i s h m e n ta n do p t i r n j z a t i o no fi s s ra n ds 凡垤s y s t e m s f o rp l o p u l a t i o ng e n e t i c so fw 0 1 f s p i d e r t l l ei s s ra n ds 凡廿s y s t e mw e r e 印p l i e di n 心a c h n o l o g ) ri nt h i s p a p t o s t u d yg e n e t i cd i v e r s i 缈 o ft h ew o l fs p i d e ri nd i f f e r e n t g e o g r l p h i c a lr e g i o n s 7 i h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ti s s ra n ds r a pa 心 s e n s i t i v ea n dr e l i a b l em 0 1 e c u l a rm 乏咄e rt e c h n i q u ef o rs t u d y i n gg e n e t i c d i v e r s i t yo ft h ew o l fs p i d e r t h ee i g h tp r i m e r sp a i r sw o u l dg e n e r a t e a c c u r a t eb a n d sw h o s ep o l y m o 叩h i s mi sh i g h ( 2 ) t h e w o l f s p i d e rs a m p l ew h i c h w a sp r e s e r v e db ya l c o h o lf o ra1 0 n g t i n l ei sn o tas u i t a l b l em a t e r i a lf o r i n ae x 仃a c t i o n i nt h ee x p e r i m e n t ，t h ed n ao fm ew o l fs p i d e r 、h i c hw a sp r e s e r v e d b ya l c o h o lf o ral o n gt i m ew a se x t r a c t e di no r d e rt og e tm o r em a t e r i a lf o r p c ra m p l if i c a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea l c o h 0 1o ft h ew o lf s p i d e r s a m p l em u s tb er e p l a c e dt og e tt h ed n a ，a n dt h ed n ab a n d sw e r e s m a l l e ra n di 1 1 d e l f i n e d s ot h es a m p l ei sn o tas u i t a b l em a t e r i a lf o rd n a i v e x t r a c t i o nb e c a u s et h eg e n o m ed n ah a db e e nd e g r a d e d ( 3 ) t h en a t u r a lp o p u l a t i o no ft h ew o l fs p i d e rh a sa b u n d a n tg e n e t i c d i v e r s i t ya n dt h e r ew e r ed i f f e r e n c e i nt h e g e n e t i cd i v e r s i 够o fm e p o p u l a t i o n 敞) md i f f l e r e n tg e o g r 印h i c a lr e g i o n s b yt h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，i s s ra n ds r a ps y s t e mg o t b a n d so fd n a i ts h o w e da b u n d a n tg e n e t i cd i v e r s i t yt h a tt h e6 3 5 - 7 4 o ft o t a l 仔a g m e n t sw e r ep 0 1 y m o 叩h i c 仔a g m e n t t h es i z eo f 仃a g m e n t s r a n g e d 仔o m3 0 0 b pt o5 0 0 b p t h es i m i l a rr e s u l tt h a tt h eg e n e t i cd i v e r s i t y o ft h ew 0 1 fs p i d e ri nl e i f e n gt o 、v ni sh i g h e s ta n dt h ef u g o n gi sl o w e s t c a m e6 o mi s s ra n ds r a p s y s t e m a c c o r d i n gt ot h ep a r a m e t e r ss u c ha ss h a n n o n si n d e xa n dn e i s g e n ed i v e r s i 妙i n d e x ，m ew o l fs p i d e rh a d ah i g hg e n e t i cd i v e r s i t ye i t h e ri n s p e c i e so rp o p u l a t i o nl e v e la n do b v i o u sg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o n f r o mt h e p o p u l a t i o nv 撕a t i o ns o u r c e ，2 4 6 2 2 7 9 9 o ft o t a lg e n e t i cv a r i a t i o nc a m e 仔o mi n t r a - p o p u l a t i o na n d7 5 38 7 2 o1 c a m e 仔o m i n t e r p o p u l a t i o n ( 4 ) t h ee c o l o 垂c a lf a c t o ra f f e c t e dg e n e t i cd i v e r s i t yo f t h ew 0 1 fs p i d e r i nd i f 五e r e n te n v i r o m e n t t h em a t r i xs h o w e dt h a ti ns r a ps y s t e m ，t h eg e n e t i cd i s t a n c ei s f i a n h e s tb e 似e e nf u g o n gp o p u l a t i o na n dj i s h o up o p u l a n t i o na n dn e a r e s t b e t w e e nw u h a np o p u l a t i o na n dc h a n g s h ap o p u l a t i o n i ni s s rs y s t e m ， t h eg e n e t i cd i s t a j l c ei sf a n h e s tb e 似e e nf u g o n ga n d 、7 m h a np o p u l a t i o n a n dn e a r e s tb e t w e e nw u h a np o p u l a t i o na n dc h a n g s h ap o p u l a t i o n s o ， v d i 付b r e n th a b i t a tm a d et h ew 0 1 fs p i d e rh a v eg e n e t i cd i 目睹r e n t i a t i o n t h ec o r r e l a t i o na n a l y s i so f e c o l o g i c a lf a c t o r sa n dp o p u l a t i o ng e n e t i c d i v e r s i t ys h o w e dt h a tt h e r ew a so b v i o u s l yn e g a t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e n t h eg e n e t i cd i v e r s i t ya n dt h ea l t i t u d e ，b u tt h e r ew a sp o s i t i v ec o l l r e l a t i o n b e 似e e nt h eg e n e t i cd i v e r s 时a n dt h ea c c u 咖l a t e dt e n l p e r a t u r e i tm e a n s t h a tt h e p 0 1 y m o 印h i cl o c i ，s h a n n o n sd i v e r s i t yi n d e x 锄dn e i sg e n e d i v e r s i 妙i n d e xo fp o p u l a t i o nd e c r e a s e dw i t ht h eh o i s to fa l t i t u d e ，b u t i n c r e a s e dw i t ht h ea u g m e n to fa c c u m u l a t e dt e m p e r a t u r e b e c 乏l u s e 勺ft h e 西c hr a i n f a l li nt h es o u t ha n ds o u t h - w e s to fc h i n a ，t h ec o l l r e l a t i o i nb e t w e e l l g e n 舐cd i v e r s i t ya n dr a i n f a l lw a sn o ts i g i l i f i c a i l t t h ec l u s t e ra n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sd i s t i n c tg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o nb e 俩e e nf u g o n g p o p u l a t i o ni nh i g ha l t i m d er e g i o n sa n do t h e rp o p u l a t i o n i ts h o w e dt h a t h i g ha l t i t u d em a yb et h eo b s t a c l eo fs p i d e rd i s t r i b u t i n ga n dm a yl e a dt o t h eg e n e r a t i o no fn e w s p e c i e ( 5 ) t h ev 抓a t i o ns o 眦eo ft h ew o l fs p i d e rp o p u l a t i o nb yi s s r s y s t e mi ss i m i l a rw i t hw h i c ho fs r a ps y s t e m ，b u tt h er e s u l to fi s s ri s h i 曲e rt h a ns r a p t h er e s u l to fi s s ri sh i g h e rt h a i ls r a ps u c ha st h ep o l y m o 叩h i s m b a n d s ，p e r c e n t a g eo fp o l y m o 印h i s mb a n d s ，e f r e c t i v ea l l e l e ，p o l y m o 叩k c l o c i ，s h a n n o n sd i v e r s i t yi n d e xa n dn e i sg e n ed i v e r s i t ) ri n d e x t h ei s s r a n ds r a ps y s t e mw e r eb o t hs u i t a b l ef o rt h ea n a l y s i so fg e n e t i cd i v e r s i t y o ft h ew o l f s p i d e ra n do t h e rs p i d e r s v i k e yw 研d s ： s r a pi s s r g e n e t i cd i v e r s i t ye c 0 1 0 9 i c a lf a c t o r p n r d o s np s e n d o n n n u t 口t n v i i 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不合任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：术骆i 慧 z od g 年l2 月6 日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：耥缎忽日期三耐年仅月6 日 导师签名：身乙絮方参 日期：力僻p 月多 日“ 0 基丁s r a p 和i s s r 分析的拟环纹豹蛛种群遗传多样性研究 1 前言 1 1 遗传标记概述 1 1 1 遗传多样性的概念 遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 是生物多样性的重要组成部分之 一。广义上的遗传多样性【1 1 是指地球上所有生物所携带的各种遗传信 息的总和；因为这些遗传信息储存于生物个体的基因中，故遗传多样 性也就是生物遗传基因的多样性；任何一个物种或一种生物个体都保 存着大量的遗传基因，因此，一个物种或一种生物个体可被看作是一 个基因库( g e n ep 0 0 1 ) ；一个物种所包含的基因越丰富，它对环境的 适应能力就越强，所以基因多样性是生物进化和物种分化的基础。狭 义上的遗传多样性是指生物种内基因的变化，包括种内显著不同种群 之间以及同一种群内的遗传变异。此外，遗传多样性可以表现在分子、 细胞、个体等多个层次上。在自然界中，对于绝大多数有性生殖的生 物而言，种群内的个体之间往往没有完全一致的基因型，而种群就是 由这些具有不同遗传结构的多个个体组成的。 在生物的长期演化过程中，遗传物质的改变( 或突变) 是产生遗 传多样性的根本原因。遗传物质的改变主要有两种类型，即染色体数 目和结构的变化以及基因内部核苷酸的变化；前者称为染色体的畸 变，后者称为基因突变( 或点突变) 。此外，基因重组也可以导致生 物产生遗传变异。 1 1 2 遗传标记的发展 硕十学位论文 1 1 2 1形态标记形态标记是指生物明确显现出遗传多样性的外 观性状【2 1 ，如人的肤色、植物的株高、植物种子的粒形、植物果实的 颜色等，这些外观性状肉眼即可观察和识别。从广义上讲形态标记包 括简单测试即可识别的色素、生殖生理特性、抗病抗虫性等有关的标 记，它是最早被使用和研究的一类遗传标记；其基因的染色体定位是 通过2 点或3 点测验进行，看其是否符合遗传的分离规律、自由组合 定律和连锁交换定律，从而确定控制这些性状的基因是否连锁，并把 连锁群与染色体对应，以重组率作为染色体的相对距离。由于形态标 记的优点是简单直观、容易观察记录，所以长期以来对物种的分类及 生物资源鉴定都是以形态标记为初步的或主要的指标；其缺点是数量 较少、可鉴别的基因有限、难以建立饱和的遗传图谱，同时遗传表达 有时不太稳定，易受环境条件及基因显隐性的影响。 1 1 2 2细胞标记细胞标记是指能明确显示出遗传多样性的细胞 特型3 1 ，最常见的是染色体的结构特征和数量特征；如核型分析( 染 色体的数目和类型、染色体的形态和大小、着丝粒的位置) 、带型分 析( c 带、n 带、g 带、银染技术) 、染色体的行为等。与形态标记 相比，细胞标记的优点是能进行一些重要基因的染色体定位；缺点是 花费的人力多，时间长，某些物种对染色体变异反应敏感，观察鉴定 比较困难。 1 1 2 3 生化标记生化标记是指生物的生化特征特性4 5 】，包括同 工酶和等位酶等标记。同工酶是指具有同一底物专一性的不同分子形 式的酶6 ，它是由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯 基丁s r a p 和i s s r 分析的拟环纹豹蛛种群遗传多样性研究 聚体或杂聚体，并具有组织、发育及物种的特异性。等位酶是指由一 个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同形式。生化标记的分析方 法是在粗酶的提取物中，通过电泳和组织化学方法将酶的多种形式转 变成肉眼可见的酶谱带型。生化标记的优点：一是直接反应了基因产 物差异，受环境影响小；二是短时间内可检测出大量样本中多个位点 的遗传变异。生化标记的缺点：一是可利用的生化标记数量少，只能 检测出编码蛋白的基因位点；二是每一种同工酶都需要特殊的显色方 法和技术【针，故其实际利用受到限制。 1 1 2 4 分子标记分子标记指的是d n a 分子标记，是d n a 水平 上遗传多样性的直接反应【9 1 0 1 。理想的分子标记具有以下优点：( 1 ) 能对生物各发育时期的个体、器官、组织、细胞进行检测，直接以 d n a 的形式表现、不受环境影响、不存在基因表达与否的问题；( 2 ) 数量丰富，遍及整个基因组，可检测到的基因座位几乎是无限的；( 3 ) 多态性高，自然界存在许多等位变异；( 4 ) 对生物体的影响表现为“中 性”，不影响目标性状的表现，且不良性状无必然连锁；( 5 ) 多为共 显性，能为鉴别纯合基因型和杂合基因型提供完整的遗传信息；( 6 ) 检测手段稳定快捷，稳定性、重复性好，易于实现自动化；( 7 ) 标记 为共显性标记，能区别杂合体和纯合体；( 8 ) 开发成本和使用成本均 低【l l 12 1 。 1 1 3 目前常用的分子标记有： ( 1 ) 建立在s o u t h e m 杂交基础上的分子标记技术【1 3 】： i 江l p ( r e s t r i c t i o nf r a 舯e n tl e n g t hp o l 严。印h i s m ) ：限制性片段长度多 硕十学位论文 态性 d g g e ( d e n a t u r i n g g r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ) ：变性梯度凝胶电泳 t g g e ( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ) ：温度梯度凝胶电泳 ( 2 ) 建立在重复序列基础上的分子标记技术【1 4 】： s a t e l l i t e ：卫星d n a s s r ( s i m p l es e q u e n c er 印e a t ) ：简单重复序列或微卫星d n a m i n i s a t e l l i t e ：小卫星d n a s r s ( s h o nr 印e a ts e q u e n c e ) ：短重复序列 ( 3 ) 建立在p c r 基础上的分子标记技术1 5 】： m t d n a ( m i t o c h o n d r a ld n a ) ：线粒体d n a r a p d ( r a j l d o m l y 加n p l i f i e dp o l y m o 印l l i s md n a ) ：随机扩增多态性d n a s c a r ( s e q u e n c ec h a r a c t 嘶z e d 印1 i f i e dr e g i o n ) ：测序的扩增区段 s s c p p c r ( s i n g l es t r 锄dc o n f 0 珊a t i o np 0 1 ) ，m o r p h i s m p c r ) ：单链构象 多态性p c r d a f ( d n a a m p l i f i c a t i o nf i n g 唧m t i n g ) ：扩增产物指纹分析 a f l p ( a m p l i f i e df r a 鲫e n th 舢p 0 1 ) ，i i l o 神i s m ) ：扩增限制性片段长 度多态性 s r a p ( s e q u e n c er e l a t e d 锄p l i f i e dp o l 胂。叩h i s m ) ：相关序列扩增多态性 ( 本文用到的方法) c d n a - a f l p ( c d n a a m p l i f i e df r a 舯e n tl e n 舀hp o l y m o 印h i s m ) ：c d n a - 扩增限制性片段长度多态性 ( 4 ) 以d n a 特定序列为核心的分子标记技术【1 6 】 s t s ( s e q u e n c et a g g e ds i t e ) ：测序的标记位点 s t m s ( s e q u e n c e t a g g e dm i c r o s a t e l l i t e s ) ：序列标记微卫星 i s s r ( h l t e r s i m p l es e q u e n c er 印e a t ) ：插入简单重复序列( 本文用 到的方法) a s s r ( a n c h o r e ds i m p l es e q u e n c er 印e a t ) ：锚定简单序列重复 基丁s r a p 和i s s r 分析的拟环纹豹蛛种群遗传多样性研究 c a p s ( c l e a v e d a m p l i f i e dp 0 l y i n o 叩h i cs e q u e n c e ) ：酶切扩增多态性序列 s p a r ( s i n g l ep r i m e ra m p l i f i c a t i o nr e a c t i o n ) ：单引物扩增反应 d a m d ( d i r e c t e da m p l i f i c a t i o no fm i n i s a t e l l i t er e 百o nd n a ) ：定向扩增微 卫星区域d n a 标记 i s t r ( i i l v e r s es e q u e n c et a g g e dr 印e a t ) ：反转序列标定重复性标记 球l p ( h t r o nf r a 舯酬l e n mp 0 l 珊o r p h i s m ) ：基因内区长度多态性标记 r a m p ( r a n d o ma m p l i f i e dm i c r o s a t e l l i t ep o l y t n o r h i s m ) ：随机扩增微卫星 多态性标记 s n p ( s i n g l en u c l e o t i d ep 0 1 ) ，1 1 1 0 印h i s m ) ：单核苷酸多态性标记 ( 5 ) 建立在i n 】 a 基础上的分子标记技术： d d ( d i i a ld i s l a y ) ：差异显示 i m p c r ( r e v e n1 协s c p t i o np c r ) ：逆转录p c r d d i m p c r ( d i 虢r e n t i a ld i s p l a yr e v 瞰t r m s c 邱t i o np c r ) ：差异显示逆 转录p c r 砌) a ( r 印r e s e n t a t i v ed i 腩r e n c e a n a l y s i s ) ：特征性差异分析 e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a q s ) ：表达的顺序标位 1 2i s s r 及s r a p 分子标记概述 1 2 1 微卫星d n a 的发现及定义 在真核生物的整个基因组的不同座位上广泛分布着一类非常特 殊的d n a ：重复d n a ( r 印e t i t i v ed n a ) 。重复d n a 在结构上它包括重 复不同次数的核心模体( c o r e m o t i f ) ，根据核心模体的长度由小到大的 顺序【1 7 1 ，重复d n a 分为微卫星( m i c r o s a t e l l i t e ) 、小卫星( m i n i s a t e l l i 伦) 和卫 星( s a t e l l i t e ) d n a 。 卫星d n a 因其含大量的a 、t 碱基，浮力密度小，在c s c l 密度 梯度离心时形成一条与d n a 主带相伴的卫星带而得名。卫星d n a 硕十学何论文 重复单位很大，一般在几百至几千个碱基；它通常分布在染色体异染 色质区，具有物种的高度特异性，可用于染色体和染色体片段的鉴定。 小卫星d n a 的重复单位在几个至几十个碱基，总长度由几百至 几千碱基组成，在基因组中有上千个位点，主要分布在常染色质区的 近端粒( t e l o m e r e ) 处。 微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) ，又称短串联重复序列( s h o r d 锄 r 印e a t s ，s t r ) 或简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er 印e a t s ，s s r ) ，是一类 由几个核苷酸( 一般为1 6 个) 为重复单位簇集而成的长达几十个核 苷酸的串联重复序列，如 t g n 、 a t g n 、 g g c c n 等，可分布在整 个基因组的不同位置上。微卫星d n a 两端的序列多是相对保守而专 一的单拷贝序列，这类重复序列最大的特点是长度的高度变异性。 1 9 7 4 年s k i n n e r 就在寄居蟹中发现了重复序列( a c ) ( t g ) n ； t a u t z 和r e n z ( 1 9 8 4 ) 通过用不同微卫星d n a 与d n a 杂交，证实了许 多简单重复序列的存在；1 9 8 6 年a l i 等人首次用合成的微卫星寡核苷 酸作为探针用于人的指纹分析，这时该技术才受到重视；在1 9 8 8 年， 经j e 倚e y s 等和g a o 等人的进一步完善和发展，该技术成为新的遗传 标记技术；1 9 8 9 年，t a u t z 等几个实验室同时报道了微卫星d n a 丰 富的多态性，l i t t 等正式命名微卫星d n a 并将其作为基因标记。 1 2 2s s r 的形成原因 s s r 的形成有4 种假说【1 8 】：一是滑动假说，是指在微卫星位点上， 等位基因长度突变的产生和变异是在重复序列复制的过程中d n a 聚 合酶的滑动以及酶对被滑动链的错误修复造成的；二是不均等交换机 基丁s r a p 和i s s r 分析的拟环纹豹蛛种群遗传多样性研究 理，是指在有丝或减数分裂期间，姊妹染色体之间或者同源染色体之 间不均等交换造成的；三是重组假说，是指在转染的哺乳动物细胞中， 小卫星与微卫星表现被重组热点造成的；四是认为在d n a 聚合酶的 校对功能上，通过d n a 聚合酶的校对而产生的简单重复序列造成的。 四种假说中，滑动假说和不均等交换机理为大多数学者所接受。 1 2 3s s r 的基本结构、类型、功能 1 2 3 1s s r 的基本结构 s s r 是短的串联的重复序列，由核心序列和两侧的侧翼序列【1 9 1 构成。它的核心序列是有1 6 个核苷酸，如( c a ) n 、( c a g ) n 等重 复l o 一2 0 次的首尾相连的串联重复序列；通常微卫星核心序列的重复 数与该座位的等位基因数呈正相关，序列重复次数多，其变异性就大， 该座位的等位基因数也就越多；核心序列重复数的差异就形成微卫星 的高度多态性。侧翼序列位于核心序列两侧，为保守的特异单拷贝序 列，能使微卫星特异地定位于染色体的特定部位；如果某个体基因组 中一对同源染色体相对位置上( 相同侧翼序列) 的重复单位数目相同， 该个体在该位点的基因型就是纯和的，否则就是杂和的。 1 2 3 2s s r 的类型 ( 1 ) 根据组成重复单位的核苷酸数目的不同分 微卫星d n a 可以分为：单核苷酸微卫星d n a ( 重复单位是由一 个核苷酸组成的) ，如 a 】n ；双核苷酸微卫星d n a ( 重复单位是由两 个核苷酸组成的) ，如【a - t n ；三核苷酸微卫星d n a ，如 a t t 】n ；四 核苷酸微卫星d n a ，如 a a a t 】n ；五核苷酸微卫星d n a 和六核苷酸 硕十学位论文 微卫星d n a 等。 ( 2 ) 根据重复类型的不同分 完全重复型( p e r f e c tr e p e a t s ) ：重复单元重复没有打断，如 t g 】n ； 不完全重复型( i m p e r f e c tr 印e a t s ) ：重复单元重复被打断，如 t g n c a c 一 t g 】m ；复合型( c o m p o u n dr 印e a t s ) ：邻近的串联重复序列 不同，如 t g n 【c a m 。 1 2 3 3s s r 的功能 个体基因组微卫星序列间存在差异，可以来清楚地研究个体间的 遗传关系【2 0 珑】，即每个个体各有5 0 的条带来自亲本的一方。 1 2 4i s s r 标记的原理及应用 1 2 4 1i s s r 标记的原理 在s s r 标记技术中，采用p c r 反应必须指导扩增d n a 片段两 侧序列。大多数情况下核心序列和侧翼序列并不知道，同时s s r 两 侧引物具有种的特异性，引物设计费时耗力，检测多个基因座不现实， 这样限制了p c r 的应用；锚定p c r ( a n c h o r e dp c r ) 可以解决上述障 碍。锚定简单重复序列( 锄c h o r e ds i m p l es e q u e n c er 印e a t ) 标记也称简单 重复序列间( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er 印e a ti s s r ) 标记。 i s s r 标记技术是由加拿大蒙特利尔大学的z i e t k i e w i c z 【2 3 2 5 1 等人 于1 9 9 4 年提出。它利用锚定的微卫星d n a 为引物，即在s s r 序列 的37 端和5 端加上2 4 个随机核苷酸；在p c r 反应中，锚定引物可以 引起特定引物位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序 列间d n a 片段进行p c r 扩增；所扩增的i n t e r s s r 区域的多个条带可 基丁s r a p 和i s s r 分析的拟环纹豹蛛种群遗传多样性研究 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖电泳分辨。i s s r 标记技术具有 以下特点【2 6 】： ( 1 ) 实验操作简单、快速、高效，不用构建基因文库、杂交、同 位素显示等步骤； ( 2 ) 扩增基因组d n a 可用于任何富含s s r 重复单元和s s r 广 泛分布的物种，可同时提供多位点信息以及揭示不同微卫星座位个体 间变异的信息； ( 3 ) 遗传多态性高，重复性好；i s s r 采用了较长引物( 1 7 2 4 b p ) ， 退火温度高，专一性强，与模板的结合强度高，提高了实验结果的可 重复性； ( 4 ) i s s r 标记为共显性标记，符合孟德尔遗传定律； ( 5 ) 无需知道任何靶序列的s s r 背景信息；i s s r 标记技术在引 物设计上比s s r 标记技术简单，不需知道d n a 序列就可以扩增，又 可以揭示比l 强l p 、r a p d 、s s r 更多的多态性； ( 6 ) i s s r 标记技术结合了r a p d 和s s r 标记技术的优点，耗资 少，模板d n a 用量少。 当然，i s s r 也有不足之处，具体为：p c r 扩增的适合条件需要摸 索；i s s r 为共显性标记，不能用于交配系统计算杂和度和父系分析。 1 2 4 2i s s r 标记的应用 ( 1 ) 遗传连锁图谱的构建自从k o j i m a 首次将i s s r 标记用 于构建小麦遗传连锁图谱以来，现在在玉米、小麦、马铃薯、大麦、 落叶松的遗传连锁图谱的构建已获得了成功。如p r e v o l 用i s s r 标记 硕十学位论文 构建了马铃薯品种的指纹图谱，他们将3 4 个品种的马铃薯进行实验， 仅用4 个引物进行扩增，结果2 个引物就可以区分这些品种。又如 2 0 0 3 年，易克利用野生西瓜种质p 1 2 9 6 4 3 1 为亲本，获得f 8 的重组 自交系群体，通过1 6 个s s r 引物对和5 个i s s r 引物对其扩增，建 立了1 个总长5 5 8 1 c m 、平均图距为1 1 3 c m 的遗传连锁图谱。 ( 2 ) 基因定位k o j i m a 首次以i s s r 、r a p d 标记建立了一个 包含7 个小麦品种的遗传连锁图谱，其中9 个i s s r 标记被定位在小 麦的5 条染色体上；且定位了抗枯萎病基因连锁的i s s r 标记。 r a t n 印a r k h e 等在鹰嘴豆中找到了抗镰刀菌枯萎病的i s s r 标记。g 0 1 d 等找到了小麦抗锈病基因s r 3 9 和l r 3 5 的i s s r 标记。 ( 3 ) 种质资源鉴定i s s r 标记技术应用于玉米、小麦、马铃 薯、柑橘、水稻、和葡萄等种质资源鉴定。2 0 0 2 年，邱英雄等用 i s s r _ p c r 分析鉴定了乐昌含笑的不同类型；2 0 0 3 年，孙悦报道了南 五味子和北五味子的i s s r 鉴别研究；同年，s c a r 锄。等用i s s r 标记 鉴别了柑橘体细胞杂合体。 ( 4 ) 分类、进化和遗传多样性的分析这方面的成果很多。 2 0 0 0 年，钱伟用r a p d 和i s s r 标记探讨了中国野生稻的遗传多样性； 同年，h u a j l g 等用i s s r 标记番茄属植物，发现了番茄属存在丰富的 遗传多样性；2 0 0 1 年，何予卿利用i s s r 标记研究栽培稻和野生稻的 亲缘关系；2 0 0 3 年，葛永其等进行银杏群体遗传多样性的i s s r 分析； 2 0 0 4 年，李海生等使用i s s r 标记对中国卵叶海桑进行遗传多样性研 究。 基丁s r a p 和i s s r 分析的拟环纹豹蛛种群遗传多样性研究 1 2 5s i 认p 标记的原理及应用 相关序列扩增多态性( s e q u e n c er e i a t e d 锄p l i f i e dp o