（应用化学专业论文）用酶催化氧化油脂制备香味料的工艺研究.pdf

北京工商大学硕士学位论文 摘要 脂肪氧合酶可将油脂中的亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等不饱和脂肪酸催化 氧化，生成含有氢过氧化物的油脂氧化产物。氢过氧化物易于降解生成2 己烯醛、 2 4 癸二烯醛、庚醛、壬醛等小分子挥发性成分。一方面这些挥发性成分具有青香、 叶香、油脂香或油炸香香气特征，是已经批准使用的香料；另一方面，它们还是 热反应肉味香精制备中，与氨基酸、还原糖发生反应，生成小分子杂环香料化合 物的重要前体物质，以含有2 己烯醛、2 ，4 癸二烯醛、庚醛、壬醛等小分子羰基化 合物的脂肪氧化产物结合热反应制备的肉味香精，具有肉香味浓郁、和谐、不同 种类动物肉香味突出的优点。 国外几篇专利报道了以植物油的酶催化氧化降解制各香味料的技术，但国内 相关性研究尚未见报道。油脂价廉、来源广泛，以油脂为原料采用酶催化氧化法 制备的香料化合物，绿色健康、高附加值，其工艺路线无三废、经济可行，此领 域的研究应具有较好的应用前景。 此外，有关用酶催化氧化猪脂、牛脂、鸡脂等动物脂肪及将该氧化产物进一 步参与热反应制备肉味香精方面的研究国内外还均未见报道。 本论文选题来源于国家自然科学基金项目“调控脂肪氧化一热反应形成特征 肉香味分子的机理研究”。论文研究了植物油( 葵花籽油) 酶催化氧化降解制备青香 香味料的工艺和动物脂肪( 鸡脂) 酶催化氧化一热反应制各肉味香精的工艺。 l 、葵花籽油的酶催化氧化降解工艺研究 a 脂肪氧合酶催化油脂形成氢过氧化物的反应研究 首先将葵花籽油皂化水解制备成脂肪酸，然后以从大豆中提取的含脂肪氧合 酶的粗酶液作为酶的来源，以过氧化值( p v ) 作为油脂氧化参数，通过单因素试验 和正交试验分别考察了底物脂肪酸的浓度、反应温度、粗酶液的种类、空气流速、 缓冲液p h 值等因素对所生成氧化产物的过氧化值的影响。确定了欲获得较高过氧 化值的氧化产物的较优酶催化氧化反应工艺条件：脂肪酸的浓度为8 4 9 l ，反应温 度1 0 。( 2 ，酶液选择为提取时料液比= 1 ：5 的种类，压缩空气流速0 1 2 m 3 ( h k g 脂肪) ， 缓冲液p h = 9 ； 用酶催化氧化油脂制备香味料的工艺研究 b 含有氢过氧化物的葵花籽油氧化产物的降解工艺研究 采用同时蒸馏萃取装置，使氢过氧化物在蒸馏过程中被酸催化降解，并同 时获得含有己醛等挥发性物质的萃取液。以萃取液浓缩后所得萃取物中醛类等挥 发性成分的含量作为指标，通过单因素试验考察了柠檬酸溶液加量、加热时间以 及萃取溶剂种类对降解反应的影响，确定了较优的降解条件：时间4 h ，2 0 柠檬 酸的加入量为2 5 0 9 ，溶剂为乙醚。降解产物通过萃取浓缩得到了具有青香味的香 味料，并对该香味料进行了气质联机分析。 从青椒中提取青椒裂解酶粗酶液，用青椒裂解酶催化降解。以羰基含量作 指标，通过单因素试验和正交试验分别考察了反应时间、粗酶液种类、底物r 氧化 产物) 与裂解酶的质量比等因素对降解反应的影响，确定了较优的降解工艺：时间 2 h ，裂解酶选用料液比= 1 ：3 的提取液，底物与裂解酶质量比= 1 ：1 。 i i 、鸡脂的酶催化氧化一热反应工艺研究 a 以大豆中提取的含脂肪氧合酶的粗酶液作为酶的来源，以过氧化值为指标， 通过单因素试验考察了底物( 鸡脂) 浓度对氧化反应的影响，确定了较佳的工艺：鸡 脂浓度为1 8 7 9 l 时获得反应液的过氧化值较高；氧化产物采用同时蒸馏萃取装置 在酸性条件下加热降解，所得萃取物进行了气质联机分析。 b 固定热反应配方，以特征肉味强度综合评分的方法，评价鸡脂氧化产物对 热反应产物气味的影响，得出获得具有明显鸡肉味的热反应产物的氧化鸡脂的 e v = 3 4 8 6 m m o l k g ，鸡脂的加入量占配方总量的4 0 。固定热反应条件：p h 6 0 ， 反应温度1 1 0 ( 2 ，反应时间6 0 r a i n ，通过正交试验，考察了配方中木糖、l 半光氨 酸、谷氨酸及v b l 等因素对热反应结果的影响，确定了要获得鸡肉味强度最高的 较优热反应配方为：葡萄糖1 2 9 、甘氨酸0 6 9 、丙氨酸0 6 9 、缓冲溶液7 0 9 、木 糖0 0 5 9 、l - 半光氨酸1 2 9 、谷氨酸0 2 9 、v b l 0 6 9 、鸡脂氧化产物 ( p v = 3 4 8 6 m m o l k g ) ，加入量7 6 3 9 ( 占配方总质量的4 0 ) 。 关键词：酶；氧化降解；葵花籽油；鸡脂；香料 l i 北京工商大学硕士学位论文 a b s t r a c t c a t a l y z e do x i d a t i o nb yl i p o x y g c n a s e ( l o 冷h y d r o p e r o x i d e sw e r ep r o d u c e df r o m u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ( 1 i n o l e i ca c i d ，l i n o l e n i ca c i da n da r a c h i d o n i ca c i d ) o fo i l s t h e n t h eh y d r o p c r o x i d c sw e r ec l e a v e di n t ov o l a t i l ec o m p o u n d so f2 - h e x e n a l , 2 4 - d e c a d i e n a l , h e p t a n a l ，n o n a n a la n d8 00 n t h e s ev o l a t i l ec o m p o u n d sp o s s e s sg r a s s yg r e e n , l e a f y g r e e na n df a t t yc h a r a c t e r i s t i c s w h a ti si m p o r t a n t , i nt h ep r e p a r a t i o no fm e a tf l a v o r t h r o u g ht h e r m a lr e a c t i o n ，t h eh y d r o p e r o x i d e sc 狮r e a c tw i t ha m i n oa c i d s ，r e d u c i n g s u g a r sa n dg a v eh e t e r o c y c l i cv o l a t i l e s ，w h i c hm a k et h em e a tf l a v o rm o r ef u l l - b o d i e s a n dh a r m o n i o u s t h et e c h n o l o g yo fe n z y m eo x i d a t i o no fo i l i n p r e p a r a t i o no ff l a v o r sh a sb e e n r e p o r t e db ys e v e r a lf o r e i g np a t e n t s ，b u ti nd o m e s t i cs t u d i e s ，i th a s n tb e e nr e p o r t e dy e t t h es o u r o go fo i l si s 诵d e ，a n dt h ef l a v o r sm a d eb yt h i sm e t h o da r es a f ea n dv a l u a b l e ， t h u st h er e s e a r c ho ft h i sf i e l dw i l lh a v eab e t t e rf o r e g r o u n d i na d d i t i o n ，t h em e t h o d “p r e p a r a t i o nm e a tf l a v o r i n g st h r o u g hf a t s ( s u c ha sl a r d , t a l l o w , c h i c k e nf a t ) o x i d i z e db y e n z y m ea n da d d e di nt h e r m a lr e a c t i o n h a s n tb e e nr e p o r t e dy e t t h i st h e s i si so a es e c t i o no ft h en a t i o n a l n a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o np r o j e c t - s t u d yo nt h em e c h a n i s mi nt h ed e v e l o p m e n to fc h a r a c t e r i s t i cm e a tc o m p o u n d s t h r o u g hf a to x i d a t i o n t h e r m a lr e a c t i o n ”h e r e , “o x i d a t i o no fs u n f l o w e ro i lb ye n z y m e t oo b t a i ng r e e nf l a v o r sa n do x i d a t i o no fc h i c k e nf a tb ye n z y m et op r e p a r em e a tf l a v o r “w e r em a i n l ys t u d i e d is u n f l o w e ro i lo x i d i z e db ye n z y m et oo b t a i ng r e e nf l a v o r s ( 1 ) c r u d el i p o x y g e n a s e ( l o x ) c a t a l y z e do x i d a t i o n ：f i r s tt h ef a t t ya c i dw a sm a d e f r o ms a p o n i f i c a t i o no fs u n f l o w e ro i la n dc r u d el o xw a se x t r a c t e df r o md e f a t t e d s o y b e a nf l o u r w i t ht h eo x i d a t i v es t a t ei n d i c a t e db yp e r o x i d ev a l u e v ) ，i n f l u e n c e so f f a t t ya c i d sc o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r e ，k i n d so fc r u d el o x , a i rf l o wr a t ea n db u f f e rp h v a l u ew o r e i n v e s t i g a t e db ym e a n so fs o m es i n g l e - f a c t o r t e s t sa n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s t h eo p t i m a lo x i d i z a t i o nc o n d i t i o n sw e r ef a t t ya c i d sc o n c e n t r a t i o n8 4 9 ，l t e m p e r a t u r e1 0 。c ，c r u d el o x e x t r a c t e dw i t hw ( s o y b e a n f l o u r ) ：w ( w a t e r ) = 1 ：5 f l u xo f c o m p r e s s e da i ro 1 2 m 3 ( h k gf a t ) a n db u f f e rp h = 9 i i i 用酶催化氧化油脂制备香味料的工艺研究 ( 2 ) t h eh y d r o p e m x i d e sw e r et h e r m a l l yc l e a v e du n d e ra c i dc o n d i t i o n so rm i l d l y c l e a v e db yh y d r o p e r o x i d el y a s ef l i p l 、 u n d e ra c i dc o n d i t i o n s ，o x i d i z e dp r o d u c t sw e r ec l e a v e dt h r o u g hs d ep r o c e s s w h e r eg a v ev o l a t i l ec o m p o u n d so fh e x a n a la n ds oo n b yr e c a l l so fs o m es i n g l e f a c t o r t e s t s ，f a c t o r so fc l e a v a g et i m e ，v o l u m eo f2 0 c i t r i ca c i d , k i n d so fe x t r a c t i n gs o l v e n t w e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lc l e a v a g ec o n d i t i o n sw e r e ，t i m e4 h ，2 0 c i t r i ca c i d2 5 0 9 ， a n ds o l v e n td i e t h y le t h e r f i n a l l y , t h ev o l a t i l e sw e r ea n a l y z e db yg c - m s i nt h ep r o c e s so fm i l dd e g r a d a t i o nw i t hp e p p e rl y a s e ，s o m es i n g l e f a c t o rt e s t sa n d o r t h o g o n a le x p e r i m e n t sw e r ed o n e f a c t o r so ft i m e ，k i n d so fc r u d el y a s ea n dt h er a t i oo f o x i d i z e dp r o d u c t st oc r u d el y a s e ( g ：g ) w e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r e ， t i m e2 h ，c r u d el y a s e e x t r a c t e dw i t hw ( m a t e d a l ) ：w ( 1 i q u i d ) = 1 ：3 ，t h er a t i oo fo x i d i z e d p r o d u c t st oc r u d el y a s e = l ：1 nc h i c k e nf a to x i d i z e db ye n z y m et op r e p a r em e a tf l a v o r c r u d el o xw a se x t r a c t e df r o md e f a t t e ds o y b c a nf l o u r b ym e a n so fs i n g l e f a c t o rt e s t s ， t h ec o n c e n t r a t i o no fc h i c k e nf a tw a si n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fc h i c k e n f a tw a si n1 8 7 以t h eo x i d i z e dp r o d u c t sw e r et h e r m a l l yc l e a v e di na c i dc o n d i t i o n ，a n d t h ev o l a t i l ee x t r a c t sw e r ea n a l y z e db yg c - m s e v a l u a t e db yg r a d i n gt h ec h a r a c t e r i s t i c m e a tf l a v o r , i n f l u e n c e so fo x i d a t i v es t a t ea n dq u a n t i t yo fo x i d i z e df a to nt h ea r o m ao f t h e r m a lr e a c t i o np r o d u c t sw e r ei n v e s t i g a t e dw i t ho n ef i x e dt h e r m a lr e a c t i o nf o r m u l a t i o n o b t a i n i n gc h i c k e nf l a v o rw i t ho b v i o u sc h i c k e nc h a r a c t e r i s t i c s ，t h eo p t i m a lo x i d a t i v e s t a t eo fc h i c k e nf a tw a sp v = 3 4 8 6 m m o lo x y g e n ( k gf a t ) ，( 4 0 w w ) w h a ti sm o r e ， w i t hf i x e dt h e r m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，t i m e6 0 r a i n s ，t e m p e r a t u r e1 1 0 。ca n dp hv a l u e 6 o t h ef o u rf a c t o r so fx y l o s e ，l - c y s t e i n e ，g l u t a m i ca c i da n dv j lw e r ef u r t h e r i n v e s t i g a t e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s t h ef i n a lo p t i m a lt h e r m a lr e a c t i o nf o r m u l a t i o n w e r ea sf o l l o w s ：g l u c o s e1 2 9 , g l y c i no 6 9 , a l a n i n e0 6 9 , b u f f e r7 0 9 , x y l o s eo 0 5 9 , l - c y s t e i n e1 2 9 , g l u t a m i ca c i d0 2 9 , v m0 6 9a n do x i d i z e dc h i c k e nf a t7 6 3 9m w w ) 北京工商大学硕士学位论文 k e y w o r d s ：e n z y m e ；c a t a l y z e do x i d a t i o na n dc l e a v a g e ；s u n f l o w e ro i l ； c h i c k e nf a t ；f l a v o r v 北京工商大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作所 取得的研究成果。除了文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体。 均已在文中以明确方式标明。本声明的法律后果完全由本人承担。 学位硷文作者签名：熟址臁刎年，月，7 日 北京工商大学学位论文授权使用声明 本人完全了解北京工商大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生 在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京工商大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借 阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复 制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 学位论文电子版同意提交后，可于口当年口一年口二年后在学校图 书馆网站上发布，供校内师生浏览。 学位论文作者签名：盔越2 导师签名：揭鳓魄吩勿加 北京工商大学硕士学位论文 1 1 研究背景 第一章绪论 植物的叶子、花、果实等往往散发出令人喜爱的新鲜青香香气，这种新鲜青 香香气的主要成分是己醛、己烯醛、庚醛、壬烯醛等挥发性化合物，是由植物体 内所含不饱和脂肪酸类化合物在其自身的酶系统催化下氧化降解生成的。 己醛、己烯醛、庚烯醛、壬烯醛等化合物，具有青草香、青叶香香气特征， 是调配花香香精、果香香精、肉味香精、蔬菜香精、辛香香精等多种香精产品的 常用香料，这些香料化合物目前主要通过化学合成方法得到。 随着人们对绿色健康的要求，天然香料越来越受到人们的青睐。近几年，全球 对天然香料的需求不断上升，就同一品种而言，天然级香料的市场价格远高于其 合成品。事实上，在天然植物中，己醛、己烯醛、庚烯醛、壬烯醛等化合物的含 量极低，从天然植物资源中直接获取这些成分的成本较高。而模拟植物体内的代 谢途径，人为地采用酶催化的方法使油脂中不饱和脂肪酸氧化降解形成的己醛、 己烯醛、庚烯醛、壬烯醛等青香味香料或其混合物，仍属于天然香料。油脂价廉、 来源广泛，以油脂为原料采用酶法制备的香料化合物，绿色健康、高附加值，其 工艺路线无三废、经济可行，应逐渐引起国内香料香精行业和食品行业的重视。 另外近年来，随着食品工业的发展，肉味香精作为种主要的食用香精，其 研制、开发、生产和应用在我国得到了长足的发展，并且显示了巨大的市场潜力。 肉味香精不仅能满足人们的肉味口感，富含营养，又不易致人发胖，越来越受人 们青睐。 用动物脂肪作原料，通过酶催化氧化得到氧化脂肪，再用此氧化脂肪与热反 应结合“二步法”制备的肉味香精，具有肉香味浓郁、和谐，肉的特征味突出的优 点。该技术已经逐渐受到重视，随着此项技术的深入研究，将会对肉味香精行业 的发展带来一定的推进作用。 1 1 1 油脂的酶催化氧化降解在香料制备中应用概况 在黄油、亚麻油、葵花籽油、玉米油、花生油等植物油及鸡油、鱼油等动物 脂肪中，均含有一定量的亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸。在用酶催化氧化反应制 用酶催化氧化油脂制备香味料的工艺研究 备香味料时，可将这些植物油脂或动物脂肪直接使用，或先将油脂碱性条件下皂 化，得到不同比例的亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸后，再作为酶催化反应的底物。 由于植物油中不饱和脂肪酸的含量要远远高于动物油，对以植物油或不饱和脂肪 酸为原料的酶催化氧化降解制备香味料的研究报道较多【1 叫，而针对动物脂肪的研 究报道却很少，2 0 0 4 年n a i t i n gm a 等从海藻中提取脂肪氧合酶，以鸡油为原料， 生成庚烯醛、壬醛等香味物质【1 0 l 。 1 9 9 5 年w h i t e h e a d 等【1 】以亚油酸和亚麻酸为原料，以粗大豆脂肪氧合酶结合植 物裂解酶及面包酵母，生产出己醛、己醇、3 - ( z ) 己烯1 醇、2 ( e ) 己烯醛、2 但) - 己烯1 醇。1 9 9 8 年g 盯9 0 u f i 等1 2 1 以亚油酸为原料，得到其9 亚油酸氢过氧化物， 再进一步降解生产出3 ( z ) 壬烯醛，具有黄瓜香气特征，可用于化妆品和食品中。 2 0 0 3 9 k a n g s a d a n 等1 3 】从海藻中提取脂肪氧合酶，花生四烯酸为原料，制备了1 2 花生四烯酸氢过氧化物( 1 2 h p e t e ) ，还有少量的1 5 花生四烯酸氢过氧化物 ( 1 5 一h p e t e ) ，再在裂解酶的存在下分别降解生成3 ( z ) 壬烯醛和己醛。2 0 0 4 年王辉 龙等【4 】从番茄果实中提取脂肪氧合酶，制备9 亚油酸氢过氧化物p h p o d ) ，还有少 量的1 3 亚油酸氢过氧化物( 1 3 h p o d ) 。 在采用亚油酸、亚麻酸或花生四烯酸为原料的同时，以大豆脂肪氧合酶氧化 葵花籽油、亚麻籽油等植物油制备香味料研究也发展较快。1 9 9 5 年m u l l e r 等1 5 】以葵 花籽油为原料，豆粉作为脂肪氧合酶来源，制备出1 3 亚油酸氢过氧化物 ( 1 3 h p o d ) ，然后再在番石榴叶氢过氧化物裂解酶作用下，制备出了己醛。他们还 以亚麻籽油作原料，在同样的条件下，还制备了3 ( z ) - 己烯醛。1 9 9 9 年h a e u s l e r 等【6 j 以亚麻籽油为原料，在室温下利用已成熟的紫罗兰叶子作为脂肪氧合酶来源，生 成青草味物质，该法主要产物为2 ，6 ( e ，z ) 壬二烯醛。2 0 0 2 年n o o r d e r m e e r 等【7 】以红 花油和亚麻籽油为原料，利用大豆脂肪氧合酶和紫花苜蓿裂解酶，生产己醛，根 据脂肪酸的量，得出己醛的产率为5 0 。2 0 0 2 年m a r c z v 等【8 l 以葵花油为原料，利用 大豆脂肪氧合酶和菠菜叶裂解酶在水相体系中生产己醛。底物浓度为l o o m m o l l ， 其中第一步生成1 3 亚油酸氢过氧化物( 1 3 h p o d ) 的产率为7 2 ，第二步生成己醛 的产率为5 4 。2 0 0 4 年船i e s 等【9 j 以亚麻籽油为原料，利用大豆脂肪氧合酶i ( l o x l ) 和青椒裂解酶，生成己烯醛，底物浓度为1 0 0 m m o l l ，其中第一步生成1 3 亚麻酸 氢过氧化物( 1 3 h p o t ) 的产率为6 2 ，第二步生成己烯醛的产率为3 7 ，通过水蒸 2 北京工商大学硕士学位论文 气蒸馏产物，2 ( 酚己烯醛与3 ( 分己烯醛的比例从0 2 7 升到7 8 6 。 此外，2 0 0 5 年k e r l e r 等1 1 1 1 分别以黄油、柑橘油、亚麻籽油、葵花籽油为原料， 以豆粉作为脂肪氧合酶来源，生成的油脂氢过氧化物在酸性条件下( 柠檬酸) 加热降 解，温度控制在9 0 - 1 8 0 。c ，主要得到了己醛、己烯醛、“z ) 庚烯醛、2 ) - 壬烯醛 和2 ，6 - ( e ，z ) - 壬二烯醛等挥发性物质。 而将油脂酶催化氧化产物与热反应结合制备肉味香精的研究还尚未见报道， 但脂肪在空气中加热氧化和用氧化产物与热反应结合制备肉味香精的技术已得到 很好的发展。1 9 7 7 年，日本的k i k k n o m a ns h o y oc o ( 菖字酱油公司) 【1 2 】在1 6 0 1 8 0 。c ，通空气氧化动物脂肪( 如牛脂、猪油) ，再加入酿造的酱油，制备出一种牛 肉香精。1 9 8 3 年，瑞士的雀巢( n e s t ws 九) 公司【1 3 】在8 0 1 2 0 。c ，通空气或氧气氧 化脂质物质( 如鸡肉脂肪、牛脂、猪油、鱼肝油) ，再加入含硫化合物、动物蛋白水 解物的氨基酸源等物质，加热此混合物制备出肉味香精。1 9 8 8 年，英国和荷兰的 联合利华( u n i l “c r ) 公司【1 4 】在食品中加入氧化的乳脂肪，使食品具有奶油香味。1 9 9 1 年，英国和荷兰的联合利华( u n i l c v e r ) 公司1 1 5 】在5 0 1 0 0 c ，温和氧化油脂( 如奶油 制备用油、牛油、猪油、鸡肉脂肪、花生油1 ，然后在6 0 1 8 0 c 加入碳水化合物、 含氮化合物等物质，制备出和谐的食用香精。1 9 9 3 年，西北轻工业学院应化所1 1 6 1 研究了在1 6 0 1 7 0 ，通空气氧化精炼牛油，然后再加入发酵酱油、果葡糖浆、 胱氨酸( 半胱氨酸) 等原料，利用热反应制备牛肉香精。2 0 0 1 年，中国科学院过程 工程研究所生化工程国家重点实验室和天津轻工业学院食品工程系m 研究了在 1 0 0 通空气氧化鸡肉脂肪，再加入糖、含硫化合物、氨基酸混合物于1 0 0 。c 下加 热反应2 小时，制各集肉香、脂香、烤香于一体的脂肪香精。 北京工商大学香料课题组【1 & 2 1 j 自2 0 0 3 年始，开展了对猪油、牛脂、羊脂、鸡 脂等油脂控制氧化工艺的研究，并将氧化产物与水解蛋白、氨基酸、还原糖等进 行热反应制各肉味香精。 这些研究充分说明了脂肪氧化在香味生成上很重要。h o m s t e m 和c r o w e 【恐 2 3 】 以及p c a r s o n 【2 4 】等人也发现牛肉、猪肉和羊肉中水溶性的提取物在加热时具有类似 的香味，而加热脂肪则产生特征性肉香味。动物脂肪组织除了含有脂质物质之外， 还含有少量的蛋白质、氨基酸、盐和还原糖，w a s s e r m a n 和s p i n e l l l 2 5 1 认为脂质物 质和动物脂肪中的水溶性成分对于特征香味的形成都有重要作用。 3 用酶催化氧化油脂制备香味料的工艺研究 在肉中，已经发现一些挥发性化合物能够通过脂质和m a i l l a r d 反应间的相互作 用形成。这些化合物的存在已经由w h i 伍c l d 【2 6 1 进行了研究。这些化合物是含有长 链烷基取代基( c 5 c 1 5 ) 的o - 、n - 、s - 杂环。烷基通常是由脂质氧化产生的脂肪族 醛衍生而来，氮和硫则来源于氨基酸。 1 1 2 用油脂的酶催化氧化降解法制备香味料的基本原理 油脂酶催化氧化降解分两步( 见图1 1 、图1 2 、图1 - 3 ) ，首先，油脂中的不饱和 脂肪酸在脂肪氧合酶( l i p o x y g e n a s e ，简称l o x ) 催化下生成氢过氧化物；第二步，氢 过氧化物可通过裂解酶( h y d r o p e r o x i d el y a s e ，简称h p l ) 降解生成己醛、己烯醛、 壬烯醛、壬二烯醛等挥发性成分【姗，或在酸性条件下加热降解生成戊醛、己醛、 庚醛、壬烯醛、癸醛等c 5 c - l 醛类化合物。 、 、u o o h 亚油酸 l l o x 厂 一艘曼c o o h 婴5 1 9 、二、c o o h 0 h 9 一醛基- 壬酸( z ) - 3 壬烯醛 1 2 - 醛基一( z ) - 9 十二碳烯酸 己醛 图1 - 1 亚油酸l o 舢p l 酶催化氧化降解途径 4 o 北京工商大学硕士学位论文 、同、 工；o o h 亚麻酸 j l o x 、一一l ，苎妆c o o h粤骂、= !p o o h 9 - i - i p o t | i - i p l 1 3 一h p o t 厂_ = = 二= = 厂 o h c 。、，v 、o o h 、p c h o c h o 一c o o h一：c h o 9 - 醛基_ 壬酸( z z p 卢壬二烯醛1 2 醛基( z ) - 9 十二碳烯酸( z ) - 3 己烯醛 j 异构 - o h o r e ) - 2 己烯醛 图1 2 亚麻酸l o x h v l 酶催化氧化降解途径 恿c 0 0 h 花生四烯酸 弋 ( e ) - 2 一壬烯醛 图l - 3 花生四烯酸l o x m p l 酶催化氧化降解途径 如图1 1 、1 - 2 、1 - 3 所示，亚油酸在脂肪氧合酶作用下，首先生成9 亚油酸氢过 氧化物( 9 h p o d ) 和1 3 亚油酸氢过氧化物( 1 3 h p o d ) 。亚麻酸在脂肪氧合酶作用下， 首先生成9 亚麻酸氢过氧化物( 9 h p o t ) 和1 3 亚麻酸氢过氧化物( 1 3 f i p o t ) 。花生 四烯酸在脂肪氧合酶作用下，首先生成1 2 花生四烯酸氢过氧化物( 1 2 h p e t e ) 和1 5 花生四烯酸氢过氧化物0 5 h p e t e ) 。 所生成的氢过氧化物可在裂解酶( h p u 作用下，生成短链醛和含氧酸。如图 1 - 1 、1 - 2 、1 - 3 ，h p l 降解9 氢过氧化物( 9 h p o d 和9 h p o t ) 和1 2 氢过氧化物 5 用酶催化氧化油脂制备香味料的工艺研究 ( 1 2 h p e t e ) 时，生成含有九个碳原子的化合物，3 - ( z ) 壬烯醛( 9 h p o d 、1 2 - h p e t e ) 或3 ，6 - ( z , z ) 壬二烯醛( 9 - h v o r ) ，这两种醛类均有类似黄瓜味的香气。当降解1 3 氢 过氧化物( 1 3 h p o d 、1 3 - h p o t ) 承1 1 5 氢过氧化物( 1 5 珥咖时，生成含有六个碳 原子的化合物，己醛( 1 3 h p o d 、1 5 h p e t e ) 或3 - ( z ) 己烯醛6 h p o t ) ，己醛具有清 新的香气，3 ( 砷己烯醛具有显著的青草味，而这些醛类很容易在醇脱氢酶或其它 的条件下转变成他们相应的醇，另外，这些3 ( z ) 和9 ( z ) 烯醛类在异构酶或加热的 条件下可以各自转变成它们对应的异构2 ( e ) 和1 0 - ( e ) 烯醛，所以可以根据需要调 整反应条件得到不同的香味物质i 3 , 2 7 1 。 此外，氢过氧化物在酸性加热条件下很容易分解，断裂生成各种挥发性的香 味物质和非挥发性的物质。氢过氧化物的降解涉及到o o h 的均裂，生成烷氧基自 由基和羟基自由基。烷氧基自由基在c c 键上进行降解，形成醛和乙烯基自由基或 不饱和醛和烷基自由基，进而形成挥发性的醛、烯、醇等有机化合物。通过降解 反应形成的产物取决于存在的脂肪酸及其所形成的氢过氧化物异构体的降解产物 的稳定性。由烷氧基自由基断裂生成的挥发性物质中，一些醛，特别是不饱和醛 是很重要的香味物质，许多极低含量的醛有助于许多食品的香味。中等碳链( c 5 c 9 ) 的醛有脂肪的、苦的、油腻的、青香的气味；碳数更高的醛( c l o c 1 1 ) 有柑橘 香、花香气味；c 5 c l l 的2 ( z ) 烯醛有青香、果香或脂肪香的气味【捌。 1 1 3 脂肪氧合酶的来源与制备 脂肪氧合酶( l o x ，编号为e c l 1 3 1 1 1 2 ) ，其结构中含非血红素铁，专一催化 含有顺，顺1 ，4 戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸如亚油酸( c - 8 ，2 ) 、亚麻酸( e 1 8 ：3 ) 和花 生四烯酸( c 2 0 ；4 ) 。通过对其分子内加氧，从理论上讲，氧原子可以加在脂肪酸分子 中顺，顺1 ，4 戊二烯结构的任一a 位( 见图1 - 1 、1 - 2 、1 - 3 ) ，使其形成含有共轭双健 的氢过氧化衍生物。 有关脂肪氧合酶的研究报道较多，1 9 3 2 年a n d r e 和h o u 首先发现大豆蛋白中含 有脂肪氧合酶，1 9 4 7 年t h e o r e l l 等首次从大豆中获得了脂肪氧合酶结晶，分子量为 1 0 2 k d a 。此外，在许多其它天然物如西红柿、马铃薯、芦笋、苹果、玉米、海藻、 鱼翅及一些真菌类中也发现了脂肪氧合酶的存在0 0 - 3 4 1 。但相比之下，大豆中蛋白 质含量为4 0 左右，成熟的大豆种子中l o x 含量很高，约占种子蛋白含量的 6 北京工商大学硕士学位论文 1 _ 2 1 a s ，且在大豆酶系统中，脂肪氧合酶是其活性最高的酶。为此，脂肪氧化酶 的主要来源是从大豆中提取分离的。 大豆脂肪氧合酶，可在低温下从脱脂豆柏中提取得到，提取的方法主要有水 浸提法、盐析法、共沉淀法三种。 水浸提法得到的是粗酶液。将大豆粉浸入水中，其蛋白质溶出率可达8 5 左 右，所得酶液中含有较多的杂蛋白。但此法过程比较简单，其它损失较小，得到 粗酶液的总酶活较高。蔡琨等【3 5 】用脱脂豆粉先加水搅拌，再进行离心分离，得到 粗酶液的总酶活为6 7 1 x 1 0 7u l o g 豆粕，比酶活为8 6 1 x 1 0 5u m l 粗酶液。 盐析法是一种比较古老的方法，目前仍广泛采用，它根据酶和杂蛋白在高盐 浓度下的溶解度差别进行分离纯化，最常用的盐是硫酸铵。f i n a z z i 等【3 6 j 先将脱脂 豆粉溶于1 0 0 m 镕量瓶中，用p h 6 8 的磷酸盐缓冲液润湿后满至刻度，间断性搅拌 1 5 h ，用双层纱布过滤，滤液用硫酸铵调饱和度至0 5 0 ，用0 5 0 m o l l 的氢氧化钠溶 液调至f j p h 6 8 ，静置，再用4 0 0 0 r m i n 的离心机离，t ) q o m i n ，沉淀物用1 0 0 m l 磷酸盐缓 冲盐溶解，再用硫酸铵调饱和度至0 3 0 ，p h 调至6 8 ，静置，离心分离，沉淀物即 为大豆脂肪氧合酶，在4 下保存待用。 共沉淀法，是利用离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠、非离子型聚合物如 聚乙二醇( p e g ) 等，在一定条件下与蛋白质直接或间接地形成络合物，将蛋白质沉 淀析出，然后再用适当方法将脂肪氧合酶溶解出来，除去杂蛋白和沉淀剂，使脂 肪氧合酶被纯化。p e g 无毒、溶解时放热少、形成沉淀的平衡时间短，般当p e g 的浓度达到3 0 时，就可以使大部分蛋白质沉淀出来。蔡琨【2 7 1 也曾用此法提取酶 液：脱脂豆粉加水并用l m o l l 盐酸调至p h4 5 ，搅拌5 0 r a i n ，过滤；滤液中加入5 0 的p e g 6 0 0 0 至p e g 浓度达3 0 ，继续搅拌4 0 m i n ，离心分离2 0 r a i n ，用p h9 0 ，0 2 m o l l 的硼酸盐缓冲液溶解沉淀，滤去不溶物得到酶液。利用此法得到的酶液总酶 活为2 4 1 x 1 0 7u 1 0 9 豆粕，这种提取方法，操作简便，但成本相对于盐析法较高 3 7 1 。 上述三种提取脂肪氧合酶的方法，各有一定的优缺点，直接用水浸提法，操 作简单，酶活损失少，成本最低，但粗酶液中含有较多杂蛋白，可通过盐析等方 法进行进一步提纯。二次盐析法虽然除去了l o x 中的杂蛋白，但同时也造成了l o x 的损失，总酶活下降。p e g 共沉淀法，操作也相对简便，但成本较高。综合上述 提取方法，在解决了后续酶保存及不影响催化过程的前提下，以采用水浸提法最 7 用酶催化氧化油脂制备香味料的工艺研究 为经济合理。 此外，脂肪氧合酶可采用生物合成法和化学合成法制备。生物合成法是2 0 世 纪5 0 年代后生产上开始采用；化学合成法至今仍然停留在实验室阶段。 1 1 4 不饱和脂肪酸的来源 在黄油、柑橘油、亚麻油、红花油、橄榄油、蓖麻油、豆油、葵花籽油、玉 米油、芝麻油、米糠油、棕榈油、桐油、花生油、菜籽油、棉籽油、茶籽油、椰 子油等植物油及鸡油、鱼油、牛油、猪油、鸭油、羊油等动物脂肪中，均含有一 定量的亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸p s - 4 0 ! ，如表1 - 1 所示。 表1 1 各种油脂的不饱和脂肪酸的组成 亚油酸( c 1 8 ，2 )亚麻酸( c 1 8 ：3 )花生四烯酸( c m4 ) 玉米油 葵花耔油 红花油 芝麻油 棕榈油 米糠油 亚麻油 橄榄油 桐油 蓖麻油 豆油 菜籽油 棉籽油 花生油 茶籽油 椰子油 鸡油 5 5 - 6 0 6 5 - 7 8 7 3 - 7 9 4 6 1 0 2 9 - 4 2 2 0 3 5 - 2 0 7 1 8 4 1 4 7 5 0 - 5 5 1 m 2 0 5 6 3 6 5 7 - 2 4 0 - 2 5 2 4 7 8 0 4 0 1 6 0 o _ 1 - 5 7 - 9 5 1 5 7 - 1 4 1 3 北京工商大学硕士学位论文 酶催化氧化反应中的底物不饱和脂肪酸可从上述油脂中皂化得到，因为这样 成本比较低，而且有的油脂中不饱和脂肪酸的含量十分丰富，如葵花籽油中亚油 酸含量为6 5 7 8 ，亚麻油中亚油酸含量为2 0 ，亚麻酸含量为6 0 等。 1 1 5 裂解酶的来源与制备 裂解酶( h p l ) 的来源也很多，已经在梨的果实和叶片、茶叶、辣椒果实、番茄 果实和叶片、大豆种子、西瓜种子、黄瓜果实及幼苗等1 4 “7 1 植物器官中均有发现。 植物裂解酶有一些共同特征：由2 - 3 个分子量在5 0 k d 左右的亚基组成，酶作用的最 适p h 值在5 0 7 0 之间【船】。 不同植物中含有的h p l 之间有差异。西瓜幼苗、番茄果实和叶片以及茶叶叶 片等植物组织中只存在1 3 一h p l ，梨中只有9 h p l ，而大豆种子和幼苗以及黄瓜幼 苗和果实中则同时存在两种h p 踞性，紫花苜蓿幼苗中的h p l 可以以9 h p o d 和 1 3 h p o d