（植物学专业论文）重楼属植物的组织培养和分子系统学研究.pdf

重楼属植物的组织培养和分子系统学研究 植物学专业 研究生：唐荣华指导老师：王丽 重楼属( p a r i s ) 隶属延龄草科( t r i l l i a c e a e ) ，共有2 4 个种，我国有1 9 个 种，主要分布在西南地区。本属植物是重要的中草药，在被子植物系统发育的 研究中也有着重大意义。本文从三方面对重楼属植物进行了研究：( 1 ) 对其组 织培养的条件进行了摸索；( 2 ) 通过随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 技术探讨 了重楼属植物的遗传多样性和种间关系；( 3 ) 通过i t s 区序列进行了重楼属植 物系统发育分析。 ( 1 ) 组织培养研究：以m s 培养基为基本培养基，附加不同浓度的生长 素n a a 和细胞分裂素6 b a ，对尸p o l y p h y l l a v a r oc h i n e n s i s 的不同器官进行组织 培养研究，结果表明根和茎不能诱导脱分化并形成愈伤组织，幼嫩茎关节部位 可诱导产生瘤状突起和少量愈伤组织，但生长缓慢：隐芽可离体培养成活并生 长，但不能形成正常幼苗；幼嫩块茎可诱导产生愈伤组织，但易受内生菌污染， 且愈伤组织生长缓慢，易褐化；幼叶可持久保持活力，但不易脱分化形成愈伤 组织；子房在离体培养情况下仍保持较强的活力，易膨大，可产生少量愈伤组 织。 ( 2 ) r a p d 分析：本文首次利用随机扩增多态性d n a 技术对重楼属1 0 个种和1 个变种的遗传多样性和种间关系进行了分析。1 2 个引物共扩增出8 6 条带，其中有8 2 条( 9 5 3 ) 表现出多态性，说明重楼属植物遗传多样性水平 较高。凌云重楼多态性最高( 9 0 2 ) ，长柱重楼最低( 7 9 0 ) 。用u p g m a 法构建分子系统树，聚类结果不支持在重楼属下划出侧膜胎座和中轴胎座两个 亚属。1 1 个种可划分为7 组，与形态上分组的差异在于蚤休组的五个种位于4 个不同的分支：户c r o n g q u i s t 与pp o l y p h y l l av a l r c h i n e n s i s 聚成一支，尸d a l i e n s i s 单独成一支，pu n d u l a t 括与球药隔组聚在一起，而尸m a i r e i 与花叶组聚在一起。 ( 3 ) 1 t s 区序列分析：本研究测定了15 种及变平【f ，和一种延龄草的1 1 、s 区 序列。其余5 种和西藏延龄草的i t s 区序列从g e n e b a n k 获得。2 2 个种及变种 的i t s 区序列对位排列后长度在6 3 1 6 4 0 b p 之间，其中i t s l 长度在2 4 2 2 5 0 b p 之间；5 8 s d n a 长度为1 6 铀p ，i t s 2 长度在2 2 5 2 2 7 b p 之问。序列保 守位点占7 6 4 ，变异位点占2 2 8 ，信息位点占1 4 1 ，g c 含量5 4 3 ， 转抉颠换值为2 9 。分析表明i t s 区变异主要发生在转录间隔区，i t s 2 的g c 含量和转换颠换值明显高于i t s i 。 选择延龄草和西藏延龄草为外种群，用系统发育软件m e g a 2 1 对i t s 序 列进行统计和聚类分析，结果表明：1 支持把重楼属划为三个独立的属( p a r i s , k i n u g a s a , d a i s w 口) ；i i pt h i b e t i c a 和p p o l y p h y l l av a t m i n o r 的i t s 区序列完全 相同，而后者产地重叠在前者产地范围之内，形态性状差别不大，且二者产地 存在较多过渡类型，推测后者非pp o l y p h y l l a 变种而应该是pt h i b e t i c a 的变种； i i ip p o l y p h y l l av a t y u n n a n e n s 括，pp o l y p h y l l av a t c h 招n s & ， p p o l y p h y l l av a r s m n o p h y l l a 三个变种在分子聚类树中并未与pp o f ) p 砂妇聚在一起，在形态上， 这三个变种都有其独特之处，是否应该上升到种的地位有待进一步论证。户 d a l i e n s i s 和pp o l y p h y l l av a t , y u n n a n e n s 括i t s 医序列完全相同，而二者花瓣及 叶形均相似，前者产地重叠在后者产地范围之内，推测前者为后者的变型。v pc r o n q u i s t 与户p o l y p h y l l a v a r c h i n e n s i s 亲缘关系较近。户l u q u a n e n s i s 、 pm a r m o r a t a 、pd a l i e n s i s 、p p o l y p h y l l av a t y u n n a n e n s i s 和户a x i a l i s 五个种的 亲缘关系紧密，起源相同。pd u n i a n a 属于较进化的类群，与侧膜胎座亚属 的重楼有着共同的起源。 关键词：重楼属组织培养遗传多样性分子系统学聚类分析r a p di t s t i s s u ec u l t u r ea n dm o l e c u l a r s y s t e m e t i c ss t u d i e so n p a r i s m a j o r ：b o t a n y s t u d e n t ：t a n gr o n g h u as u p e r v i s o r ：w a n gl i t h e r ea r e2 4s p e c l e si nt h eg e n u sp a r i so ff a m i l yt r i l l i a c e a ei na l l ，19o f w h i c hh a v ed i s t r i b u t i o ni nc h i n a , w i t l lt h es o u t h w e s t e r nr e g i o na st h ed i s t r i b u t i n g c e n t e l t h e y a r e i m p o t a n t c h i n e s em e d i c i n ea n d s i g n i f i c a n t f o r p h y l o g e n e t i c r e s e a r c ho f a n g i o s p e r m o u r r e s e a r c hw o r kf o c u s e do nt h r e e a s p e c t s ：t h e i n v e s t i g a t i o no f i t st i s s u ec u l t u r ec o n d r i o n s ，t h ec l a r i f i c a t i o no fi t sg e n e t i cd i v e r s i t y a n d i n t e r s p e c i e sr e l a t i o n s h i pb a s e d o nr a p d a n a l y s i sa n d t h ep h y l o g e n e t i cr e s e a r c h t h r o u g h t h ea n a l y s i so fi t s s e q u e n c e ( 1 ) t i s s u ec u l t u r e ：t a k i n gm sa st h eb a s i cm e d i u m ，w et r i e dt oc u l t u r e d i f f e r e n to r g a n so fp p o l y p h y l l av a r c h i n e n s i su n d e ras e r i e s o fn a aa n d6 b a c o n c e n t r a t i o ng r a d i e n t s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ti t ss t e ma n dr o o tp a r tc o u l dn o t d e d i f f e r e n t i a t ei n t oc a l l u s ，t h en o d eo fs t e mc o u l dp r o d u c ep r o t r u s i o na n ds o m e c a l l u su n d e ri n d u c t i o n ，b u tt h eg r o w t hr a t ew a sq u i t es l o w , w h i l et h el a t e n tb u d s c o u l dd e v e l o pi nv i t r ob u tg r e wi n t oa b n o r m a ls e e d l i n g ；c a l l u so f t h er h i z o m e p a r ti s i n d u c i b l eb u te a s yt ob ep o l l u t e db yt h es y m b i o t i cb a c t e r i a ，l e a v i n ga l o n ei t ss l o w g r o w t hr a t ea n dt e n d e n c yo fb r o w n i n g ；t h ev i t a l i t yo fs p i r ec a nm a i n t a i nv i g o r o u s f o rl o n g ，b u tw a sh a r dt od e d i f f e r e n t i a t ei n t oc a l l u s ；t h eo v a r yw a s h i g h l yv i g o r o u s a n ds w e l l a b l e ，as m a l l q u a n t i t yo f c a l l u sc o u l db ep r o d u c e df r o mi t ( 2 ) r a p da n a l y s i s ：u s i n gr a p da sm o l e c u l a rm a r k e r , w ea n a l y z e dt h e g e n e t i cd i v e r s i t ya n di n t e r s p e c i e sr e l a t i o n s h i pa m o n g10s p e c i e sa n d 1v a r i a n to f g e n u sp n r 拈w e g o t8 6g e lb a n d si nt o t a lt h r o u g h t h ep c r a m p l i f i c a t i o no f a l lt h e 1 2r a n d o mp r i m e r s ，8 2o f w h i c h ，t h a ti s ，9 5 3 ，s h o w e dt h ep o l y m o r p h i s m 户 c r o n q u i s t s h o w e dt h eh i g h e s tp o l y m o r p h i s m ( 9 0 2 ) w h i l ep f o r r e s t i is h o w e d t h e 3 l o w e s t ( 7 9 o ) s y s t e m a t i ct r e e c o n s t r u c t e d b yu p g m ad i d n t s u p p o r t t h c d i v i d e n c eo fg e n u sp a r i si n t o s u b g e n u sd a i s w aa n ds u b g e n u sp a r i s w ed i v i d e d t h e11 s p e c i e si n t o7s e c t i o n s ，w h i c hi sd i f f e r e n tf r o mt h et r a d i t i o n a lc l a s s i f i c a t i o ni n t h a tt h e5s p e c i e so f s e c t e u t h y r aw e r es e ti nf o u rb r a n c h e s pc r o n g q u i s tc l u s t e r e d w i t hp p o l y p h y l l av a rc h i n e n s i sw h i l e 尸d a l i e n s i s i sf o r m e das e p a r a t eb r a n c h p u n d u l a t e sc l u s t e r e dw i t hs e c t f a r g e s i a n a ew h i l e 户m a i r e ic l u s t e r e dw i t hs e c t m a r m o r a t a ( 3 ) i t ss e q u e n c ea n a l y s i s ：w es e q u e n c e dt h ei t sr e g i o no f15s p e c i e so r v a r i a n t si ng e n u sp a r i sa n da s p e c i e st r i l l i u mt s c h o n o s k i i t h ei t ss e q u e n c eo f t h e r e s t5p a r i ss p e c i e sa n dt r i l l i u mg o v a n i a n u mu s e di nt h ea r t i c l ew e r eq u o t e df r o m g e n b a n k t h ei t ss e q u e n c el e n g t ho ft h e s e2 2s p e c i e so rv a r i a n ta f t e ra l i g n m e n t r a n g e df r o m6 3l b pt o6 4 0 b p ，i nw h i c ht h el e n g t h so fi t s lv a r yf r o m2 4 2 b pt o 2 5 0 b p ，t h el e n g t h so f5 8 s d n aw e r ee x a c t l ya l l1 6 4 b p ，a n dt h el e n g t h so fi t s 2 v a r i e df r o m2 2 5 b pt o2 2 t o p 。7 6 4 s i t e sw e r ec o n s e r v a t i v ew h i l e2 2 8 s i t e s s h o w e dv a r i a t i o na n d1 4 1 s i t e sw e r ei n f o r m a t i v e t h eg cc o n t e n to ft h e s e q u e n c e sw a s5 4 3 t h er a t i oo ft r a n s i t i o nt ot r a n s v e r t i o ni s2 9 n l ea n a l y s i s s h o w e dt h a tt h ev a r i a t i o no fi t s r e g i o ni sc o n c e n t r a t e di ni t s la n di t s 2a n di t s 2 h a dam u c h h i g h e rg c c o n t e n tt r a n s i t i o n t r a n s v e r t i o nv a l u et h a ni t s l t r i l l i u m 捃c h o n o s m ia n dt r i l l i u mg o v a n i a n u mt a k e na so u t g r o u p w ec a r r i e d t h r o u g h t h e c l u s t e r i n ga n a l y s i s o fi t s s e q u e n c e s u n d e rt h ee n v i r o n m e n to f m e g a 2 1a n dc a n o et ot h ef o l l o w i n gs y s t e m a t i ct r e a t s ：ip a r i ss h o u l db ed i v i d e d i n t ot h r e es e p a r a t eg e n e r a ( p a r i s , k i n u g a s a , d a i s w a ) ；i if o rt h a tp p o l y p h y l l a v a t m i n o ra n d 尸t h i b e t i c ah a v et h es a i i l ei t s s e q u e n c e ，a n d t h a tt h ed i s t r i b u t i n ga r e ao f t h ep r i o ri sc o m p l e t e l yi n c l u d e di nt h el a t e r sw h e r e m a n yi n t e r m e d i a t e sc o u l db e f o u n d ，a sw e l lt h a tt h e yh a v en og r e a td i f f e r e n c ei n e o n f i g r a t i o nc h a r a c t e r s ，w e a s s u m e dt h a tt h el a t e ri sn o tav a r i a n to fp p o l y p h y l l ab u tav a r i a n to fpt h i b e t i c a ； it h e p h y l o g e n e t i ct r e es h o w e d t h a tp p o l y p h y l l av a ly u n n a n e n s i s ，pp o l y p h y l l a v a ec h i e n s i sa n dp p o l y p h y l l av a f , s t e n o p h y l l ad i d n tc l u s t e rw i mpp o t y p h y l l a t h e yh a ds p e c i a lm o r p h o l o g i cc h a r a c t e r sr e s p e c t i v e l y ，b u tt od e t e r m i n ew h e t h e r 4 t h e ys h o u l db eu p g r a d e dt os p e c i e so rn o t ，w en e e dm o i + ee v i d e n c e ；i v 户d a l i e n s i y a n d 尸p o l y p l l ay a ey u n n a n e n s i sh a dt h es a m ei t ss e q u e n c e ，s i m i l a rp e t a la n d l e a v e sa sw e l la sa no v e r l a pi nd i s t r i b u t i n ga r e a ，b a s e do nw h i c hw e p r e s u m e dt h a t t h ep r i o ri saf o r m ao ft h el a t t e r ；vp c r o n q u i s th a sac l o s eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pt o 户p o l y p h y l l av a t c h i n e n s i s ；t h e r ew a sc l o s eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pa m o n gp l u q u a n e n s i s ，pm a r m o r a t a ，pd a l i e n s h r ，pp o l y p h y l nv a ky u n n a n e n s i st o l d p a x i a l i sv hpd u n i a n ah a sah i g h e re v o l u t i v es t a t u s ，w h i c hi n d i c a t e di t sc o m m o n o r i g i nw i t ho t h e rs u b g e n u s d a i s w a s p e c i e s k e y w o r d ：p a r i s ，t i s s u ec u l t u r e ，g e n e t i cd i v e r s i t y , m o l e c u l a rs y s t e m e t i c s ， c l u d t e r i n ga n a l y s i s ，r a p d ，i t s 5 刚舌 1 概述 重楼是延龄草科t r i l l i a c e a e 中p a r i s 属植物的统称，因这类植物的机株一根 茎、一轮叶、一支花，且花萼叶状，看似两轮绿叶而得名。又因为夺属植物多 数个体的一轮叶为七片( 一般为4 1 6 片) ，在这一轮叶之上再长出枝花， 因此又称七叶一枝花。 重楼瘸植物是一类极具药用价值的植物，我国人民对此属植物药用价值的 认识已有几千年的历史，在我国古代中草药典籍中，常称之为重楼、重台、莺 楼金线、重楼一枝箭、虫蒌、三层草、蚤休、蚩休、螫休、铁灯台、七叶一枝 花、紫河车、草河车、草甘遂、自甘遂等。最早在神农本草经中就有：“蚤 休，味苦微寒，主惊痫，摇头弄舌，热气在腹中，癫疾，痈疮，阴蚀，下三虫， 去蛇毒，一名蚩休，生川谷”的叙述。据专家考证，此书中记载的蚤休即重楼 属中的华重楼( p a r i s p o l y p h y l l av a t c h i n e n s 括) 。本革纲目中，在蚤休条目 又有“紫河车，足厥阴经药也。凡本经惊痫、疟疾、瘰疠、痈肿者宜之”的记 载。在植物名实图考中，还记载了滇南土医的用法，称其“为大苦大寒， 入足太阴，治湿热、瘴、虐、下痢”，并说滇南多瘴，故为常用药。中医认为： 重楼有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬 伤、跌打伤痛、惊风抽搐等症。在民间，七叶一枝花是治疗蛇伤应用摄为厂。泛 的草药之一，般的蛇药配方中都少不了它【2 4 】。 我国的重楼属植物种类最多，主要分布于西南，但是由于本属植物自然繁 殖效率较低，生长缓慢，又由于它具有重要药用价值，民间采用量很大，加上 其根状茎又是多种中成药和新药的主要原料，因此每年的消耗远远超出了野生 重楼的生长量，使重楼资源日趋枯竭。因此，一方面非常有必要制定措施对重 楼的野生资源进行重点保护，禁止滥采乱挖，使其种质资源能得以延续；另一 方面要积极研究出快速有效的人工繁殖及栽培方法，缓解人类需求对自然资源 的压力。 另外，重楼虽为单子叶植物，但其网状叶脉，心皮多数等特征又与双子叶 植物有共同之处，植物学家都希望通过它来解决系统发育中的一些疑难问题。 2 重楼属植物研究现状 2 1 形态分类研究 重楼因子叶一枚而为单子叶植物，但其叶脉网状，心皮多数，花基数都在 4 以上，又与双予叶植物有共同之处。植物学家都希望通过它来解决系统发育 中的一些疑难问题。在单子叶植物系统中，重楼的位置也摇摆不定。重楼屈内 不同类群的特征性状常有交叉或重叠，各类型的界限常常模糊不清，敝历史上 重楼属的分类系统发生过较多的分歧和争议。1 8 8 8 年f r a n c h e t 把本属分为s e c t e u p a r i s 和s e c t e u t h y r a ( s a l i s b u r y ) f r a n c h 两个组1 “。18 9 8 年f r a n c h e t 又以p d e l a v a y if r a n e h 为模式成立了一个组s e c t p a r i s e l l a f r a n c h 【2 】。7 0 多年以后，日 本学者h h a r a 在f r a n c h e t 的基础上进行了一次调整，把本属分为三组，新成 立一个组p a r i ss e c t k i n u g a s a ( t a t e w a k ie ts u t o ) h a r a ，但把s e c t p a r i s e l l a f r a n c h 并入了s e c t e u t h y r a 内【3 j 。他们所依据的指标首先是根茎的粗细，萼片 的数目及颜色。1 9 8 3 年，a 勋砌t a j i a n 明确的根据子房、种子、果实和根茎4 个指标把重楼属划为三个独立的属( p a r i s ，k i n u g a s a ，d a i s w a ) 各属的范围与 h a m 划分的三个组一致1 ”，这样延龄草科共有四个属( t r i l l i u m ，p a r i s ，k i n u g a s a ， d a i s w 口) 。近年来有研究赞成这样的划分啦7 1 。李恒等人根据形态特征及演化趋 势为重楼属建立了新的分类系统1 3 0 , 3 1 】。新的分类系统把胎座类型作为亚属的标 志，把重楼属分为侧膜胎座亚属s u b g e n u sd a i s w a ( r a f i n e s q u e s c h r n 抛) hl i 和中轴胎座亚属s u b g e n u sp a r i s ，继而根据雄蕊轮数，假种皮的有无，果开裂 与否在亚属下分出8 个组，2 4 个种。我国分布有1 9 个种，以西南地区居多p j 。 2 2 细胞学研究 从3 0 年代开始就有人进行过重楼植物的细胞学研究。迄今为止，依据李 恒的分类系统，2 4 种重楼除缅甸重楼p a r i sb i r m a n i c ah l i 、大理重楼p a r i s d a l i e n s i sh l i 和卷瓣重楼尸卯括u n d u l a t e s 外，己对2 1 种进行了细胞学或是核 形态学的研究1 5 , 2 8 1 。 重楼的染色体倍性变异有2 x ，3 x ，4 x ，8 x ，归纳成三种类型；( 1 ) 二倍体 种。我国黄河以南的大多数种，如海南重楼p a r i sd u n n i a n al e v i ，南重楼p a r i s v i e t n a m e n s i s ( t a k h t ) h l i ，凌云重楼p a r i sc r o n q u i s t i i ( t a k h t ) h ，l i ，毛重 楼p a r i s m a i r e i l 6 v 1 ，球药隔重楼p a r i sf a r g e s i if r a n c h ，禄劝花l lr 重楼 p a r i s l u q u a n e n s & h l i ，黑籽重楼p a r i s t h i b e t i c af r a n c h ，长柱委楼p a r i s f o r r e s t i i( t a k h t ) h “，平伐重楼p a r i sv a n i o t il 6 v l ，巴山重楼p a r i s b a s h a n e n s 如w a n g e tt a n g ，以及分布于高加索地区的无瓣重楼尸甜插i n c o m p l e t a m g r a y ，和日本的日本四叶重楼尸捃t e t r a p h y l l a a g r a y ，共计十四种，占全 属种类的6 7 。说明二倍体占主要地位。( 2 ) 多倍体种。计2 种，其一为产于 欧洲至亚洲北温带的四叶重楼p a r i sq u a d r i f l i am - b i e b 2 n = 3 x ，4 x ，5 x ，6 x ，大 多数作者报道为异源4 倍体；其二为产于闩本的日本重楼p a r i s j a p o n i c a ( f r a n c h e ts a v ) f r a n c h 叵定为8 倍体，h a r a 认为是异源8 倍体1 2 ”。( 3 ) 种内多倍体。 一些二倍体中，个别居群或个体有多倍体( 3 x ，4 x ) 的发生。如多叶重楼p a r i s p o l y p h i l l as m i t h ，花叶重楼p a r i s m a r m o r a t as t e a m ，五指莲p 口r 如a x i a l & h l i ，金线重楼j p 口r 打d e l a v a y i f r a n c h ，北重楼p a r i sv e r t i c i l l a t a m b i e b 。 重楼植物的体细胞染色体数为5 ，从大到小分别命名为a ，b ，c ，d 和e 。 通常a ，b 和c 为中部或近中部着丝点染色体，d 和e 为近端或端部着丝点型 染色体【2 “。其基本核型有三种：k 2 n = 1 0 = 6 m + 4 s t 、k 2 n = 1 0 = 6 m + 2 s t + 2 t 、 k 2 n = 1 0 = 6 m + 4 t 。李恒等研究了重楼植物细胞学与地理学的关系，把其核型 归纳为三类：( 1 ) 热带核型( 4 t 型) ；( 2 ) 温带核型( 2 s t + 2 t 型) 和( 3 ) 过渡 核型( 4 s t 型) 1 2 8 , 具有4 s t 的只有巴山重楼pb a s h a n e n s 括一种。2 s t + 2 t 型包 括5 个分布于欧亚北温带的重楼：北重楼pv e r t i c i l l a t a ，无瓣重楼pi n c o m p l e t a ， 日本四叶重楼pt e t r a p h y l l a ，四叶重楼pq u a d r i f l i a ，日本重楼p j a p o n i c a 。其 它1 5 个种及其变种属于4 t 型，主要分布于我国长江以南的热带或亚热带地区。 重楼属植物染色体结构变异主要表现在：( 1 ) 杂合性。在染色体互换和重 组过程中，染色体间和染色体的臂间发生倒位、易位和不等易位等结构变异。 ( 2 ) 多态性。种内不同居群或是同一居群不同个体间，由于不同的生境条件， 受各种环境因子的影响以及自然杂交后染色体在重组时发生了一些结构上的 变异，而导致核型结构的变异形成多种细胞型。( 3 ) b 染色体。重楼植物染色 体结构变异中b 染色体( b s ) 较为活跃，2 1 种及3 变种中具有b s 的有1 1 个种 和变种，b s 数目多为1 3 个，最多可达8 个。染色体结构变异多样也反映出 重楼属植物的遗传多样性特征。 2 3 孢粉学研究 同本学者t a k a h a s h im 共研究了亚洲所产6 种7 变种的花粉”l 。韦仲新 曾对中困产的1 2 个种6 个变种( 或变型) 的花粉进行了光学显微镜、扫描电镜和 透射电镜的对比研究【2 “。研究表明它们的花粉形态特征具有许多共同之处，也 存在不同程度的差异。相同之处是：所有种类的花粉均具有远极单沟( 槽) ， 为扁球形，极面观椭圆形，左右对称。外壁结构分为覆盖层，分化明显或不明 显柱状层以及薄的基层。在外壁纹饰上随不同的种而存在一定的差异。在电镜 下可区分为穴状纹饰、网状纹饰、皱网状纹饰及芽胞状纹饰四类。多叶重楼及 其变种以及海南重楼、金线重楼、毛重楼、凌云重楼和卵叶重楼等均为穴状纹 饰；而巴山重楼、北重楼及无瓣黑籽重楼则为网状纹饰；五指莲和长柱重楼为 皱网状纹饰：日本四叶重楼及日本重楼为芽胞状纹饰。 2 4 植物化学研究 陈昌祥等从该属1 2 种植物中分离鉴定了5 0 余种化合物，主要有脂肪酸脂、 甾醇及其甙、黄酮甙、c 2 1 孕甾烷甙和c 2 7 甾体皂甙、b 蜕皮激素及多糖。其中 甾体皂甙4 h 4 种，占总化合物的8 0 以上，甾体皂甙元为螺甾烷醇类、异螺甾 烷醇类、味甾烷醇类以及变形螺甾类，都有很强的生理和药理活性 5 】。有止血、 祛痰和抑菌、镇痛镇静、抗早孕杀灭精子、抗细胞毒等作用，在临床上应用于 治疗功能性予宫出血、神经性皮炎和外科炎症以及治疗骨癌等，而且都有显著 的疗效【2 - t t l 。 2 5 组织培养研究 因为重楼属植物有着较大的药用价值，中国科学院昆明植物所于1 9 8 0 年 成立的重楼课题组企图通过重楼愈伤组织快速生长，获得有效活性成分，多年 来的实验未获得满意效果：用重楼的茎、叶、花蕾作外植体均未获得愈伤组织： 用幼芽诱导的愈伤组织生长缓慢，而且不含原植物中的皂甙，最后认为通过愈 伤组织生产重楼药用成分暂时还不可行【卯。至今尚未见到国内外有关重楼属植 物组织培养的报道，显然以现有的理论水平研究重楼属植物的组织培养是有难 度的。 9 2 6 分子系统学研究 在重楼属的分子系统学方面，国内尚未有人涉足。国外学者近年来通过r b c l 基因，m a t k 基因和r d n a 的i t s ( i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r ) 区序列分析探讨 过延龄草科的系统发育问题f 6 棚，但并未单独就重楼属植物作分子系统学研究。 因此很有必要对重楼属植物的系统学研究补充分子证据。 3 本研究目的与意义 重楼的快速繁殖是一个急待解决的问题，虽然难度较大，我们依然决定进 行组织培莠研究，希望为重楼属植物的离体快速繁殖，或通过诱导愈伤组织生 产其药用成分找到一些突破点。 重楼属的分类系统分歧和争议较多，基于r a p d 方法和i t s 序列分析常用 于较低分类阶元的研究n n 2 ，我们希望通过这两种分子手段来探讨重楼属植物 的种间关系、遗传多样性和系统发育，为其分类学、系统学和植物地理学提供 一些分子证据。 1 0 参考文献 】f r a n c h e t a m o n o g m p h l ed ug e n e r p a r i s ，m e ms o cp h i l o mc e n t e n ，p a r i s ，1 8 8 8 ，2 4 ：31 9 - 3 2 4 2f r a n c h e t a p l a n t a r u m s i n e n s i u m e c l o g es e c u n d a d o u r d eb o t 1 8 9 8 1 2 ：1 9 0 - 1 9 1 3h a r ah v a r i a t i o ni np a r i s p o & p h y a as m i t h ，w i t hr e f e r e n c et oo t h e ra s i a t i cs p e c i e s j f a c s c iu n i v t o k y o ，s e c t 3 ，b o t 1 9 6 9 ，1 0 ( 1 0 ) ：1 4 1 - 1 8 0 4 t a k h t a j a n a ，1 9 8 3 ar e v i s i o n o f d a i s w a ( t r i l i a c e a e ) b r i t t o n i a ，v 0 1 3 5 ：2 5 5 2 7 0 5 李恒重楼属植物北京：科学出版社1 9 9 8 6k a t o ，h ，t e r a u c h i ，r ，u t e c h ，f h a n dk a w a n o ，s m o l e c u l a rs y s t e m a t i c so ft h et r i l l i a c e a e s e n s ul a t oa si n f e r r e df r o mr b c l s e q u e n c ed a t a m 0 1 p h y l o g e n e t e v 0 1 1 9 9 5 ，4 ( 2 ) ：1 8 4 - 1 9 3 7k a z e m p o u ro s a l o o ，s a n dk a w a n o ，s m o l e c u l a rs y s t e m a t i c so ft r i l l i a c e a ei i p h y l o g e n e t i c a n a l y s e so ft r i l l i u ma n di t sa l l i e su s i n gs e q u e n c e so fr b c la n dm a t kg e n eo f c p d n aa n d i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r s ( i t s ) o f f8 s - 2 6 sn u c l e a rr i b o s o m a ld n a p l a n ts p e c i e sb i 0 1 1 9 9 9 1 4 ：7 5 - 9 4 8s u s a nb f a r m e ra n de d w a r d e s c h i l l i n g p h y l o g e n e t i ca n a l y s e so f t r i l l i a c e a eb a s e d o n m o r p h o l o g i c a la n d m o l e c u l a r d a t a s y s t e m a t i cb o t a n y 2 0 0 2 ，2 7 ( 4 ) ：p p 6 7 4 - - - 6 9 2 9w i l l i a m sjg k ，k u b e l 墩ar l i v a kk je ta 1 ，d n ap o l y m o r p h i s m s a m p l i f i e db ya r b i t r a r y p o t 7 7 a e sa r eu s e f u la s g e n e t i cm a r k e r s n u c l e i c a c i d sr e s e a r c h 1 9 9 0 1 8 ：6 5 3 1 - 6 5 3 5 1 0 万海清，梁明山，许介眉分子生物学手段在植物系统与进化研究中的应用植物学通 报1 9 9 8 ，1 5 ( 4 ) ：8 - 1 7 2 0d o v e rg a m o l e c u l a rd r i v e ：ac o h e s i v em o d eo f s p e c i e se v o l u t i o n n a t u r e ，1 9 8 2 ，2 9 9 ：1 11 1 1 7 】2h i l l i sm d m ，d a v i ss k r i b o s o m a l d n a ：i n t r a s p e c i f i cp o l y m o r p h i s m ，c o n c e r t e d e v o l u t i o n a n d p h y l o g e n yr e c o n s t r u c t i o n s y s tz o o l , 1 9 8 8 3 7 ：6 3 6 6 1 3马云淑，桂镜生，朱燕等滇产重楼资源及市场情况调查云南中医学院学报1 9 9 7 ， 2 0 ( 2 ) ：2 4 2 6 1 5 胡光万，刘克明，雷立公湖南重楼属植物小志生命科学研究2 0 0 2 ，6 ( 3 ) ：2 5 0 2 5 4 1 6 钟延瑜舒光明，易尚平四川重楼属药用资源研究生物资源1 9 9 8 ，z 4 0 ) ：2 0 2 2 0 6 1 7 张霄霖，刘月婵重楼的研究与应用中国中医药科技2 0 0 0 ，7 ( 5 ) ：3 4 6 3 4 7 1 8 汤海峰，赵越平蒋永培重楼属植物的研究概况1 9 9 8 ，2 9 ( 1 2 ) ：8 3 9 8 4 3 1 9t a m u r a , m n t r i l l i a c e a e i nt h ef a m i l