（生态学专业论文）餐厨垃圾厌氧发酵过程中高效乳酸菌的筛选及发酵条件优化.pdf

中国农业大学硕士学位论文 摘要 摘要 为利用餐厨垃圾生产乳酸，为餐厨垃圾寻求一种新的处理途径，同时降低乳酸的生产成本，本 课题研究了高效工程菌的分离筛选。利用选择性培养基m r s 、e l l 拙e t 从厌氧发酵的餐厨垃圾发酵 液中分离到2 1 0 株乳酸细菌，优选出8 6 株产酸量较高的乳酸细菌，其中同型发酵类型的菌株有1 5 株b 根据各菌株在葡萄糖浓度为2 0 9 l 的不添加碳酸钙的发酵培养基中，3 7 厌氧发酵4 8 h 的发 酵结果筛选出r 1 9 、r 7 6 、r 7 7 三株高效菌株。 发酵环境的p h 值在4 - 8 这个范围爽，菌株的生长旺盛。盐浓度在0 - 6 的范围内乳酸菌可以 生长，随着盐浓度的增加，各菌种的生长逐渐受到抑制。最适生长温度为3 7 各菌株对乳酸的耐 受性均可一达到1 6 以上，其中r 7 7 号菌株可以达到1 8 。当乳酸浓度在1 2 以下时，各菌株的均 能保持正常生长。 高糖发酵培养基发酵结果表明5 天后r 7 7 号菌株还原糖利用率最高，可以达到6 6 0 4 ，乳酸浓 度可以达到9 7 ，2 2 9 l ，高于其他菌株和参比菌株。餐厨垃圾发酵结果表明接种以上高效菌株可以 提高乳酸产量，3 7 厌氧发酵7 2 h 后r 7 7 的乳酸产量最高可以达到2 8 9 5 9 l ，分别比l b 和c l ( 高 1 5 4 5 和3 4 7 0 。 关键词餐厨垃圾，乳酸菌，发酵 中国农业大学硕士学位论文 a b c t r a c t a b s t r a c t i no r d e rt of i n dan e wa p p r o a c ho ft r e a t i n gf o o dw a s t e ，a n du t i l i z ei tt op r o d u c el a c t i ca c i ds ot h a t w ec a nr e d u c ep r o d u c t i o nc o s to fl a c t i ca c i d ，t h i st e x tc o n f i r m si s o l a t i o na n dp u r i f i c m i o nh i g h - e f f i c i e n c y a c i d - p r o d u c i n ge n g i n e e r i n gs t r a i n s i nt h i sp a p e r ，2 1 0s t r a i n so fl a c t i ca c i db a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o m f o o dw a s t eo fa n a e r o b i cf e r m e n t a t i o nu s i n gs e l e c t i v em e d i u m ：m r s 、e u i k e r ，a n ds c r e e n e do f8 6 s t r a i n s o f h i g h - e f f i c i e n c y l a c t i ca c i d b a c t e r i a ，a m o n g w h i c h l 5 w e r e h o m o f e r m e n t a t i o n a c c o r d i n g t o t h er e s u l to f a n a e r o b i c f e r m e n t a t i o na t 4 8 h ，w es c r e e n o f 3s t r a i n s o f h i g h - e f f i c i e n c y l a c t i ca c i d b a c t e r i a r 1 9 、r 7 6 、r 7 7 t h e c o n d i t i o n s o f f e r m e n t a t i o n w e r ea s f o l l o w s ：t e m p e r a t u r e3 7 g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n2 0 9 l , w i t h o u tt h ea d d i t i o no fc a l c i u mc a r b o n a t e t h es t r a i n sg r o ww e l lu n d e rp hf r o m4t o8 i nt h es a l i n i t yo f0 t o 6 t h el a c t o b a c i l l n sc a ng l o w w i t ht h es a l i n i t yi n c r e a s i n g , e a c hs t r a i ng r o w t hw a si n h i b i t e dg r a d u a l l y t h ee n d u r a n c eo fs t r a i n s ，w h i c h o p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s3 7 c ，t ol a c t i ca c i dr e a c ha b o v e1 6 ，o n l yl 玎7c a nr e a c h1 8 e a c hs t r a i nc a n g r o wr e g u l a rw h e nl a c t i ca c i dc o n c e n t r a t i o nl e s st h a n1 2 h i g h - g l u c o s em e d i u mf e r m e n t a t i o ni n d i c a t e dr e d u c i n gs u g a ru s ee f f i c i e n c ya n dl a c t i ca c i d c o n c e n t r a t i o no ft h er 7 7s t r a i nr e a c h e d6 6 0 4 a n d9 7 2 2 9 li nf i v ed a y s ，r e s p e c t i v e l y , w h i c hw e r e h i g h e rt h a no t h e rs t a i n sa n dr e f e r e n c es t r a i n s t h ef o o dr e s i d u ef e r m e n t a t i o nd e m o n s t r a t e dt h eh i g h e f f i c i e n c ys t r a i n si m p r o v e dl a c t i c a c i dy i e l d t h eh i g h e s ty i e l do fl a c t i ca c i do fr 7 7s t r a i n w a s 2 8 9 5 9 l i n7 2 hf e r m e n t a t i o na t3 7 。c ，w a s1 5 4 5 a n d3 4 7 0 h i g h e rt h a nl ba n dc k , r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：f o o dr e s i d u e ，l a c t o b a c i l l u s ，f e r m e n t a t i o n ， i i 独创性声明 y 9 3 9 4 4 3 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：年 月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 时间： 时间： 年月日 年月日 1 ，1 餐厨垃圾 第一章前言 随着我国经济高速发展，人民生活水平的日益提高，城市垃圾产量大幅度增加，我国城市垃 圾增长率约9 ( 王春杰等，2 0 0 5 ) ，2 0 0 3 年我国的城市生活垃圾产量已超过1 5 8 亿吨( 徐旭，2 0 0 1 ) ， 仅北京市平均每天产生的生活垃圾就有1 1 5 万吨( 赵文峰，2 0 0 6 ) 。我国历年来的垃圾积累量达 到了5 0 多亿吨，到2 0 0 2 年我国生活垃圾的总产量达到了1 6 0 0 0 万吨( 冯思静，2 0 0 6 ) 。在人民生 活水平提高的同时，餐厨垃圾数量也在不断增加，一般可达到城市生活垃圾的1 5 一2 0 ( 吴文伟， 2 0 0 3 ) 。从目前我国城市垃圾收集、运输体制现状看，适合集中处理的餐厨垃圾主要来源于餐饮 服务业、单位食堂、食品加工业等。动植物残体、餐余物是其主要成分( 李葆生，2 0 0 4 ) 。 1 1 1 餐厨垃圾的特性 餐厨垃圾以淀粉类、食物纤维类、动物脂肪类等有机物质为主要成份，具有含水率高( 水的 质量分数大于8 0 ) ( 汪群慧，等，2 0 0 4 ) ，油脂、盐分含量高，厨余垃圾中有机物含量高( 约占干物 质质量的9 5 以上) ( k e l l e y t r ，w a l k e r p m ，1 9 9 9 ) ，易腐发酵发臭等特点。尤其是在夏季，高温能 使餐厨垃圾很快发酵、腐变，产生恶臭的气体和污水。导致生活垃圾压缩站、装运点的臭味大。 与此同时垃圾运输车辆洒漏，污染马路，一直困扰附近居民，造成环境污染。 另外，一些餐厨垃圾被一些养猪户用作饲料养猪，每年上万头用餐厨垃圾喂养出的“垃圾猪 上了居民的餐桌。当人吃了用的餐厨垃圾养的猪，不但容易患上引起动物感染的1 0 余种传染性 疾病，而且病原寄生在猪的体内繁衍，以食物链的形态进入人体，易造成人体感染病毒，如口蹄 疫等。许多专家担心，“垃圾猪”随时会成为引起传染性疾病爆发的“隐形炸弹”。此外，餐厨垃圾 中的废弃油脂被一些不法分子商贩回收提炼，制成潲水油”，掺入食用油中出售，重返居民餐桌。 这种油含有大量的致癌物质。对人民的身体健康造成极大的危害。 2 0 0 4 年北京市生活垃圾治理白皮书中指出，北京“日产餐厨垃圾约1 0 5 0 吨”。白皮书还 预测，到2 0 0 8 年，北京市日产餐厨垃圾将达到1 2 0 0 吨左右，上海市日产餐厨垃圾约1 1 0 0 吨( 张 显辉等，2 0 0 6 ) 对于餐厨垃圾的处理与处置，各地都分别制定了一定的处理与管理办法。例如上 海市2 0 0 1 年出台了“餐厨垃圾处置和管理试行办法”，明确规定了“6 禁止”：将废弃食用油脂加工 后作为食用油食用或者销售：擅自从事餐厨垃圾收运、处置；将餐厨垃圾作为畜禽饲料：将餐厨 垃圾混入其他生活垃圾收运等。为规范餐厨垃圾的集中收集、运输和处理，2 0 0 4 年北京出台了餐 厨垃圾管理办法，对餐厨垃圾进行严格管理。在犬兴、朝阳、通州、海淀各建设一座餐厨垃圾集 中处理厂。 1 1 2 餐厨垃圾处理方式 目前餐厨垃圾的处理方式主要是焚烧、填埋和堆肥这三种方式。 由于餐厨垃圾具有含水量大等性质导致在垃圾焚烧过程中，餐厨垃圾不利于焚烧。龚佰勋( 龚 佰勋，2 0 0 2 ) 通过用t g a 一6 0 1 热天秤测定深圳市的城市生活垃圾燃烧过程，发现同其他生活垃圾 相比较，厨余的挥发物快速析出起点温度较低：厨余的固定炭最难燃尽。同时发现在垃圾焚烧的 过程中厨余垃圾的蒸发速率转折温度最高( 6 9 4 8 ) ，水分蒸发速率昂低0 5 4 m i n ，挥发物 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 析出阶段快速挥发起止时间最长，固定碳燃烧阶段平均燃尽速率最慢0 1 3 m i n 。廖洪强，姚强 ( 廖洪强，姚强，2 0 0 1 ) 研究发现厨余垃圾的着火温度最高( 4 6 0 。c ) 总体平均燃烧速率最低，为 5 5 0 m i n 。另外，餐厨垃圾中含有丰富的蛋白质，淀粉，维生素等营养物质。垃圾焚烧并不能 充分的利用这些有机物质。而对于填埋方式来说，同样不能有效的利用餐厨垃圾中的营养物质， 并且由于餐厨垃圾的易分解特性，导致垃圾渗滤液的大量增加。因此，对于餐厨垃圾来说填埋并 不是一项有效的处理措施。这两种方法虽然能达到无害化处理的目的，但是并不能满足垃圾处理 中的减量化与资源化的目的。同时对垃圾进行填埋和焚烧还存在着二次污染的可能性( 徐 旭2 0 0 4 ) 。 堆肥型技术则将大部分餐厨垃圾变成了有机肥料和饲料进行资源化利用。( 张显辉等，2 0 0 6 ： 粱政等，2 0 0 4 ) 餐厨垃圾用来堆肥也是一条有效的资源化处理途径。 堆肥法是将垃圾堆积在地面或蔑于某种发酵装置中，也可根据情况配入适量的粪便和粉煤灰 等作为蓬松剂( 席北斗等，2 0 0 3 ) ，利用微生物将垃圾中易降解有机物逐步降解，最终形成稳定的 腐殖质( 陈世和，1 9 9 0 ；p a r k j o n g i k ，2 0 0 2 ) 。席北斗等( 席北斗，2 0 0 1 ) 针对城市垃圾和污泥的 混合堆肥系统，应用了高效的复台微生物，即酬菌群，使垃圾加速腐熟。 韩国主要是通过微生物集中处理制取饲料，日本主要通过高温对厨余垃圾进行消毒，处理后的 垃圾直接就可作饲料，某些热带国家则充分利用太阳能来对垃圾进行消毒和蒸干水分 ( n i j m e h a b l n ，1 9 9 8 ) 。孙向军等( 孙向军，2 0 0 2 ) 通过比较高温消毒和生物处理饲料的经济性和技 术性认为高温消毒是我国餐厨垃圾处理的首选方案。中国一直有利用厨余垃圾作饲料喂养牲畜的 传统，经消毒处理的厨房垃圾也是一种成本低廉的资源化方法，消毒处理的主要方式就是以废弃 食用油对餐厨垃圾进行真空油炸。餐厨垃圾的处理新技术还包括包括制取菌体蛋白饲料，超临界 水氧化等等( 赵由才，2 0 0 2 ；孙晓红等，2 0 0 3 ) 。 日本九州工业大学的s h i r a i 等( 5 h i r a i k e i k o ，2 0 0 1 ；c i r a l ，u i s a ，2 0 0 2 ) 认为提出可以利 用餐厨垃圾进行厌氧发酵来制取乳酸。目前我国主要是哈尔滨丁业大学的汪群慧教授对此进行深 入研究( 王旭明等，2 0 0 3 ；汪群慧等，2 0 0 5 ) 。 1 2 厌氧发酵机理 1 2 1 乳酸菌生物学特性 乳酸细菌并非细菌分类学上的名词，而是对一类能利用可发酵性糖产生大量乳酸的细菌的统 称。目前在自然界中已经发现的这类细菌在分类学上至少划分有2 3 个属，包括：乳杆菌属 ( l a c t o b a c i u u s ) 、肉食杆菌属( c a r n o b a c t e r i u m ) 、双歧杆菌属( b i f i d o b a c t e r i u m ) 、链球菌属 ( s t r e p t o c o c c u s ) 、肠球菌属h t e r o c o c c u $ ) 、乳球菌属( l a c t o c o c c u s ) 、明串珠菌属杷e u c o n o s t o c ) 、 片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 、气球菌属e r o c o c c u s ) 、奇异菌属“t o p o b i u m ) 、漫游球菌属( v a g o c o c c u s ) 、 利斯特氏菌属( l i s t e r i a ) 、芽孢乳杆菌属( s p o r o l a c t o b a c i l l u 审、芽孢杆菌属( b a c i l l u 审中的少 数种、环丝菌属( b r o c h o t h i z ) 、丹毒丝菌属( e r y s i p e l o t h r i x ) 、孪生菌属( 6 e m e l l 日) 、糖球菌属 ( s a c c h a r o c o c c u s ) 、四联球菌属( t e t r a g e n o c o c c u s ) 、酒球菌属( o e b o c o c c u $ ) 、乳球形菌属 ( l a c t o s p h a e r a ) 、营养缺陷菌属“b i o t r o p h i a ) 和魏斯氏菌属( w e i s s e l l a ) 。( 金其荣，2 0 0 0 ；杨洁 彬，1 9 9 6 ；凌代文，1 9 9 9 ) 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 大多数乳酸细菌兼性厌氧，接触酶阴性，不运动，具有高度的耐酸性，可以在p h 5 的酸性 环境中生存。由于它们合成氨基酸和维生素，尤其是b 族维生素的能力差，所以其营养要求比较 苛刻。这类细菌常常存在于营养丰富的环境中，如植物、牛奶、人和动物体内。 1 2 2 发酵机理 乳酸发酵按发酵过程中生产产物的不同，可分成同型发酵及异型发酵两类，不同菌种有不同 的乳酸发酵机理，细菌发酵为厌氧或微好氧。细菌的同型发酵一般是通过糖酵解途径，异型发酵有 6 一磷酸葡萄糖酸途径和双歧途径两种。根霉发酵属好氧异型发酵，但其途径与细菌异型发酵不同， 是通过糖酵解途径，发酵产生l 一乳酸的同时产生乙醇、富马酸等，糖转化率较低。 同型发酵 同型乳酸发酵是葡萄糖经直接酵解途径( e m p 途径) 降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催 化下还原为乳酸。此发酵过程中，l m o l 葡萄糖可以生成2 m o 乳酸，理论转化率为1 0 0 。 异型发酵 异型乳酸发酵是某些乳酸细菌利用磷酸已糖途经( m 妒途径) ，分解葡萄糖为5 一磷酸核酮酸，再 经差向异构酶作用变成5 一磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶催化裂解反应，生成3 一磷酸甘油醛和乙 酰磷酸。磷酸酮解酶是异型乳酸发酵的关键酶。乙酰磷酸进一步还原为乙醇，同时放出磷酸。而 3 一磷酸甘油醛经e m p 途径后j 部分转化为乳酸，同时产生两分子a t p 。扣除发酵时激活葡萄糖消耗 的1 分子a t p ，净得1 分子a t p 。因此由葡萄糖进行异型乳酸发酵，其产酸能力比同型乳酸发酵低 一、i 。异型乳酸发酵产物除乳酸外还有乙醇、c 0 2 和a t p 。此过程l m o l 己糖生成l m o l 乙酸、i m o i 氧化碳和l m o l 乳酸，乳酸对糖的转化率只有5 0 。 双歧发酵 双歧发酵是两歧狈岐杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m b i f u t u r e ) 发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。此途径 中有两种酮解酶参予反应，即6 一磷酸果糖磷酸酮解酶和5 一磷酸木酮糖磷酸酮解酶，分别催化6 一磷 酸果糖和5 一磷酸木酮耱的裂解反应，产生乙酰磷酸、4 一磷酸赤藓耱和3 一磷酸甘油醛、乙酰磷酸。 在此发酵过程中，2 m o l 的葡萄糖可以生成2 m o l 乳酸和3 m o l 的乙酸，乳酸的转化率理论上只有 5 0 。 1 3 发酵技术 1 3 ，1 发酵工艺 目前最常采用的发酵方式是分批发酵，而采用半连续发酵和连续发酵的还较少。有研究表明， 分批发酵通常能得到更高的乳酸浓度和产量，而连续发酵通常能得到更高的乳酸体积产率 ( h o f v e n d a h lk h a g e r d a l - h a h nb ，2 0 0 0 ) ，这可能是由于连续发酵方式中基质的稀释比例高造成的。 连续发酵方式可以提高生产效率和设备利用率，减少产物抑制作用。乳酸的转化途径较为简单， 3 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 应用细胞固定化和细胞再循环技术较为方便。但约有半数的研究表明，应用固定化细胞的乳酸产 量低于游离细胞发酵，而应用细胞再循环发酵通常能得到更高的乳酸产率。 乳酸的产生会使环境的p h 值降低，对乳酸菌的活性和乳酸的产生都有严重的抑制作用。为了 减轻产物抑制作用，提高乳酸产量，发酵t 业中人们常在发酵液中加入c a c 0 a 等作中和剂，在发 酵结束后用钙盐结晶得到乳酸钙，再将乳酸钙用硫酸酸化，从而分离出乳酸。但这一传统工艺的 流程长，消耗化上原料多，且产品回收率低。通过中和的方法控制p i t 值，虽然能在一定程度上 减轻产物的抑制作用，但是乳酸盐的产生对发酵仍有抑制作用。近年来。原位分离技术( i s p i d 受到了广泛的关注它能在线移去发酵产物乳酸，有助于消除产物抑制作用，简化提取工艺，提 高产品回收率。 1 3 2 发酵廉料 人类采用发酵工艺制各l 一乳酸始于2 0 世纪初，早期人们研究l 一乳酸发酵的原料主要是糖类， 如：葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜( j o s emm o n t e a g u d o ，1 9 9 7 ) 等作为碳源。之后，为降低 原料成本，出现了用淀粉质原料如大米、大豆、小麦粉( s u n h o o nk w o n ，2 0 0 0 ) 及工业淀粉如玉 米淀粉、马铃薯淀粉、甘薯淀粉( r a n u r a d h a ，1 9 9 9 ) 发酵生产l 一乳酸的研究。结合环境保护， 国内外开展了利用有机废弃物为原料的乳酸发酵研究，如利用造纸工业污泥、渔业加工废弃物、 食品加工废弃物，林业生产废弃物( 李梦琴，2 0 0 1 ) 等。利用工农业及生活废弃物作为原料制备 l 一乳酸，一方面可以解决环境污染问题，使废弃物得到资源化利用：另一方面可降低乳酸生产成 本，因此成为目前研究的热点，且具有良好的发展前景。 利用可再生资源生物发酵制取乳酸常采用的原料为富食淀粉、纤维素、半纤维素、木质素等 可降解的聚糖类物质( 郭开宁，2 0 0 0 ) 。通常分为2 个阶段进行。第1 阶段为预处理。先采用物理 方法对原料进行机械粉碎与筛分，或加入酸、碱、次氯酸钠等试剂，以降低其结晶性。再利用生物 或化学方法进行水解，将原料转化为能够被乳酸菌利用的糖类物质( 主要为葡萄糖) ( 夏黎 明，1 9 9 9 ) 。第2 阶段为乳酸发酵阶段。即指在乳酸菌的作用下，将糖类物质进一步转化为乳酸。 自然界中可以产生乳酸的微生物很多，但产乳酸能力强，能应用到工业中的只有乳秆菌和霉 菌中的根霉菌。乳酸菌的生长特点是产酸迅速、副产物少、营养要求简单、耐高温。良好的发酵 条件可以避免杂菌污染，加速发酵过程，提高产率，便于产物提取。如果能够选取适当的菌种将糖 类物质发酵转化成乳酸，其转化率可达到9 0 以上( 李艳，1 9 9 7 ) 。所以，采用可再生资源生物发酵 生产乳酸在技术上是可行的( 赵鹏，2 0 0 5 ) 。关键在丁原料预处理阶段水解效率的提高和发酵阶 段高产乳酸菌株的培养。 1 3 3 菌种 根据乳酸细菌代谢葡萄糖的方式，可以将乳酸发酵分为3 种方式，即同型乳酸发酵、异型乳 酸发酵和双歧乳酸发酵途径。其中同型乳酸发酵的末端产物只有乳酸一种，理论上乳酸的转化率 可以达到1 0 0 ，而另外两种发酵类型的乳酸转化率只有5 0 。因此应该选择同型乳酸发酵的菌种 用于乳酸的生产。 中国农业大学硕士学位论文 第- - i 前言 在工业生产上，以乳杆菌的应用最多，这是因为它具有生长速度快，乳酸生产率高，耐酸能 力强等优点，其中以德氏乳杆菌的发酵产率最高，冈此应用也最多。链球菌属中的某些种以及凝 结芽孢杆菌( b a c i l l u sc o a g u 如n s ) 等也具有较高的乳酸转化率( h o f v e n d a h lk ，1 9 9 7 ) 。除了乳酸细 菌之外，霉菌中的米根霉也是一种工业上常用的乳酸生产菌( 白冬梅等，2 0 0 2 ) 。但是因为其为 好氧菌须要通气搅拌，所以耗能大，而且糖转化率低( 陈育如，2 0 0 0 ) 。 乳酸的制各方法有发酵法和化学合成法两种，其中发酵法生产的乳酸因其没有有害物质摄 入、食用安全而在世界范围内广泛采用。适用于工业生产乳酸的菌种，一般有如下要求：一是同 型发酵类型；二是营养要求简单，成本低；三是产酸迅速，生产周期短；四是能耐高温( 减少冷 却水用量及染菌的机会) ；五是乳酸产量高。表卜1 列出了产乳酸的主要微生物( h e l a n d e r i m e t a l ，1 9 9 7 ：刘伟雄，2 0 0 1 ) 。 表1 _ 1 产乳酸的微生物 t a b l e1 - 1l a c t i c a c i dp r o d u c i n gb a c t e r i a 菌种 发酵温度 报霉菌属 米根霉 黑根霉 廿薯根霉 小麦曲根霉 u 本根霉 乳杆菌属 千酪乳杆菌属 嗜热乳杆菌 嗜酸乳杆菌 清洒乳杆菌 唾液乳杆菌 戊糖乳杆菌 木糖乳杆菌 链球菌属 嗜热链球菌 粪链球菌 乳链球菌 孢芽杆菌属 嗜热脂肪芽孢杆菌 凝结芽孢杆菌 1 3 4 营养要求 乳酸细菌能利用的碳源主要是葡萄糖等一些单糖和一些寡糖。不同种的乳酸细菌对不同碳源 的利用能力也不同，通常以葡萄糖为碳源时可以得到更高的乳酸产量，而木糖、半乳糖、阿拉伯 糖、乳糖、麦芽糖等的乳酸转化率比较低。 乳酸菌属丁- 化能异养型微生物，它们缺乏对许多有机化合物的合成能力，必须提供多种营养 物质和生长因子。乳酸菌由于蛋白酶活性较弱，甚至缺乏必要的蛋白酶，因此其适合的氮源是蛋 白水解物，如氨基酸、肽和蛋白质等。乳酸菌必须由外界提供，才能很好的生长和繁殖，没有一 种乳酸菌在仅含有葡萄糖和铵盐的纯矿物培养基上生长，它们大多需要某些维生素和氨基酸等生 长因子如核黄素、烟酸、生物素等，同时，还要添加一些无机盐和微量元素，来满足菌体的生理 需求( 杜连祥，1 9 9 9 ) 。 6 弛弘帅蚰弛蚰 婀毒； 邶瑚 蓦 蚰 睁睁睁言睁纷廿 廿纷 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 碳源 由于每一种微生物其生理特性不同，对各种碳源的利用能力差别很大，同时，不同碳源的添 加还跟最终代谢产物的合成息息相关。碳源是作为菌体自身组成成分及代谢能量的主要来源，还 是最终产物的骨架结构来源，此外。每一种微生物不仅对碳源的种类有严格的要求，最适碳源的 浓度对菌体的生长和产物的合成的影响也至芙重要( 钱铭，1 9 9 8 ) 。在乳酸发酵工业中常用的碳 源有蔗糖、糖蜜、淀粉及淀粉质原料如大米、小麦、玉米、马铃薯、红薯、木薯等水解糖、乳汁、 木材造纸的亚硫酸废液、菊粉等，其中又以淀粉质原料大米、小麦、玉米等因其来源广泛且便于 储藏、易于水解和处理等方面的优势而在乳酸发酵工业上得到广泛的应用。 氮源及生长因子 氨源是指构成微生物细胞和代谢产物中氮素营养物质。它是微生物发酵中使用的主要原料之 一。不问的微生物对不同的氯源有不同的要求，有些微生物只能利用有机氮源，有些微生物只能 利用无机氨源，而有些微生物两者都能利用。氨源还分速效氨源和缓效氮源，其最终的选择不仅 取决于微生物本身，还取决于代谢控制的虽终目的，每一种微生物不仅对氮源的种类有严格的要 求，最适氮源的浓度对菌体的生艮和产物的合成的影响也至关重要( 熊宗贵，1 9 9 5 ) 。 l o n t e a g u d oj m 等( m o n t e a g u d o j m 。1 9 9 4 ) 认为，不同乳酸菌在相同条件f 对生长因子的需 求不同，对所有的乳酸菌来说，一般都需要谷氨酸、撷氨酸和亮氨酸这三种氨基酸。但是，不同 的研究者得出的结论不尽相同，也有认为不同的乳酸菌需要的氨基酸并不完全相同。除此之外， 有的乳酸杆菌还需要各种维生素，如叶酸、烟酸；有的乳酸杆菌不需要维生素，但各种维生素对 乳酸菌生长有明显的促进作用，如吡哆醛促进干酪乳杆菌( l c a s e i ) 的生长。人们在研究生长因 子对乳酸菌生长和发酵影响的同时，积极寻找最佳的廉价氮源。已经发现添加玉米浆、甜菜糖蜜、 乳清蛋白水解液、( n l t 4 ) 2 s 0 4 这些较低廉的物质做氮源，可显著提高乳酸产量。在众多的辅料中 以酵母膏为最好。 h u j a n e nm ( h u j a n e nm ，1 9 9 6 ) 认为，培养基中酵母膏的主要作用是提供嘌呤和嘧啶碱基以 及b 族维生素。这些碱基和b 族维生素可促进乳酸菌生长和产酸。a e s c h l i m a n n a ( a e s c h l i m a n n a ， 1 9 9 0 ) 等也发现，加入酵母提取物的上清液可促进乳酸菌生物量、乳酸生产率增加，但是酵母膏 的价格高，限制了它在乳酸工业中的广泛应用。此外，培养基是菌体生长繁殖和产生有用代谢产 物的物质基础，各组分的浓度和比例要恰当，特别是碳源和氮源的比例，如果碳氮比偏小，会导 致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶：碳氮比过大，菌体繁殖数量少，从而影响产物的合成。 因此对微生物发酵来讲，应严格控制碳氮源的最适比例( h u j a n e nm 1 9 9 6 ) 。 无机盐 同型乳酸发酵中，微生物利用底物葡萄糖，通过e m p 糖降解途径合成中闻物质丙酮酸，再在 厌氧环境下合成乳酸，在删p 途径中，从葡萄糖开始，酵解全过程共有l o 步反应，整个过程需 要l o 种酶，这些酶都在细胞质中，大部分过程都需要m n “、m 9 2 + ，f e 2 + 等金属离子，它们作为 各种酶或辅酶的组成成份或是激活剂从而发挥其生理活性。因此，应在发酵培养基中添加适量的 无机盐，来满足茵体生理代谢要求。 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 3 5 调控 中和剂的选择 以代谢产物为目的的分批发酵中，p h 值的控制是至关重要的，苗体只有在最适p h 值的环境 下，才能很好的生长和进行产物的合成，在乳酸发酵过程中，e h 于乳酸不断的积累，造成发酵液 p h 不断地f 降，乳酸菌一般在p h 为5 0 以下就表现为生长变缓、产酸受到抑制，乳酸产率仅为 1 6 左右( 张龙翔，1 9 8 6 ) 。因此，在乳酸发酵工艺中，一般通过添加c a c 0 3 ，n a o h ，n h 4 0 h 来中 和产生的乳酸，以维持最适的p h 值。 发酵温度的选择 微生物的生命活动由一系列的生物化学反应组成，而这些化学反应都受温度的影响。微生物 生长的温度有一定的范围，超出该温度范围时，生长速率急剧下降。不同种类的微生物具有不同 的最低、撮高以及最适生长温度。这三个温度称为微生物生长的基本温度( 周德庆，1 9 9 1 ) 。 温度的变化对发酵过程产生的影响大致有以下两个方面：一方面是各种酶的反应速率和蛋白 质的性质，在一定范围内，随着温度的升高，发酵中酶的反应速度也增加，但有一个最适温度， 超过这个温度，酶的催化活力就下降，甚至失活。另一方面是影响发酵液的物理性质，如粘度、 基质和氧在发酵渡中的溶解度以及传递速率、某些基质的分解和吸收速率等，进而影响发酵的动 力学特性和产物的生物合成( 张克旭，1 9 9 8 ) 。因此，乳酸菌也一定存在着晟适生长温度和最适 发酵温度。 接种量的选择 接种量的高低直接影响生产菌株在发酵过程中生长繁殖及代谢产物的积累。通常，接种量较 低，菌体生长缓慢，不利。r 产物的积累：而较高的接种量可以加快菌体生长，缩短延迟期和发酵 周期。乳酸发酵从发酵动力学上讲属于偶联型发酵，是一种产物合成与底物消耗有计量关系的发 酵，菌体的生长量、底物浓度和产物的合成量这三者之间也存在计量关系，因此，在乳酸发酵的 操作过程中，应掌握最佳的接种量，以期获得高产率、高产量和高生产强度的相对统一。 发酵中氧的控制 乳酸菌大部分是兼性厌氧或微需氧菌，微生物利用葡萄糖形成丙酮酸的酬p 途径对供氧没有 严格的要求。同样微生物在有氧或无氧的状态下都能进行。下一步的分解却取决于微生物体系 内氧的有无。在有氧的条件下，丙酮酸会转化为乙酞c o a ，再经三羧酸循环和电子传递链彻底氧 化成大部分丙酮，而因在缺氧或无氧的条件下，丙酮酸不能进一步氧化成c 0 2 和h 2 0 。而是生成乳 酸、乙醇等。因此，利用乳酸菌发酵生产乳酸，同样有一个供氧控制问题。 8 1 4 研究意义与技术路线 1 ，4 1 研究意义 生物工程材料聚乳酸是以乳酸为单体经聚合制成的一类高分子材料，具有良好的生物相容性， 可生物降解吸收，强度高，可塑性加工成型。它易被自然界中的各种微生物或动植物体内的酶分解， 最终形成二氧化碳和水，不污染环境因而被认为是最有前途的可生物降解高分子材料( 梁 诚，2 0 0 l ；汪多仁，1 9 9 9 ；杨惠娣，1 9 9 6 ) 。聚乳酸作为可生物降解性材料已引起人们的重视但是 随着聚乳酸及相应共聚物研究的深入，以玉米、小麦、蔗糖、甜菜等粮食和经济作物为原料合成 聚乳酸单体乳酸的高成本问题以及高摩尔质量聚乳酸合成工艺复杂、工艺流程较长等问题让人们 不可忽视。探索新的廉价的原料来源、开发新的催化和聚合体系是解决成本问题的根本出路。 本实验研究从廉愤的原料来源入手，通过利用乳酸菌发酵餐厨垃圾来制取乳酸。既可以达到 餐厨垃圾的资源化和减量化，又可以降低聚乳酸的生产成本。 1 ，4 2 研究目标 探索条餐厨垃圾资源化的新途径，同时为乳酸生产寻找廉价原料提供参考 乳酸细菌发酵餐厨垃圾制取乳酸，为发展生物质能源开辟一条新途径。 为利用餐厨垃圾制取乳酸进行深层次的研究提供理论依据 1 4 3 研究内容 发酵餐厨垃圾的高效乳酸菌株的筛选 高效乳酸菌生物学特性研究 高教乳酸菌发酵性能验证试验 9 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 t 4 4 技术路线 2 1 引言 第二章乳酸菌的分离与筛选 通过利用乳酸菌发酵餐厨垃圾来制取乳酸。既可以达到餐厨垃圾的资源化和减量化，又可以 降低聚乳酸的生产成本。 本试验通过对垃圾理化性质进行测定，确定餐厨垃圾的基本成分，为厌氧发酵提供有效的理 论基础。同时餐厨垃圾发酵的主要菌群乳酸菌一直以来都是人们研究的热点，通过从垃圾发 酵液中分离大量的乳酸菌，可以为进一步筛选优势菌种提供必要保障。 乳酸菌的产酸类型以及其产酸性能对缩短发酵时问，提高乳酸产量等方面都具有重要影响。 因此，筛选出餐厨垃圾发酵液中的高效产酸乳酸菌对于在工业生产中提高乳酸产量是至关重要 的。因此本试验通过餐厨垃圾厌氧发酵，并从不同发酵时期的发酵液中分离出乳酸菌作为出发菌 株，通过对各个菌株的产酸能力，还原糖利用率以及对乳酸的耐受性情况等方面进行分析测试，从 而筛选出利于在大规模的工业化生产中应用的产乳酸性能高的乳酸菌株。 2 2 试验材料 2 2 1 垃圾来源 取自中国农业大学西区学生食堂生。 2 22 培养基 m r s 固体培养基( g l ) ：蛋白胨1 0 0 ，牛肉浸膏1 0 0 ，酵母提取物5 0 ，乙酸钠5 0 ，t w e e n8 0 1 0 ，柠 檬酸二铵2 0 ，k 2 h p 0 4 h 2 02 0 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 ，m n s 0 4 4 h 2 00 0 5 琼脂1 5 0 ，葡萄糖2 0 ，蒸 馏水1 l ，p h6 2 - 6 5 ，用于乳酸菌的分离和培养。 m r s 半固体培养基：用于乳酸菌的分离和培养。 液* m r s 培养基：用于菌种的培养。 e 1 1 i k e r 培养基( g l ) ：胰胨2 0 0 ，蔗糖5 0 ，酵母提取物5 0 ，n a c l l 0 0 ，明胶2 5 ，乙酸钠1 5 ， 葡萄糖5 ，o ，抗坏血酸o 5 ，乳糖5 ，0 ，蒸馏水1 l ，用于乳酸菌的分离。 p y 基础培养基：蛋白胨0 5 ，胰酶解酪肮0 ，5 ，酵母提取物1 0 ，盐溶液4 0 m l ，蒸馏水1 0 0 m l盐溶 液成分：无水c a c l 20 2 ，m g s 0 4 7 h 2 00 4 8 ，n a c i 1 o ，k 2 h p 0 4 h 2 01 0 ，n a h c 0 31 0 0 ， k h 2 p 0 4 h 2 01 0 ，蒸馏水1 l 。 p y g 培养基：p y 基础培养基内加入1 0 9 1 0 0 m l 葡萄糖，用于过氧化氢酶测定。 中国农业大学硕士学位论文第二章乳酸菌的分离与筛选 2 2 3 试验仪器 仪器设备 7 2 2 紫外光栅分光光度计 电热恒温培养箱 超净工作台 p h s - 2 5 型p h 计 2 3 试验方法 2 3 1 厨房垃圾预处理 产地 上海精密科学仪器有限公司 天津市中环实验电炉有限公司 北京昌平长城空气净化工程公司 上海精科雷磁 把新鲜的锓厨垃圾粉碎后，加入i 5 倍重量的自来水，装入密闭容器中，充入氨气，使温度保 持在3 7 。c 的条件下进行厌氧发酵。 2 3 2 垃圾理化性质测定 含水量测定 取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶，置于9 5 1 0 5 c 干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热0 5 1 o h ，取出盖好，置干燥器内冷却0 5 h ，称量，并重复干燥至恒量。称取2 0 0 1 0 o g 切碎或磨 细的样品，放入此称量瓶中，样品厚度约为5 m m 。加盖，精密称量后，置9 5 1 0 5 c 干燥箱中， 瓶盖斜支于瓶边，干燥2 4 h 后，盖好取出，放入干燥器内冷却0 5 h 后称量。然后再放入9 5 1 0 5 。c 干燥箱中干燥l h 左右，取出，放干燥器内冷却o 5 h 后再称量。至前后两次质量差不超过 2 m g ，即为恒量。 结果计算公式：x ，。竺2 二! 坠1 0 0 m 1 一m 3 式中：x 广样品中水分的含量，； m l 称量瓶和样品的质量，g ； 1 1 1 2 _ 称量瓶和样品干燥后的质量，g ； m 广称量瓶的质量，g 。 p h 值测定：使用p h s 一2 5 型d h 计进行测定 脂肪含量测定 精密称取约2 9 烘干后已测定含水量的餐厨垃圾，置于5 0 毫升大试管内，加8 毫升去离子水， 混匀后再加1 0 毫升盐酸将试管放入7 0 c 8 0 水浴中，每隔5 m i nl o m i n 以玻璃棒搅拌一次， 至样品消化完全为j r ，约4 0 m i n 5 0 m i n 。取出试管，加入1 0 r a l 乙醇，混合。冷却后将混合物 1 2 移于1 0 0 m l 具塞量筒中，以2 5 m l 乙醚分次洗试管，一并倒入量筒中。待乙醚全部倒入量筒后， 加塞振摇i m i n ，小心开塞，放出气体，再塞好，静置1 2 m i n ，小心开塞，并用石油醚乙醚等量 混合液冲洗塞及筒e 1 附着的腊肪。静置l o m i n 2 0 m i n ，待上部液体清晰，吸出上清液于已恒量 的锥形瓶内，再加5 m l 乙醚于具塞量筒内，振摇，静置后，仍将上层乙醚吸出，放入原锥形瓶 内。将锥形瓶置水浴上蒸千，置9 54 c 1 0 5 。c 烘箱中干燥2 h ，取出放干燥器内冷却o 5 h 后称量。 脂肪含量计算公式 x ；竺! 二! q 1 0 0 m 式中x 样品中脂肪含量，； m 1 镞收瓶和脂肪的质量，g ； 1 l l i 广接收瓶的质量，g ； m 一样品的质量，g ， 淀粉含量测定 样品经除去脂肪及可溶性糖类后，其中淀粉用淀粉酶水解成双糖，再用盐酸将双糖水解成单 糖，晟后按还原糖测定，并折算成淀粉。称取2 5g 样品，置丁放有折叠滤纸的漏斗内，先用 5 0i i l 】乙醚分5 次洗除脂肪( 注：如果脂肪含量少，此步骤可免) ，再用约1 0 0m l8 5 乙醇洗去 可溶性糖类，将残留物移入2 5 0 m l 烧杯内，并用5 0 1 l 水洗滤纸及漏斗，洗液并入烧杯内，将烧 杯置沸水浴上加热1 5m i l l ，使淀粉糊化，放冷至6 0 以下，加2 0i n l 淀粉酶溶液，再5 5 6 0 保温1h ，并时时搅拌( 温度过高淀粉酶的活性破坏) 。然后取1 滴此液加1 滴碘溶液，应不显 兰色，若显兰色，再加热糊化并加2 0r n l 淀粉酶溶液，继续保温，直至加碘不显兰色为止。加热 至沸，冷后移入2 5 0 m l 容量瓶中，并加水至刻度，混匀，过滤。( 此时淀粉已水解成双糖，过滤 可去除残渣和纤维素) 弃去初滤液，取5 0 i n l 滤液，置于2 5 0 m l 锥形瓶中，加5 m l6 m o l d 盐酸， 装上回流冷凝器，在沸水浴中回流1 h ，冷后加2 滴甲基红指示剂，用5 m o l l 氢氧化钠溶液中和 至中性，溶液转入1 0 0m l 容量瓶中，洗涤锥形瓶，洗液并入1 0 0m l 容量瓶中加水至刻度，混 匀备用。( 淀粉在沸水浴条件下糊化是淀粉水解的第一步反应，然后在淀粉酶的作用下，分解成 短链淀粉、糊精、麦芽糖等低聚合的糖，所以在淀粉酶解后需用酸进一步水解得到葡萄糖。) 测定按还原糖的测定方法操作。同时量取5 0l n l 水及与样品处理时相同量的淀粉酶溶液， 按同一方法做试剂空白试验。 结果计算腻x ，= 垃鲁喾x l 0 0 0 m l 1 e1 0 0 式中：x ，样品中淀粉的含量，； a ，测定用样品中还原糖的含量。m g ； a r 试剂空白中还原糖的含量，r a g ； o 9 一还原糖( 以葡萄糖计) 换算成淀粉的换算系数； m 】称取样品质量，g ； v 1 水解用样品溶液体积，m 1 ； v 厂样品定容总体积，i i l l ； v 3 _ 枷0 定用样品处理液的体积，m 1 。 蛋白质含量测定 蛋白质是含氮的有机化合物，食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨 与硫酸结合成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的 消耗量，乘以换算系数即为蛋白质含量。 精密称取试样并记录，倒入消化管( 每个样品作两个平行测定，同一批消化实验作一空白试 验) 。每个消化管加入1 5 m l 浓硫酸，同时把附在消化管壁上的试样冲入底部。放入二颗催化剂， 摇动均匀