（食品科学专业论文）检测氨基甲酸酯类农药生物传感器的研制.pdf

检测氨基甲酸酯类农药生物传感器的研制 摘要 本文主要对检测氨基甲酸酯类农药生物传感器进行了研究，所研 制的生物传感器以乙酰胆碱酶酶为敏感率孝料，c h l 8 0 0 电化学分析系 统为支持系统组合而成。生物传感器工作原理基于氨基甲酸酯类农药 对乙酰胆碱酯酶特异性抑制研制而成。这为现场快速检测农药的需要 提供了研究基础。 本文包括以下研究内容： 电极反应机理初步研究，用循环伏安法和线性扫描伏安法对胆碱 酯酶催化产物硫代胆碱在玻碳电极表面氧化的电极反应过程机理进 行了初步研究。硫代胆碱的特征氧化电位为0 7 v ，在玻碳电极表面 的电极反应过程是一个具吸附性不可逆的过程。 本文以戊二醛为交联剂，牛壶清白蛋白为保护荆，将乙酰胆碱酯 酶固定在活化的薄膜上。研究了固定化酶量、戊二醛浓度、牛血清白 蛋白浓度、固定化时间和温度对固定化酶片活力的影响；实验结果表 明，腮碱酯酶最佳固定化条件为：乙酰腿碱酯酶用量i o u ，5 戊二 醛1 0 妊l ，1 牛血清自蛋白3 0 ul ，以o 4 5um 孔径的硝酸纤维素滤 膜作载体，4 。| c 固定8 小时，可获彳导活力高的隧定化酶片。不同批次 固定的酶片，其活力值相对标准偏差在5 2 0 6 7 1 之间，固定化 酶片在o 1 m o l l 磷酸盐缓冲溶液( p h 8 o ) 中4 。c 下可保存3 周。 将所制得的固定化酶片与玻碳电极复合制备了测定氨基甲酸酯 类农药的生物传感器，本文选择了一群目魏正在中国广泛使用的氨基 甲酸酯类农药甲萘威作为对象，该生物传感器对予甲萘威的响应 灵敏，采用此传感器进行检溅，绘制了将该传感器应餍予甲蔡威检测 时的标准曲线。萁对甲蔡威的定量检出浓度范围在0 1 1 0 0 m g l 之 间，在此范猛内，甲萘威对乙酰胆碱酶酶的百分乎 | 】制率与其浓度的对 数值具有良好的线性关系，线性相关系数为o 9 9 3 1 ，测定蘸维因的检 测限达o 1 l m 。j l 。 生物传感器法检测蔬菜中甲茶威含量与气相色谱法相比，准确率 高、方法简便快速，分析周期短。该传感器在检测蔬菜、水柒等农产 品中残舞甲萘威方面有着良好的应用前景。 关键词：乙酰胆碱赡酶，生物传感器，氨基甲酸酯类农药 a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e b a s e db i o s e n s o re l e c t r o d e sf o r c a r b a m a t e p e s t i c i d ed e t e c t i o n a b s t r a c t t h i sp a p e rp r e s e n t st h ec o n s t r u c t i o no fa m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r sf o r t h eh i g h l ys e n s i t i v i t yd e t e c t i o no fc a r b a m a t ei n s e c t i c i d e sb a s e do nt h e i n h i b i t i o no fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) t h eb i o s e n s o r p r o v i d e d a p r o m i s i n gw a yt od e t e c tc a r b a m a t ep e s t i c i d e so n f i n ew h i c hw a sb o t h r a p i da n ds i m p l e t h e r ea r es o m es e c t i o n si nt h i sp a p e ra sb e l o w ： t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro ft h i o c h o l i n er e l e a s e df r o mt h e e n z y m a t i ch y d r o l y s i so fa c e t y l t h i o c h o l i n ew a se x a m i n e d t h em e c h a n i s m o fe l e c t r o c a t a l y s i so nt h es u r f a c eo ft h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ew a s s t u d i e di nc y c l i cv o l t a m m o g r a ma n dl i n e a rs w e e pv o l t a m l n o g r a m 。t h e p r o d u c to ft h ee n z y m a t i cr e a c t i o n ，t h i o c h o l i n e ，i se l e c t r o c h e m i c a l l ya c t i v e a n di su s u a l l yd e t e c t e da m p e r o m e t r i c a l l ya t7 0 0 m v s t u d y o ni m m o b i l i z a t i o nm e t h o do fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s e u s i n g g t u t a r a l d e h y d ea sac r o s s l i n k i n ga g e n ta n db o v i n es e r u ma l b u m i na sa p r o e c t a n t ，a l li m m o b i l i z a t i o nm e t h o do fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s ei sd e v e l o p e d t h ei m p o r t a n tf a c t o r sa f f e c t i n gi m m o b i l i z a t i o na r ee x p l o r e ds u c ha st h e c o n c e n t r a t i o n o fg l u t a r a l d e h y d ea n db o v i n es e r u ma l b m n i na n dt h e a m o u n to fi m m o b i l i z a t i o ne n z y m e ，a n dt h e o p t i m u mc o n d i t i o n sa r e o b t a i n e d t h eb e s ti l m n o b i f i z a f i o nc o n d i t i o n sa r e ：1 0 uo f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ，1 0 u lo f5 g l u t a r a l d e h y d e ，3 0 u lo f l b o v i n e s e r n ma l b u m i n ，4 ，8 h ，a n dac e l l u l o s en i t r a t em e m b r a n ef i l t e rw i t hap o r e s i z eo f0 4 5 u ma st h ec a r r i e rm e m b r a n e t h ea c t i v e t yo fe n z y m e m e m b r a n e s p r o d u c e d i n d i f f e r e n tb a t c h e si s q u i t e s i m i l a r ( 5 2 0 一6 7l ) ，a n d t h em e m b r a n e si ss t a b l ef o r3 w e e k si n 0 1 m o l lp h o s p h a t eb u f f e r ( p h 8 0 ) a t4 an o v e lb i o s e n s o rf o rd e t e c t i o nc a r b a r m a t ep e s t i c i d e sw a st h eg l a s s y c a r b o nc o m b i n e dw i t he n z y m em e m b r a n e s c a r b a r y l ，aw i d e l yu s e d c a r b a m a t e s p e s t i c i d en o w a d a y si nc h i n a ，w a sc h o s e na s t h e s u b j e c t i n v e s t i g a t e d w i t ht h eb i o s e n s o ra sm e n t i o n e db e f o r e ，t h er e s p o n s eo ft h e b i o s e n s o rt oc a r b a r y li ss e n s i t i v e t h ec a l i b r a t i o n c u r v e ，w h i c hh a sa q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o nr a n g ef r o m0 。1 t ol o o m g l i nt h er a n g eo f 0 1 一l o o m g l ，t h ep e r c e n t a g ei n h i b i t i o no fc a r b a r y lt o w a r d sa c h ei s l i n e a r l yr e l a t e st ot h el o g a r i t h m i cv a l u e so fc a r b a r y lc o n c e n t r a t i o nw i t ha c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to fo 9 9 3 1a n dad e m c t i o nl i m i to fo 1l m g lt h e s e n s o rp o s s e s s e sg o o dp r o s p e c t si nt h e a p p l i c a t i o n so fd e t e c t i n g t h e r e s i d u eo fc a r b a m a t e p e s t i c i d e s i n a g r i c u l t u r a lp r o d u c t s ，s u c h a s v e g e t a b l e so rf r u i t se t c 。 k e y w o r d s ：a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) ， c a r b a m a t e p e s t i c i d e s ， b i o s e n s o r s 学位论文独创性声明及使用授权声明 论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 遗行研究工作所取得的成果。除文中已经注躜弓l 惩的内容外，本论文 不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果。对本论文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示了谢 意。 学位论文作者签名幺遂型日期 泖c i 、岱 学位论文使用授权声明 本人完全了熊上海水产大学有关保留、使用学位论文的规定，箴 意学校保留并向有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被壹阆和借阆。本人授权上海水产大学将本学位论文的内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复划手段和汇编学 位论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文保密日，在一年解密后适用本授权书。本学位论文 属予不保密目。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名：么垒垂型疆期 导师签名： “、f 、拶 日期逊i ：丛 上海水产大学硕士论文 第一章引言 我国建擞界上最早使用农药防治农作物有害生物的圈家之一，也是农药生产 和使用的大闰“3 。世界范围内已l 登记的农药有效成分约1 2 0 0 种，与其它各种成分混 在一起构成3 5 0 0 0 羊孛商品。我国由于幅员辽阔，地理环境和气候条件复杂，农l 乍物 品静多，瘸虫肇鼠危害种类也很多，使用的农药的种类也多。中国每年常用农药 2 0 0 张，用量2 0 万吨左右。 农药是快速、高效、经济地防治有害生物的重要武器，它在保证农业丰收， 促逮高产、优质、高效现代化农业的发展，满足人们对农副产品的需求等方舔发 挥出的突出作用是众所周知的”。农药的广泛使用在给人们带来巨大的经济效蕊的 同时，也带来了很大的负西影响，这种负丽影响随着农药使用量的增加而不断扩 大。较轻微的农药残留量，可导致多种漫性疾病，并在人体类积累和富集，进两 引发各种疾瘸。我国每年豳农药造成的食物中毒率居化学性食物中毒之首。 在我国目前生产和使用的农药中，杀虫荆占鹰很大的比例，有机杀虫剂主要可 分为四大类。第一类是阻滴漓涕、六六六为代表的有概氯杀虫荆。这类杀虫剂由 于致畸、致瘸、致突变、赢残留等缺点，已经停止生产和使用；第二类跫鬻前品 种最多，应用范围广，用爨最多的有机磷杀虫剂：第三类是氨基甲酸酯杀虫剂， 其中有些品释属于高毒农药，如呋喃丹等；第四类是拟除虫菊酯类杀虫荆，多 属中等毒性或较低毒性驰农药。近些年来，由予害虫抗药性的增强，导致了使用 农药的浓度和次数不断增加，并引起了滥用和乱用离毒、赢残留的现象，造成严 重后果，因此必须对农药加以控制，两控制农药残留危害最为广泛的方法之一就 是加强农药残留的监测力度。由此可见，农药残露检测晌重点品种为有机磷郡氨 基甲酸醋类杀虫剂。 从2 0 世纪5 0 年代超，有机磷和氨基甲酸酯两丈类高效有机杀虫剂相继出现。 1 9 9 4 年有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂占全球农药市场的5 7 以上。虽然其中一紫品 种存在毒性大的弊端，但不失为一类优良农药。但也因其品种多、应用范围广积 上海水产大学硕士论文 用量大和高毒性等特点，最容易引起食物农药残留中毒。有机磷和氨基甲酸酸类 农药在生产使用过程中可遇过消化道、呼吸道和友肤等途径进入人体，对人类产 生各种危害。农药进入人体后，营先进入矗液然后通过组织细胞膜和血赫屏障等 组织，到达作用部位丽弓 起中毒反应；长期接触农药也可引起慢性中毒。1 。 近年来食品安全越来越引起世界各国的重视，对它们的快速检测一菹是食 品卫生科学领域的研究重点，并兵有重要的临床诊断价僮。有搴几磷及氨基甲酸酯 类农药残露物的常用检测手段是色谱法、色谱一质谱联用法和波谱法，但由于仪器 复杂、价格昂贵、操作繁琐、鬻需液一液萃取或固一液萃取等前期处理过程，囡丽 难予现场使用，更不能满足现场快速检测豹需要。生物传感器由于其具有生物反 应快速、离特异性、离灵敏度豹特点为此阀题豹解决提供了一种待选方法。 1 。 生物传感器 在过去豹3 0 多年中，生物学与物理学、化学融为一体，产生了一代新的装置 一生物传感器( b i o s e n s o r ) 一个典型的多学秘交叉产物，导致了分析生物学技 术的一场革命o ，。 1 1 生物传惑器的定义等分类 生物体的发展与进化是通过与其巧境的不断交换和交流来实现的，他们收集 到的信息能够满足其生产与生存的需求谗多微生物具有独特的化学识别能力，使 他们得到营养物质，远鹰危险，人类一直梦想能具有同榉的工具一生物识别的传 感器来观察和了解其生存环境，首先人们必须模拟自然界，使用自然爨所提供的 细胞、组织、礞自质和酶等，将可潞察的事物转交为可测量的物理量，作为这种 生物模拟的结采，这一类的传感器就被称为生物传感器”3 。 随蓑近代电子技术和生物工程的快速发展，生物传感嚣的数量和种类迅速增 加。为了规范该领域，近来翻际理论稻应用化学联合会( i u p a c ) 推荐一个非鬻严 格的生物传感器定义。3 ：个生物传感器应是一个独立的、完整豹装嚣，通过利用 与换能爨保持直接空间接触的生物识别组件( 生物化学受体) ，它能够提供特殊的 定擞和半定量分析信息。 生物传感器的分类可按照生物特异性授予枧制或信号转换模式分类。按备选 上海水产大学硕士论文 生物化学受体的不同，可将生物传感器分为酶传感器、免疫传感器、组织传感器、 微生物传感器、细胞传感器等。按生物传感器与底物作用枧理的不慝，又可将传 感器分为生物催化型传感器和生物亲和型传感器。生物催化型传感器包括酶传感 器、组织传感器、微生物传感器等；两生物亲和型传感器包括免疫传感器年d d n a 传 感器等。根据生物反应产生信息的物理或化学性质，换能器通常采用电化学、光 谱、热、压电及袭面声波等技术与之糨匹配，两由此衍生出电化学生物传感器、 光生物传感器、半导体生物传感器、热生物传感器、压电晶体生物传感器等。 1 1 2 生物传癌器的发展过程 临床诊颟和发酵工业迫切需要建立各种快速分析方法，传统方法以化学法为 主，常常包括一系列繁琐操作过程，丽且周期较长，远不熊适应实际需要。6 0 年 代，酶法分析开始取代一些化学法，其特点是专一性强、灵敏度赢、操作简便， 但未能有效地缩短测定周期。此间，传感器的一大类一离子选择牲电极的研究与 开发取得了较大进震，这类电极操作简单，一般无需对样品预处理，能在数分钟 内出结累，假只限于检测无机离子”3 。 1 9 6 2 年，电化学分析专家c l a r k ”嫁接了酶法和i s e 技术，将酶与各种电化学 传感器结合起来，构成了新的分析装鬣“酶电极”( e n z y m ee l e c t r o d e ) ，这静酶 电极同时其餐酶法分析和电极法的优点，准确快速，毽它所用的酶是溶解性的， 难以重复使用。5 年以后，u d d i k e 采用了最新方法，将葡萄糖氧化酶阐定在c l a r k 氧毫极装两，当底物透入围定化酶层时，在合遥的条件下，酶即催化底物的氧化 还原反应，在反应过程中，原本溶解于酶膜中的氧气参与底物的氧化还原反应， 当氧气被漓耗时，氧气敏电擞上所检测到豹电流便下降，阑此可以间接地测量底 物的浓度，或者通过检测生成的过氧化氢以测定底物浓度。从葡l 证实了有机物无 试剂分析的可能。此后，测b o d 微生物传感器和测抗原的免疫传感器闯世了，渔 后又相继出现了细胞器传感器、细胞传感嚣和组织切片传感器，这些研究成采推 动了一个新的领域的形成。 7 0 年代末至今，分析化学、生物科学及其它相关技术科学领域的广大研究人 员对生物传感器的研究兴趣不峨增长。由于生物技术、生物电子学和微电子学不 断渗透融合，从基础理论研究、传感器制各技术、生物活性材料范围的扩大、生 上海水产大学硕士论文 物传感器种类的增加、换能器件及系统研究的深入8 “”，崴至应用范围从临床、生 化、医疗保健、药物研究、生物医学研究、环境监测、食晶工业及食品检测、添 d i ：t 齐u 、农药、工业过程控制、直至扩张到分子生物器l 串豹研制、卒孛经网络的模拟、 仿生智能器件的出现乃至生物计算橇的基础硬究等。生物传感器不孬仅仅局限于 生物反应的电化学过程，而是根锯生物学反应中产生豹各种信息( 如光效应、热 效应、场效应和质量变化等等) 来设计各种萎精密灵敏的搽测装鬣。在功能方嚣， 生物传感器已经发展到活体测定、多指标测定和联机在线测定，检测对象包括近 百种常见的生物化学物质，在临床、发酵、食品、化工和环保等方瑟显示了广泛 的应用前景。 生物传感器是一种具有较高的灵敏度和选择性的测试器件，宙予冀利用了生物 分子所特有的选择及催化性能，使其较普通的化学传感器性能更为优异。另一方 馘，应用生物传感器可能实现篱经、快速和在线分析，以l 弋替某些传统的实验室 分析手段，从而将分毒斤方法尽量篱化、使其能在实际常规测量中应用、且对操作 者的技熊要求不窝，从而与分析化学的总战略嚣标达成了一致。 1 1 。3 生物悖惑器的王作原理 生物传感器实际上蔗一种特殊的化学传感器，是用生物活性物质作识别组件， 配以适当的物理或化学信号转换器腰构成的分 斥工其。生物传感器的结构一般有 两个主要组成部分：其一是生物识别缝件( b i o r e c e p t o r ) ，是具有分子识别能力的 生物活性物质；其二是信号转换器( t r a n s d u c e r ) ，主要有电化学电极、光学检测 组件等。生物识别系统能将生物化学领域的信惑，通常为分据物的浓度，转译为 具有一定灵敏度的化学或物理输出信号。识别系统的烹要目的是提供给传感器对 被测分寄厅物具有高度选择性。两传感器的换能器部分则负责把识别系统输出的信 号通常转换为电信号“。生物传感器豹传感原理主要是待测物质经扩数作用进入 固定化生物敏感层，经分子识羽，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的亿 学或物理换能器转交成可定量和可处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，便 可知道待测物浓度。展示在图l 一1 中。 4 上海水产大学硕壹论文 识尉挥位 倚母l 炱凡秘 数掘妊理 平挽物质特异性生物被穆聪 图i - i 生物传感器工作原理 f i g1 一iw o r k i n gp r i n c i p l eo fb i o s e n s o r 被测物通过扩散进入生物敏感膜层，经分子识别，发生生化反应后，羼产生的 信息被相应的换能器转换成与被i 9 1 | | 物浓度棱关的信号。 作为生物传感器，首先必须具备毫好豹选择性，这就要求构成生物识别组件的 生物活性物质对底物有分子识别功能，邸显示出选择的亲和性。分子识别机瑗盛 接决定了后续信号转换器的类黧，是决定生物传感器性能的最关键因素。生物活 性物质豹分子识别主要与以下生化过程有关“”： ( 1 ) 酶促反应：酶是生化反应豹高效催化剂，具有高度的专一性。在反应过程中 酶与底物形成了酶一一底物复合物，此时，酶的构象对底物分予显示识别能力。 ( 2 ) 免疫化学反应：抗源是由外界入侵到体内豹异物，两抗体是该异物入经后体 内生成的一种蛋囱质。抗体与抗原形成复合物，起控制抗原的作用，即显示出对 抗原的分子识别。抗体( a b ) 与相应抗原( 船) 的反应，可表示为 a b + a g = a g a b 与酶促反应不同，通常酶只对低分子量物质有识别能力，而抗体则对离分子鬟物 质有缀强的识别能力，即使是微小的结构差异氇能做出明确的羯龌。 ( 3 ) 离子在膜土的选择传输：通常做法是将生物活性物质固定在某种膜上，形成 响应特定离子的选择性膜。在检测过程中，分体作为载体，承担了目标离子的传 送工作。 上述的分子识别机理只对分子态的生物活性物质丽言，对分予集合体、细胞 上海水产大学硕士论文 器或微生物等的分子识别则比较复杂，影响因素甚多，一般难以预示呈现选择性 的条件，必须依靠实验研究结果来确定。 1 。4 生镌活性单元的圈志化方法 生物活性单元的固定化是生物传感器得以研究开发和改进的重要技术背景。 它的围定亿技术建生物传感嚣制作的核心部分，它既要保持生物活性单元的固有 特性，又要避免童出活性单元应用上的缺陷。生物活性单元的固定化技术决定饕 生物传感器的稳定性、灵敏度和选择性等主要性能，也决定着生物传感器是否有 研究和应用价值。 圈定化酶技术是指通过化学或物理学手段将酶束缚在一定区间内，限制酶分 子在此区间内进行活跃的催化作用。豳定化酶技术是酶举研究中的叛领域。通过 麓的固定化技术，可以极大改善酶对热、强酸、强碱、有机溶剂等不够稳定的性 质，并且在反应结束后，很容易将酶与反应液分开，同时酶也可以多次馊爝，极 大地提高了酶的使用效率。 常用的固定化技术有四种：吸附法、共价法、交联法、包埋法。 吸附法”圳：吸附法是将酶分子吸附在水不溶性的载体上而使酶固定的方法。 吸附的祝理包括范德华力、离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。吸附酶分子 的稳定性依赖于上述多羊孛相互作用的加和强度以及在操作条件下保持的长久性。 吸附法是最简单、最具缀济吸引力的方法，操作简单，可供选择的载体类型多， 常用载体有无枫载体、有枫载体、有机大分子物质等。吸附过程可以间时达到缝 化和圈定化的露的，且酶失活后可重新活化樽生。吸附法分为物理吸附法和离子 交换吸附法。物理吸附法是酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。它具 有酶活性中心不易被破塥和酶高级结构变化少的特点，但这种吸附作用选择性不 强，吸附不牢，相互作用力弱，酶易脱落，很少有实用价值。离子吸附法。4 是酶 通过离子键结合于其有离子交换基的水不溶性载体，是一种电性吸附方法。该法 操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残蒸不易被破坏， 能得到酶活回收率较离的固定化酶，而且经反复使用酶失活后，载体用酸碱处理 再生，又可重新使用，但是载体与海结合力比较弱，容易受缓冲液或p 锄q 影响， 在离子强度高的条件下进行反应时，酶易脱落。 上海永产大学硕士论文 包壤法嘲：包埋法是搀酶物理包堙在多聚物内的一种方法，这种结构可以防止 酶渗出，僚底物能渗入包材内与薅接触，而酶分子本身不发生结合与偶联反应， 因而很少改变酶的高级结构，酶活潮收率较裹，所以适合于许多貉、微生物和细 胞器的圈定化，僵也有局限性，由于凝胶类物质网络空隙大小不一，也可能会使 酶分子从离分子稠络中溶去，造成酶流失，从谣使得固定化酶的活力驿低。只有 小分子可以遂过高分子凝胶的嬲格扩散，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动 力学行为的改变，也会降低酶活力。所以，用此法刽成的霞定亿酶，不能对大分 子底物的生化反应起催化作用。包埋法分为凝胶包埋法和微囊他法( 界面聚合法、 分相法、流体干燥法、流朕法) 。“。常用包壤载体有聚丙酰胺、淀粉、聚乙烯醇、 海藻酸盐、胶厥、明胶等。 载体偶联法。7 。”：这楚将酶蛋白的非必需基闭经共价健与不溶性载体结合成不 可逆的联结的方法，又称共价法。参加与载体共价结合的基团必须不是活性中心 基团，也不是参与维持酶蛋白空间结构的必需基团，否则会使制成的潮定化酶几 乎不呈现催化活力。载体必须其有在温和条件下可与酶蛋白发生偶联反应的基团， 又有一定的机械强度和较大的表嚣积。 扛匕法的优点是酶和载体间的缝合较为牢霾，在介质维成发生改变和进行反应 时都不会造成酶的脱落，这类圈定化酶一般可较长时间的反复使用，用予大量生 产及工业化较为理想，但此法操作比较复杂，条传也较剧烈，可能会内于酶分子 活性中心的官能团参与反应丽使酶分子活力降低或丧失，因此，可以用酶的可逆 抑制荆或底物封闭或牵制酶豹活性中心与必需基团，完成固定化反应后，再除去 以恢复催化活性，是研究中最活跃的一类方法。 载体含功能基团”。：芳香氨鏊、羟基、羧基、羧甲基、氨基等；与载体共价 结合的酶的功能基团有：( 1 ) 氨基( 2 ) 羧基( 3 ) 酚基( 4 ) 巯基( 5 ) 羟基( 6 ) 眯基( 7 ) 吲哚基。 共价结合法，按载体和酶之间所发生的反应不同，可分为重氮化法、溴化氰 亚胺碳酸基法、芳香烃基纯法、与戊二醛的反应偈联法、肢键结合法、硫醇一二硫 化物互换反应法、钛螯合法。“、四组分缩合反应法。”等。 交联法：利用双功能或多功能试铡，使酶分子之闻或簿蛋白与其它惰性蛋白之 上海水产大学硕士论文 闼发生交联，凝聚成网状结构，对酶进行固定。诧法与熬价结合法一样也是利用 共价键西定酶，所不同的是它不使用载体。常用的交联试剂分为“同型”双( 多) 功能试剂和“杂型”双( 多) 功能试制，其中戊二醛是应用最广泛的双功能试剂。 这类方法的优点，一是简便，二是通过控制酶分子问的化学反应，可以掌握 最终产物的颗粒大小和物理性质。但有许多酶对交联剂敏感，在交联过程中有可 能丧失活性，所以该法很少单独使用，一般与其它方法联合使用”。 袁卜l 固定纯酶方法的优缺点比较、3 ” t a b l el lc o m p a r i s o no ft h em e r i ta n ds h o r t c o m i n go ft h ei m m o b i l i z e de n z y m em e t h o d s 没有一种固定化方法能普遍适用于每一种酶。寻找合适的固定化方法和选择 榻应的载体是酶圈定化磷究的羹点。一方面载体积酶要尽可能在温和条件下操作， 另一方西要使操作相对简单，成本榴对低廉，还要保证酶活。酶经过固定后，可 用测定以下参数来判断固定化方法豹优劣以及所得固定化酶的实用性：固定化酶 的活力、固定化酶的活力回收、固定化酶的半衰期。而强前的固定化酶研究中要 么酶活不高，操作半衰期不够长，要么成本过高，不符合大工业生产的要求。 纵观生物传感器发展的历史可知，生物传感器的发展史就是圈定化技术不断改进 和完善的历史，阉定化技术的研究就是对固定化方法和生物活性载体的磺究和开 发。目前使用的固定化载体、方法或技术存在着这样或那样的问题，难于从根本 土海水产大学硕士论文 上提高生扬传感器豹稳定性、选择性、灵敏度、准确度和确应速度等牲能。因此， 使用更简单、更实用的新型固定化技术和性能更优异的载体材料以促遴固定化生 物活性单元获得更多的实际应用仍是该领域今后磺究的重要方向之。 1 。2 生物传藤器在农药监测审的应用 用于农药残嫠速测的生物传感器技术，是建立在普通生物传感器技术与农药学 槌结合基稿上的。生物传感器可根据所蠊控的分析物或发生的反应迸一步分为壹 接检测反应产生的或消耗的分卡厅物的浓度，及闰接检测生物识别缎件的抑制剂和 激活剂。而电化学换能器具有较高豹灵敏度，易微型化，能在浑浊的溶液中操作 等优势，并且所需的仪器简单、便宣，因而被广泛应用于传感器的制备中。电亿 学生物传感器就是基于此换雅器的一类生物传感器。根据电化学检测的模式不间， 又可具体分为安培登、电势爨电化学生物传感器。 农药益测中普遍应用的是酶传惑器，酶传感器技术主要是利用标靶酶，如乙酰 胆碱醅酶或丁虢膣碱酯酶，根据农药对其豹特异性抑制作蠲研制葡i 成的。 乙酰胆碱( a c h ) 是第一个文献记载的神经递质，存在于昆虫和脊稚动物神经 中，它是丰牵经冲动传递中不可缺少的物质，也是最重要豹膊碱衍生物之一。它存 在于突触和神经效应器接头处，一旦接受辛申经冲动，a c h 锤从胆碱丰睾经末捎的贮藏 突触囊泡中释放出来，随后a c h 与突触后膜上的受体、运动终板或神缀肌接头绪 合，从丽改交接头后膜的通透性，使兴奁所需的离子雩导以流动，由此实现冲动的 传递。正常车凡体在神经兴奁时，神经末裢释放乙醮膣碱起作用，然后被体内胆碱 酯酶分解两失去作用，这样来调节神经之间的刘激传导。 腱碱酯酶( c h 0 1 i n e s t e r a s e ) 是类糖蛋自，以多种同功酶形式存在于体内。 一般分为宾性艟碱醣酶和假性胆碱貉酶。真性腥碱酯酶也髂乙酰腿碱酯酶 ( a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ，a c h e ) 主要存在于胆碱能神经寒稍突触间隙，也存在于 胆碱能神经元内稻红细胞中，其中分布于脑、神经细胞和肌肉组织中的乙酰胆谶 醣酶对乙酰胆碱作翔最强，特异性也较高。骰性胆碱酯酶广泛存在于神经胶质缎 胞、难浆、肝、肾、肠中，对乙酰翘碱特具性低，还可承解其它胆碱酸类，如琥 珀艟碱“。如前所述，乙酰胆碱酯酶在维持正常的神经生理功能方面有着重要作 9 上海水产大学硕士论文 用。 由于琵虫暴有a c h 传递的享孛经系统，丽有极磷农药在结构上与天然底物胆 碱有些类似，它可以和趋碱酯酶的活性中心有效结合，季窜铡胆碱酯酶的活性。因 此可有效地于扰胆碱醢酶对a c h 的催化水解过程，所以被作为蓉虫齐j 广泛应用于 昆虫防治。 当此类杀虫剂进入人体后，与体内的腥碱酯酶结合，并使之失去活性，丧失 对乙酰胆碱的分解能力，造成体内乙酰胆碱的蓄积，弓l 起神经传导生理功能的紊 乱，出现一系列中毒的临床症状。有机磷及氨基甲酸翡类农药生物传感器的研制 主要是基于这两类农药对胆减酯酶贝存特异性撩制豹基础上。国内外利用腱碱醵 酶研制的生物传感器主要分为两大类：电位爱耱碱醣酶生物传感器和电流型胆碱 酯酶生物传感器也称安培型生物传感器。 1 2 。 聪酸酴酶电位烈传潦器 电位型胆碱酸酶生物传感器根据离子选择性膜诱边的电解质浓度或缀成的蓑 肄魇产生的电能蓑来测定有机磷农药的浓度“”。电位氆生物传感器的基础电极一 般为离子选择性电极，该复合电极由指示电极和参毙亳极构成，指示电极多用p i 玻璃电极，参跑电极常用a g a g c l 电极。前者是迄今性能最可靠的离子选择性电极， 后者是重现性和稳定蛙最虫孑的参比电极之一。 在乙酰腥碱酯酶存在的情况下，乙酰胆碱可发生酶促承解。反应生成的乙酸 可以电离，从丽改变溶液的p h 馕。氨綦甲酸酯类农药与底物乙酰胆碱的分子形状 类似，能与酶醋基的活性中心发生键合从而抑制酶活性，当氨然甲酸醅类农药季窜 制该酶反应时，水解反应生成的乙酸量减少改变【 + 】，影响溶液p h 值。酶反应产生 的p k 变化可由邀位黧生物传感器测出，从而间接测定其含量。 电位型传感器中的酶往往是固定化的，如将a c h e 用丙烯酰胺异丁煺酰胺化学 交联围定在氧化电极的表面，采用较简单的包埋法将b c h e 强定在铱氧化电极表露 的纤维素三乙酸蘸层中，效果也不错。k u m a r a n 等人在这一领域有许多研究成果， 1 9 9 2 年时“3 采用多种方法将丁酰胆碱醋酶固定在p h 电极敏感端，从重现性、稳定性 及实用性等方露对酶电极进握了研究。瘸戊二醛和牛血渍白蛋白与丁酰胆碱酯酶 交联制成酶膜固定于p h 毫极表面制备的酶电极效果最佳。他们用此方法将丁酰胆 上海水产大学硕士论文 碱酯酶交联在预活化了的尼龙聚酰胺膜上，用尼龙网将载酶膜片固定在p h 电极表 碾，测定土壤萃取液中对硫磷和遮灭灵的检出限分别为3 9 p p b $ e 1 4 p p m 该酶电极 在于燥的情况下具有异常的稳定性，在4 。c 时保存3 年活性不变，在缓冲液中放置3 7 天活性损失6 5 。8 6 。酶膜制备简单，分析过程简便、快速，适合于一次性使用。 1 9 9 4 年时将丁酰胆碱酯酶固定在预活化的p a h b i o d y n e 商膜上“”，与p h 玻璃电极 敏感端复合，检测从土壤中弛提的多种有机磷农药，线性范围广，相对标准偏差 低于1 2 ，整个分析过程快速简便。两酶膜价廉、脱卸容易适合一次性使用，可用 于壤中农药污染的早期预警。 t r a n - m i h n 等“4 3 将乙酰胆碱酯酶固定在p h 电极上构成酶电极一生物传感器，其检 测过程中，a d h 与待测样中有机磷农药含量在1 0 - 1 01 0 5 m o l l 闻呈线性关系。最近 e s p i n o s a 等“”采用丝网印刷术设计了电位型生物传感器，它是以碳电极作基底电极， 将a c h e 与c o x 共同固定于基底电强表面铡成的釉新型电位型酶电极。碳电极表 面h 。0 。的还原，因反应的超电位降低，电极电位发生移动。电极电位的增长率与 a c h e 的活性成比例，测定有枫磷农药的检出限小予n m o l l ，整个检测过程不超过 2 0 r a i n 。b 海之等入“6 3 将a c h e 共价交联在聚乙烯酶缩丁醛膜( p v b ) p h 电极上制 成新型的a c h e 电极的方法，响应快，稳定性较好，寿命可达两个多月。何奕等人 0 7 3 以戊二醛为交联裁，制备了一种基于乙酰胆碱酯酶的酶膜生物传感器，并将冀 应用于毒死萆的检测，稔出浓度为1 6 4 2 0 5 2 m g k g 的毒死荤。需范平等人“8 用戊二 酸将乙酰胆碱酯酶交联在透析膜上，与p h 电极结合，由此开发懑一种基于固定化 酶的电位型转感器。该酶电极可以快速、灵敏地测定海水中的久效磷。仪器对海 水中1 0 - 1 0 _ 1 0 铂久效磷农药具有率及好的线性响应，检钡下限为0 1hg l ，加标圈收 在9 0 一1 0 3 之闯，分析一个海承样品只需5 0 m i n 。 电位型生物传感器的酶电极响应时间和电极恢复时间相对较慢“。两采用电流 烈检测方法可以大幅提高传感器的灵敏度。 1 2 2 疆喊酝装安培型生襁费感嚣 在电化学生物传感器中，研究的较为广泛的安培型生物传感器( v o l t a m m e t r i c b i o s e n s o ro ra m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r ) 即是基于修饰在电化学基础电极表面的敏感 膜的一类酶电极。 上海水产大学硕士论文 安培型酶传感器是生物传感器领域中最蘑蛩、研究得最多，且最灵敏的一种类 型它基予酶化学反应和异相电子转移反应，在恒定电位的情况下，电流随反应 过程有一定响应的原理。个优良的酶传感器的主要性能体现在灵敏度、选择性 和重现瞧上，要满足酶辫定化技术上，酶可保持照好的生物活性，且固定化层有 良好的稳定性及耐用性，保持酶高度的选择性。保证快的响应时闻及高的灵敏度， 尽曩减少箕它活性物质的干扰因此对于安培型酶传感器的研究，酶电极的制各 是最关键的。 魏福祥等 s u 将乙酰胆碱酯酶和交联剂戊二醛以及保护剂b s a 在低温下混匀制 成酶混合液，然后将预活化的硝酸纤维索滤膜载体浸入酶混合液中，3 下固定8 h ， 固定化效果较好。丽李元光的丝网印刷电极用戊二醛蒸汽熏蒸的酶潮定化方法所 褥的酶电极对有机磷农药对氧磷的检测限可达1 8 1 0 m o l l 。 由于胆碱醣酶催化产物硫代腮碱氯化电位相对较高，在较高的电位下很多其它 的杂质也可以氧化，从而产生杂蜂，影响实验的准确性及灵敏度。为降低其氧化 过电缎，避免杂质于扰多采用化学修饰电极窳降低其氧化毫位，即将电子媒介体 如二茂镞及其衍生物等修饰于电极表面。使反应在毖裸电极上较低的过电位发生， 提高传感器的灵敏度和选择性。目前这方面的工作成为这一领域的研究热点。 e s u p r u n - 等a ”。将酶混合液直接涂在用酱鲁士蓝修饰过的电极的敏感区，室淀 下干燥蜃形成一层固定化酶膜。该电极系统对涕灭威、对氧磷和对硫磷三种农药 的检测限分别可达3 0 、l o 和5 p p b 。s s e n 等人用聚乙烯二茂铁一离氯酸修饰过的 p t 电极直接浸入配制好的酶液中数次，通过离子交换过程实现对a c h e 的吸附豳定 化。t - g o d j e v a r g o v a 等h “”则是通过改照的聚酰胺吸辩剂固定a c h e ，也取得了良好 的稳定性。c h r i s t i n eb o n n e t 。4 等人利用沉积吸附法在t c n q 修鲧过的石墨丝网印薜9 电极固定a c h e 。并且证明了该方法除了具备酶活隧收率高的优点的同时也具备良 好的使用性能。 s i i v a n aa n d r e e s e u 等5 。使用三种非共价键的固定化方法将a c h e 固定于可次 性使用的丝嘲印刷电极并作了比较，分别为p v a s b q 光聚合反应束缚法，硅溶黢包 理法，金属螯合a c h ( h i s ) 。法。这三种方法都没有使用交联剂，因丽没有改变酶 的构象，最大限度地保持了酶最初的活性。其中光聚合束缚法虽然简单却仍有酶 上海水产大学硕士论文 脱离的问题，而穆酶与组氨酸结合后通过金属螯合则被褪为一种新型而又具有良 好前景豹方法，用于检测对氧磷，敌敬畏，毒死蜱等农药眩检测限可达p p b 级别。 康天放等吲利用电聚合的方法，将锥( 国一4 ，47 ，4 ，4 一圜氨基酞瞢( c o t a p c ) 荦体聚合到玻碳电极上l 乍为硫代胆碱电化学氧化的电催化裁，将霜定好a c h e 的酶 膜与聚四氨基锫酞警( p - - c o t a p c ) 修馋过的宅极组合，用于检测对硫磷和乐果，检 测蔟分别可达7 0 1 0 1 0 m 0 1 l 幂1 2 6 1 0 4 o l l b 。刘因栋渊篇利用碳纳米管修饰的 玻碳电极( c n t ，g c ) 对有梳磷农药遗零亍检测，并与没有经过化学修饰的玻碳电极、 碳糊电极、金电极做了详尽的对比，结栗表明由予碳纳米管末端的棱面结构以及 较大的表西积，使得c n t g c 其有高稳定矬、商灵敏度、良好的熏现性，将酶促反 应产物硫代胆碱的氧化过电位从0 7 v ( 由g c 灏, i 彳导) 降低至0 0 1 5 v ( c n t ，g c ) ，大 大提高了检测的灵敏度，得到一个明显的氧化峰。 双酶系统c - p l l 戆在溶液中要比其与胆碱氧化酶共同固定于膜上所得检出限 低。巍b c h e 在溶液中时，用测h 国。的生物传感器测定河水中1 。5hj h 水平豹对氧磷， 结果与g c 法吻合的很好，假该法不逶合予对海水和废永样品的测定，将b c h e 车i c h o d 共同阐定在尼龙膜上，测定土壤、湖水的马拉硫磷时豳收寥较好。3 。 电流型腿碱酯酶传感器鍪蔫在食品硷验和环境监测中得到了广泛的应用。尽 管胆碱酯簿生物传感器在环境检测方弱灵敏实用，但在在线分析应用上仍存在如 下缺点： 1 由于许多化舍物对酶都有抑制佟月。这类传感器只测出各类农药的总曩， 选择性低；两有机磷与酶的不可逆键合性强，被抑制的酶的活性难以爵生，酶电 极重复使用率低，成本高。 2 。膜碱酯鹣由于本身的性质，可能不耐热、强酸和强碱等，所制备的生物传 戆器稳定性也不太好，因而要制得结构均一、活性致的酶电极，还有许多理论 和实际闯越需要探讨。 3 干扰因豢豹考虑特别是在生物样品测试中，要考虑许多干扰因素主要分 电活性物质和非惫活性物质于扰。 不管怎样，电流型胆碱酯酶传感器作为目前研究最多、发旋最快、应用最广 的生物传感器，随羲对其稳定性、重现性、灵敏性的进一步提高，理论性研究的 上海水产大学硕士论文 进一