（预防兽医学专业论文）内蒙古牧区传统乳制品中乳杆菌降胆固醇特性的研究.pdf

摘要 本研究对分离自内蒙古牧区乳及乳制品中的2 4 株乳杆菌进行了酸耐受性、胆盐 耐受性、药物敏感性、细胞黏附性等生物学特性的研究，并对经以上试验筛选所得 菌株进行了体外和体内降胆固醇能力的测定。 2 4 株试验菌中，1 6 株植物乳杆菌( l a c t o b a c i t l u s p l a n t a r u m ) 显示出一定的胆盐 耐受性，在含o 3 0 牛胆酸钠的m r s 培养基中的生长率从o 0 5 9 3 9 不等。在 p h 3 0 环境中3 7 ( 2 培养l h 后，存活率在5 9 1 0 3 之间。对酸的耐受能力明显 高于胆盐。 经酸和胆盐耐受性试验筛选的1 3 株受试菌，对抗菌药物表现出不同程度的敏感 性。多数菌对氨苄西林、头孢噻肟和克林霉素敏感，对青霉素耐药；所有受试菌对 哌拉西林、阿莫西林、复方新诺明、利福平和呋喃妥因敏感，对万古霉素、环丙沙 星和诺氟沙星耐药：对多粘菌素b 和氧氟沙星的敏感性因菌株而异。 1 3 株受试菌对h t - 2 9 细胞表现出不同程度的黏附能力，黏附率从o 7 5 0 个菌 细胞不等。 经筛选后的1 1 株受试菌表现出不同的体外降胆固醇活性，胆固醇脱除率从2 8 5 4 3 1 不等。在胆盐去结合试验中，各菌株对胆盐的解离程度不同，产生的游 离胆酸量为0 6 5 1 1 5 t m o l m l 。 体外筛得的2 株植物乳杆菌中，l p l a n t a r u mw h 2 4 2 3 能显著抑制大鼠血脂的 升高。而l p l a n t a r u mw h l 5 - 3 在实验期内未表现出降低血脂的功效。 关键词：内蒙古牧区：传统乳制品；乳杆菌：降胆固醇 s t u d y o nt h ec h o l e s t e r o l - r e d u c i n gc h a r a c t e r i s t i co fl a c t o b a c i l l u s i s o l a t e df r o mt r a d i t i o n a ld a i r yp r o d u c t si np a s t u r er e g i o no fi n n e r m o n g o l i a a b s t f a c t i nt h i ss t u d y , s o m eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f2 4s t r a i n so fl a c t i ca c i db a c t e r i a i s o l a t e df r o md a i r yp r o d u c tw e r ea n a l y z e d ，s u c ha st o l e r a n c et oa c i da n db i l es a l t , s e n s i t i v i t yt oa n t i b i o t i c s ，a d h e n s i o nt oh t - 2 9c e l la n dc h o l e s t e r o lr e m o v a li nv i t r oa n di n v i v o 1 6s t r a i n so fl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ms h o w e dr e s i s t a n c et ob i l es a l ti nac e r t a i n d e g r e ea m o n g2 4s t r a i n so ft e s t e db a c t e r i a a l lo ft h e mc o u l dg r o wi nt h em e d i u m c o n t a i n e d0 3 s o d i u mt a u r o c h o l a t ea n dt h es u r v i v a ir a t ew a sf r o m0 0 5 t o9 3 9 珊l e ni n c u b a t e da t3 7 cf o rl hi nt h ec o n d i t i o no f p h3 0 t h es u r v i v a lr a t eo f s t r a i n sw a s b e t w e e n5 9 a n d10 3 b u tc o m p a r e dw i t l lb i l es a l t t h ea c i dr e s i s t a n c ew a s s t r o n g e r 13s t r a i n so ft e s t e db a c t e r i ah a dd i f f e r e n ts e n s i t i v i t yt od i v e r s ea n t i b i o t i c s m o s to f t h e mw e r es e n s i t i v et oa m p i c i l l i n ，c e f o t a x i m ea n dc l i n d a m y c i n ，b u tr e s i s t a n tt op e n i c i l l i n a l lo ft h e mh a ds e n s i t i v i t yt op i p e r a c i l l i n ，a m o x i c i l l i n ，s u l f o m e t h o r x a z o l e ，r i f a m p i na n d n i t r o f u r a n t o i n ，b u tr e s i s t a n c et ov a n c o m y c i n ，c i p r o f l o x a c i na n dn o r f l o x a c i n a i m e da t p o l y m y x i nba n do f l o a x a c i n ，t h es e n s i t i v i t yw a sd i f f e r e n ta m o n gs t r a i n s t h ea b i l i t yo fa d h e n s i o nt oh t - 2 9c e l lc h a n g e da m o n g13s t r a i n so ft e s t e db a c t e r i a t h er a t eo f a d h e n s i o nt oh t - 2 9e e l lw a sf r o m0 7t o5 0 t h es c r e e n e db a c t e r i a d i f f e r e di nt h er a t eo fc h e l e t e r o l r e m o v e li nv i t r o t h e r e m o v a lr a t eo fc h e l e s t e r o lw a sf r o m2 8 5 t o4 3 1 t h ef u r t h e re x p e r i m e n ti n d i c a t e d t h a te a c ho n ec o u l dd e c o n j u g a t eb i l es a l t b u tt h ea m o u n to fd i s s o c i a t i v ec h o l a l i ca c i d w a sd i f f e r e n tf r o mo 6 5 9 m o l m lt o1 1 5g m o l m l d u r i n gt h e2 0d a y sa n i m a le x p e r i m e n t t h el p l a n t a r u mw h 2 4 2 3 1 0 w e r e dt h e s e r u mc h o l e s t e r o lo fr a t sf e d w i t hf a t - e n r i c h e dd i e ta n dp r e v e n t e dh y p e r l i p e m i af r o m o c c u r i n g b u t 上p l a n t a r u mw h l 5 - 3h a dn oe f f e c to nb l o o df a tr e d u c t i o n k e yw o r d s ：i n n e rm o n g o l i ap a s t u r er e g i o n r e d u c t i o n d r e c t e db y ：p r o f z h o uy u xia p r o f 刚n i p p li c a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：l i uh a mi n g 伽口曲b g y 删嘶畸) ( c o l l e g eo f a n i m a js c i e n c ea n dm e d i c i n e ，i n n e rm o n g o l i a a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y ，h u l m o t0 1 0 0 1 8 ，o d n a ) 插图附表清单 图1 胆固醇含量测定流程图 图2 胆盐脱结合测定流程图 图3 游离胆酸标准曲线 图4 灌胃乳酸菌对血清总胆固醇的影响 图一5 灌胃乳酸菌对甘油三穗钓影响 图6 灌零乳酸菌对高密度脂蛋白胆固醇的影响 图7 灌胃乳酸菌对低密度脂蛋白胆固醇的影响 图8 灌胃乳酸菌对动脉硬化指数的影响 图9 灌胃乳酸菌对i t d l - c 与t c 比值的影响 表1 动物分组及饲喂方式 表2 普通饲料配方 表3 高腊饲料配方 表4 试验菌株耐酸及耐胆盐试验结果 表5 试验用抗生素的种类、药敏纸片含药量及抑菌圈直径判断标准 表6 试验菌株对8 大类1 9 种抗菌药物的药敏性实验结果 表7 试验菌株对i i t - 2 9 细胞的黏附 表8 降胆固醇体外试验结果 表9 胆盐脱结合试验结果 表1 0 灌胃乳酸菌对血清总胆固醇的影响 表1 1 灌胃乳酸菌对甘油三酯的影响 表1 2 灌胃乳酸菌对高密度脂蛋白胆固醇的影响 表1 3 灌胃乳酸茵对低密度脂蛋白胆圈醇的影响 表1 4 灌胃乳酸菌对动脉硬化指数的影响 表1 5 灌胃乳酸菌对h d l - c 与t c 比值的影响 0均船船腮黔孔驼 l 2 3 4 5 6 7 8 9 如牡毖四必衢巧盯卯勰约；驵就 m n挖城h坻m玎坞均加n毖船丝 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 1 1 研究背景 早在2 0 0 0 多年前，人类就已经开始利用有益于人体健康的乳酸菌制作发酵食 品。但在相当长的一段时期内，人们利用乳酸菌仅仅因为它可以改善食物的风味， 而对发酵食品的制作加工，却只依靠感官和经验。直到1 8 5 7 年，巴斯德在研究乳 酸发酵过程中才发现了乳酸菌。1 8 7 8 年，利斯特( j l i s t e r ) 从酸败的牛乳中也分离 到了乳酸菌，同年汉森( h a n s e n ) 完成了啤酒酵母的纯培养。数年之后，h t i s s i e r ( 1 8 9 9 ) 和e m o r o ( 1 9 0 0 ) 又分别发现了从肠道而来的双歧杆菌及嗜酸乳杆菌n ，。 2 0 世纪初，从事人类寿命研究的梅切尼柯夫教授发现，“长寿国”的人所经常饮用 的酸乳酪中，含有很多细菌。研究之后发现，体内只要摄取了某种特定的细菌，既 可抑制肠内有害菌的增殖，防止毒素产生，又能减缓衰老、延年益寿，这就是后来 的“乳酸菌疗法”的始祖。随着对益生菌认识和研究的不断深入，人们越来越了解 到益生菌在食品加工、保藏及促进健康方面的重要作用，益生菌也因此成为国内外 学者的研究热点，使其在众多领域得到广泛的应用，并显示着不朽的生命力。 1 2 益生菌的研究概况 1 2 1 益生菌的定义 益生菌一词源于梅切尼柯夫提出的“长寿论”，他认为肠道乳酸菌能够通过抑 制腐败菌的生长而起到延长寿命的作用。一般认为益生菌就是指能够在生物体( 主 要是人和动物) 内存活，并对宿主的生命健康有益的一类微生物，而把益生菌活菌 制剂或含有微生物培养物的微生物制剂称作益生素m 。随着人们对益生菌研究的深 入，其定义也在发生着变化。1 9 6 5 年，l i l l y 和s t i l l w e l l 把益生菌描述为一种微生 物产生的可以刺激其它微生物生长的物质，是与抗生素作用相反的物质。1 9 7 4 年， p a r k 将益生菌定义为有利于肠道平衡的有机物质，这一定义将抗生素也包括在内。 1 9 8 9 年，f u l l e r 把益生菌定义为能够促进肠内菌群生态平衡，对宿主起有益作用的 活微生物制剂，这一定义强调了益生菌必须由活细胞组成，从而排除了抗生素。1 9 9 2 年，h a v e a m a r 等人将益生菌定义为“_ 由单一或多种微生物组成的活菌制剂，当应用 于人或动物后，能通过改善宿主土著菌群的组成，从而促进人或动物的健康”，该 定义从多方面发展了益生菌这一概念。1 9 9 6 年，美、德、英、荷、瑞典及日本等国 1 5 位专家参加的“国际抗菌策略研究组”在讨论会提出了益生菌定义：“益生菌是 含活菌和( 或) 包括菌体组分及代谢产物的死菌的生物制品，经口或其他黏膜投入， 旨在黏膜表面处改善微生物与酶的平衡或刺激特异性与非特异性免疫”。上述定义 指出3 点：( 1 ) 益生菌的组成：活菌、死菌、菌体组分及代谢产物：( 2 ) 使用途径： 经口及其他黏膜( 包括皮肤) ；( 3 ) 目标功能：调整正常微生物群及其酶系统的平 衡，刺激特异性及非特异性免疫。到目前为止，在世界范围内学者们对其定义还存 2 内蒙古牧区传统乳制品中乳杆菌降胆固醇特性的研究 在着争议。但益生菌的保健功效已得到一致认可，并被广泛应用于工业、农业、食 品及医疗保健等与人类密切相关的各领域中。 1 2 2 益生菌的种类 益生菌主要是来源于动物肠道的正常生理性细菌和某些非肠道菌。1 9 8 9 年美 国食品和药物管理局( f d a ) 以及美国饲料监察协会( a a f c o ) 公布了4 1 种可用 于饲料的安全菌株。我国农业部于1 9 9 6 年公布了6 类菌：乳酸杆菌、粪肠球菌、 双歧杆菌、酵母菌、d m 4 2 3 腊样芽孢杆菌和s a 3 8 腊样芽孢杆菌可尉于动物微生态 调节剂。目前，常用的益生菌菌种有双歧杆菌，乳酸杆菌和一些链球菌。其中，双 歧杆菌有：青春双歧杆菌、短双歧杆菌等；乳酸杆菌有：嗜酸乳杆菌、保加利亚乳 杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、格氏乳杆菌和瑞氏乳 杆菌；链球菌有：粪肠球菌、乳链球菌、嗜热链球菌、和唾液链球菌。有些益生菌 菌株已被用于商业化生产，如新西兰恒天然公司的d r i o 和d r 2 0 、汉森的c r l 4 3 l 和b b l 2 、雀巢的l a l 、益力多的s h i r o t a 菌株和荷兰l g g 制品等。 1 2 3 益生菌应具备的条件 益生菌必须是被公认为安全的微生物，在应用于生产实践之前要经过严格的筛 选。目前普遍认为益生菌应具各的基本条件如下所述。 1 ，2 3 1 对酸和胆盐有一定抗性 益生菌及其制剂通常以口服的途径摄入，经过胃、小肠后以活性状态到达大肠， 定植后发挥其生理功效。益生菌定植存活是其发挥有益作用的关键，这种定植存活 过程取决于两个方面的特性，即能否抵御体内不良环境和是否具有附着于肠道的黏 附能力。通常从自然界分离得到的益生菌，如嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等抵御人体消 化道环境的能力很差，这是影响其应用功效的主要障碍m 。因此，考察益生菌对酸 和胆盐的耐受能力极具研究意义。胃中存在大量胃液，所构成的酸性环境可阻止大 多数外源性微生物进入肠道。而肠道中的胆汁和胰酶在消化过程中对食物中的微生 物也构成一道屏障，他们与胃肠蠕动一起保证肠道微生物区系的稳定。正常人的胃 液p h 值在1 5 4 5 之间，通常p h 值在3 0 左右，食物通过胃的时间相对较短，一 般为1 2 ”n 一。肠道内胆汁浓度是变化的，而且很难预测其在某一时间段内的浓度， 但胆汁盐含量总在o 0 3 0 3 的范围内波动w m 。因此，在体外研究益生菌对酸和 胆盐的耐受能力时，很多研究者采用p n 值3 0 和o 3 胆盐浓度的环境。 研究耐酸、耐胆盐情况最有效的方法是体内研究法，但由于体内研究法既昂贵 又费时，并且涉及道德问题，所以目前多采用体外研究法。为获得更加可靠的试验 结果，许多国外的研究者设计了体外模拟胃肠道的试验模型。c e r t e f i s 等( 1 9 9 8 ) 提 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 出一种模拟胃肠道转运的体外试验模型，用来检测益生菌对上消化道转运的耐受 性，同时确定饮食成分对微生物耐受性的影响。日本学者光冈知足在酸奶乳酸菌 的应用一书中，也建立了一种模拟胃肠道的模型，用来分析乳酸菌对上消化道的 耐受性。m a r t e a u 等( 1 9 9 7 ) 采用一种动力学的、由计算机控制的模型来模拟乳酸 菌在体内肠道转运的连续过程，如p h 值、胆盐浓度及食糜的动力学变化。近年来， 国内也开始了这方面的研究“”。 1 2 3 2 能在肠道中黏附定植 新生婴儿，其肠道是无菌的。但出生后不久，外界的菌便会大量进入体内。有 的菌与宿主细胞有一定亲和力，通过黏附定植，成为肠道里的常驻菌。黏附是指细 菌与肠上皮细胞通过生物化学作用产生的特异性黏连。黏附是定植的第一步，不能 黏附于肠上皮细胞表面的细菌只能是过路菌，而不能在肠道内定植，也就不能充分 发挥生理功能。乳酸菌是人及动物肠道正常菌群的重要成员，百年来人们对其生理 调节功能，营养促进作用和非特异性抗感染等方面作了大量的基础和应用方面的研 究。乳酸菌本身良好的黏附定植特性，是其充分发挥生物学效能的保证，也是影响 活菌制齐j 效果的关键因素之一。 迄今为止，人们对益生菌黏附性已进行了大量研究，但主要以体外试验为主。 h u u bjm 等人( 1 9 8 5 ) 以1 4 c 油酸标记一株两歧双歧杆菌的脂磷壁酸( l t a ) ，研究 u a 对人肠上皮细胞的黏附，开启了对益生菌黏附作用研究的先河。此后，e l os 。( 1 9 9 1 ) 和b e m e t ( 1 9 9 3 ) 等人采用体外细胞培养法，研究了双歧杆菌对人结肠癌 细胞2 ( c a c o 2 ) 和人肠上皮细胞的黏附能力。c r o c i a n i 等( 1 9 9 5 ) 检测了用体外 细胞培养方法研究黏附能力的准确性，与体内试验进行了比较。结果发现，菌株在 体内肠细胞的黏附和定植能力与体外培养细胞方法所得结果具有相似性。这为以后 采用体外细胞培养法研究益生菌细胞黏附性提供了重要的理论依据。 体外研究益生菌对肠上皮细胞的黏附能力存在许多困难，需体外培养肠上皮细 胞，而且要与受试菌株共同培养，观察菌对细胞的黏附量，从而确定黏附力。有动 物实验表明，小鼠钵内朐乳杆菌匮乏，可通过补充鼠源乳杆菌达到永久性重建m 。 也有人研究得出长双歧杆菌易于在无菌小鼠体内永久性定植的结论“咖。但也有研究 表明，志愿者服用双歧杆菌后，该菌大量出现于粪便中，而当停止服用此菌株时， 它在粪便中就不复存在了。”。因此人们推断，尽管双歧杆菌通过胃肠道时能够存活， 但其在一定程度上不能在消化道内定植。 大量研究表明，益生菌的黏附性具有以下特点：可逆性、种属特异性和宿主特 异性。h u u bjm 等人( 1 9 8 5 ) 研究双歧杆菌l t a 与人肠上皮细胞黏附时发现，此 黏附过程是特异的、可逆的，并且具有细胞浓度和时间依赖性。有文献报道n 一，不 同乳杆菌菌株的黏附特性不同，而且差另j 很大，某些肠道中的非优势乳杆菌根本没 4 内蒙古牧区传统乳制品中乳杆菌降胆固醇特性的研究 有黏附能力。在b e r n e t 等( 1 9 9 3 ) 的研究中，不同双歧杆菌对人肠上皮细胞的黏附 性差异很大。t a n n o c k 等( 1 9 8 2 ) 通过动物实验发现，从啮齿类动物分离得到的乳 杆菌菌株只能在同类动物的消化道中黏附定植，而从家禽体内分离到的乳杆菌只能 定植在家禽的嚎嚷上皮上。这一事实证明了乳杆菌黏附定植具有较强的宿主特异 性。 1 2 3 3 不携带可转移的耐药因子 自1 9 2 9 年f l e m i n g 一发现青霉索以来，已发现9 0 0 0 余种抗生素，抗生素的应用。 使大多数细菌性疾病得以控制，也正是由于长期大量使用抗生素，而产生了不少副 作用。滥用抗生素引起微生物的耐药性是一个重要问题，耐药性的存在不仅影响抗 生素效果，而且可能产生出一批新的对人类危害更大的致病性微生物。由此可见， 在选择有益菌株应用于微生态制剂的生产时，应将不带耐药因子作为一个重要的筛 选指标。 在日益广泛食用的微生态制剂中，应用最为普遍的是乳酸菌。而乳杆菌天生对 许多抗生素具有抗性，但在大多数情况下。这种特性是不能转移的。这些具有非转 移耐药基因的乳杆菌，不必考虑其安全性。一些乳杆菌( 如干酪乳杆菌和鼠李糖乳 杆菌) 对万古霉素天生具有抗性，它们作为安全的益生菌使用，已有多年的历史， 而且还没有发现抗万古霉素的特性转移给其他细菌。t y n k k y n e n 等n ”证明鼠李糖乳 杆菌的抗万古霉素因子与肠道球菌的无相关性，他们还未观察到这种抗性可以在鼠 李糖乳杆菌和肠道球菌间转移。但也有少数菌株的抗抗生素基因是由质粒编码的， 进入动物肠道后有可能将其携带的抗药性质粒转移给肠道菌群，即存在抗药性质粒 在体内传播的危险。已证实，罗伊氏乳杆菌能将耐药性因子传递给屎肠球菌，屎肠 球菌还能将其传递给粪肠球菌。因此，在选择利用乳酸菌为活菌制剂时，了解其耐 药性及质粒携带情况非常必要。 测定药物在体外对微生物有无抑制作用的方法称为药物敏感性试验。随着生物 物理、分子化学、放射免疫及计算机技术的不断发展及其在临床实验的应用，测定 药敏的方法随之增多，如扩散法、稀释法、光密度计法、电阻抗法、放射性测量法、 固体免疫荧光法等。尽管方法很多，但其中有的对培养基要求严格，有的自动化仪 器价格昂贵，在一般试验中难以推广。目前常用的药敏测定方法主要有两种，即稀 释法和扩散法。 1 2 3 4 对宿主的安全性 益生菌对宿主必须是安全的。双歧杆菌、乳酸杆菌一直破认为是安全的，关于 其有害的报道很少。但随着科学的不断发展，对益生菌安全性的认识也在发生变化。 近年发现，乳酸杆菌、明串珠菌、片球菌、肠球菌和双歧杆菌经常能够从许多感染 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 的病变组织中分离出来。这些报道引起了人们对益生菌安全性的重新认识。益生菌 安全性评价一般以病原性、毒性、代谢活性及菌株内在特性作为依据。 如果益生菌制剂应用于人体，那么菌株除具备上述特性外还需满足以下几点要 求：( 1 ) 必须分离自健康人体的肠道；( 2 ) 必须经过一定时间证明其无致病性：( 3 ) 不能与一些疾病( 如心内膜炎、肠道不适症等) 有相联系的历史：( 4 ) 不能使胆盐 早期解离。 1 2 4 益生菌的功能 1 2 4 1 抗菌作用 对于益生菌抗菌作用的研究主要集中于双歧杆菌和乳酸菌。其作用机理主要 是：补充有益菌群，产生有益代谢产物，维持肠道菌体平衡，通过竞争性抑制作用 阻止有害菌的生长繁殖。乳酸菌在代谢过程中可产生有机酸、过氧化氢、二氧化碳、 乳酸菌素等物质，它们具有抑制或直接杀灭病原菌、腐败菌的作用。乳酸菌本身还 有抑制瘸原体复制的作用。有研究表明，有些乳酸菌在人体肠道的定植能力特别强， 而且能均匀定植于肠道表面，对肠道细菌如大肠杆菌、沙门氏菌等引起的肠道感染、 腹泻等疾病有预防性作用n m u “。 。 1 2 4 2 整肠作用 肠道微生物生态系统是人体最大、最复杂的微生态系统，在诸多细菌共存情况 下，不同菌种之间存在拮抗作用，宿主与细菌之间借助对营养物质的吸收和利用， 在消化道中形成相互作用的关系，维系着消化道微生物生态系统的平衡。当宿主抵 抗力下降时，有害菌会过度增殖，造成肠道菌群紊乱，引起机体发病。当乳酸菌进 入肠道后，即在肠内繁殖，抑制病原菌和其它有害菌的繁殖，增强机体免疫力，从 而起到预防感染，维持肠内菌群平衡的作用。n a n i i ( 1 9 9 4 ) 发现，潜在病变( 如慢 性肾脏疾病) 和胃酸缺乏可导致小肠细菌过度繁殖，从而造成有害微生物大量滋生。 当摄入一定量乳酸菌后，可明显降低肠道疾病发病率、缩短发病时间和缓解病情。 1 2 4 3 调节免疫功能 乳酸菌作为一种新型的绿色无公害保健品、治疗药物及饲料添加剂，其研究已 经取得了很多成果，其中研究乳酸菌在免疫方面的作用报道较多。h ef a n g 等( 2 0 0 2 ) 对一些益生菌进行的研究表明：有些乳酸菌能够影响人体免疫系统的应答能力，且 不同菌的影响程度不同。同年，h a r s h a m j i ts g i l l 等也通过实验发现了乳酸杆菌能 够增强机体的免疫能力。有些乳酸菌的活菌细胞、死细胞或发酵产物都具有免疫调 节功能，特别值得一提的是其免疫调节不会带来有害的炎症反应。m a r t e a u 和 r a m b a n d 还测试了乳酸菌对病原菌和肿瘤的抑制作用，这为研究益生菌调节免疫功 6 内蒙古牧区传统乳制品中乳杆菌降胆固醇特性的研究 能的特性提供了有效的途径。 1 2 4 4 营养作用 乳酸杆菌能分解食物中的蛋白质和糖类，并合成维生素，对脂肪也有一定的分 解能力，能显著提高食物消化率和生物价，促进消化吸收。乳酸杆菌还能合成动物 所需要的多种维生素，如b 1 、b 2 、b 6 、b 1 2 、烟酸、泛酸、叶酸等。吕嘉枷等( 2 0 0 3 ) 还研究了益生菌中的嗜酸乳酸杆菌在甜酒酿造过程中的生长繁殖的营养条件和培 养条件，并用于指导含高活性益生菌甜酒的生产。 1 2 4 5 提高乳糖利用率 乳酸菌具有乳糖酶，将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖经发酵作用转变为 乳酸等小分子化合物，半乳糖部分吸收进入机体，成为脑苷脂和神经物质的合成原 料，促进脑组织发育。此外，乳酸菌对缓解乳糖不耐症也有一定作用。k i m 和g i l l i l a n d ( 1 9 8 3 ) 研究发现，含嗜酸乳杆菌的乳可以提高乳糖的消化率，这可能是由于嗜酸 乳杆菌可产生d 半乳糖苷酶，它可以分解乳糖，使其有利于肠道的吸收。 1 2 4 6 预防癌症 研究表明癌症发生率的高低与膳食组成密切相关，而含益生菌的膳食已被证明 具有明显降低癌症发生率的效果。根据a s o 和a k a z a n 的研究( 1 9 9 2 ) ，每日3 次食 用1 0 1 0 c f u 的l c a s e i 干粉制品并持续一年，可达到抑制膀胱癌的再发生。另有研 究表明益生菌具有阻碍结肠和其它器官中发生的非基因型和基因型突变的功能，其 机理是益生菌或其代谢副产物通过影响结肠上皮细胞的变化历程，来达到降低癌细 胞增殖的目的“”。 1 2 4 7 延缓机体衰老 实验已证实了乳酸菌的抗变异性，并发现乳酸菌能够产生超氧化物歧化酶。超 氧化物歧化酶是一种含有金属离子的酶，其生理功能是清除体内代谢过程中产生的 过量超氧阴离子自由基，从而延缓衰老。另外，乳酸菌产生的乳酸，抑制了肠道腐 败细菌的生长，从而减少了这些细菌所产生的毒胺、靛基质、氨、h z s 等致癌物质 和其他毒性物质，使机体衰老过程变得缓慢。 1 2 5 益生菌的降胆固醇功效 众所周知，血清中胆固醇含量被认为是诱发高血压、冠心病等众多血管疾病的 主要因素。统计表明，心脑血管疾病是目前引起人们死亡的主要杀手，而且逐年呈 上升趋势。因此，降低血清胆固醇水平直接关系到人类的健康。为此，人们开展了 内蒙古农业大学硕士学位论文 乳酸菌降低胆固醇的体内和体外研究，旨在开发功能性乳酸菌制品，满足人们健康 的需要。 1 。2 ，5 1 体内外研究中取得的成果 国内外大量研究发现，食用活性乳酸菌食品具有减少人体血清中胆固醇的能 力，这个结论已被大量的体内及体外实验所证实n m “a ”。m a n n 和s p o e r r y ( 1 9 7 4 ) 发现，非洲m a s a i 人大量饮用由乳杆菌发酵的乳制品，其体内血清胆固醇含量普遍 较低。1 9 7 7 年，他们调查发现经常饮用酸奶和相关发酵乳制品的美国人，其体内血 清胆固醇含量也较低w 。此外，通过对新生几的研究m ，和直接对酸乳的研究w ，均表 明乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的功能。这些结果引起了国内外营养学、医学、 微生物学等各界人士的普遍关注，从而掀起了乳酸菌降胆固醇作用的研究热潮。 国外对于乳酸菌降低胆固醇作用机制的研究起步较早。19 7 7 年，g i l l i l a n de w 对 肠道乳杆菌的降胆固醇作用进行了研究，提出了乳酸菌在生长过程中通过降解胆盐 促进胆固醇的分解代谢，从而降低胆固醇含量的观点。r a s i c 等m ，证实了纯培养条件 下，部分乳酸菌和两歧双歧杆菌对胆固醇的吸收作用。与此同时，人体及动物实验 也证实了乳酸菌的降胆固醇作用。按胆固醇含量，l i n 等m 将血清中高胆固醇的人群 分为三组，均服用相同剂量的嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌制剂，8 个月后发现被 测人群的血清中总胆固醇含量和低密度脂蛋白浓度均有不同程度的下降，并且血清 中胆固醇含量越高，总胆固醇含量和低密度脂蛋白浓度下降越显著。a k a l i n 等m ，应 用小鼠作为模型，分别给小鼠伺喂酸奶、含有嗜酸乳杆菌的酸奶和鲜牛奶，研究了 乳酸菌对小鼠血清中总胆固醇含量、甘油三酯和低密度脂蛋白浓度的影响。得出的 结论是：嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌可以显著降低鼠血清总胆固醇和低密度脂蛋白含 量。另外，f u k u s h i m a 和m o h a n 分别在小鼠和雏鸡的研究中获得了同样的结论。 u s m a n 等w 在大鼠的实验中也证实了乳酸菌的降胆固醇作用。 1 2 5 2 降胆固醇机理的探讨 尽管乳酸菌降低培养基中胆固醇含量、减少人和动物血清胆固醇含量的益生作 用得到了大量的证实，但具体的机理至今尚无定论。目前国内外研究者的观点主要 集中于以下三个方面：( 1 ) 乳酸菌细胞直接吸收胆固醇；( 2 ) 乳酸菌的胆盐水解 酶活性使胆盐由结合态转变为脱结合态，与胆固醇发生共同沉淀：( 3 ) 吸收和沉 淀共同作用；( 4 ) 其它理论。 体外研究表明，在厌氧条件下，乳酸菌在含有胆盐的高胆固醇培养基中生长时， 菌体细胞可以吸收介质中的胆固醇，降低介质中胆固醇的含量。g i l l i l a n d 等“n 对从 猪肠道中分离到的嗜酸乳杆菌( l a c i d o p h i l u s p 4 7 ) 进行了降低胆固醇的体内和体外 研究，以类胸膜炎体( p l e u r o p n e u m o n i al i k e o r g a n i s m ) 代替胆固醇加入到含有不同 8 内蒙古牧区传统乳制品中乳杆菌降胆固醇特性的研究 胆盐的培养基中，接种后厌氧培养，发现培养液中胆固醇含量明显降低。破碎菌体 细胞后，发现细胞内胆固醇含量显著增加，从丽证实了菌体对胆固醇具有吸收作用。 他们同时指出，菌体细胞对胆固醇的吸收因胆盐浓度、胆盐种类和菌株的不同而表 现出明显的差异。 体外研究发现，乳酸菌产生的胆盐水解酶( b i l es a l t h y d r o， ) 可以使结1 a s e b s h 合胆酸分解为游离胆酸，游离胆酸与胆固醇形成复合物共同沉淀下来，从而导致环 境中胆固醇含量的降低m m ，。k l a v e r 等m 利用多株乳杆菌和双歧杆菌进行的降胆固醇 研究证实了这一理论。同时，t a r a n t o 和g r i l p nw 对此也有相关研究，均认为胆盐 水解酶活性是胆固醇降低的关键因素。应用动物实验也证实了乳酸菌促进胆固醇沉 淀和排出的观点。这种降胆固醇效果或许来源于两个方面：第一，因胆圃醇的溶解 度取决于胆盐的溶解度，胆盐经水解后溶解度下降，从而致使胆固醇也一同沉淀下 来：第二，在体内，胆盐水解酶作用后产生的脱结合胆酸在大肠内不被重复吸收而 由粪便排出，胆酸的排出导致其在肠肝系统循环次数减少，从而增加了胆酸的生物 合成。由于胆固醇是形成胆酸的前体物，部分胆固醇需要转化为胆酸以弥补被分解 后排出体外的部分，这样就加速了胆固醇的分解代谢，从而导致胆固醇浓度的降低。 鉴于乳酸菌降低胆固醇作用受多种因素的影响，其作用方式随所采用的菌株和 测试对象有很大的差别，对于嗜酸乳杆菌和双歧杆菌降低胆固醇的作用，部分研究 人员倾向于菌体吸收和共沉淀联合作用的观点，而且在不同条件下乳酸菌会表现出 以某一种作用方式( 吸收或者沉淀) 为主的能力。此外对双歧杆菌的研究还发现， 双歧杆菌通过抑制人体内活化的t 细胞，可以控制新形成的低密度脂蛋白接受器， 有助于降低血清胆固醇含量w 。利用小鼠作为模型的实验结果表明，嗜酸乳杆菌和 双歧杆菌可以影响胆固醇合成途径中的p 羟基b 甲基戊二酸单酰辅酶a 还原酶的 活性，因而具有降低血清胆固醇含量的功效w m 。上述研究结果充分说踢乳酸菌降 低血清胆固醇含量的机制是复杂的，或许还存在其他的作用机理。 1 2 5 3 影响降胆固醇能力的因素 许多因素可以影响到乳酸菌对胆固醇的脱除能力。分离自同一样品的不同菌 种，同一菌种的不同菌株间，甚至同一菌株在不同的试验中，其胆固醇脱除能力均 有所不同。纯培养条件下的研究表明，在含有胆盐的高胆固醇培养基中乳酸菌沉淀 胆固醇的能力受多种因素的影响，如胆盐浓度、胆盐种类、活细菌数量以及培养液 的p h 值等。适宜的胆盐浓度、较高的活菌数和较低的p h 值有利于胆固醇的沉淀。 此外，也有体内研究证明，乳酸菌在动物胃肠内的活性、在胃肠道内黏附和定植的 能力以及是否有足够数量的菌体，都会影响其降胆固醇作用的发挥。 对于胆盐与乳酸菌降低胆固醇的之间关系，众多研究者均认为，适当增加胆盐 浓度可以提高菌体细胞壁的通透性，使固醇类物质渗入细胞内部，引起环境中胆固 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 醇浓度下降n ”；而胆盐浓度过高，则抑制细菌的生长，不利于菌体细胞对胆固醇的 吸收。在体内，胆盐是胆固醇代谢的主要终产物，采取有助于胆盐分解代谢的措麓 将有利于降低胆固醇浓度。b r a s h e a r s m l 等人对两株干酪乳杆菌和两株嗜酸乳杆菌在 不同p h 值条件下的降胆固醇能力进行了研究，发现干酪乳杆菌在不同p h 值条件下对 胆固醇的脱除能力存在显著差异。在p h 6 0 时两株菌几乎不能降低生长介质中的胆 固醇含量，而在不控$ i j p a 值( 低于6 0 ) 时，对胆固醇的脱除量可达6 0 i l g m l 。但嗜 酸乳杆菌在不同p h 值条件下对胆固醇的脱除量则无明显差异。h k i m o t o ，s o h m o m o 等人试验表明热致死的菌株n 7 具有降低培养基中的胆固醇作用，他们还推测能够降 低动物体内的血清胆固醇m 。这可能是由于死菌体在通过人体肠道时，利用其表面 吸附胆固醇，将胆固醇携带出体内，降低体内的一部分血清胆固醇含量。孟和的论 文中也报道了热致死乳酸菌能降低大鼠血清中的胆固醇含量，且效果比活菌明显。”。 h 永士等人从传统的发酵乳制品中筛选出一株具有降胆固醇能力较强的干酪乳杆 菌，试验中发现活菌体对血清胆固醇的降低有明显的作用，而且低剂量( 1 0 6 个菌d ) 较高剂量更有利于降低老鼠体内的血清胆固醇，这与体外试验的结果相反。r o d a s 等人研究乳酸菌对猪的高血脂症试验中发现高剂量的( 1 0 1 2 个菌d ) a c i d o p h i l u s 效 果是低剂量( 1 0 4 个菌d ) 的几倍，g r u n e w a l d 利用发酵乳饲养小鼠也发现了类似的结果 。 鉴于体内与体外实验结果存在差异，因此，仅仅用体外实验数据和部分动物模 型的实验结果来阐述乳酸菌在人体内的胆固醇降低机制，显然是不够充分的，尚需 要更多的研究，特别是加强开展乳酸菌降低人体血清胆固醇的研究很有必要。 1 2 5 4 筛选降胆固醇益生菌应注意的问题 虽然巍酸菌具有降低血清的胆固醇的功效，但对具有降胆固醇功效的乳酸菌制 剂及其食品进行安全性评价也是十分必要的。据报道，一些地区的居民由于食用含 有微生物的发酵乳制品，从而延年益寿，该现象引起对此类产品中微生物的研究。 在研究其有益方面的同时，也考虑其安全性。通常认为乳酸菌是安全的，然而也有 一些报道指出了特殊情况，发现乳酸菌可以从人体的肠道转入到人体的肝脏甚至血 液中去，这种现象叫乳酸菌的肝肠易位。肝肠易位会促进肝功能衰竭，带来严重的后 果。因此，在选用乳酸菌作为益生菌制剂时必须小心谨慎，注意其发挥益生作用的 同时所带来的负面影响一 乳品，特别是发酵乳制品是人们摄入外源乳酸菌的条重要渠道，筛选优良、 具有降低胆固醇能力和安全的乳酸菌菌株，对于开发功能性乳制品、丰富现有乳制 品种类、提高乳品的附加产值将具有重要意义。 l o 、 内蒙古牧区传统乳制品中乳杆菌降胆固醇特性的研究 1 2 6 益生菌产品的现状及应用前景 随着对具有健康促进效用的益生菌产品的不断开发，人们对益生菌及其产品的 研究热情日益增长，对益生菌功效作用和重要性的理解也愈加深刻。美国卫生饮食专 家预测：未来最受消费者欢迎的健康食品之一就是添加乳酸菌或其它有益细菌的乳 制品。益生菌已大量应用于酸奶的生产，这些益生菌主要包括：乳杆菌和双歧杆菌， 使用这些益生菌生产的酸奶，在进入消化道后，会抑制一些致病性微生物的生长与 定植，发挥其特殊的生理作用，如调节血脂、降低血清胆固醇、增强机体免疫力等。 ，t l , 血管疾病是威胁人类健康鲍一类主要疾病，其中四分之三是由动脉粥样硬化 及其并发症引起的，而血液中胆固醇浓度过高则是其主要的诱因。人体血清胆固醇 主要来源于两个方面：即外源摄取和自身合成。在饮食中添加具有降胆固醇功能的 益生菌，不但可以降低食物中的胆固醇含量，而且能减少体内胆固醇的合成，从而 起到降低人体血清胆固醇的作用。同时，这也为预防和治疗，t l , 血管疾病提供了新的 可行性途径。从1 9 7 4 年至2 0 0 0 年，许多研究者报道了服用发酵牛奶制品对人体胆 固醇降低作用的评价，研究对象约5 0 0 人，总胆固醇降低幅度为5 4 2 3 2 ，低 密度脂蛋白胆固醇降低幅度为9 9 8 。根据体外研究和部分体内研究结果，以 及某些地区大量服用含乳酸菌的发酵牛奶的人群血清胆圊醇浓度低这客观事实， 益生菌作为降血脂的食品添加剂及临床应用的前景还是非常乐观的。 乳、肉、蛋中含有丰富的蛋白质、维生素、磷脂、微量元素等，是重要的食品 加工原料，但由于其中胆固醇含量高，不得不限制其饮食。若在发酵过程中添加益 生菌，不但可以生产出风味独特发酵制品，而且可以降低其中的胆固醇含量。 g h a l e b 。1 用两歧双歧杆菌按传统方法制作酸奶，5 储藏6 d 后，胆固醇含量从 2 0 3 7 m g 1 0 0 9 降至1 6 8 3 m g 1 0 0 9 。张佳程等筛选出3 株可同化食品中4 5 以上的 胆固醇的乳酸菌菌株，并认为嗜酸乳杆菌对胆固醇的同纯能力较强。这些乳酸菌可 用于酸性奶油、酸奶、蛋奶以及发酵香肠等发酵食品的生产。 此外，益生菌在其它方面也有着广泛的应用。在饲料领域中，乳酸菌主要应用 于青贮饲料和饲料添加剂。乳酸菌是引起青贮饲料发酵酸化成熟的主导菌群，在厌 氧条件下乳酸菌增殖而产生乳酸，随之p h 值下降，可抑制腐败菌的增殖，获得了 良好的青贮。畜禽用微生态制剂，是一种含活性益生菌的饲料添加剂。它既无毒、 无副作用、无残留、无抗药性，同时也不会污染环境，具有广阔的应用前景。 目前，益生菌产品在日本和欧洲市场较为普遍。日本y a k u l t 公司的y a k u l t 就是 一种发酵脱脂乳饮料，其中含有l a c t o b a c i l l u sc a s e is h i r o t a ，销往全球2 7 个国家和 地区，是全球最大的功能性食品品牌。a c t i m e l 是通过保加利亚乳杆菌、嗜热链球 菌和干酪乳杆菌发酵的酸乳菌饮料，其产品畅销欧洲市场，自1 9 9 4 年从比利时上 市后，现已销往西班牙、法国、德国、英国和爱尔兰等国家。另外在西班牙和意大 利市场，雀巢公司的l c lg o 产品也显示了一定的实力。该产品含l c l 益生菌株。 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 芬兰的v a l i o 乳品公司则推出了含l g g 菌的各类乳制品。l g g 被认为是最具研究 潜力的菌株之一，它具有平衡消化道微生物群、增强免疫功能、调节新陈代谢和减 少有害化合物形成、预防和治疗痢疾、加速乳过敏反应的恢复等功能。此外，丹麦 m d 公司的“g a i o ”酸乳中含高加索乳酸菌，该菌具有降低胆固醇的作用。另外， 还有其它的一些公司也纷纷推出其益生菌株产品。 随着益生菌产品市场的不断壮大，益生菌的研究工作还需进一步深人，亟待研 究的领域总结如下：( 1 ) 通过直接对人进行口服益生菌产品等试验，确定益生菌的 生理学功能、作用机理及其产生的影响程度。( 2 ) 益生菌功能的评价，特别是对血 、清胆固醇、免疫系统和肠道微璺：态的调节功能( 3 ) 评价益生菌对肠道微生物的数 量和活性的影响。( 4 ) 确定载体对益生菌的影响，即确定不同存在状态( 以食品的组 分或分离状态存在1 下益生菌的作用。( 5 ) 提高益生菌分类的可靠性并使之易于分类。 ( 6 ) 消费者对益生菌概念的认同和具有良好风味的益生菌产品的开发。( 7 ) 益生 菌产品载体的研究以及消费者接受程度、产品稳定性、产品功效等方面的研究。 1 2 7 国内外对益生菌的研究热点及未来研究方向 综合近几年的文献，可以发现益生菌的研究呈现两个特点：( 1 ) 大量借鉴其