（环境工程专业论文）固定化微生物降解石油污染物规律研究.pdf

摘要 本文以筛选驯化得到的高效石油降解菌为菌源，选用可自然降解的、无害的秸秆材 料做载体材料，采用吸附法制备固定化微生物；考察了温度、固定化微生物接种量、原 油浓度、p h 等因素对石油降解三个主要过程( 吸附、运输、降解) 的影响，并采用响 应面法对三个过程进行优化分析，在最优条件下进行动力学研究，了解固定化微生物降 解石油污染物的过程，初步揭示固定化微生物降解石油规律，主要研究结果如下： 筛选驯化后确定s j 1 号菌株降解效果最好，降解率2 7 ，经过生理生化试验初步 鉴定，菌株s j 1 为假单胞菌属：通过考察吸菌量和7 d 降解率，选择c l 2 作为固定化 载体材料；采用吸附法制备的固定化微生物所含菌体数量为2 9 2 5 1 0 1 2 个儋，即1 o g 固定化微生物相当于3 1 m l 游离菌液所含生物量。 利用响应面优化软件d e s i g n - e x p e r t8 0 5 进行b o x - b e h n k e nd e s i g n ( b b d ) 实验设计， 通过响应面实验，分别以石油吸附率、石油运输量和石油降解率为响应值，建立了p h 、 原油浓度、接种量、温度等因素和响应值之间的数学模型，模型回归效果均显著，可以 用来预测固定化微生物对石油的吸附率、运输量和降解率。 固定化微生物与游离微生物相比，吸附量大幅度提高，固定化载体材料在吸附过程 中发挥了主要作用；固定化微生物与载体材料的吸附特性近似保持一致，但由于固定化 微生物在制作过程中，细菌的吸附造成孔结构数量减小，吸附能力下降，而且微生物以 材料中的有机物质作为营养物质，导致材料表面损失，造成固定化微生物与固定化载体 相比，吸附容量下降。 固定化载体材料对石油的吸附作用，阻碍了微生物与石油的接触，造成固定化微生 物运输石油速度缓慢；有机载体材料对石油的吸附，能对石油起到更好的分散作用，有 利于微生物对石油的摄取运输，所以无论在最高点，还是达到平衡后，固定化微生物运 输石油量都大于游离微生物的运输量。 微生物对石油的吸附和运输过程都较快，对石油的降解影响较小，影响石油降解速 率和程度的关键过程是生物降解过程；固定化微生物对石油污染物的降解具有更强的生 物活性，更好的降解效果。在最佳降解条件下，固定化微生物和游离微生物降解过程符 合一级动力学，且微生物固定化后降解速度是游离微生物的3 6 7 倍。 关键词：固定化微生物；响应面；吸附；运输；石油降解 s t u d yo nt h el a w o fd e g r a d a t i o no fo i lb y t1 l m m 0 d l l l z e c in 1 l c r o o r 2 a n l s m w uj i a d o n g ( e n v i r o n m e n t a ls c i e n c ea n de n g i n e e r i n g ) d i r e c t e db yp r o f z h a n gx i u x i a a b s t r a c t t h i sp a p e rs e l e c t i n ga n dd o m e s t i c a t i n gh i g h l ye f f i c i e n to i ld e g r a d i n gb a c t e r i aa st h e b a c t e r i as o u r c e ，w i t l ls t r a wm a t e r i a lf o ri m m o b i l i z e dc a r r i e r , i m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m w e r em a d eb ys u r f a c ea d s o r p t i o nm e t h o d ；i n v e s t i g a t i n gt h et e m p e r a t u r e ，i m m o b i l i z e d m i c r o o r g a n i s mq u a n t i t y ，c r u d eo i lc o n c e n t r a t i o n ，p ho nt h r e em a i no i ld e g r a d a t i o np r o c e s s ( a d s o r p t i o n ，t r a n s p o r t a t i o n ，d e g r a d a t i o n ) ，a n du s i n gt h er e s p o n s es u r f a c em e t h o dt oa n a l y s i s a n do p t i m i z et h r e ep r o c e s s ，p r e p a r i n gd y n a m i c sr e s e a r c hu n d e rt h em o s to p t i m a lc o n d i t i o n s t ou n d e r s t a n dt h e p r o c e s so fo i ld e g r a d a t i o n o fo i l b yi m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m ， p r e l i m i n a r yr e v e a l i n gt h el a wo fd e g r a d a t i o no fo i lb yi m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m m a i n c o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) b a c t e r i an a m e ds j - 1w a ss e l e c t e da f t e rd o m e s t i c a t i n g ，t h ed e g r a d a t i o nr a t e2 7 ，i t w a si d e n t i f i e dr e s p e c t i v e l ya sp s e u d o m o n a ss pb a s e do np h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s m a t e r i a ln a m e dc l 一2w a ss e l e c t e da si m m o b i l i z e dc a r t i e rm a t e r i a lt h r o u g ht h e i n v e s t i g a t i o no fs u c t i o nb a c t e r i aa n d7dd e g r a d a t i o nr a t e n l ei m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m c o n t a i n sb a c t e r i an u m b e ri s2 9 2 5x10 “a g ，o r1 0 gi m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s mi s e q u i v a l e n tt o3 1m l f r e eb a c t e r i al i q u i dc o n t a i n sb i o m a s s ( 2 ) b o x b e h n k e nd e s i g ne x p e r i m e n t sw a sd e s i g n e db yt h er e s p o n s es u r f a c eo p t i m i z a t i o n s o f t w a r ed e s i g n e x p e r t8 0 5 b yr e s p o n s es u r f a c ee x p e r i m e n t , r e s p e c t i v e l yc h o o s i n go i l a d s o r p t i o nr a t e ，o i lt r a n s p o r tv o l u m ea n do i ld e g r a d a t i o nr a t ef o rr e s p o n s ev a l u e s ，t h e m a t h e m a t i c a lm o d e le s t a b l i s h e db e t w e e nt h e p h ，c r u d eo i lc o n c e n t r a t i o n , q u a n t i t y ， t e m p e r a t u r e ，e t cf a c t o r sa n dr e s p o n s ev a l u e s r e g r e s s i o nm o d e l s w e r es i g n i f i c a n te f f e c t ，t l l e y c a l lb eu s e dt op r e d i c to i la d s o r p t i o nr a t e ，t r a n s p o r t a t i o nv o l u m e ，a n dd e g r a d a t i o nr a t e ( 3 ) i m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m sa d s o r p t i o nr a t eg r e a t l yr a i s e dt h a nf r e em i c r o o r g a n i s m ， i m m o b i l i z e dc a r d e rm a t e r i a lp l a y e dam a j o rr o l ei nt h ep r o c e s so fa b s o r p t i o n ；n l ea d s o r p t i o n c h a r a c t e r i s t i co fi m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s ma n dc a r d e rm a t e r i a lr e m a i n e dc o n s i s t e n t s i m i l a r l y ，b e c a u s ep o r es t r u c t u r e ，r e d u c e dc a u s e db ya d s o r p t i o no ft h ef r e eb a c t e r i a , a d s o r p t i o na b i l i t yd r o p p e d ，a n dm i c r o b e sc h o o s e do r g a n i ci nt h em a t e r i a la sn u t r i t i o n ，w h i c h c a u s e dt h a tm a t e r i a ls u r f a c ed a m a g e d ，s oi m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s mi m m o b i l i z e dc o m p a r e d w i t hc a r r i e r ，a d s o r p t i o nc a p a c i t yd e c l i n e d ( 4 ) a d s o r p t i o nf u n c t i o no fi m m o b i l i z e dc a r t i e rm a t e r i a lo nt h eo i lb l o c k e dt h ec o n t a c t b e t w e e no i la n dm i c r o o r g a n i s m ，w h i c hc a u s e di m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s mt r a n s p o r to i la ta s l o wp a c e ；o r g a n i cc a r r i e rm a t e r i a lm a d eo i l d i s p e r s eb e t t e r ，w h i c hi s i nf a v o rf o ro i l t r a n s p o r t a t i o n s on o tm a t t e r e da tap e a k ，o rr e a c h e db a l a n c e ，t h eo i lv o l u m et r a n s p o r t e db y i m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s ma r eg r e a t e rt h a nf r e em i c r o o r g a n i s m ( 5 ) o i la d s o r p t i o na n dt r a n s p o r t a t i o n w e r ef a s t e r ，s ot h e yh a ds m a l l e rf o u n c t i o no nt h eo i l d e g r a d a t i o n ，t h ek e yp r o c e s sw h i c ha f f e c to i ld e g r a d a t i o n r a t ea n dd e g r e ei s b i o l o g i c a l d e g r a d a t i o np r o c e s s ；t ot h eo i lp o l l u t a n t s ，i m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s mh a das t r o n gb i o l o g i c a l a c t i v i t y ，a n dab e t t e rd e g r a d a t i o ne f f e c t 。d e g r a d a t i o nd y n a m i c se x p e r i m e n tw a ss t u d i e du n d e r t h e b e s tc o n d i t i o n s ，t h er e s u l t ss h o w e d t h a t ，d e g r a d a t i o np r o c e s s o fi m m o b i l i z e d m i c r o o r g a n i s ma n df r e em e e tl e v e l1d y n a m i c s ，a n dt h ed e g r a d a t i o ns p e e do fi m m o b i l i z e d m i c r o o r g a n i s mi s3 6 7t i m e st h a to f t h ef r e em i c r o b e s k e y w o r d s ：i m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m ；r e s p o n s es u r f a c e ；a d s o r p t i o n ；t r a n s p o r t a t i o n ； o i ld e g r a d a t i o n 中国石油大学( 华东) 硕士论文 第一章绪论 1 1 课题来源与选题依据 石油是“经济的血液 ，作为一种常规能源在工业、交通各部门有着广泛的应用， 而且随着经济的发展，石油的需求量将会增加。石油的生产涉及到开采、运输、炼制、 储存、使用等过程，在石油的生产使用过程中，由于技术水平的限制和操作不当，产生 大量的石油污染物。石油污染物进入土壤、水体、大气，严重影响环境质量，对人类和 生物的生存产生持续威胁i l 】。 因为传统生物处理技术依然存在许多不足，近年来，人们开始采用固定化技术，即 通过物理或化学的方法，固定游离状态的微生物或酶于限定的空间区域内，并保持它的 活性，使其具有良好重复使用性能的一种基本生物技术【2 训。固定化技术的特点是固定 完整的微生物细胞，使细胞和质粒的生物稳定性都得到提副5 j ；同时，提高了单位体积 内固定化细胞的有效浓度；并且能长期保持固定化后的微生物的生物活性；由于固定化 细胞颗粒微环境的存在，能够降低目标微生物与土著菌的恶性竞争【6 】，极端p h 和毒性 物质对微生物的毒害作用也会得到降低【_ 7 1 ，所以即使在复杂环境中，固定化细胞也能够 稳定、高效地发挥作用；固定化载体固定微生物后，大大提高了单位体积内微生物细胞 有效浓度，使污染物的降解率得到提高；由于固定化后的成品具备良好的再生性能，所 以可以被重复使用。在石油污染的土壤修复领域，固定化微生物技术的优势非常明显， 添加到土壤中的固定化载体还能够发挥膨松剂的作用，有利于氧气的传递，这非常有助 于石油的矿化降解【引。 鉴于固定化微生物技术在生物修复方面的优势和降解石油污染物微生物种群丰富 的特点，可利用固定化材料对石油降解细菌进行固化，来降解环境中的石油污染物。目 前固定化微生物的研究方向多集中在固定化微生物的制备条件和相关性能优化改进等 方面，对固定化微生物降解石油污染物的过程规律和机制研究甚少。 石油的降解过程涉及到三个过程：污染物在生物细胞表面的吸附；污染物的跨膜运 输；污染物在纽胞内的降解。本课题以筛选出的高效石油降解菌为菌源，选用可自然降 解的、无害的秸秆材料做载体材料，采用吸附法制备固定化微生物；考察温度、固定化 微生物接种量、原油浓度、p h 等对石油降解三个主要过程的影响，并采用响应面法对 第一章绪论 对三个过程进行优化，在最优条件下通过进行动力学研究，进一步了解固定化微生物降 解石油污染物的过程，揭示降解规律，为固定化微生物降解石油污染物提供理论支持。 1 2 国内外研究现状分析 1 2 1 固定化技术研究进展 1 2 1 1 固定化载体材料和固定方法 固定化技术主要包括酶固定化和细胞固定化技术，目前研究方向多集中在固定化微 生物的制备条件优化、载体选择，和性能优化等方面。吸附法、包埋法、共价结合法和 交联法四种主要的固定化方法中，吸附法和包埋法是最为常用的方法2 1 。 吸附法主要针对无机载体材料的固定化，另外也可以结合有机载体材料和无机载体 材料，组成复合载体材料制备固定化微生物【13 ，h 】。 包埋法主要针对有机材料作为固定化载体，是利用高聚物在形成凝胶时包埋在其内 部，从而固定细胞。温度、p h 值、载体浓度对固定化效果影响最大。温度主要影响包埋 小球的机械强度，温度过高或过低都不利于保持颗粒性状；载体浓度直接影响固定化细 胞的性能，随着载体浓度越高，机械强度和粘度也会增加，操作难度变大，且阻碍营养 物质和氧的传递，对微生物的生长造成很大影响i l5 1 。 有机高分子载体材料可分为天然高分子和合成有机高分子凝胶载体两种，常见的此 类载体有琼脂、角叉莱胶、海藻酸钠等，其中海藻酸钠满是应用最为广泛的载体之一【1 6 1 ， 还有近来研究的比较热门的新载体甲壳素和壳聚糖【1 7 圳】。 p a i 2 2 1 等分别用颗粒活性炭吸附固定细菌和海藻酸钙包埋细菌( 内含1 粉末活性 炭、4 海藻酸钙、1 湿菌体) 来降解高浓度苯酚废水，将制备的海藻酸钙凝胶颗粒在 聚乙烯亚胺溶液中浸泡，来提高其机械强度，结果表明：当来水苯酚浓度为1 0 0 0m g l 时，海藻酸钙颗粒比颗粒活性炭具有更高的苯酚去除率。也可通过加入膨润土、碳酸钙 和二氧化硅等添加剂【2 3 】，或改变c a c l 2 浓度也可以提高固定化颗粒的机械强度，改善固 定化细胞稳定性【2 4 ，2 5 1 。 聂荣掣2 6 】采用补充钙、添加钡和减少包埋量三种方法，提高藻酸盐载体的耐久性。 结果表明，藻酸盐凝胶强度下降主要是因为钙离子的流失。采用减少包埋量的方法，仅 能在短时期使藻酸盐载体的耐久性得到提高；而采用补充钙离子、添加钡离子两种方法， 2 中国石油人学( 华东) 硕上论文 可以长时间保持固定化颗粒的稳定性，并且固定化颗粒得到加固后，同时具有了良好的 生化性能。 h a q u et a s i m a 等1 2 7 1 研究涂有多聚赖氨酸( p l l ) 和壳聚糖的药用聚乙二醇( p e g ) 的新型微胶囊膜的性能，并与之前制备的海藻酸盐壳聚糖p e g 微胶囊和海藻酸盐 p l l p e g 海藻酸盐微胶囊比较，结果表明：含有p e g 的微胶囊可维持细胞的存活率， 可提高微胶囊在低渗压溶液中的稳定性；三种微囊膜都可以为细胞提供免疫保护。 d ec a s t r oh f 等【2 8 】采用稻草作为载体，用戊二醇和聚乙烯乙二醇分别作为活化剂 和稳定剂，来固定微生物脂肪酶。通过设计2 2 因素实验方法，研究聚乙烯乙二醇分子 量的影响和载体对酶的固定量。 无机载体也是一类重要的载体，如活性炭、多孔陶珠、硅藻土、红砖碎粒、沸石、 微孔玻璃、砂粒、氧化铝、高岭土等，这些载体材料机械强度大、对微生物无毒性、不 易被微生物分解、耐酸碱、成本低、寿命长1 2 9 , 3 0 i 。 有机载体和无机载体还包括天然的植物材料、粉煤灰和贝壳等，由于这类材料 不会污染环境，关于天然材料3 3 ，3 4 1 的研究，近年来也越来越多。 1 2 1 2 固定化微生物技术在废水治理和污染土壤修复方面的应用 固定化微生物技术在废水处理中应用较广，被处理废水的种类主要有一般高浓度有 机废水、印染废水、含氮废水、难降解有机废水和重金属废水 3 s 埘】。 毛雪慧1 4 5 等利用沸石和海藻酸钠作固化剂，对球形红假单胞菌进行固化，来处理含 c d 和c r 废水，结果表明，固定化菌对c d 和c r 去除效果比游离菌好。废水p h 值、菌 体投加量对处理效果影响较大，当废水的p h 值为6 0 、菌体投加量为1 0 0 0g l j 时，对 浓度为4 0 0 0m g l 1 含c d 废水的去除率可达9 6 6 8 。 罗晓虹【4 6 】等首次利用聚丙烯酰胺与壳聚糖形成的互融聚合物网络凝胶，固定非活性 的铜绿假单胞菌，并研究了这种新型的固定化微生物颗粒对c u 2 + 的吸附特性。该固定化 微生物吸附剂表现出较好的吸附性能。 在污染土壤生物修复领域中，固定化微生物技术也被广泛地应用，目前在石油污染 土壤中研究最多【4 7 ，4 引。首先从污染土壤中筛选能高效降解污染物菌株作为目标菌株，选 取固定化载体材料，可以采用吸附法和包埋法对目标菌株进行固定化，应用在污染土壤 的修复中1 4 9 5 1 1 。 第一章绪论 刘媚媚1 5 2 】以活性炭纤维作为固定化载体材料，对从土壤中筛选驯化得到的高效石油 降解菌进行固定化。结果表明，石油降解菌固定化的最佳活性炭纤维用量为6 2 5 l ， 当石油培养基盐度为0 3 5 、p h 为7 、初始石油浓度为5 0 0 0 m g l 时，固定化石油降 解菌降解率比游离的石油降解菌高3 0 2 ，且重复利用性好。 综上，与游离微生物相比，固定化微生物的很多理化性能都具有优势。首先，载体 的屏蔽作用避免了固定化微生物受到有毒有害物质直接侵害，增强了对环境的适应能 力；其次，大大提高了单位体积内固定化细胞的有效浓度，提高了对目标污染物降解能 力；并且，固定化微生物具有良好的重复使用性能。因此，修复治理环境污染，固定化 微生物技术与游离微生物技术相比，优势更加明显。 1 2 2 微生物吸附行为 微生物对污染物的吸附作用在对污染物的降解去除过程中，无疑占据着很重要的作 用，受到非生物体( 吸附材料) 吸附动力学研究的影响，人们开始对微生物的吸附行为 进行动力学研究，以期能更好地了解吸附在生物修复中的作用，但是从目前的文献来看， 这方面的研究还不是很多。研究热点主要集中在两个方面：( 1 ) 吸附量的确定，跟吸 附材料不同，游离微生物一般采取离心，差减法确定吸附量；( 2 ) 动力学方程模型的 选取，目前还没有统一的微生物吸附动力学方程。 罗雪梅【5 3 】用一株枯草芽孢杆菌，针对微生物在沉积物和湿地土壤吸附菲和苯并芘 ( b a r ) 过程中的影响，进行动力学研究。她将培养后的微生物离心，取得上清液，测定 菲和苯并芘浓度，用差减法计算吸附量。分别采用四种不同的动力学方程对实验数据进 行拟合。结果表明：拟合效果较好，表明这四种方程可以用来预测微生物对多环芳烃的 降解；菲与b a p 都可以被枯草芽孢杆菌生物降解，且微生物菲的利用率高；接种微生物 后的土壤与沉积物，与仅有微生物吸附菲和b a p 的吸附动力曲线相近似，表明微生物降 解是多环芳烃含量降低的主要原因；沉积物与土壤接种微生物后，对菲的吸附量比苯并 芘高。 王红旗【5 4 1 等筛选驯化得到一株可以利用正十六烷的菌株，并研究菌株对烷烃的吸附 行为。将培养后的细菌离心清洗后，用g c 测定正十六烷浓度，然后根据实验数据，选 择合适的动力学模型，建立吸附动力学方程。结果表明：细菌正十六烷的吸附为2 个阶 段：第1 阶段( o 1 0 m i n ) ，开始阶段，正十六烷向微生物表面扩散非常迅速，吸附速度快， 正十六烷浓度不断增大，用零级吸附动力学模型拟合，效果较好；在第1 i 阶段( 1 0 6 0 m i n ) ， 4 中国石油大学( 华东) 硕士论文 吸附速度明显减慢，吸附推动力开始降低，微生物吸附的正十六烷逐渐减少，此时用动 力学方程c = k t + b 拟合，效果也较好。 1 2 3 微生物运输行为 微生物治理环境污染，应用越来越广泛。微生物降解环境中的污染物，首先要修复 摄取，其次是富集运输，这两个过程在微生物的降解作用中的地位非常重要。目前对微 生物的运输机理研究主要集中在石油烃的运输方面。 潘学芳【5 5 】等筛选得到一株高效石油降解菌株s d 2 ，并利用s d 2 对石油烃类运输机 理进行了初步研究。将细菌接种到原油培养基3 5 培养7 天，将发酵液用石油醚萃取， 洗涤离心，收集菌体细胞。再次用石油醚和蒸馏水进一步洗涤，得到菌悬液，分成两部 分，一部分用无水乙醚萃取；另一部，将细胞破碎离心，将上清液用无水乙醚萃取，用 无水硫酸钠干燥得到干燥的萃取液，最后将两部分萃取液做气象色谱分析。研究表明： 石油烃类在细胞中的运输，首先是将石油烃紧密地吸附在细胞表面，然后运输到细胞内， 运输过程虽然不加修饰，但对石油烃成分有一定的选择性。 王红旗【5 4 】等通过动力学分析，研究2 种可以利用正十六烷的微生物( d q 0 1 和d q 0 2 ) 摄取和运输正十六烷的机理。将菌体接种到正十六烷培养基上，经过萃取，洗涤，离心 破碎，再萃取，干燥，用g c 测定菌种体内的浓度。结果表明：菌种d q 0 1 将正十六烷 运输到体内，整个过程可以分为第1 阶段( o 1 5 m i n ) 和第1 i 阶段( 1 5 - 6 0 m i n ) ，均符合零级 动力学方程拟合结果；菌d q 0 2 整个运输过程分为第1 阶段( 0 - 1 5 m i n ) 、第1 i 阶段 ( 1 5 3 0 m i n ) 和第1 阶段( 3 0 6 0 m i n ) ，均符合零级动力学方程拟合结果；还通过在实验中 加入n a n 3 抑制a t p ( 三磷酸腺苷) 的生成，判断实验所用菌种运输正十六烷的过程，属 于主动运输。 1 2 4 微生物降解动力学及机理 目前，生物法因为成本低，投资少，效率高，对环境二次污染少等优点，应用越来 越广泛。一研究微生物降解的机理也受到越来越多的关注，其中微生物降解动力学成为其 中热点。一般地，动力学包括以下几个方面的内容：基质降解动力学、微生物生长动力 学和产气动力学。也可将其概括地分为两类，即一类是利用m o n o d 的动力学模型；另 一类是利用一级反应的动力学模型【5 6 , 5 7 】。 第一章绪论 1 2 4 1 微生物降解废水中污染物动力学研究 在废水处理过程中，动力学表达为群体动力学，废水中基质的去除是生物处理的基 本任务，而微生物的生长是基质去除的结果。反应体系中动力学行为表现为微生物的生 长和废水基质的消耗。 马占青1 5 8 】等以自配污水为处理对象，对e m 菌降解有机物的动力学方程进行了研 究。选择不同初始c o d 。，浓度的人工配制废水，加入等量的e m 菌液，每隔一定时间测 定c o d 。，浓度，根据实验结果和动力学实验建立动力学模型。结果表明，在基质浓度远 大于m o n o d 常数时，e m 菌的生长符合零级动力学关系：当基质浓度远小于m o n o d 常 数时，e m 菌的生长符合一级动力学关系。 郭雅琼1 5 9 】在一体式膜生物反应器处理稀土氨氮废水的实验中，通过合理的理论推导 和实验验证，得出消化过程中的基质降解的动力学模型，测出了基质降解动力学模型中 的相关参数，并推导出了微生物生长的动力学模型。结果表明：氨氮降解符合m o n o d 方程，并从生物膜组成角度，清楚地揭示其生长动力学行为的变化。 目前很多研究是用单一菌种降解单一基质，而实际废水成分复杂。 全向春删研究了皮氏伯克霍尔得氏菌在喹啉与葡萄糖共基质时，对二者的降解动力 学。结果表明：在共基质条件下，微生物能同时降解喹啉与葡萄糖。葡萄糖的存在促进 了生物降解喹啉，而喹啉的存在减弱了葡萄糖的微生物降解作用。当喹啉浓度为 5 0 m g l ，葡萄糖浓度为3 4 、6 0 、1 1 0 m g l ，二者共基质时，喹啉与葡萄糖的降解都遵 循一级反应动力学。 刘佐才【6 1 1 用一株新的降解喹啉的优势菌种，研究共基质的生物降解动力学。分别配 制不同浓度的喹啉与苯酚，喹啉与吡啶，喹啉与亚硝酸盐，喹啉与硝酸盐，喹啉与氨离 子共基质的溶液，再加入皮氏伯克霍尔德氏菌纯菌悬浮液，进行动力学实验。结果表明： 皮氏伯克霍尔德氏菌降解喹啉的动力学行为符合h a l d a n e 方程；苯酚和吡啶对此起抑制 作用；而n 0 3 和葡萄糖，特别是葡萄糖对此起激活作用；而n 0 2 和n h 4 + 对此基本无影 响。 1 2 - 4 2 微生物降解土壤中污染物动力学 土壤中的污染物降解动力学比在与废水中的动力学研究简单，一般生物降解过程都 符合一级反应动力学关系： c = c o e 。幻 ( 1 1 ) 6 中国石油人学( 华东) 硕上论文 式中：c - 剩余污染物浓度；c 分初始污染物浓度；缸速率常数；，- 反应时间。 以式( 1 1 ) 为动力学方程对微生物、温度、含水率等其他参数进行动力学研究。 张小啸【6 2 】等以罗丹明1 2 3 为荧光探针，使用激光扫描共聚焦显微镜系统，研究了 正十六烷在石油降解菌细胞膜上的吸附降解动态变化过程。结果表明：正十六烷加入到 微生物培养体系1 2 0s 后，菌株膜上的正十六烷浓度的变化不断增大，呈不规则的锯齿 状攀升；攀升过程中，明显有“节奏”的振荡在峰谷之问传递；0 5 0s 内，正十六烷吸 附运输不断加速：5 0 1 2 0s 内，不断被吸附的正十六烷在细胞膜表面累积。使用幂指数 定律，建立该微生物膜上的正十六烷的动力学方程，为二级动力学，速率常数为6 e 一。 马秀兰1 6 3 】等在可控条件下，用从施用阿特拉津多年的栽参土壤中分离出的3 株放线 菌，降解土壤中的阿特拉津。结果表明：阿特拉津在土壤中生物降解过程，符合关系为 式( 1 1 ) 反应应动力学，相关系数为o 8 1 0 9 9 。阿特拉津在土著微生物作用下的降解 半衰期为2 6 6 2 8 4d ，放线菌接入到土壤中后，降解半衰期为2 2 0d 。 王军l 删研究了苯醚甲环唑在北京、萧县、杭州及长沙4 个地区土壤中的降解动力学， 以式( 1 1 ) 为方程探讨了土壤微生物、温度、含水量及药剂质量分数对其降解的影响。 结果表明：土壤微生物对苯醚甲环唑降解起主导作用。 马宏瑞【6 5 】研究了以烃为惟一碳源条件下，一株石油烃降解菌( 假单胞菌d s i i i ) 的 生长特征、降解性与脱氢酶活性变化之间的关系。结果表明，脱氢酶活性比细胞生物量 增长滞后，适应后，d s i i i 的脱氢酶活性变化，与降解柴油的趋势基本一致；d s i i i 菌的 对数生长期代时为4 0 5 d ，生长速率为0 2 5 d 一。d s i i i 的脱氢酶活性，在培养温度3 2 。c 、 p h6 5 时达到最高，在该条件下获得的米氏方程中，为1 5 9 1 6 1 a g l ，为 l1 0 6 9 9 l 。1 d 。 郭东梅【6 6 】在实验室条件下，研究了吡虫啉在4 种土壤中的降解动态，以一级动态 方程对实验数据进行拟合，相关系数r 大于0 9 ，说明拟合效果很好。结果发现，吡虫 啉在浙江土壤中降解最快在江西红壤中降解最慢。土壤有机质含量和农药浓度对吡虫啉 在土壤中降解有一定影响，土壤有机质含量越高降解越快，反之亦然。 徐珍【6 7 】采用实验室模拟试验研究了土壤微生物、氟铃脲初始浓度、土壤c u 含量、 土壤含水率及温度对土壤中氟铃脲降解的影响。以式( 1 1 ) 为动力学方程对这5 个因 素的实验进行数据拟合，相关系数r 都大于0 9 。结果表明，微生物对氟铃脲在土壤中 的降解有显著影响。 第一章绪论 1 2 4 3 固定化微生物降解污染物动力学及机理 张秀霞1 6 8 】选用纳米s i 0 2 作为载体固定菌种q 5 ，制成固定化微生物，对其降解喹啉 的效果及动力学进行研究。研究表明，当喹啉在溶液中的浓度分别为5 0 0 、1 0 0 0 、1 5 0 0 m g l j 时，固定化q 5 降解喹啉遵循一级动力学反应： l n c = a + k t t ( 1 - 2 ) 方程相关系数均大于o 9 7 ，拟合效果较好；随着喹啉初始质量浓度的升高，固定化 q 5 降解喹啉的速率常数减小：采用固定化q 5 的降解速率常数，远高于游离q 5 的降解 速率常数。 孙永利【6 9 】等通过正交实验考察不同固定化材料、溶液p h 值和生物接种量，确定出 适宜的菌株固定化包埋条件。分别用游离单株优势菌和固定单株优势菌对p c p 进行降解 实验研究，对比结果表明固定化的菌株表现出了较好的降解效果。通过固定化菌株对 p c p 的降解动力学研究，确定不同固定化菌株的m o n o d 参数。 全向春1 7 0 1 通过富集培养，从焦化污泥中筛选到1 株可以降解喹啉，并以喹啉为唯一 碳源和氮源的菌种( 鉴定为皮氏伯克霍而德氏菌) 。采用纱布p v a 复合载体固定化的 方法，对固定化微生物降解喹啉的行为进行动力学研究，结果表明，当喹啉浓度为5 0 、 1 0 0 、3 0 0 、5 0 0m g l 1 时，固定化微生物降解喹啉遵循零级动力学反应，随着喹啉初始 浓度的升高，降解速率常数增加。 汪玉【7 1 】以粘土矿物为载体，采用吸附挂膜法对已筛选的阿特拉津降解菌株进行固定 化，并应用固定化微生物降解土壤中的阿特拉津。结果表明，在土壤中，阿特拉津的降 解过程符合一级降解动力学方程，相关系数都在0 9 0 左右，拟合效果较好；阿特拉津在 不同土壤中，降解速率不同。在红壤、砂姜黑土、黄褐土中，阿特拉津的降解半衰期( t 1 2 ) 分别为3 6 9 、4 9 1 、5 5 0d 。投加纳米蒙脱石后，半衰期则分别为1 6 3 、2 5 3 、2 1 7d 。 1 2 5 响应面优化 1 2 5 1 响应面优化的定义与模型 响应面优化法( r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ) 是实验过程中寻求最佳实验条件的 方法，是通过设计有限次数实验来获取各个因素条件下的实验结果，进而利用回归方程 描述实验结果与各因素之间对应关系，再通过回归方程的分析确定最佳实验结果条件的 方法。 8 中国石油大学( 华东) 硕士论文 常见实验设计方法有两水平设训7 2 1 、星点设计( c c d 设计) 、b o x b e h n k e n 设训7 4 1 ， 一般采用两水平实验设计或单因素实验来对影响实验的多个因素进行筛选，找到影响实 验结果的主要因素，再通过星点设计或b o x b e h n k e n 设计确定最佳实验条件。目前常用 的是星点设计，但与星点设计相比，b o x b e h n k e n 设计所需实验次数相对较少，效率更 高且所有影响因素不会同时处于较高水平，实验点能够落在安全区域，该设计得到广泛 应用。 1 2 5 2 响应面优化的一般步骤 ( 1 ) 确定影响实验的主要因素和水平。影响实验结果的因素有多个时，首先需要 经过筛选，选出显著影响因素再进行设计实验。对与筛选出的影响因素还需确定中心点， 中心点是实验结果相对最优时的各个因素实验条件的组合。找到中心点后，在中心点两 侧对称取水平。常见确定因素和中心点的方法有单因素法【7 5 , 7 6 1 、最陡爬坡实验法【7 7 ，7 引。 ( 2 ) 编制实验表，按实验表进行实验。 ( 3 ) 对实验结果用回归方程进行分析，寻求最佳实验条件。 ( 4 ) 在最佳条件下实验，验证实验条件。 1 2 5 3 响应面优化法实验设计优点 响应面优化法通过合理的选择实验模型来关联实验结果和各个实验因素之间的关 系，并将这种关系以回归方程的形式量化，可连续动态观察实验结果与各个因素之间的 对应关系。 正交实验则是仅仅考虑各个实验因素值的组合条件下的实验结果，无法连续观察和 预测其他实验条件下的结果，且无法观察实验因素交互作用对实验结果影响。 均匀设计则是以追求实验的均匀性来减少实验次数为目的，采用多重回归的方法来 研究响应变量随自变量的变化的回归方程就不是唯一的，而且其在实验设计时没有考虑 全部交互作用，只有通过回归分析时引入因素之间的交叉乘积项等来进行探索，因此结 果不稳定【7 9 1 。 9 第一章绪论 1 3 研究目标、研究内容、拟解决的关键问题 1 3 1 研究目标 通过考察温度、固定化微生物接种量、原油浓度、p h 等对石油降解三个主要过程 的影响，并采用响应面法对三个过程进行优化，在最优条件下通过进行动力学研究，进 一步了解固定化微生物降解石油污染物的过程，揭示降解规律，为固定化微生物降解石 油污染物提供理论支持。 1 3 2 研究内容 ( 1 ) 固定化微生物的制备。筛选高效石油降解菌、选择固定化载体材料，考察载 体材料对吸光度测定的影响，采用吸附法制备固定化微生物，考察固定化载体材料吸附 高效石油降解菌数量。 ( 2 ) 固定化微生物吸附石油规律研究。考察原油浓度、固定化微生物接种量、温 度3 个单因素对固定化微生物吸附的影响响应面优化实验；根据单因素实验结果，利用 响应面优化软件d e s i g n - e x p e r t8 0 5 进行b o x - b e h n k e nd e s i g n ( b b d ) 实验设计，并对实验 结果进行分析，考察因素交互影响，寻求最佳吸附效果时的实验条件吸附动力学实验； 在最佳实验条件下，分别用固定化微生物、固定化载体、游离菌体进行吸附动力学实验， 比较吸附规律。 ( 3 ) 固定化微生物运输石油规律研究。单因素实验，考察原油浓度、接种量、温 度、p h4 个单因素对固定化微生物运输富集石油含量的影响；利用响应面分析法考察因 素交互影响，并寻求最佳条件；用固定化微生物、游离菌体进行运输动力学实验，分析 运输规律；并判别微生物运输石油的的方式。 ( 4 ) 固定化微生物降解石油规律研究。考察原油浓度、接种量、温度、p h4 个单 因素对固定化微生物降解石油的影响；利用响应面分析法考察因素交互影响，并寻求最 佳条件；最佳实验条件下，分别用固定化微生物、游离菌体进行降解动力学实验，分析 释解规律；分别提取胞内酶和胞外酶进行降解实验，并用米氏方程描述粗酶液降解石油 动力学，分析结果。 1 0 中国石油大学( 华东) 硕。 二论文 1 3 3 拟解决的关键问题 ( 1 ) 微生物吸附石油浓度、运输石油浓度测定方法的选择问题； ( 2 ) 响应面优化分析实验的设计问题； ( 3 ) 吸附、运输及降解过程动力学的研究方法； ( 4 ) 酶降解的研究方法。 1 4 拟采取的研究方法、技术路线及其可行性分析 1 4 1 研究方法 本研究以有机秸秆材料为载体，通过表面吸附固定化方法制备固定化微生物。对固 定化微生物的性能进行测定。分别用响应面法对吸附摄取、富集运输和生物降解三个过 程进行分析，并进行动力学研究，建立动力学方程，进一步了解固定化微生物降解石油 污染物的过程，揭示降解规律，为固定化微生物降解石油污染物提供理论支持。 第一章绪论 1 4 2 技术路线 固定化微生 物降解石油 污染物规律 研究 1 4 3 可行性分析 1 4 3 1 理论可行性 固定化微生 物的制备 固定化微生 物降解石油 污染物规律 实验 固定化微生物 降解石油污染 物规律分析 高效石油降解菌的筛选 固定化载体材料选择 同定化载体材料吸附高效石油降解菌数量考察 吸附规律 研究 运输富集 规律研究 生物降解 规律研究 响应面法分析吸附过程实验 吸附过程动力学研究实验验 响应面法分析运输过程实验 运输过程动力学研究实验 运输方式判别实验 响应面法分析降解过程实验 生物降解过程动力学实验 酶降解实验 总结上述实验结论，分析固定化微生物降解石油污 染物的过程，揭示降解规律 本实验是研究固定化原油降解菌降解石油的规律。利用微生物固定化技术修复受