（食品科学专业论文）大豆11S、7S球蛋白的功能特性及其与淀粉相互作用研究.pdf

华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 大豆l l s 、7 s 球蛋白的功能特性及 其与淀粉相互作用的研究 摘要 大豆蛋白的营养价值高、资源丰富、原料成本低，并且还与食品的嗜好性、加 工性等各种功能性质相关联。1 1 s 和7 s 球蛋白是其主要组分，在大豆蛋白的功能特 性中起重要作用。近年来，有关l l s 和7 s 球蛋白的功能性质的研究鲜有报道，关于 1 1 s 或7 s 球蛋白与淀粉复合体系的研究也尚未见详细报道。本文从大豆中提取、分 离及鉴定了具有较高纯度的l l s 和7 s 球蛋白，评价了其改性后的功能性质，并且初 步探讨了与两种淀粉复合后体系的流变学特性、热变性及质构特性。主要研究结果 如下： 1 、l l s 和7 s 球蛋白的提取、分离、纯化和鉴定 比较了三种提取分离方法，根据目标1 l s 和7 s 球蛋白的相对纯度，确定了t h a n h 法作为本实验方法。在t h a n h 法的基础上，实验比较了3 种提取缓冲液的提取效果， 结果表明采用t r i s h c i ( p h 8 0 ，0 0 3 m o l l 巯基乙醇) 缓冲液时1 l s 和7 s 球蛋白 的提取率最高。 l l s 和7 s 球蛋白的纯化采用了硫酸铵分级沉淀法及凝胶过滤法，通过各级纯化 蛋白的凝胶过滤图谱，可以看出n s 和7 s 球蛋白的纯化效果明显。 采用s d s - - p a g e 法、凝胶过滤图谱的峰单一性及凯氏定氮法鉴定了蛋白纯度。 结果表明s d s - - p a g e 图谱与文献报道相一致，凝胶过滤图谱呈单一的峰，而且蛋 白含量高达9 5 ，已经达到研究所需纯度。 2 、1 1 s 和7 s 球蛋白的构象表征 采用了傅立叶红外光谱法( f t - i r ) 、圆= 色谱法( c d ) 、原子力显微镜法( a f m ) 和差示扫描量热法( d s c ) 对l l s 和7 s 球蛋白的构象进行了初步的表征。从傅立叶 红外光谱图中可以看出l l s 和7 s 球蛋白的以a 一螺旋结构为主，与圆二色谱图得到 的结论相符：原子力显微镜观察中性溶液中7 s 和l l s 球蛋白均呈球状，直径分别约 为5 6 n m 和1 0 5 r i m ad s c 结果表明7 s 和1 l s 球蛋白的变性吸热峰分别为韶9 c 和 6 0 6 c ，根据蛋白质热变性的原理，这一过程可能是蛋白质空间结构被破坏的过程。 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 3 、1 l s 和7 s 球蛋白的凝胶特性 评价了大豆分离蛋白( s p i ) 、1 1 s 和7 s 球蛋白的持水性、乳化性、凝胶质构特 性( 硬度、粘性和粘结性) 。结果1 1 s 和7 s 球蛋白的功能性质均优于s p i ，并且7 s 球蛋白的乳化能力大大优于s p i ：加热温度与蛋白质凝胶特性基本呈正相关性，但 是9 0 ( 2 时达到最大；p h 5 8 时，凝胶硬度逐渐降低，等电点附近蛋白质成胶能力最 弱；离子强度0 2 1 6 时，n a c l 离子有减弱蛋白的凝胶化的趋势，尤其当离子强 度大于0 6 时1 1 s 球蛋白不能凝胶化。 4 、7 s 球蛋白的改性研究 改性后的大豆7 s 球蛋白四项功能性质都有不同程度的改善。乙酰化改性提高 7 s 球蛋白的乳化稳定性、改善了持水性；磷酸化使7 s 球蛋白的溶解性提高、吸油 性增加；酶改性蛋白的持水性较好，但是水解度大于1 5 时，改性后的乳化稳定性 和吸油性下降。 5 、蛋白质与淀粉复合体系的性质研究 蛋白质与淀粉的相互作用影响共存体系的质构特性、热变性及流变性。共存体 系的凝胶质构特性研究结果表明，随着蛋白质含量的增加体系的硬度逐渐降低。蛋 白质、淀粉的种类影响共存体系的质构特性，如随着蛋白质添加量的增大，7 s 一土 豆淀粉体系的粘性逐渐下降，7 s 一玉米淀粉体系的粘性有所增大；而1 1 s 与两种淀 粉的共存体系的粘性随着蛋白质的添加量的增大都呈上升趋势。 7 s - ：f f 豆_ 淀粉体系的热交性与体系中二者比例相关，并且共存体系中存在两个 或以上变性峰。在升温、保温和降温过程中，7 s 一土豆淀粉体系的流变性受二者相 互作用的影响。 关键词 1 i s 球蛋白；7 s 球蛋白；改性：功能特性；构象：淀粉：交互作用 2 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 s t u d i e so nf u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fl l sa n d7 sg l o b u l i ni n s o y b e a na n di n t e r a c t i o nb e t w e e np r o t e i na n ds t a r c h a b s t r a c t s o y b e a np r o t e i na r ce x t e n s i v e l yu s e df o rp r o c e s s e df o o da n dt r a d i t i o n a lc h i n e s ef o o d s b e c a u s eo ft h e i rf u n c t i o n a lp r o p e r t i e sa n dh i g l ln u t r i t i o n a lv a l u e s o y b e a np r o t e i n sc o n s i s t o ft w om a j o rc o m p o n e n t s ，7 sa n dl l s 酉o b u l i n s ，w h i c hh a v ed i f f e r e n tf u n c t i o n a l p r o p e r t i e sa n ds t r u c t u r e s i nt h ep r e s e n ts t u d y , s o m ei n v e s t i g a t e df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so f 7 sa n d1 1 sg l o b u l i n s t h el i t e r a t u r ei ss c a n t yc o n c e r n i n gat w oc o m p o n e n ti n t e r a c t i o n b e t w e e ns o y b e a np r o t e i n sa n ds t a r c h i nt h i sp a p e r , t h em e t h o d so fe x t r a c t i o n ，i s o l a t i o no f 7 sa n dl l sg l o b u l i n sw e r es e t u p ，t h ec o n f o r m a t i o no f7 sa n d l l sg l o b u l i n sw e r e d e t e c t e db yf t - 1 r ，a f m ，c d ，d s c ，t h eg e lp r o p e r t i e so f7 sa n d1 1 sg l o b u l i n sw e r e d e t e r m i n e d ，7 sg l o b u l i nw a sm o d i f i e db yc h e m i c a la n de n z y m a t i cm e t h o d s ，at w o c o m p o n e n ti n t e r a c t i o nb e t w e e ns t a r c ha n d7 sg l o b u l i nw a si n v e s t i g a t e db yt e x t u r ep r o f i l e a n a l y s i s ，d s ca n dr h e o m e t e nt h er e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w ： 1 e x t r a c t i o n ，i s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f7 sa n dl l sg l o b u l i n si n s o y b e a n c r u d e7 sa n dl l sg l o b u l i n sw e r ep r e p a r e da c c o r d i n gt ot h em e t h o do ft h a n he ta 1 t h e c r u d e7 sa n d1 1 s g l o b u l i n sw e r ef u r t h e r f r a c t i o n a t e dw i t ha m m o n i u ms u l f a t e c h r o m a t o g r a p h i cf r a c t i o n a t i o n so ft h ec r u d e7 sa n dl l sg l o b u l i n sw e r ep e r f o r m e do na c o l u m no fs e p h a r o s e6 b t h ep u r i f i e d7 sa n dl l sg l o b u l i n sf r a c t i o n a t i o n sw e r ef o u n dt o b eh o m o g e n e o u sf r o ma n a l y s eb yg e le l e c t r o p h o r e s i s t h ep r o t e i nc o n t e n to ft h el l s g l o b u l i na n d7 sg l o b u l i nw e r er e s p e c t i v e l y9 5 0 6 ，9 5 3 5 ，w h i c hw e r eo b t a i n e df r o m t h i sc h r o m a t o g r a p h y , d e t e r m i n e da c c o r d i n gt ot h ek j e l d a h lm e t h o d 2 t h ec o n f o r m a t i o no f7 sa n di l sg l o b u l i n s a st h er e s u l t so fc ds p e c t r u ma n df t - i rs p e c t r u ms h o w n ，t h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo f7 s a n dl l sg l o b u l i n sw e r em a i n l ya h e l i x 7 sa n dl l sg l o b u l i n sw e r eo b s e r v e da sm a i n l y g l o b u l a rf o r mb ya f m ，t h e i rs i z e sw e r ea b o u t5 6 n m ，1 0 5n mr e s p e c t i v e l y t h ed e n a t u r e d t e m p e r a t u r e so f7 sa n dl l sg l o b u l i n sw e r er e s p e c t i v e l y5 8 9 0 ，6 0 6 0 ，m e a s u r e db y d s c 3 t h eg e lp r o p e r t i e so f7 sa n dl l sg l o b u l i n s t h ee m u l s i f i c a t i o na b i l i t yo f7 sg l o b u l i nw a sh i g h e rt h a ns o y b c a np r o t e i ni s o l a t e h e a t i n g t e m p e r a t u r ea c c e l e r a t e dp r o t e i n sg e l a t i o nd u r i n g7 0 - 9 0 c p hv a l u ea f f e c t e dg e lt e x t u r a l 3 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 p r o p e r t i e si n t e n s i v e l y t h eg e l si l e a l f r o mp ih a daw o r s et e x t u r a lp r o p e r t y i o n i cs t r e n g t h o fn a c lw e a k e n e dh a r d n e s so fp r o t e i n sg e l s a n d1 1 sg l o b u l i nc o u l d n tf o r mg e lw h i c h h e a t e da t9 5 ，4 5 m i n ，1 5 ( w v ) a n di 0 6 4 c h e m i c a la n de n z y m a t i cm o d i f i c a t i o no f7 sg l o b u l i n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tb o t ht h em o d i f i c a t i o nm e t h o d so fc h e m i s t r ya n de n z y m ec o u l d t a k es o m em e l i o r a t i o n st ot h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fs o y b e a n7 sg l o b u l i n t h ec a p a c i t y o fh o l d i n gw a t e ra n dt h ee m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t yo fs o y b e a n7 sg l o b u l i nc o u l db eg r e a t l y a d v a n c e db ya p p e n d i n ga c e t i ca c i da n h y d r i d e ( 1 5 v w ) ，t h ea b s o r b e n c yo fo i lc o u l db e e v i d e n t l ya d v a n c e db yt h ea c c e s s i o no fs t pf 1 w w ) t h ec a p a c i t yo fh o l d i n gw a t e r , e m u l s i f i c a t i o na n de m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t yo fs o y b c a n7 sg l o b u l i nm o d i f i e db yp a w p a w p r o t e i n a s ew e r ee v i d e n t l ya d v a n c e dw h i l et h eh y d r o l y z ei n d e xw a s1 0 7 8 s o y b e a n7 s g l o b u l i nc o u l db eh a r d l ya d v a n c e db ya s l 3 9 8p r o t e i n a s e 5 。at w oc o m p o n e n ti n t e r a c t i o nb e t w e e ns t a r c ha n dp r o t e i n at w oc o m p o n e n ti n t e r a c t i o nb e t w e e ns t a r c ha n dp r o t e i nh a de f f e c t so nt e x t u r a l ，t h e r m a l a n dr h e o l o g i c a lp r o p e r t i e so fp r o t e i n - s t a r c hs y s t e m g e lh a r d n e s so fm i x e dg e ld e c r e a s e d w h e nt h ep r o t e i nf r a c t i o ni n c r e a s e d t h et e x t u r a lp r o p e r t i e so fp r o t e i n s t a r c hs y s t e mw e r e a f f e c t e db yv a r i e t yo fp r o t e i no rs t a r c h a p u r e7 sg l o b u l i no rp o t a t og e lh a do n l yo n ed e n a t u r a t i o np e a k b u tm u l t ip e a k si n 7 s p o t a t os y s t e mw e r ef o u n db yd s c s c a n s t h er h e o l o g l c a l ( g ，s t o r a g em o d u l u s ) p r o p e r t i e sh a dc h a n g e sw i t hr a t i oo f7 sg l o b u l i ni n m i x e ds y s t e m sd u r i n gh e a t i n g ，h e a tp r e s e r v i n ga n dc o o l i n g t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et w oc o m p o n e n ti n t e r a c t i o nb e t w e e ns t a r c ha n dp r o t e i nw a s e x i s t e d k e y w o r d s l l sg l o b u l i n ；7 sg l o b u l i n ；m o d i f i c a t i o n ；f u n c t i o n a lp r o p e r t i e s ； c o n f o r m a t i o n ；s t a r c h ；i n t e r a c t i o n 4 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 s p i s p c f ：c m c d f t i r d s c s b s 缩略表 s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e s o y b e a np r o t e i nc o n c e n t r a t e d a t o mf o r c em i c r o s c o p e c i r c u l a rd i c h r o i s m f o u r i e rt r a n s f o r m a t i o ni n f a r e d d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y s o d i u mb i s u l f i t e 大豆分离蛋白 大豆浓缩蛋白 原子力显微镜 圆二色谱 傅立叶红外光谱 差示扫描量热 亚硫酸氢钠 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 前言 1 研究目的及意义 大豆蛋白是世界上最丰富、最廉价的蛋白质。大豆蛋白具有高的营养性，特别 是具有多种功能性，因此在食品工业得到广泛的应用。大豆蛋白中球蛋白占总蛋白 的5 0 9 0 ，除2 s 球蛋白和1 5 s 球蛋白两个含量少的组分之外，主要的组分是7 s 球蛋白和1 1 s 球蛋白。 大豆7 s 球蛋白是大豆蛋白的主要组分之一，约占大豆蛋白总含量的3 7 左右， 大豆7 s 球蛋白是一类三聚糖蛋白( 分子量1 4 10 0 0 1 7 00 0 0 ) ，由疏水相互作用缔合 的n ( 分子量5 80 0 0 ) 、a ( 分子量5 70 0 0 ) 和6 ( 分子量4 20 0 0 ) 三个亚单位组成。 大豆7 s 球蛋白的热凝胶形成性是大豆蛋白在食品中应用最重要的功能特性之一，这 是由于许多大豆食品的加工就是利用大豆蛋白的凝胶化来制作的。因此，大豆7 s 球 蛋白的性质对大豆蛋白的应用有至关重要的影响。 大豆1 1 s 球蛋白含量占大豆蛋白总含量的3 0 以上，它是由酸性多肽( 分子量 3 50 0 0 3 70 0 0 ) 和碱性多肽( 分子量2 00 0 0 ) 构成的、分子量为3 0 00 0 0 3 8 00 0 0 的疏水性六聚体。亚基之间以及相同亚基之间通过二硫键结合。大豆1 1 s 球蛋白的 热凝胶形成性同样是大豆蛋白在食品中应用的最重要的功能特性之一。大豆1 l s 球 蛋白既可以作为食品的组分，也可以作为添加剂，以其独特的胶凝特性提高和改善 原有食品的质构特性及口感。 我国的大豆蛋白深加工产品主要有大豆浓缩蛋白( s p c ) 和大豆分离蛋白 ( s p i ) ，对二者功能特性和加工特性的研究及应用已经十分广泛和成熟。研究实践 表明，s p i 难于同时兼具多种功能特性，不能满足所有食品加工特性的要求，而生 产上要求的却是具有专项功能或兼具几种功能平衡点的产品。7 s 、1 l s 是s p i 的主 要组分，它们的存在对s p i 的各项功能性质起着十分重要的作用。但是，目前对单 一组分7 s 、1 1 s 尚缺乏深入的研究。因此，研究l l s 球蛋白和7 s 球蛋白就成为大豆 蛋白研究的主要内容，并且为不同类型大豆蛋白食品及其他食品加工提供指导意义。 蛋白质与淀粉是食品中两类重要的大分子组分。除营养性外，两者还可作为胶 凝剂、增稠剂及稳定剂等，极大地影响着食品的质构、流变学及其它一些理化性质。 蛋白质与淀粉共存时，二者同时影响着质构特性、流变学特性，尤其是共存体系的 a n t 特性。比如，蛋白质具有许多重要的功能特性，如胶凝特性、乳化特性、起泡 6 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 特性等，这些特性常常因为淀粉的添加而大大改善，最终影响胶态食品的质构及加 工特性。可以说蛋白质与淀粉是形成食品质构及加工特性的主要因素。 近年来有关这两种成分间的交互作用的研究逐渐成为食品研究的热点。巧妙利 用这两种大分子的相互作用可明显改善食品品质。对于这两种大分子形成的共存体 系的特性及分子问交互作用的机理有所了解，同样对食品加工业具有积极的指导意 义。 2 国内外的研究状况 目前，有关大豆蛋白l l s 和7 s 球蛋白的提取分离方法的研究报道较多。冷沉淀 法是根据l l s 球蛋白在4 时具有沉淀的性质将其与7 s 分离；等基于1 1 s 和7 s 球 蛋白在钙盐溶液中溶解度存在着较大的差异，建立一套提取分离工艺( s a i o ，1 9 7 8 ) ： t h a n h 等研究发现，1 l s 和7 s 球蛋白在t f i s 缓冲溶液中存在溶解度的差异，并据此 将二者分离( t h a n h ，1 9 7 6 ) ；n a g a n o 等在t h a n h 法的基础上进行了改进，用亚硫酸 氢钠( s b s ) 替代巯基乙醇( 2 - m e ) 作为还原剂( n a g a n o ，1 9 9 2 ) 。 近年来，研究蛋白质与多糖之间的相互作用越来越受到重视，因为将两者混合 后可改善各自的性质，甚至得到两者均不具有的特殊性质，从而扩大其在食品工业 或其他工业中的应用。蛋白质与多糖在溶液中共存时，当一些理化条件如温度、p h 值、离子强度等适宜时，大分子上的部分基团可以相互连接，从而赋予混合体系一 些独特的性质，最终影响食品的性质。 许多发达国家如美国、日本、俄罗斯等均投入大量的人力和物力从事天然商分 子的交互作用及作用机理的研究，并已取得了较大的成果，对传统食品产品质量的 提高，改善加工工艺和指导新型食品的研究和发展起到巨大的推动作用，如蛋白质 加工成人造营养食品、仿生食品、重组功能食品等。对于蛋白质一多糖体系的研究， 我国起步较晚，目前也有一些报道。 研究表明，蛋白质与多糖在水溶液中的交互作用主要有相容及不相容两种形式。 在食品体系中，蛋白质与多糖的相容表现为蛋白质与多糖可发生交互作用，即大分 子间相互吸引，通过静电相互作用氢键及共价键进行连接，形成络合物。当d h 值低于蛋白质的等电点时，并且溶液中离子强度极低的条件下，蛋白质与阴电性多 糖产生静电交互形成络合物；当控制一定条件，蛋白质与多糖发生美拉德反应，通 过共价键连接在一起，形成共价络合物( 陈昀等，2 0 0 1 ) 。 7 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 b e r n a l ( b e r n a l ，1 9 8 7 ) 等利用可破坏分子闻作用力的物质，如盐类、巯基乙 醇、尿素等来研究乳清蛋白与阴电性多糖类在水溶液中的交互作用。结果证明阴电 性多糖与蛋白质的交互以静电作用为主，而氢键、疏水交互的影响较小。赵谋明等 通过酪蛋白一卡拉胶体系在添加不同浓度的氯化钠和尿素后，研究了凝胶强度和粘 度变化情况。结果表明，蛋白质与阴性多糖的交互作用力是以静电作用为主，疏水 作用和氢链的作用不明显。 孙哲浩等研究了多糖类与蛋白质交互作用对食品乳状性稳定性的影响，认为共 价结合及静电交互作用对乳状液稳定性产生有利影响，而弱的交互作用及无交互作 用可能导致乳状液的分层等不稳定现象的发生( 孙哲浩，2 0 0 0 ) 。 b u r o v a ( b u r o v a ，1 9 9 2 ) 等研究了多糖对l l s 球蛋白的构象稳定性、乳化特性 及热凝胶能力等性质的影响，结果发现，由于多糖与蛋白质的相互作用，使l l s 球 蛋白的胶凝临界值降低；并且当p h 值为4 2 6 0 ，离子强度较低时，一些含羧基多 糖与中性多糖与蛋白表现出楣容性，相互形成络含物，显著的降低了l l s 球蛋白的 变性温度；另外，还改善了蛋白质的乳化能力，提高了乳状液的稳定性。 蛋白质与多糖的交互作用在食品工业中具有重要的意义。国内外现主要致力于 蛋白质与多糖混合后的流变性质的变化规律等研究，利用差热分析方法来探讨交互 作用的强弱及交互作用键的种类和稳定性，从而揭示交互作用的机理，但忽视了蛋 白质与多糖的微观与亚微观结构；另外，国外许多研究大多用液相体系来研究交互 作用的机理，对凝胶体系的交互作用机理研究不多，因此，有待进一步研究。 3 主要研究内容 基于上述研究意义及进展，本文通过比较，确定一种提取分离大豆1 1 s 和7 s 球 蛋白的优化工艺，对以此法提取的大豆l l s 和7 s 球蛋白进行了分子构象表征、功能 特性评价、化学及酶法改性研究，同时研究了蛋白质与淀粉共存体系的凝胶质构特 性、流变特性及热变性。主要内容如下： 3 1 大豆1 1 s 和7 s 球蛋白的提取、分离及纯化及鉴定 3 2 大豆l l s 和7 s 球蛋白分子构象的研究 3 3 大豆l l s 和7 s 球蛋白功能特性的研究 3 4 大豆1 1 s 和7 s 球蛋白改性研究 3 5 大豆l l s 和7 s 球蛋白与淀粉交互作用的研究 8 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 第一章大豆1 1 s 和7 s 球蛋白的提取与分离 蛋白质的提取通常需要根据所要制各的蛋白质的性质，选择合适的提取溶剂将 蛋白质与其他杂质分开。比如用稀酸或稀碱溶液提取谷蛋白，用醇溶液提取醇溶蛋 白，以及用水提取清蛋白和用盐溶液提取球蛋白。提取缓冲液的p h 、离子强度、组 成成分等条件的选择，应根据欲制各的蛋白质的性质而定( 陶慰孙，1 9 9 5 ) 。 大豆蛋白中1 l s 和7 s 球蛋白的提取分离有相关的报道。冷沉淀法是根据1 1 s 球蛋白在44 c 时具有沉淀的性质将其与7 s 分离；s a i o 法的原理是基于1 l s 和7 s 球 蛋自在钙盐溶液中溶解度存在着较大的差异而进行提取分离：t h a n h 法利用1 l s 和 7 s 球蛋白在缓冲溶液中溶解度的差异将二者分离：n a g a n o 法在t h a n h 法的基础上 进行了改进，用亚硫酸氢钠( s b s ) 替代巯基乙醇( 2 一m e ) 作为还原剂。本课题依 据t h a n h 法比较了三种提取缓冲液对1 1 s 和7 s 球蛋白的提取分离效果，同时与 n a g a n o 法、s a i o 法与t h a n h 法进行了比较，以图建立一种有效的提取方法。 1 材料和方法 1 1 实验材料 大豆( 市售) 1 2 主要试剂 1 i sb r 考马斯亮兰g 一2 5 0 a r 磷酸氢二钾 a r 磷酸二氨钾 a r 硫酸铵a r 硫酸铜 a r 硫酸钾 a r 氯化钠 a r 硼酸 a r 硼砂a r 氢氧化钠 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 汕头市化学试剂厂 天津市化学试剂六厂 天津博迪化工有限公司 武汉市洪山中南化工试剂有限公司 广州化学试剂厂 天津博迪化工有限公司 江西洪都试剂化工厂 重庆东方试剂厂 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 9 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 巯基乙醇 石油醚 1 3 仪器设备 凯氏定氮仪 索氏脂肪提取器 粉碎机 p h 计 紫外分光光度计 紫外可见记录光谱仪 旋转蒸发器 1 4 实验方法 c p a r h r 2 8 4 0 p h s3 c 型 7 5 2 型 u 、卜2 6 5 型 r e 5 2 - 9 9 型 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 天津市博迪化工有限公司 武汉玻璃仪器厂 天津玻璃仪器厂 p h i l i p s 上海雷磁仪器厂 上海精密仪器公司 日本臼立公司 上海亚荣生化仪器厂 1 4 1 样品制备方法 大豆粉碎后过4 0 目筛，用石油醚脱脂，得脱脂大豆粉。 1 4 2t h a n h 法提取分离大豆1 1 s 和7 s 球蛋白方法研究 l _ 4 2 1 提取分离流程 在t h a n hvh 等建立的1 1 s 和7 s 球蛋白粗分离工艺的基础上，选用三种缓冲 液( t r i s - h c i 缓冲液、硼酸一硼砂缓冲液、磷酸盐缓冲液) 优化脱脂大豆粉中总蛋 白的提取工艺，以达到最佳提取率。具体提取分离步骤按图卜l 进行： 华中农业大学2 0 0 5 届顼士学位论文 脱脂大豆粉 料滚比l i2 1 3 ，提取2 h ，2 0 c i 离心l o o o o r p k2 0 m n 。2 0 c 上清液 沉淀i ( i l s 租提物) 6 4 上蒲液i i 船( 襞妒至p 腿8 沉淀h ( 7 s 扭提物， 图l 一1t h a n h 法分步提取大豆l l s 和7 s 球蛋白工艺 f i g u r el - 1m e t h o d so f e x t r a c t i o no fl l sa n d7 sg l y c i n i ni ns o y b e a nb yt h a n h 1 4 2 2 不同缓冲液对总蛋白提取效果的影响 取2 0 9 干燥脱脂大豆粉，加入3 0 0 m l 提取缓冲液实验选用t r i s h c l 缓冲液( 含 有l o m m o l l 巯基乙醇) 、硼酸一硼砂缓冲液、磷酸盐缓冲液，2 0 c 搅拌2 h 。离心 i 0 0 0 0 r m i n ( 2 0 r a i n ) ，弃去残渣，保留上清液。用紫外光吸收法测定上清液中蛋白 质的含量。比较不同缓冲液对脱脂大豆粉中总蛋白提取效果的影响。 1 4 2 3 总蛋白提取条件的优化研究 考虑到液料比、浸提时问、提取温度对提取效果的影响较大，实验在单因素实 验的基础上通过正交设计，优化实验参数。采用考马斯亮兰法测定上清液中蛋白质 的含量。 表卜1 影响总蛋白提取率的水平因子表 t a b l e1 - lt h el e v e lf a c t o r st a b l eo fe f f e c to nt h ep r o t e i n e x t r a c t i n gy i e l d 囚素 浸提时间( h ) 液料比提取温度( ) 1 1 01 5 水平 2 1 52 0 32 0 2 5 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 1 4 2 4 大豆n s 和7 s 球蛋白的分离 用2 m o l lh c i 调节上清液p h 值至6 4 ，离心1 0 0 0 0 d m i n ( 2 0 m i n ) ，得沉淀为 l l s 球蛋白粗提物，所得上清液再调p h 值至4 8 ，离心9 0 0 0 r m i n ( 2 0 m i n ) ，弃去 上清液，得沉淀为7 s 球蛋白粗提物。 l ，4 3s a i o 法提取分离大豆l l s 和7 s 球蛋白 大豆l l s 和7 s 球蛋白在钙盐溶液中溶解度存在着较大的差异，s a i o 等基于此原 理建立提取分离工艺，具体步骤如下图1 - 2 ： 脱脂大豆精 2 3 h ，科液比1 ：2 0 2 昵 残渣 上诸液 j 悬浮在本身重1 0 倍的温水中i 调p h 4 5 ，离心4 f “o ) ，调衅8 , - bs ，提拌2 h+ +残渣( 粗7 s ) 离心 l 上清液 l 中和 士 褪i i $ 图卜2s a i o 法分步提取大豆l l s 和7 s 球蛋白工艺图 f i g u r e1 - 2m e t h o d so fe x t r a c t i o no fl l sa n d7 sg l o b u l i ni ns o y b e a nb ys a i o 1 4 4n a g a n o 法提取分离大豆1 1 s 和7 s 球蛋白 在s u c h k o v 等人建立的11 s 和7 s 球蛋白粗分离工艺的基础上，n a g a n o 等人认 为在0 2 5 m o l ln a c i 、p h 5 。0 条件下能更好地分离7 s 球蛋白，同时用亚硫酸氢钠 取代了巯基乙醇。图卜3 是n a g a n o 等建立的提取分离方法。 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 脱脂大豆粉 p h 7 5 蒸馏水提提2 h 室温 l 离心8 5 0 0 r p m 2 0 m l n 厂1 残渣上清液 i 加入岛s ( o 9 8 9 l ) 调至p h 一i 冰浴过夜。离j 厶4 + 。 + 残渣上清液 ( 粗1 1 s 球蛋白) i 加国体n l 至o 2 5 n 。i l ，调至 f 离心，4 c f 1 残渣 上清液 i 用两倍体积的双蒸水稀释 i 调至p h4 8 ，离心4 厂1 粗7 s 球蛋白上清液 5 4 p h5 0 图卜3n a g a n o 法分步提取大豆1 1 s 和7 s 球蛋白工艺 f i g u r e1 - 3m e t h o d so fi s o l a t i o no fl l sa n d7 sg l o b u l i ni ns o y b e a nb yn a g a n o 1 5 测定方法 1 5 1 样品总蛋白含量的测定( 李合生，2 0 0 0 ) 采用微量凯氏定氮法测定脱脂大豆粉、大豆7 s 和1 1 s 粗提物( t h a n h 法、s a i o 法和n a g a n o 法制取) 中总蛋白的含量。 1 5 2 上清液中蛋白质含量的测定( 紫外光吸收法) 取l m l 上清液( t h a n h 法、s a i o 法和n a g a n o 法提取) 定容至5 0 m l ，参照文献 ( 赵亚华，2 0 0 0 ) 的紫外光吸收直接测定法，测定蛋白质溶液在2 8 0 n m 和2 6 0 n m 两 种波长的吸光度( a 瑚。及a 2 6 0 。) ，按照下列公式计算溶液蛋白质浓度。 c - - - - ( 1 4 5 a 2 8 0 n 。一o 7 4 a 2 6 0 | l 。) 稀释倍数 式中： c ：蛋白质的质量浓度( m g m 1 ) ； a 2 s o n 。：蛋白质溶液在2 8 0 n m 处的吸光值： a 2 6 0 。：蛋白质溶液在2 6 0 n m 处的吸光值； 1 4 5 和0 7 4 ：校正值。 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 1 5 3 上清液中蛋白质含量的测定( 考马斯亮兰g 一2 5 0 法) 标准曲线的制作：准确吸取含有2 0 0 ，4 0 0 ，6 0 0 ，8 0 0 ，1 0 0 0ug 的牛血清蛋白 标准液0 t m l ，分别放入1 0 m l 刻度试管中，加入5 0 m l 考马斯亮兰g 一2 5 0 ，2 m i n 后于5 9 5 n m 处测其吸光值，空白为蒸馏水。 样品中蛋白质浓度的测定：取l m l 上清液( t h a n h 法提取) 定容至5 0 m l ，然后 按照标准曲线的操作，在5 9 5 n m 处测其吸光值。 2 结果与分析 2 1 不同缓冲溶液对t h a n h 法总蛋白提取率的彩晌 硼酸一硼砂、磷酸盐及t f i s - h c l 缓冲液是常见的三种提取缓冲液，选择偏碱性 缓冲液有助于蛋白质的提取。实验比较了三种缓冲液对蛋白质提取率的影响，实验 结果见表卜2 所示。 表1 - 2 缓冲液对t h a n h 法总蛋白质提取的影响 t a b l e1 - 2e f f e c to ft h r e eb u f f e r so by i e l do ft o t a lp r o t e i ni ns o y b e a n 由表卜2 可以看出，在相同的料液比( 1 ：1 5 ) 、提取温度( 2 0 c ) 、浸提时间( 2 h ) 下，t r i s h c i 缓冲液提取的总蛋白含量最高，达3 2 0 3 2m g m l ，高于硼酸一硼砂缓 冲液的1 7 6 、磷酸盐缓冲液的3 4 4 。因此，后续实验采用t r i s h c l 缓冲液作为 脱脂大豆粉中总蛋白质提取缓冲液。 2 2t h a n h 法总蛋白提取条件的正交优化 实验首先进行单因素实验，分别筛选出浸提时间、料液比和提取温度的最佳条 件。在此基础上对影响脱脂大豆粉中总蛋白提取率的主要条件进行正交优化，以筛 选脱脂大豆粉中总蛋白质提取的最佳条件。实验结果见表卜3 。 华中农业大学2 0 0 5 靥硬士学位论文 表卜3 浸提时间、液料比及提取温度对总蛋白提取的影响 t a b l e l - 3 e f f e c t o f e x t r a c t i n g t i m e 、r a t i o o f b u f f e r t o m e a la n d t e m p e r a t u r e o ny i e l d o f t o t a lp r o t e i n 采用s a s 分析程序对表卜3 的数据处理见表卜4 。 表卜4 不同因素下总蛋白提取的显著性分析( f a ) t a b l e l - 4s i g n i f i c a n ta n a l y s i so ft h r e ef a c t o r so n y i e l do ft o t a lp r o t e i n ( f a ) 因素 浸提时间h料液比提取温度 吸光值a3 6 2 0 0 0 2 6 94 6 0 0 1 7 8 5 9 5 1 9 00 1 0 4 注：a 液料比。且最佳组合为提取时间2 h 、料液比l ：2 0 、 提取温度2 5 ，最终选取此组合为最优提取工艺条件。 2 3t h a n h 法、s aio 法； f l n a g a n o 法提取总蛋白的比较 2 3 1 三种方法提取1 1 s 和7 s 球蛋白粗提物的蛋白质含量 实验比较了t h a n h 法、n a g a n o 法及s a i o 法提取脱脂大豆粉中的1 l s 和7 s 球蛋 白粗提物中的蛋白质含量。结果见图l 一5 所示。 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 图卜4 蛋白质含量柱状图 f i g1 - 4p r o t e i nc o n c e n t r a t i o n 由图1 5 可知，采用t h a n h 法提取脱脂大豆粉中的1 1 s 和7 s 球蛋白粗提物中 蛋白质含量最高。t h a n h 法1 1 s 球蛋白粗提物的蛋白质含量较s a i o 法、n a g a n o 法分 别高出9 2 3 、4 5 6 ：t h a n h 法7 s 球蛋白粗提物的蛋白质含量较s a i o 法、n a g a n o 法分别高出9 5 1 、6 4 5 。 2 3 2 1 1 s 球蛋白租提物纯度分析 以1 1 s 球蛋白粗提物的凝胶过滤图谱，作为选取最佳提取工艺的依据。图1 4 a 、 b 、c 是根据t h a n h 法、s a i o 法及n a g a n o 法提取的1 l s