（微生物学专业论文）“大型粘菌复合体”细菌多样性及抑菌功能初步研究.pdf

西北大学硕士学位论文 摘要 “大型粘菌复合体”是自然界形成的神秘生物。采用现代生物技术研究。大型粘 菌复合体”的具体组成、形成机理以及有何生物学特性，是揭开大型粘菌复合体奥秘的 重要研究课题。 研究首先对“大型粘菌复合体”的样本进行了细菌多样性的调查。采用可培养( 纯 菌分离) 和非培养的分子生物学方法初步阐明其体内的优势细菌种群为d 一变形菌纲伯 克氏菌目( b u r k h o l d e r i a l e s ) 的细菌，分离获得3 5 株细菌和1 株粘细菌。具体的非培 养方法包括细菌1 6 s r d n a 的克隆测序和末端限制性片段长度多态性分析( t r f l p ) 。非培 养方法的应用直接拓宽了细菌多样性研究的范围，t r f l p 方法测定该粘菌复合体中还有 c y a n o b a c t e r ( 蓝细菌) 的存在，这也为我们探索粘菌复合体的形成提供了一定的证据。 对复合体中化学组成物质的实验分析，初步确定了该复合体的化学成分含有1 4 4 8 多糖类物质，并确定此多糖对几种细菌和植物病害菌的抑制作用；最后对其体内分离 的一株强抑菌功能的菌株( p s e u d o a l o n a sa e r u g i n o s a ) 的胞外多糖粗提物进行了初步的 抑菌实验，证明其抑菌并非色素和细菌素的作用，而是多糖所致。通过上述数据，初步 分析了该。粘菌复合体”抑菌作用的部分可能来源是其上所分布的多糖。 因此，“大型粘菌复合体”由于其体内含有高度抗腐化性物质，在无公害农药、无 公害食品、食品防腐剂等领域，有重要的开发价值。 关键词：细菌多样性细菌1 6 s r d n a 末端限制性片段长度多态性( n l p ) 胞外多糖( e p s ) 西北大学硕士学位论文 p r e l i m i n a r yr e s e a r c ho n b a c t e r i a ld i v e r s i t ya n d i n h i b i t i o nf u n c t i o no f ”l a r g e m y x o m y c e t e - l i k ec o m p l e x a b s t r a c t m y x o m y c e t c - l i k ec o m p l e x i sak i n do fm a r co r g a n i s me v o l v e db yn a t u r ew h i c h c o m p r i s el a r g eg r o u po fm i c r o o r g a n i s m s , b u t6 un o wi t sr e a lb i o - r e s o u r c oo fa c t i v e c o m p o n e n t si ss t i l lw l i c i i o w l li ti sn e c e s s a r yf o r 砒t od op h y l o g e n e t i cr e s e a r c h0 1 1t h es p e c i e s o f b i o d i v e t s i t yo f m i c r o o r g a n i s m s t h er e s e a r c hf i r s t i n v e s t i g a t e d t h eb a c t e r i a l d i v e r s i t y o fs a m p l e sf r o m l a r g e m y x o m y c e t e - l i k ec o m p l e x , 3 5s u a i n so fb a c t e r i aa n d1 s t r a i no fm y x o b a c t e t i aw e t i s o l a t e da n dt h ep r i m a r yb a c t e t i a lg e n u s b u r k h o l d e r i a l e sw a sc l a r i f i e db yt h ep l a t e - c u l t u r i n g m e t h o da n dn o n - c u l t u r i n gm e d i o d , s u c ha ss e q u e n c i n go fb a c t e r i a l1 6 sr d n ac l o n ea n d t r f l p ( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) t h ea p p l i c a t i o no f n o n - c u l t u r i n gm e t h o dd e v e l o p e dt h er a n g eo f t h er e s e a r c ho f b a c t e t i a ld i v e r s i t y l a t e rb a s e d o nt h ea n a l y s i so fp n - e x p e t i m e n t , 1 4 4 8 p o l y s 觚c h a r i d 髂w a sf o u n da n di t sf u n c t i o no f i n h i b i t i o no nb a c t e r i aa n dp l a n td i s e a s e d m i i d e w f i n a l l ye p sf r o mav a r i a t i o n a l p s e u d o m o n a sa e l u g l n o s aw a si s o l a t e d ；i td i f f e r sf r o mr e p o r t e da n f i b l a s t i cs u b s t a n c ef r o m s t a n d a r dp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s as u c h 嬲p y o c y a n i n , p y o v e r d i na n dp y o c i n t h er e s u l t s i n d i c a t et h a tt h ei n h i b i t i o n f u n c t i o n a l i t ym a yp a r t i a l l yr e s u l t 丘o mt h ep o l y s a c c h a r i d e s c o n t a i n e di nt h e m t h e r e 矾t h r e es i g n i f i c a n ta n dv a l u a b l ea s p e c t sf o rd e v e l o p m e n t ：f o o da d d i t i v e s , p o l l u t i o n - f l e ef o o d , f 0 0 dp r e s c - f v a t i v e sc o n c l u d e db yh g h - c o n c e n t r a t e da n t i - 七o n t a g i o n s u b s t a n c e ； m y x o m y c e t e - l i k ec o m p l e x h a ss t r o n gl i f ef o r c ea n dt h ea b i l i t yt oa c c o m m o d a t e , t h es u b s t a n c ei n s i d ew h i c hc o u l di n c r e a s et h ei m m u n i t yi ss u i t a b l ef o rh e a l t hc a r ep r o d u c t s d e v e l o p m e n t ；s e l f - r e p r o d u c t i o nc a nb ea c h i e v e dt h r o u g ht h ea s s i m i l a t i o no fo r g a n i c c o m p o u n da n dh u m u s t h ep h a r m a c e u t i cr e s e a r c hm a y 嘴t h i si nt h ed i g e s t i v es y s t e m k e y w o r d s ：b a c t e r i a ld i v e r s i t y b a c t e r i a l f r a g m e n tl e n g t h ) p o l y m o r p h i s m 1 6 s r d n a t r f l p ( t e r m i n a lr e s t r i c t i e p s ( e x t r a c c l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e ) 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。 学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时，本人保 证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为西北 大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名： 。多孩 指导教师签名 溯年其s e t 俩年参其j 7 i ：7 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本 论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大 学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：! 童塾 捌年石月r 日 西北大学硕士学位论文 第一章综述 1 。大型粘菌复合体”的简介 自1 9 9 2 年我国第一次在陕西渭河滩发现“不明生物体”以来，近年来又在全国各地 多次出现有关不明生物体的报道该生物体形态不一，4 , n 只有几公斤，大的可达数百 公斤，有盘状或柱状。无四肢五官不像动物，又无植物细胞结构不是植物，表面棕褐色， 内部白色，在自然界久放不腐不臭，具有抑菌作用，在水中还能观察到生长，真谓世间 怪物也。后经研究发现其中含有大量的粘菌子实体和多种丝状真菌和细菌等微生物。故 将该生物体暂称为“大型粘菌复合体”。但对该生物体的称呼，不同专家有不同的解释。 1 1 非。粘菌复合体” 中科院微生物所形态学专家卯晓岚称曾多次见过这种神秘的怪物。并通过对生命成 分的化学分析证实，它含有大量的水；做蛋白质实验，没有蛋白质反应，也没有核酸反 应，说它有生命很勉强；对于在火上烧，能闻到呛鼻的味道，他估计有醛基、醇基或羟 基成分。因为粘菌必须具备蛋白质和核酸成分，因此判断“怪肉”不是粘菌复合体。 1 2 高等真菌 有关陕西周至发现怪物的连续报道引起有关科学家高度重视。南开大学生命科学学 院白玉华教授经初步研究，出具了一份鉴定证明。鉴定说，经过将“怪物”切片后放在 显微镜下观察，发现其体内具有菌丝，初步确定为高等真菌。其确实具有生命。 1 3 粘细菌 2 0 0 2 年5 月，一个重达4 9 公斤的特大“不明生物体”在吉林被人发现。吉林大学微 生物专家解释，它是介于原生生物与真菌之间的粘细菌，生活于土壤中，生命力极强， 是自然界非常稀有的大型粘细菌复合体。 l - 4 一种复合茵 1 9 9 9 年，一块重达7 公斤的怪肉在北京南城旧宫一个挖电缆线的壕沟中被捡出来， 有媒体采访了中国农业科学院食用菌研究中心研究员胡秀清女士。胡女士听了描述后， 认为这块怪肉应该就是民间传说的“太岁”，属于一种复合菌。至于吃“太岁”是否可 以大补，她本人也是道听途说，无法证实。 尽管对这种粘菌复合体有不同的解释，但其主要成员究竟有那些? 形成的机理又是 西北大学硕士学位论文 什么? 至今尚无定论。为了破解这些奥秘，本论文首先就复合体中所含有的微生物种类 进行分离鉴定，并同时考虑该复合体的抑菌作用，对分离的菌株进行抑菌的测定，这一 研究，可能和复合体的形成具有一定的相关性。 2 微生物对粘菌复合体内活性物质生成的影响 微生物对粘菌复合体内活性物质的生成有何影响? 究竟扮演了怎样的角色? 这是 一个急需解决的疑难问题。如果天然活性物质由共生微生物产生，那么能否对这些微生 物进行分离培养十分重要，因为通过微生物大规模的发酵培养，可以从发酵物中源源不 断地获取活性物质。目前，粘菌复合体内分离到的天然活性物质的生物来源仍很难确定， 一般认为：对粘菌复合体内的微生物进行分离培养，确定能否从它们的代谢物中分离得 到相同的天然活性物质，这样才能来解释这些活性物质可能的生物来源。 因此对该生物活性物质进行微生物多样性调查就成为首先需要解决的问题。微生物 多样性的研究是通过微生物生态学的方法进行的。 3 微生物多样性研究现状及发展趋势 传统的微生物多样性研究工作大多建立在分离培养的基础上，即从环境样品中分离 尽可能多的微生物的纯培养物，通过对其外部形态、生理生化特征、核酸特征进行鉴定， 得到该环境样品中的微生物多样性。传统的微生物生态学研究主要包括直接测定、培养、 代谢活力的测定和数学方法等n ， 3 1 传统的纯培养物研究现状 目前，用于细菌鉴定的方法和技术很多，除了用常规的方法即通过细菌的形态、生 理生化性状等对细菌进行分类鉴定外，还可以采用血清学、酶学、噬菌体技术以及蛋白 质和核酸分析等技术鉴定细菌。随着微生物学的发展，微生物鉴定系统自动化的研究以 其快速简便的优势引起人们的兴趣，近年来相继出现了一些商品自动鉴定系统。 ( i ) b i o l o g 全自动快速微生物鉴定仪m i c r o s t a t i o n 系列的鉴定： 美国b i o l o g 细菌自动鉴定系统利用细菌对9 5 种不同碳源的代谢情况来鉴定菌种，即 每种细菌形成各自特有的代谢指纹图谱。选用四唑紫作为细菌能否利用供试碳源的指示 剂，它具有数据库广、鉴定范围大、自动化程度高、操作简便、快速鉴定菌种等优点， 受到人们的广泛重视。b i o l o g 鉴定板分为g n 、g p 2 种，鉴定结果也分为两部分“。 ( 2 ) b i o - - v i t e k 生物梅里埃全自动微生物生化分析仪的鉴定： 西北大学硕士学位论文 受到人们的广泛重视。b i o l o g 鉴定板分为g n 、g p 2 种，鉴定结果也分为两部分“1 。 ( 2 ) b i o - - v l t e k 生物梅里埃全自动微生物生化分析仪的鉴定： v i t e k 系列全自动微生物分析系统是法国b i o m e r i e u x ( 生物梅里埃) 生产的全自动微 生物分析仪的一个系列，包括：v i t e k - - 3 2 、v i t e k - - 6 0 、v i t e k - - 1 2 0 等。试验2 - - 6 小时 能出报告。有时也需要进行其他一些试验来进一步确定，比如血清学反应等。仪器把3 0 个对细菌鉴定必需的生化反应培养基固定到卡片上，培养后对显色反应进行判断，利用 数值法鉴定微生物的种类。 、( 3 ) 气相色谱一质谱法检测细胞脂肪酸及其在细菌鉴定上的应用： 脂肪酸是微生物细胞组分中一种稳定并大量存在的重要成分，和细菌的遗传变异、 毒力、耐药性等关系密切，它的种类和含量是细胞化分类法的重要信据之一气质联用 技术能快速、灵敏、精确地检出细菌细胞内的脂肪酸，是一种重要的化学分类手段，并可 通过计算机的运用而使分类达到数据化、自动化n 1 。 然而许多微生物采用传统的纯培养技术无法被分离纯化，从而严重地制约了对微生 物多样性的深入研究。s t a l e y 和k o n o p k a 的名言：“t h eg r e a tp l a t ec o u n ta n o m a l y ”， 就是对环境中微生物实际数量同平板菌落计数之间巨大差异的最好描述。因此，纯培养 的局限性已经成为了研究微生物自然生态和多样性的主要瓶颈| 4 - 7 1 。 3 2 微生物多样性的非培养( c u l t u r e - i n d e p e n d e n tm e t h o d ) 方法研究与 发展趋势 图i 1 微生物生态学新型研究方法 3 西北大学硕士学位论文 鉴于纯培养很难反应微生物环境的真实情况，对微生物多样性的研究工作更多地采 用8 0 年代中后期建立的不依赖于培养的分子生物学研究方法，该方法不要求纯培养物的 获得，直接通过检测来自环境样品中的特征性生物大分子来研究该环境中的微生物多样 性。 3 2 11 6 s r r n a 序列在微生物鉴定中的应用 其中核糖体小亚基r n a 基因由于大小适中，并且能够提供足够的信息体现不同菌属 之间的系统进化关系，又易于通过p c r 扩增以及利用测序技术来获得其序列，而成为微 生物多样性研究中最常选用的生物大分子。r r n a 在大多数原核生物中都具有多个拷贝， 5 s 、1 6 s 和2 3 s r 刚a 的拷贝数相同。 3 2 1 1 基于1 6 s r r n a 的序列鉴定方法 p a c e 等( 1 9 8 6 ) 最初通过5 s r r n a 基因的序列分析来研究微生物的生态和进化，但是 由于5 s r r n a 相对比较小，仅有1 2 0 个核苷酸，携带的信息量少，对5 s r r n a 的分离仅限于 研究比较简单的生态系统。后来，人们开始对细菌1 6 s r r n a 和2 3 s r r n a 感兴趣，选用 1 6 s r r n a 进行研究的主要原因是：1 6 s r r n a 普遍存在于真核细胞和原核细胞中，故可用 以比较它们在进化上的相互联系；1 6 s r r n a 有重要且恒定的生理功能；在细胞中， 存在着较大量的易于提取1 6 s r r n a ；1 6 s r r n a 分子中的某些碱基顺序非常保守“1 ； 1 6 s r r n a 相对分子质量适中，在原核生物核糖体所含的3 种r r n a ( 2 3 s 、1 6 s 、5 s ) 中，其 核苷酸数分别为2 9 0 0 、1 5 4 0 和1 2 0 左右，其中1 6 s r r n a 不但相对分子质量适中，而且信息 量较大，易于分析；现在已经有了比较完善的1 6 s r r n a 数据库。所以，1 6 s r r n a 是理想 的研究材料，故被细菌学家及分类学家所接收。 1 6 s r r n a 的序列鉴定常用方法是在有合适引物存在的情况下利用p c r 技术对混合样 品中的1 6 s r r n a 基因进行选择性扩增，然后电泳分离不同的1 6 s r r n a 基因产物，并进行序 列分析。也可把p e r 扩增产物克隆到合适质粒载体上，经过e c o l i 扩增后以带有1 6 s r r n a 基因的载体作为模板进行1 6 s r r n a 基因序列分析，最后与现有数据库中的1 6 s r r n a 基因序 列进行比较。这一方法大大减少甚至省掉了耗时的筛选方法。 另一种方法是以1 6 s r r n a 作为模板，利用反转录酶合成c d n a ，建立c d n a 文库，或者 在反转录后，加入一个r d n a 专一性引物进行扩增，然后克隆测序。一个典型的细菌含有 1 0 3 1 0 5 个核糖体，而基因组d n a 中r r n 操纵子( f l p r d n a 序列) 的拷贝数相对较少( 原核生物 一般为1 l o 个左右) ，因此r r n a 在细胞中的含量很高，易于获得较多的模板，但是r n a 易于降解，r n a 的提取技术相对于d n a 的提取较为复杂，一般研究多采用提取细胞总d n a ， 西北大学硕士学位论文 但也可根据情况选择提取r r n a 。由于r r n a 在死亡的细胞中很快降解，提取r r n a 通过反转 录钓取1 6 sr d n a 序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞“1 ， 还有研究学者发现，1 6 s - - 2 3 s r r n a 基因区间是位于1 6 s r r n a 基因与2 3 s r r n a 基因之间 的区间序列，具有保守性和可变性。同一菌种的不同菌株它的区问序列同源性至少在8 7 以上，一般在9 3 左右；且序列长度变异小于2 ，因此具有非常好的种特异性。另 一方面是由于不同的菌种其r r n a 操纵子数目不同，再由于它们所包括的t r n a 基因的数目 和类型不同，以及1 6 s - - 2 3 s r r n a 基因区闻经常有序列的缺失和插入，造成不同菌种的1 6 s - - 2 3 s r r n a 基因区间被认为是细菌鉴定的合适部位。近年来，国外己利用1 6 s 一2 3 s r r n a 基因区间用于某些菌种的鉴别及种系发育研究n ”。 目前，基于原核生物1 6 s r r n a 的分子生物学方法在微生物多样性研究特别是共生微 生物多样性研究领域中，发挥了非常重要的作用，显示了它们特有的优越性。 3 2 1 21 6 s r r n a 的序列鉴定方法与种定义的关系 微生物1 6 s r r n a 基因序列的多样性为微生物的系统发育和未知菌的鉴定提供了全 新的方法。1 6 s r r n a 基因序列分析主要基于已建立的微生物1 6 s r r n a 基因序列数据库， 来确定细菌的系统发育关系，并使特殊序列探针用于识别未知菌成为可能。1 6 s r r n a 基 因序列的同源性分析最适用于属和属以上的远缘关系。目前，1 6 s r r n a 基因序列分析已 广泛应用于微生物多样性的研究，每年都有一定数目的真细菌1 6 s r r n a 进行测序，并收 录在1 6 s r r n a 基因文库中。 。 现在，种的定义一般认为d n a - - d n a 复性的7 0 或更多作为一个种，这种定义方法 有些模糊，但是仅有r r n a 序列分析的结果也不能单独作为定义种的依据。然而，1 6 s r r n a 基因序列分析加上d n a - - d n a 杂交结果，如果显示出5 0 d n a d n a 配对，一般来说就相 当于大约9 9 的1 6 s r r n a 基因具有相似性。f o x 等报道了圆孢芽孢杆菌( i n c i l l u s g l o b i s p o r u s ) 和嗜冷芽孢杆菌( 最p s y c h r o p h i l u s ) 这两个种1 6 s r r n a 基因序列具有一 致性，但是这两个种经过d n a - - d n a 复性分析，如果结果显示相似值低于9 5 ，那么至 少可以被认为是两个种。 目前国际上有许多核酸数据库能够检索核糖体核酸序列，一些软件可用于序列对比 分析和构建进化树，如c l u s t a lw 、t r e ev i e w 或m e g a 软件。此外一些研究结构还建 立了专门用于核糖体序列分析的数据库，其中最著名的是美国密歇根州立大学的 r d p ( r i b o s o m a ld a t a b a s ep r o j e c t i i ) 用户可以通过( h t t p ：r d p c m e m s u e d u ) 使 用这些数据和软件，最新的r d p 数据库( 网址h t t p ：r d p c m e m s u e d u ) 中已包括 西北大学硕士学位论支 1 6 s r r n a 基因序列3 5 1 7 9 6 条( 截至到2 0 0 7 0 4 - 0 3 ) 。当然随着研究的不断深入，1 6 s r r n a 基因序列条数也在不断增加。其中w w w 网提供的主要服务包括：核糖体探针检测：用户 委托序列在r r n a 分类系统中的大致位置分析；筛选可能的嵌合r r n a 序列；自动序列对 准比较：提供未知序列在系统发育进化树中的位置以及r f l p 结果分析等多种功能n “。 此外，欧洲还有一些核糖体数据库，如比利时安特卫普( a n t w e r p ) 大学建立的数据库提 供6 0 0 0 多种小亚单位序列 1 2 l p 其网址为：h t t p ：r r n a u i a a c b e s s u 德国慕尼黑 技术大学的a r b ( a r b o r t r e e p r o j e c t ) 数据库 ( h t t p ：哪b i 0 1 c h e m i e t u - m u e n c h e n d e p u b a r b ) 提供自动序列对准比较，二级结 构检测和进化树构建等程序 1 3 1 0 3 2 2 本研究涉及的微生物多样性的非培养方法 3 2 2 1 直接对r d n a 进行扩增和分析 将p c r 产物克隆到质粒载体上进行测序，与1 6 sr r n a 数据库中的序列进行比较， 确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类，该方法获得的信息 最全面，但在样品成分复杂的情况下需要大量的测序工作n “。 构建基因文库的方法中有时用到克隆文库的计算：克隆文库的覆盖n ”：参照上述 文献提供的公式：c = 卜( n l n ) 1 0 0 ，其中c = 克隆文库多样性的覆盖率；n l - - - - 文库 中仅出现一次的克隆数( 与其他克隆序列相似性低于9 9 5 ) ；n - - - - 检测的克隆总数。 由此得到官厅水库不同深度沉积物的细菌群落分布特征。 获得的序列通过r d p 的c h i m e a r a _ c h e c kv e r s i o n2 7 将嵌合序列排除后，采用 c l u s t a lx 进行序列排序比对，选取相似性低于9 7 的序列，登录g e n b a n k 数据库。 构建系统发育树n “”。 采用构建基因文库的方法对一个环境中的微生物群体进行调查时应考虑如下因素 造成的结果偏差：不同微生物的细胞壁结构差异引起的d n a 获得的不均一性；编码 1 6 s r r n a 的操纵子拷贝数的差异及不同d n a 和p c r 引物亲和力不同所引起的扩增产物浓 度的差异等1 ”。 非培养方法的使用需要系统进化方法和样品量的平衡，对于非培养方法克隆文库提 供了最确切的系统进化分类，但是对于大量样本的分析，却由于微生物群落时空多变性 而变得不易，样本之间使用克隆文库进行群落比较可能由于文库的不完整而出现问题 1 1 9 l 另外还有研究者使用克隆和r i s a 图谱结合的方法进行多样性分析，通过典型样本 西北大学硕士学位论文 的克隆测序，r i s a 图谱概览分析和建立已测序克隆与r i s a 图谱条带的联系推测克隆 所代表的微生物在不同样本中的存在情况。该分析可以充分利用已测序克隆的微生物系 统发育学信息| 2 0 1 。 3 2 2 2 末端限制性片段长度多态性( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，t r f l p ) 不同的细菌的1 6 s r r n a 存在保守区和可变区，可以根据这些保守区设计细菌的 1 6 s r r n a 通用引物，用它们可以扩增出所有细菌的1 6 s r r n a 片段，而1 6 s r r n a 可变区的 差异则可以用来区分不同种的细菌。在设计保守区的引物时，其中一个引物的5 端用 荧光物质标记，常用的荧光物质有h e x ，t e t 、6 一f 删等，然后提取待分析样品的总d n a ， 以它为模板进行p c r 扩增，则得到的p c r 产物一端带有该荧光标记然后，将p c r 产物 用合适的限制性内切酶消化，由于在不同细菌的扩增片段的可变区内存在核苷酸序列的 差异，酶切位点会存在差异，所以酶切后会产生许多不同长度的限制性片段。消化产物 用自动测序仪( 选用g e n e s c a n 功能) 进行检测，只有末端带荧光标记的片段能被检测 到，其他未带荧光标记的片段则检测不到。这些末端标记的片段可以反映微生物群落的 组成情况，对于从不同种细菌扩增出来的片段，由于可变区的核苷酸序列的不同，酶切 位点就可能不同，因此能得到不同长度的末端限制性片段。反之，不同长度的末端限制 性片段必然代表不同的细菌，也就是说一种末端限制性片段至少代表一种细菌。具体过 程如下图所示： 图1 2t r f l p 的具体步骤 西北大学硕士学位论文 ( 1 ) 收获分析样品的d n a ： ( 2 ) 使用荧光标记引物进行聚合酶链式反应扩增目的基因； ( 3 ) 大小相近或相同的扩增反应物末端标记荧光，经过纯化后的反应物经限制性酶 酶切产生不同大小的片段； ( 4 ) 毛细管电泳分开酶切片段； ( 5 ) 由测序仪读取标记片段产生基于片段大小的图谱。 末端限制性片段技术不但可以进行微生物种类的定性分析，而且可以进行定量分 析。在基因扫描的图谱上，每个峰的面积占总面积的百分数代表了这个末端限制性片段 的相对数量，即哪种细菌对应的末端限制性片段峰面积大，说明它的数量就相对大。但 是仅分析末端限制性片段，并不能说明这种末端限制性片段的细菌的数量也一定大，因 为细菌基因组中的1 6 s r r n a 是以多拷贝的形式存在，而且拷贝数也不尽相同( 一般不超 过1 0 个拷贝) 。有研究者通过实验证明，每种末端限制性片段的量是与1 6 s r r n a 的拷 贝数而不是与这种细菌的基因组d n a 大小呈正相关。尽管末端限制性片段是建立在p c r 基础上的，但是它的重复性好，平行样得到的峰也是几乎完全一样的，因此，用它来进 行定性和定量分析是可靠的。该技术综合了p c r 技术、d n a 限制性内切核酸酶技术、毛 细管电泳技术、荧光标记技术和d n a 自动测序技术，是在d n a 水平上通过对特定d n a 片段多态性的测定来比较微生物的群落结构。 通过r i b o s o m a ld a t a b a s e p r o j e c t ( 丛! 巳；1 4 乜：盟：堡婪：! d 坠) 和m i c r o b i a l c o m m u n i t ya n a l y s i s ( m i c a ，h t t p ：h e r m e s c a m p u s u i d a h o e d u ) 等网络可使用的数据 库中的1 6 s r r n a 基因序列预测t - i l f s ，在复杂的群落中每一个酶切中单一的峰很可能代 表多个物种，对于复杂群落图谱的系统进化分类涉及每个峰所代表物种的交集。 观察和预测的片段大小很可能产生偏差。这就会增加每个片段的物种群，需要阐明 允许出错片段的大小，大量样本的时空可变性增加了样本的可变性。结果，很少的研究 可以充分利用t r f l p ，那些使用t r f l p 做复杂群落的菌种鉴定的研究经常补充克隆 文库的序列分析，或者从培养分离物中进行t r f s 的确认n ”。 t - r f l pa n a l y s i sp r o g r a m ( t a p ) ( h t t p ：w w w c m e m s u e d u r d p t r f l p # p r o g r a m ) 也是一种t r f l p 分析工具，t a p 可以让研究人员使用整个r d p 作为代用群落而模仿进行t - - r f l p 流程，使用者必须输入顺向和逆向引物序列以及限制性酶的目的序列n “。 有研究者经过研究认为，标记的限制性片段的准确长度在5 0 - - 4 5 0 b p 之间，来自不 同小亚基r r n a 基因的标记片段其长度改变限制性位点多态性和小亚基r r n a 基因的插入 8 西北大学硕士学位论文 和删除，在他们最初的工作中，很明显这种方法可以确认一定数目不同细菌的混合群落， 但随着样本中不同细菌数目的增加和分类单元的逐渐复杂，使用这种方法进行种群确认 的可行性降低。所以对于较复杂的样本，需要慎重分析露 我国学者用这个方法确认了胶州湾的细菌种群数大致为3 类陴1 。并且对油藏微生物 的组成及变化的研究能够更好地对微生物采油技术起到跟踪指导作用协1 。还研究了五 氯酚( p c p ) 对好氧颗粒污泥处理生活污水的影响，借助末端限制性酶切片段长度多态性 ( t r f l p ) 技术考察了p c p 存在时好氧颗粒污泥细菌组成的变化哺1 。 根据数据库的酶切分析并综合自然样本考虑，最好选用的内切酶为h h ai ，r s a i 。m s pi 协也有可能其他酶适合更特殊的环境。a b is e q u e n c e r 的输出结果包括绘图 和表格形式的片段峰值高度，面积，片段大小。整个过程的“限速”步骤是高质量群落 d n a 的提取和纯化。由于测序仪可以区别对待同一胶孔中不同的荧光标记，所以一块胶 应该使用p c r 扩增步骤中不同的标记引物两或三次跑胶，此举相应增加成本有效性啊1 。 1 9 9 8 年时，t r f l p 技术有一些限制：l 、p c r 对于不同模板扩增的倾向性使群落的相 对丰度定量不准确；2 、单个的t r f 检测被电泳技术所限制，应用最新的毛细管电泳技 术；3 、准确的群落定量结果只能通过多个不同单酶切图谱综合分析；4 、群落分析软件 的缺陷。随着技术的日益更新，现在为了最准确的反应细菌群落，研究者建议合并从每 一个均匀样本中提取的d n a 及多次p c r 产物，并尽可能做每一次酶切的电泳以减少低估多 样性，并将一个样本的不同酶切反应资料合并分析协。 。? t - 对t r f l p 的结果作进一步的数据分析，可以比较不同生态系统中微生物群落结 构。其中用s h a n n o n - w i e n e r 指数( h ) 计算得到的微生物群落结构的多样性就是一个常 用的参数。通过h 的比较可以进一步明确各种微生物群落结构的相似性以及同一群落在 空间水平和垂直以及随时间而发生的变化哺1 、 t i l f l p 技术具有3 个明显的优势：序列数据库具有直接的参考意义，也就是说， 从消化产物中获得的所有的末端片段大小，可以与越来越丰富的序列数据库中的末端 片段相对比，从而可以傲系统发育的推断。核酸测序技术要比d g g e 或者s s c p 所依赖 的电泳系统获得的结果更为可靠。驰一r f l p 的毛细管凝胶电泳分析更为快速，而且结 果是以数据的形式输出。t r f l p 技术的这3 个明显的优势使其成为必然成为一种理想 的群落对比分析的方法。该技术目前已被成功的应用到了菌种的鉴定、各种微生物群落 的比较分析、微生物群落多样性及结构特征的研究等方面咖1 。 关于t r f l p 分析的数据库： 西北大学硕士学位论文 p a t ( p h y l o g e n e t i ca s s i g n m e n tt 0 0 1 ) p h y l o g e n e t i ca s s 细n m e n tt o o i 揣誓絮怂黜嚣淼黝。”“呻嘶“。神“ 通过使用基于网络的已知细菌的末端限制性片段预测而完成系统分类的确认，由于 多个酶切产物分析组成的需要和自然微生物群落组成的复杂性，这个方法很快由计算机 改进运算速度，威斯康星大学的工作人员开发了这个基于网络的工具( p a t ) ，通过由 已知1 6 s r d n a 序列片段组成的数据库从已经提交的t r f l p 图谱中分析确定系统进化关 系，使用者可以选择提交一个来自未公开序列或由非1 6 s r r n a 基因的常规的数据库。 p a t 网页的界面允许研究者提交、处理和操作系统进化分析的每一个方面数据，p a t 还允许系统的每一个使用者注册和拥有一个他们自己的资料和结构信息的帐户，使用者 可以用帐户上传酶切和数据资料，使用者同样可以选择由已知1 6 s r d n a 经2 7 种单独的 限制性内切酶进行电子消化所产生的t r f s 组成的默认数据库。网页允许使用者操作 酶切、已知物种数据文件和调整允许出错碱基数( b i ns i z ec o n f i g u r a t i o n ) 为了从 提供的资料中分析确定系统进化关系，使用者选择一个数据库的文件，酶切文档及运算 中涉及的最小出错碱基数( b i ns i z e s ) ，之后p a t 系统促使使用者对每一个酶切文件 在已选择数据库中指定一个特殊的限制性酶。 内切酶经确认后，该系统运行p a t 逼近算法来决定系统进化的对应，系统进化的对 应情况、对应数据和非对应片段信息可以从结果页下载。 m i c a ( m i c r o b i a lc o m m u n i t ya n a l y s i s ) 美国爱达荷大学的微生物群落分析网页 西北大学硕士学位论文 3 2 3 其他非培养微生物多样性分析方法 3 2 3 1 磷脂谱图分析方法( p h o s p h o l i p i df a t t ya c i d ，p l f a ) ： 从土壤中提取磷脂脂肪酸使用w h i t e 等人改进的单相提取法。经过提取脂质，硅胶 柱分离磷脂，甲基化p l f a ，将最终得到的脂肪酸甲酯f a m e s 溶解到含有正十九烷脂肪 酸甲酯内标物的氯仿正己烷( 1 ：4 ) 中。使用气相色谱一质谱联用仪进行定量分析脂肪 酸甲酯。多样性指数h 丰度s 和均匀度阴等指标被用来比较各个土壤样品的微生物多 样性。p l f a 数据使用s p s s 进行主成分分析，采用最大方差旋转法、每个磷脂脂肪酸的 摩尔百分含量都进行底数为1 0 的对数转换、得到的p c a 数值用相关系数矩阵进行方差 分析。 3 2 3 2 限制性片段长度多态性分析( r f l p r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 最初用于有性繁殖后代的分离以构建遗传图( b o t s t e i e t a l ，1 9 8 0 ) ，也是第一代以 d n a 指纹图谱为基础用于细菌分型鉴定的方法，其原理是用限制性内切酶将细胞基因组 d n a 进行切割，之后在琼脂糖凝胶上电泳分离，以显示不同种群基因组d n a 的限制性片 段长度多态性。r f l p 产生的指纹图谱更适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定。由于 r f l p 产生的d n a 指纹图谱十分复杂而造成了应用上的困难，因而人们改进选用切割频 率低的内切酶消化基因组i ) n a ，但产生的大片段d n a 难以用传统的琼脂糖凝胶上电泳分 离，而只能通过脉冲场凝胶电泳分离，目前此技术被认为是d n a 指纹图谱中最有效的分 型方法。 另一种改良的r f l p 是采用不同组合的限制性内切酶消化基因d n a ，经电泳分离后与 标记的核糖体核酸探针进行杂交后而显示不同种群的d n a 指纹图的差异。核糖核酸分型 法( r i b o t y p i n g ) 是一个典型的r f l p 衍生方法。 r f l p 的方法原理也是通过r r n a 基因的扩增，细菌的基因组通常含有多个拷贝的 西北大学硕士学位论文 r r n a 基因操纵子操纵子，每个操纵子由1 6 s ，2 3 s ，5 s r r n a ，t r n a 及间隔序列组成。不 同种群的r r n a 基因操纵子中的片段序列存在差异，因而所产生的限制性片段具有多态 性，有可能产生有用的分类学信息；而r r n a 基因的保守性又使得利用一个单一的r r n a 探针而达到比较研究的目的成为可能。 3 2 。3 3 随机扩增d n a 多态性分析：( r a p d ，r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 又称为随意引物p c r ( a r b i t r a r yp r i m e dp c r ，a p p c r ) 是一种d n a 指纹多态性分 析技术，其理论依据是不同的基因组中与随意引物匹配的碱基序列的位点和数目可能不 同，因而用一组人为设计的核苷酸作为引物，通过p c r 随机扩增可产生物种特异性的 d n a 带谱。因此r a p d 技术可用于细菌种间、亚种问乃至株间的亲缘关系分析，未知菌 株的快速鉴定和流行病学调查等。此外，r a p d 的p c r 产物还可作为探针，与s o u t h e r n 杂交技术结合，用于基因组或菌落杂交，可以填补基因组的遗传图谱和物理图谱问的空 缺。 r a p d 技术是1 9 9 0 年w i l l i a m s 和w e l s h 两个实验室分别建立的，w i l l i a m s 将通常 p c r 扩增中使用的特定序列引物巧妙地改为单一的仅有1 0 个碱基的随即序列弓 物；而 w e l s h 则使用几组通用引物，通过设置p c r 扩增参数也达到了产生物种特异性的d n a 指 纹图。他们的研究赋予了r a p d 显著的优点：在对基因组序列一无所知的前提下即可分 析其d n a 韵多态性；方法的简单快速和高度重复性可普及应用n “。 3 2 3 4 变梯度胶电泳技术和温度梯度胶电泳技术 变性梯度胶电泳技