（食品科学专业论文）黄酮苷元的制备及其微胶囊化.pdf

摘要 摘要 本文以黄酮类化合物中的功能性成分黄酮苷元作为研究对象，在优化黄酮类化合物 的提取工艺的基础上，应用1 3 葡萄糖苷酶将黄酮类化合物酶解制取黄酮苷元，比较了黄 酮糖苷和黄酮苷元的自由基清除能力和抗氧化能力。采用微胶囊化技术对黄酮苷元进行 保护。 采用溶剂法提取银杏叶中银杏黄酮，通过对影响银杏黄酮提取效率的条件进行单因 素实验，得出银杏黄酮的提取条件为：银杏叶粉粒径为4 0 6 0 目，7 0 乙醇水溶液，提取 温度为7 0 。c ，液固比为5 ：l ，提取次数为3 次，每次1 小时。通过对6 种大孔吸附树脂 吸附能力的考察，以a b 一8 吸附树脂的吸附效果较为理想，银杏黄酮的吸附量为4 2 1 4 m g g ，a b 一8 树脂在开始吸附5 小时后基本达到平衡状态，动态吸附提取液上样最佳流速 为0 5 b v h ，吸附液上样浓度为0 9 0 m g m l 。洗脱过程中，选择7 0 的乙醇溶液作为洗脱 剂，洗脱剂用量为4 b v ，洗脱解吸率为9 6 。经过纯化的银杏叶提取物中总黄酮含量( 以 芦丁计) 为2 5 0 1 。 采用1 3 一葡萄糖苷酶降解银杏黄酮制取银杏黄酮苷元，在单因素实验的基础上，以 还原糖相对提高量为间接反映酶解效率的指标，综合考虑酶解效率和经济成本两个方面， 最终确定了酶解的最佳工艺条件：温度5 0 ，酶解时间6h ，e s = 1 2 0 0 0 ，底物浓度5 m g m l 。在此条件下进行酶解实验，还原糖相对提高量达到9 2 3 1 。利用l c m s 对酶解产 物进行了分析研究，糖苷酶酶解后的产物游离黄酮苷元( 山奈酚和槲皮素) 主要存在于沉 淀中，这是由于糖苷降解后，苷元的水溶性显著下降引起的。 银杏黄酮和黄酮苷元的d p p h 自由基清除能力差异不大，银杏黄酮苷元对c l a 氧化的 抑制能力明显强于糖苷型银杏黄酮。 采用喷雾干燥方法制各黄酮苷元微胶囊，以乳清蛋自和麦芽糊精构成复合型壁材， 壁材配比为乳清蛋白：麦芽糊精= 2 ：7 ，最适宜的芯材添加量( 芯材占总固形物的质量百分 比) 为1 0 ，微胶囊化工艺参数为乳化均质压力4 0 m p a ，时间2 0 m i n 。喷雾干燥进风温度2 0 0 ，出风温度9 0 ，在最优条件所得微胶囊包埋率为9 1 。黄酮苷元微胶囊的扫描电镜 结果显示，该微胶囊化产品具有较好的包埋效果。 关键词：黄酮类化合物黄酮苷元提取纯化1 3 一葡萄糖苷酶酶解喷雾干燥 微胶囊d p p h 自由基共轭亚油酸的抗氧化 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ef l a v o n ea g l y c o n ew a ss t u d i e di n t h i st h e s i s ，w h i c hi st h em a i nf u n c t i o n a l c o m p o s i t i o ni nf l a v o n ec o m p o u n d s b a s e do nt h eo p t i m i z a t i o no f e x t r a c t i o nt e c h n i q u e so f f l a v o n ec o m p o u n d s ，t h ef l a v o n ea g i y c o n ew a sp r e p a r e df r o mf l a v o n eg l y c o s i d e sb y 8 - g l y c o s i d a s ch y d r o l y s i s t h ee l i m i n a t i n ge f f e c ta n da n t i o x i d a n tc a p a b i l i t i e so ff l a v o n e g l y c o s i d e sa n df l a v o n ea # y c o n ew e r ea l s oe v a l u a t e d i na d d i t i o n ，t h ef l a v o n ea g l y c o n e w a sp r o t e c t e db ym i c r o e n c a p s u l a t i o n i n p r e g n a n tt e c h n i q u ew a su s et oe x t r a c tt h eg i n k g of l a v o n e t h eo p t i m a lc o n d i t i o n f o re x t r a c t i o nw a s 弱f o l l o w s ：p a r t i c l e sb e i n g4 0 6 0m e s h e s ，7 0 a l c o h o l ，s o l i dt o s o l v e n tr a t i oo f1 ：5 ( g m l ) ，e x t r a c t i n g3t i m e sa t7 0 。ca n dl a s t i n glhf o re a c ht i m e a sa r e s u l t t h ef l a v o n ee x t r a c t i o nr a t ew a sa sh i g ha s9 2 3 1 t h em a c r o - p o r o u sr e s i no f a b - 8w a sm o s ts u i t a b l ef o rp u r i f y i n gf l a v o n eg i y c o s i d e sa m o n gt h e s i xk i n d so f m a c r o p o r o u sr e s i n sb e i n gs t u d i e d ，w i t h t h ea d s o r p t i o no f4 2 1 4m g g t h eb e s t a d s o r p t i o nc o n d i t i o nw a st h es a m p l ec o n c e n t r a t i o no fo 9 0 m g m lf l o wv e l o c i t yo f o 5 b v h t h eh i g h e s td e s o r p t i o no f9 6 w a so b t a i n e dw i t ht h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n ：7 0 o fa l c o h o lu s e da se l u e n t ，t h ev o t u m eo fe l u e n to f4 b v a f t e rt h ep u r i f i c a t i o n ，t h ef l a v o n e c o n t e n tw a sa sh i g ha s2 5 0 1 t h ee n z y m a t i ch y d r o l y z i n gc o n d i t i o n sf o rf l a v o n o i d sw e r es t u d i e df o rg b e ( g i n k g o b i l o b ae x t r a c t ) b a s e do nt h es i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m a l h y d r o l y z i n gc o n d i t i o n sw a sa sf o l l o w s ：c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t eo f5m g m le n z y m et o s u b s t r a t er a t i oo f1 2 0 0 0 ( m l l g ) ，h y d r o l y z i n gf o r6 ha t5 0 w i t ht h eo r i g i n a lp hv a l u eo f s o l u t i o n t h ei n c r e a s eo fr e d u c e ds u g a rw a s9 2 3 1 a to p t i m a lh y d r o l y z i n gc o n d i t i o n s t h ee l i m i n a t i n ge f f e c to fg i n k g of l a v o n et ot h ed p p hf r e er a d i c a lw a ss a m ea st h a t o ff l a v o n ea g i y c o n e ，w h i l et h ea n t i o x i d a t i o ne f f e c to fa g i y c o n eo fg i n k g of l a v o n ew a s b e t t e rt h a nt h a to fg i n k g of l a v o n e t h em i c r o e n c a p s u l a t i o no ff l a v o n ea g l y c o n ew a sp r e p a r e db ys p r a yd r y i n g ，w i t ht h e m i x t u r eo fw h e yp r o t e i na n dm a l t o d e x t r i nc o m p o u n da sw a l lm a t e r i a la tt h er a t eo f2 ：7 ( w h e yp r o t e i n ：m a l t o d e x t r i n w w ) a n dt h ec o n t e n to fc o r em a t e r i a lb e i n g1 0 t h e o p t i m a lt e c h n i q u e sp a r a m e t e ro fm i c r o e n c a p s u l a t i o nw a s a sf o l l o w s ：h o m o g e l y z i n ga t4 0 m p af o r2t i m e sa n d2 0m i n u t e se a c ht i m e ，t h et e m p e r a t u r ef o ri n l e ta n do u t l e tw i n d b e i n g2 0 0 ca n d9 0 。c ，r e s p e c t i v e l y t h em i c r o e n c a p s u l a t i o nr a t eo ff l a v o n ea g l y c o n e w a s9 1 a to p t i m a lc o n d i t i o n s t h es e mp i c t u r eo fm i c r o e n c a p s u l a t i o no ff l a v o n e a g l y c o n es h o w e dt h a te m b e d e f f e c tw a sd e s i r a b l e k e y w o r d s ：f l a v o n ec o m p o u n d s f l a v o n ea g i y c o n ee x t r a c t i o np u r i f i c a t i o n 1 3 - g l y c o s i d a s eh y d r o l y s i sm i c r o e n c a p s u l a t i o ns p r a yd r y i n g f r e er a d i c a lo fd p p ha m i o x i d a t i o no fc o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d l i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 兔缝 日期：绰岁月幻e l 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 璺丝导师签轹龇岛 日期：州年月2 , o e l 第一章绪论 1 1 黄酮类化合物简介 第一章绪论 黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) 是自然界尤其是植物界分布较广泛的一大类天然酚类化 合物l l j 。大多有颜色，是药用植物的主要活性成分之一。由于该类化合物具有多种多样 的生物活性，且毒性较低，因此一直受到国内外的广泛重视，成为研究和开发利用的热 点。自1 8 1 4 年发现第一个黄酮类化合物白杨素( c h r y s i n l 以来，新发现的黄酮类化合 物的数量每年都以较快速度增长，至2 0 0 0 年其总数已超过8 0 0 0 个【”。 黄酮类化合物系色原烷( c h r o m a n e ) 或色原酮( c h r o m o n e ) 的2 或3 苯基衍生物，泛指 由两个芳香环( a 和b 1 通过中央三碳链相互连接而成的一系列化合物，一般具有c 6 一c 3 一c 6 的基本骨架特征i “。 ：0 50 4 1 ： 色巨靛 色l i l l l 0 ：吠81 程。辫 黄酮类化合物在植物体内常与糖结合成苷类或以游离的形式存在。3 。在植物的花、 叶和果实等器官中多以苷类形式存在，在植物的木质部则多以游离态存在，它对植物的 生长发育、开花结果以及防御异物的侵害都具有重要作用。 生物合成途径的研究结果表明0 1 ，植物体内黄酮类化合物的形成，是由一分子桂皮 酰辅酶a ( 苯丙氨酸经桂皮酸途径产生) 与三分子丙二酸单酰辅酶a ( 醋酸一丙二酸途径产 生) 先缩合生成查耳酮，再由查耳酮在异构化酶的作用下异构化形成二氢黄酮，而查耳 酮和二氢黄酮则是黄酮类化合物生物合成的重要中间体，二者在各种酶的催化下进一步 转化衍生出各种结构类型的黄酮类化合物。同位素标记实验也证实，a 环来自丙二酸单 酰辅酶a ，而b 环则来自于桂皮酰辅酶a 。黄酮类化合物生物合成的基本路线见图1 1 “1 。 江南大学硕士学位论文 o h j 。渤h 三”旦 图1 1 黄酮类化合物生物合成的基本途径 注：e 1 ：苯内氨酸脱氨酶；e 2 ：桂皮a 羟化酶；e 3 ：c o a 连接酶 e 4 ：查耳酮合成酶；e 5 ：查耳酮异构化酶 黄酮类化合物大多以苷类形式存在，由于糖的种类、数量、连接位置以及连接方式 的不同，可以形成各种各样的黄酮苷类，且以氧苷居多，少数为碳苷“1 。黄酮苷中糖基 的连接位置与苷元的结构类型有关，例如黄酮醇类多在3 一、7 一、3 、4 。位形成单糖链 苷，或在3 一和7 一、3 一和4 一及7 一和4 _ 位形成双糖链苷。碳苷中，糖基常连接在6 一或( 和) 8 一 位上。 黄酮类化合物大多为结晶性固体，少数( 如黄酮苷类) 为无定形粉末”“”。 多数黄 酮苷元无旋光活性，结构中含有不对称碳原予的二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢异黄酮和 黄烷醇类化合物例外。黄酮苷类由于在结构中引入了糖基，所以均有旋光性，且多为左 旋。 第一章绪论 1 1 1 黄酮类化合物的颜色 黄酮类化合物的颜色与其分子结构中是否存在交叉共轭体系和是否含有羟基、甲氧 基等助色基团有关“。以黄酮为例，其色原酮部分本身无色，但在2 一位引入苯环后 形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排、使共轭链延长而显颜色，如下所示： + + 黄酮母核的7 一或4 - 位引入羟基、甲氧基等斥电子基团时，由于形成p n 共轭，促 进电子转移、重排，使化合物颜色加深，而在其他位置上引入羟基和甲氧基则影响较小。 通常，黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄至黄色，查耳酮为黄至橙色，而二氢黄酮、二氢 黄酮醇类因c 一2 和c 一3 之间的双键被氢化，交叉共轭体系中断，几乎没有颜色。异黄酮 因苯环取代在3 一位，共轭区域减少，仅显微黄色。 花色苷及其苷元的颜色随p h 值不同而变化，p h 8 5 显蓝色。 黄酮类化合物的颜色反应比较多，主要是利用分子中酚羟基和y 吡喃酮环的性质 显色。分子中有5 一羟基、4 一碳基，或3 一羟基、4 一碳基，或邻二酚羟基结构的黄酮类化 合物，能与许多金属盐类试剂如铝盐、铅盐、镁盐等发生反应，生成有色螯合物。 1 1 2 黄酮类化合物的溶解性 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态( 苷和苷元、单糖苷、双糖苷和三糖苷) 不同而有很大差异m ，。游离的黄酮苷元一般难溶或不溶于水，能溶于甲醇、乙醇、乙酸 乙酯、乙醚等有机溶剂。因其分子中多数都含有酚羟基，故易溶于稀碱性水溶液和吡啶、 甲酰胺等有机溶剂。分子中存在共轭体系且为平面型分子的黄酮、黄酮醇和查耳酮类， 分子与分子堆砌紧密、分子间作用力大，在水中的溶解度更小。二氢黄酮及二氢黄酮醇 为非平面型分子，分子间排列不紧密，有利于水分子的进入，溶解度较大。异黄酮类化 合物的b 环芳基连接在c 一3 位上，与羰基靠近，空间位阻较大，影响分子的平面性，故 水溶性要比平面型分子大“1 。花色素类虽然也是平面型分子，但因其以离子形式存在， 具有盐类通性，溶解度较大。二氢黄酮及二氢黄酮醇的非平面结构如下： 江南大学硕士学位论文 o r = 或r - - o h 图1 2 二氢黄酮及二氢黄酮醇的非平面结构 黄酮苷元有羟基取代时，水溶性增加；羟基数目越多，水溶性也越大。若羟基被甲 基化，则水溶性降低，脂溶性增加。例如一般多羟黄酮类不溶于石油醚，可借此与脂溶 性物质分开，但多甲氧基衍生物，却可溶于石油醚。 黄酮类化合物的羟基糖苷化后，水溶性即相应增强，而在有机溶剂中的溶解度则相 应减小。黄酮苷类一般易溶于热水、甲醇、乙醇等强极性溶剂，难溶或不溶于苯、乙醚、 氯仿等有机溶剂“1 。另外，苷分子中糖基的数目和结合的位置对溶解度也有一定影响， 一般3 一羟基苷类比相应的7 一羟基苷类水溶性大。例如槲皮素一3 一o - 葡萄糖苷的水溶性比 槲皮素一7 一o 一葡萄糖苷的水溶性要大m 。 1 i 3 黄酮类化合物的酸碱性 黄酮类化合物因分子中有酚羟基而显酸性，其酸性强弱与酚羟基数目的多少以及取 代的位置有关“。例如，黄酮类酚羟基的酸性强弱顺序为： 7 ，4 - 二羧基 7 或4 _ 羟基 一般酚羟基 5 一羟基 若7 一位和4 l 位同时有酚羟基，受a 环共轭效应影响，酸性增强，可溶于碳酸氢钠 溶液；仅有7 一位或4 _ 位一个酚羟基时，能溶于碳酸钠溶液：在后两种情况中，因酚羟 基酸性较弱，只能溶于氢氧化钠溶液。尤其是只有5 一位酚羟基时，由于与c 一4 羰基形成 分子内氢键，因此酸性最弱。p h 梯度法分离黄酮类化合物，正是利用了这一酸性的差异。 1 1 4 黄酮类化合物的抗氧化性 黄酮类化合物的抗氧化机理有两类：一类是络合具有促进氧化作用的金属离子，另 一类是清除自由基。当金属离子存在时，金属催化的氢过氧化物的分解是游离基的主要 来源。铁和铜等金属离子无论是处于低价氧化态还是处于高价氧化态，都可以促进氢过 氧化物的分解，所以金属离子具有促进氧化的作用。黄酮类化合物可与金属生成螯合物， 黄烷酮醇与金属离子螫合发生在3 一羟基一4 一酮基；如果a 环在5 位上是羟基时，螯合作 用则发生在5 一羟基- 4 - 酮基。b 环上的邻酚结构也有络合金属离子的作用”。从而可减少 金属离子对氧化作用的催化活性，提高了氧化反应的活化能，从而阻碍了氧化反应的发 生。 4 第一章绪论 研究表明，一些黄酮化合物类如槲皮素、杨梅黄酮等的抗氧化活性远高于传统的抗 氧化物质如v c 、v 。等“1 。 另一方面，黄酮类化合物是能提供氢原子的物质，氢原子能与过氧化物自由基即 r 0 0 反应，生成稳定的氢过氧化物r o o h ，而且，黄酮类化合物中的酚羟基与氧自由基 反应，形成共轭稳定的半醌式自由基，从而中断游离自由基链式反应，因此共轭半酣式 自由基和氢过氧化物r o o h 的稳定性与抗氧化活性成正相关。同时此抗氧化作用的强弱 还取决于酚羟基上氢原子的活性和酚羟基自由基的位阻，位阻大，酞基自由基自动氧化 链反应的传递速度减慢，使链反应中断而提高抗氧化性。 影响黄酮类化合物抗氧化活性的因素，最主要的是羟基化的程度和羟基的位置。 一般认为，b 环中的邻二羟基对黄酮类化合物的抗氧化活性起主要作用，b 环中的对位 和间位二羟基化合物在自然界一般不存在。b 环的对位醌醇结构比邻位醌醇结构的活性 大，间位体没有抗氧化活性。 研究发现，黄酮化合物邻二酚羟基清除自由基的活性强于间二酚羟基，同时发现黄 酮类各个环上的酚羟基活性相差较大，b 环的酚羟基活性最高，当c 环为色原酮时，其 上的酚羟基也有一定的作用，a 环的酚羟基活性最弱。许多黄酮类化合物及其衍生物在 油一水和油一食品体系中有显著的抗氧化能力，如与柠檬酸、抗坏血酸或磷酸配合使用 效果更佳。 含糖苷基的黄酮类化合物的抗氧化活性，比不含糖苷基的要弱，而且与其存在的位 置有关。1 ，如糖苷出现在b 环上，那其抗氧化作用基本上接近于对照，而葡萄糖基无论出 现在c 一3 或c 一7 其他位置，与其活性强弱几乎无关，因为起重要作用的是b 环上的邻二羟 基是否完整。一般在植物性食品的黄酮类化合物中，糖苷基主要出现在3 一o h 位，较少出 现在7 0 h 位，仅有极少数的出现在3 ，4 或5 0 h 位。经比较，在a a p h 水溶性自由基引 发剂诱发下，它们对脂质体磷脂酰胆碱( 蛋白卵磷脂) 产生氢过氧化物的形成能力以q 一4 一g ( q ：槲皮素，g ：葡萄糖基) 最弱，因为它打破了槲皮素原有的邻二羟基结构，而对 q 一3 一g 和q 一7 一g ，因它们分别在3 位和7 位的自由羟基被取代而丧失了部分的抗氧化能力。 1 2 黄酮类化合物的开发利用情况 1 2 1 黄酮类化合物的食用、药用价值 黄酮类化合物( 简称类黄酮) 是一种广泛存在于植物中的天然有机化合物，它存在 于植物的所有部分，包括根、心材、树皮、叶、果实和花中，光合作用中约有2 的碳源 被转化成类黄酮。早在3 0 年代人们就发现了黄酮类化合物具有维生素c 样的活性，曾 一度被视为是维生素p 。至今法国与俄罗斯仍继续将黄酮类化合物视为维生素p 。 由于含黄酮类物质的植物资源十分丰富，如银杏叶、苦荞、山楂、桑叶、竹叶、可 江南大学硕士学位论文 可、葛根等，是许多中草药的有效成分。因此深入地研究进一步开发黄酮类化合物产品， 具有很好的经济效益和社会效益，不仅能促进资源的合理开发，而且还有利于提高入民 的健康水平“1 ，同时黄酮类化合物在医药、食品等方面具有广泛的应用前景。 现代研究发现，黄酮类化合物是人体必需的天然营养素，当人体内缺乏类黄酮时， 容易导致大脑和心脏功能不全，血管硬化、脆性增强。因其分子量小，易被人体吸收， 能通过血脑屏障，进入脂肪组织。所以它对人体的健康具有广泛的作用，如抗炎症、抗 过敏、抑制细菌、抑制病毒、防治肝病、防止血栓形成、防治心脑血管病、抗肿瘤等。 黄酮类化合物能够消炎、抑制异常的毛细血管通透性增加及阻力下降、扩张冠状动 脉、增加冠脉流量、影响血压、改变体内酶活性、改善微循环、解痉、抑菌、抗肝炎病 毒、抗肿瘤，有很高的药用价值“1 。黄酮类化合物对调节生理功能，提高生命运动质量， 具有极其重要的意义。卫生部门和国家食品药品监督管理部门已正式批准蜂胶黄酮为保 健食品功效成分。 由于黄酮类化合物代谢快，在体内不蓄积，需要经常补充。黄酮类物质是人体必需 营养素之一人体自身不能合成类黄酮，必须从食物中得到，食物来源是谷物、蔬菜、水 果、果汁、茶叶等 黄酮类化合物不仅具有广泛的生物活性和重要的药用价值，而是可用做食品、化妆 品的天然添加剂，如甜味剂、抗氧化剂、食用色素等。 近年来、对其化学结构与生物活性的相关性研究越来越受重视，这对从自然界中寻 找黄酮前体化合物和进行结构改造或修饰，以及对创制新药都具有重要意义。 黄酮类化合物的生理功能可概括为“1 ： 调节毛细血管的脆性与渗透性。 是一种有效的自由基清除剂，其作用仅次于维生素e 。 具有金属螯合的能力，可影响酶与膜的活性。 对维生素c 有增效作用，有稳定人体组织内维生索c 的作用。 具有抑制细菌和抗生素的作用。 在两方面表现有抗癌作用，一方面是对恶性细胞的抑制( 即停止或抑制细胞的增 长) ，另一方面是从生化方面保护细胞免受致癌物的损害。 银杏亦称“白果树”。属银杏科，落叶乔木，高可达4 0 m ，系中生代的孑遗植物，己 存在1 5 亿年，有“植物活化石”之称，生长慢，寿命长，树龄可达数千年，一生无病 虫害，可见其具有极强的抗病能力和生命力。1 9 4 5 年广岛核爆后，银杏是惟一存活下来 的植物。我国各地均有栽培。1 6 世纪开始入药。现主要是利用其叶子的提取物。在德、 法等西欧5 5 个国家用作药品( 改善心脑血管) ，始用于1 9 6 5 年，称为“e g b 7 6 1 ”。美国、 日本作为营养补助食品使用。中国现有栽培面积约5 0 万亩，年产银杏干叶约1 5 万余 吨，占世界总产量的8 0 以上。 银杏叶中含有2 0 余种黄酮类化合物，包括黄酮、异黄酮、双黄酮等。黄酮类化合 物是银杏叶中的主要药效成分，银杏黄酮具有广泛的生物活性，包括抗氧化活性，抗肿 第一章绪论 瘤活性，抗炎症和调节免疫细胞效应，调节毛细血管的脆性与渗透性，保护心血管系统， 影响人体内的酶系统，产生抗菌抗病毒作用，影响动物生殖、生长性能等。银杏叶黄酮 类化合物能扩张血管，增加外周血液循环的血流速度，降低血胆固醇，改善胆固醇和磷 脂比例，抑制血栓的形成“4 。以银杏叶为原料提取银杏黄酮制成的药物，对心血管、 脑血管、动脉硬化、高血压等疾病的治疗，有其他药物不能达到的特殊疗效，而且银杏 叶制剂长期服用几乎没有毒副作用。 银杏叶提取物清除自由基主要基于黄酮部分，其分子中的还原性酚羟基可能是其清 除作用的化学基础。银杏叶黄酮具有消除氧自由基、防止过氧化脂质引起的损伤，改善 血液流变学、降低体内过氧化脂质和提高超氧化物歧化酶的活力等作用。 谢人明等“”报道银杏叶注射液对动物脑循环作用的研究结果表明，对麻醉猫、狗有 显著降压作用，也能降压心肌张力一时间指数。潘苏华等“”报道从银杏叶中提取的i g k 有抗血小板黏附聚集作用，明显抑制血栓形成。杨艳燕报道“”荷1 8 0 肉瘤小鼠胸腺重量 以及s o d 活性均明显降低。银杏叶总黄酮灌胃给药能增加荷瘤小鼠的胸腺重量及s o d 活 性，调动肌体内在的抗肿瘤能力，对防治肿瘤具有一定的意义。章家胜等“”报道，在2 5 l o o m g k g 范围内，银杏叶总黄酮显著降低脑、心组织中m d a 和n 0 含量，对脑心有显著 保护作用，其作用可能与抑制膜脂质过氧化以及减少n o 有关。 银杏叶黄酮类化合物能促进大脑循环代谢，改善记忆功能，对脑缺血具有明显保护 作用”7 。早期的临床研究证明，银杏叶中的黄酮类物质有止喘、抗菌消炎、抑制致癌 启动因子( t p a ) 及治疗过敏症和老年痴呆病等作用。银杏叶中的提取物可用于烧伤、烫 伤、放射病、脓毒病、胰腺炎等急救，银杏叶黄酮可阻止因苯巴比妥引起的肝微粒体自 由基的形成，从而达到保护肝的作用。银杏叶黄酮类化合物还能促进毛发生长，减少脱 发，因此可应用到护发剂中。通过促进体表毛细血管的血液循环，可以清除皮肤表面的 过氧化物和自由基，所以把银杏叶黄酮类提取物添加到护肤化妆品中能滋润皮肤，减少 黑色素的形成，延缓皮肤的衰老过程。 此外，银杏叶制品还可用于生物农药、保健食品等方面。由于我国盛产银杏，资源 丰富，因此进一步开发利用银杏叶具有重要意义。 1 2 2 国内外开发现状 黄酮类化合物由于其特殊的生理功能而受到国外研究者的广泛关注。在欧美以及日 本韩国等，研究重点主要是黄酮类物质在医药以及保健食品等方面。 上世纪六十年代德国、法国、美国、英国、日本等国开始对银杏的化学成分、药理 作用进行深入系统的研究工作。从7 0 年代起，国际上出现了以银杏为代表的天然热潮， 以银杏叶提取物为原料制成的各种胶囊、片剂、针剂，已开始用于治疗心脑血管疾病。 1 9 7 2 年西德学者获得应用银杏叶提取物治疗心脑血管疾病的专利。1 9 8 4 年法国学者发 现银杏内脂为血小板活化因子( p a f ) 的强效拮抗剂。目前，美国、日本等国家把黄酮 江南大学硕士学位论文 作为添加利用于保健食品、医药制品及功能助剂等方面产品和制品的生产。 1 3 黄酮苷元 黄酮类化合物主要有黄酮糖苷与苷元两种形式，而天然银杏中9 5 以上的黄酮是以 糖苷形式存在的。大量研究显示，黄酮苷元清除人体氧自由基的生物活性明显优于黄酮 糖苷，黄酮苷元的效价是黄酮糖苷效价的7 倍。槲皮素自身并不存在于g b e 中，但是目 前的实验表明槲皮素具有很强的血管扩张能力。l m g m lg b e 中的槲皮素葡萄糖苷在水 解之后相当于3 0 0um o l 1 的槲皮素。然而，与l m g m 1g b e 诱导产生的血管扩张作用 相比，3 0 0pm o l 1 的槲皮素诱导产生的血管扩张作用更强“。 糖苷型黄酮类化合物进入消化道后水解成苷元才能被吸收利用“”，其吸收主要通过 两种途径“，脂溶性的苷元可从小肠直接吸收，机理尚不清楚，食物中大部分以苷类形 式存在的异黄酮不能通过小肠壁，而是通过结肠中细菌的b 一葡萄糖苷酶而水解，生成 的产物又进一步被细胞降解，生成苷元，人体实验表明黄酮主要在肠道中被吸收，吸收 率为1 0 4 0 。 动物实验表明，黄酮类化合物在肝脏中参与i i 型反应，一0 h 基团与葡萄糖醛酸、硫 酸结合，此外也可能发生去甲基化。结合型产物可随胆汁分泌到肠腔中，在结肠微生物 产生的脱结合酶作用下，水解产生苷元再重新进入血液。与此同时，大部分黄酮类化合 物被肠腔内微生物通过亲环裂解方式降解和代谢，产物可吸收入血液，再从尿中排出， 但尿排出量只占吸收量的7 3 0 。 一些人体实验研究表明，槲皮素以及槲皮素糖苷能够被肠道所吸收，并且发现在血 液中，槲皮素是以槲皮素葡萄糖苷或硫酸盐和非结合状态的苷元形式存在“7 1 。金雀异 黄素和大豆苷元是大豆中的两种重要异黄酮，并且在肿瘤预防中发挥重要作用o ”“。染 料木黄酮( 三羟异黄酮，g e n i s t e i n ，g e n ) 是大豆异黄酮的重要成分，其抑制肿瘤的血管 生成是当前研究的热点之一n “据报道，金雀异黄素所发挥的重要作用的生化机理可能 包括，与雌激素的受体发生反应，作为抗氧化剂的作用，d n a 异构酶的抑制剂，酪氨酸 蛋白磷酸酶的抑制剂等n 3 。】。 g e n 是大豆中的一种非营养成分，其抗癌效应备受关注，被认为是一种强力有效的 蛋白酪氨酸激酶( p t k ) 活性抑制剂，a k i y a m a 等。”早在1 9 8 7 年就首次报道了这一特性， 且发现这种抑制作用机制包括与a t p 竞争性抑制和与蛋白质底物的非竞争性抑制两方 面。生长因子信号转导通路中的任何蛋白质( 如g r b 2 m s 0 8 复合物、r a s 蛋白、r a f 、m a p k 、 p 1 3 k 、p k b a k t 等) 都可能是g e n 的作用靶。g e n 可以通过抑制h e r2 n e u 生长因子受体 p t k 活性，阻断下游信号耦联，调节v e g f m r n a 和蛋白表达。 汪毗等”1 研究表明，经2 0um o l l g e n 处理的细胞变为梭形，伪足减少，核分裂相 减少。而经过4 0um o l l 金雀异黄素处理的出现大量细胞形态很不规则的细胞碎片， 有丝分裂相少见，细胞问少有连接。金雀异黄素可显著抑制肾肿瘤细胞g r c - 1 的增殖， 第一章绪论 使细胞周期阻滞于g 1 s 、g 2 m 期，其机理可能是通过提高肿瘤细胞中p 2 7 蛋白的表达 水平实现的。 由此可见，改善黄酮的构型，提高其在血液中的吸收率是提高黄酮类产物生物利用 率的重要途径。 酶是具有高催化效率和专一性的生物催化剂，能选择性的催化某种物质的水解。酶 本身也是蛋白质，可被生物降解，是有利于环境保护的“绿色”物质。酶催化作用的条 件相当温和，有利于节能，是极具潜力的生物催化剂。用酶催化水解黄酮类化合物上的 糖苷键，能保持黄酮苷元结构不变而得到真正的苷元，同时反应条件温和，以便于进一 步对黄酮苷元进行保护。 1 4 黄酮苷元的微胶囊化 微胶囊技术是将固体、液体或气体包裹在一个微小胶囊中的技术。包埋用的壁壳称 为壁材；被包的囊芯称为芯材，芯材可以是单一的，也可以是复合的。囊壁厚度一般为 0 1 2 0 0 um 之间，微胶囊的粒子大小，因制备工艺及用途不同而不同，理论上可以制 成0 0 1um 1 0 0 0um 的微胶囊。虽然对于微胶囊尺寸范围的分类还没有很统一的标准， 但目前有人认为直径小于l p m 的为毫微胶囊，而直径大于1 0 0 0um 的为大胶囊。工业的 微胶囊一般直径在3um 8 0 0um ，含1 0 9 0 质量百分比的芯材。微胶囊的形状可以 为球形、塔型、谷粒状、块状等。形成微胶囊的物质由于与外界环境相隔离，可以免受 环境的影响，从而保持稳定，而在适当条件下，被包埋物质又可以释放出来。进入2 0 世纪7 0 年代以后，微胶囊技术的工艺日益成熟，应用范围也逐渐扩大，已从最初的药 物覆盖和无碳复写纸扩展到食品、农药、肥料、饲料等各个行业。 将芯材物质进行微胶囊化后，有以下优点：使芯材物质与外界环境相隔离，可抵 抗氧、光的作用，尤其象一些厌氧有益活菌和维生素e 、a 、c 等易被氧化的物质；可 以使相互作用的物质相混合、共存；可以保护挥发性物质，遮蔽一些芯材物质的不良 气味；可以使液体固态化，便于贮存和运输；可以凋节物质的比重；可以使药物 在体内持续作用：具有光敏性、热敏性和力敏性及半渗透性，可以在一定条件下释放 芯材物质，可以制成一些特殊功能制品，如人造红血球等。 在食品工业中微胶囊化方法主要有利用化学原理的方法( 如：界面聚合法，原位聚 合法，锐孔一凝固浴法) ，利用物理化学的方法( 如：复合凝聚法，单凝聚法，油相分离 法，干燥浴法，融化分散凝聚法和粉末床法) ，利用物理和机械原理法( 如：锅包法， 空气悬浮成膜法，喷雾干燥法和包结络合法) 。 喷雾干燥法是最常用和成本最低廉的微胶囊化方法，喷雾干燥法制造微胶囊的过程 中，芯材与壁材的比例、进料的温度与湿度、干燥空气进出口温度等因素都会影响产品 的质量。 微胶囊过程，可分为以下四个步骤： 江南大学硕士学位论文 1 ) 将芯材分散入微胶囊化的介质中： 2 ) 再将壁材放入该分散体系中； 3 ) 通过某种方法将壁材聚集、沉渍或包敷在已分散的芯材周围： 4 ) 这样形成的微胶囊膜壁在很多情况下是不稳定的，尚需要用化学或物理的方法 进行处理，以达到一定的机械强度。 吴婉莹，李云谷在金雀异黄素壳聚糖微球的制备方法研究中。”，采用星点设计实验， 优化金雀异黄素壳聚糖微球的制备工艺，提高预测性。壳聚糖微球用复乳法制备，利用 s t a t i s t i c a l 软件进行多元线性回归和二项式拟合，求得方程，用效应面法选取较佳工 艺条件。结果：投药量最佳为1 3 1 5 ，有机相浓度为3 0 4 0 ，油相浓度为6 8 7 2 结论：通过星点设计和效应面优化法优化金雀异黄素壳聚糖徽球的制备工艺，预测性较 好。 刘云海等在天然色素花青素的微胶囊化研究中。“，采用喷雾干燥法制备了高包埋率 微胶囊化花青素( 黄酮类化合物的一种) 的壁材组成以及工艺务件，实验结果为：花青 素：壁材为2 0 ，麦芽糊精：b 一环状糊精为3 ：1 ，阿拉伯胶比例为l o o ，喷雾干燥的进口 温度1 2 0 。c ，出口温度8 0 c ，花青素的微胶囊化效果最好、包埋率高，而且花青素微胶 囊化后，其稳定性有显著提高。 1 5 立题的背景和意义 黄酮类化合物广泛存在于自然界中，其中又以银杏和大豆为最主要的黄酮来源。 目前全球使用天然药物的人数约为4 0 亿，使得世界各国不断放宽对中医药的限制， 其销量也逐年攀升，中医药产业在全球正迎来一个新的发展机遇。受世界潮流的影响， 包括中医药在内的天然药物受到各国普遍的关注，很多国家从战略的角度引导这些产业 的发展，一些国家把此类药物作为发展重点。如日本的汉方药、韩国的韩药，都从国家 角度提出发展战略、支持产业发展，并把中国作为竞争对手和战略上的赶超目标。 德国是西欧国家使用中草药最多地国家，占了德国和欧盟7 0 的市场，服用中草药 德国人超过5 8 。在德国大部分药店都可以买到中草药，德国的银杏制剂年销售额已超 过1 亿美元。用甘草、穿山甲、知母、茯苓制成的中药和用大蒜、山楂、芦丁制成的青 春活力片等在欧盟国家中的年销售额已达2 2 亿美元。 然而由于中药中的主要生物活性成分无法一一确定，所以也一直无确定中药中活性 成分与中药所起疗效作用之间的对应关系，这对于中药在国际市场的推广以及提高中药 的高附加值都有一定的阻碍的作用。如瑞士罗氏制药公司制造的治疗禽流感特效药一达 菲，其主要原料就是从国内常用的八角茴香等提取的莽草酸。所以精确分析中药中各功 能因子的生物活性及其协同作用，可以为中国中药工业在世界市场的推广提供理论依 据。 2 0 0 5 年我国银杏提取物产量可达1 5 0 吨左右。银杏提取物产品8 0 出口，国内消耗 1 0 第一章绪论 不到2 0 吨。在银杏提取物产量方面，基本形成了德国s c h w a b e 公司和法国b e a u f o u r 公司为一方( 年产1 0 0 吨) ，中国邳州为一方( 年产u 7 吨) 占领世界市场的主体格局。 我国黄酮类化合物开发利用起步较晚，由于受经济利益驱动，国内大量上马黄酮类 化合物提取项目，如银杏叶黄酮提取工厂，大豆异黄酮提取工厂以及其他黄酮类化合物 提取工厂，国内市场需求有限，市场竞争异常激烈，而黄酮类化合物的产品质量要求逐 年提高，因此企业需要与科研单位合作，解决产品质量不断出现的新问题，开拓黄酮类 化合物的国际市场，降低成本，开发高精尖的新产品，使企业能够健康快速的发展。 1 6 本论文主要研究内容 本论文研究目的是在优化黄酮类化合物的提取工艺的基础上，应用b 一葡萄糖苷酶 将黄酮类化合物酶解制取黄酮苷元。采用微胶囊化技术对黄酮苷元进行保护，比较了黄 酮糖苷、黄酮苷元和微胶囊化黄酮苷元的抗氧化能力。 主要研究内容如下： 1 采用有机溶剂提取银杏叶黄酮类化合物并优化了提取纯化工艺条件。 2 研究b 一葡萄糖苷酶酶解黄酮类化合物制取黄酮苷元的工艺。比较黄酮糖苷、黄 酮苷元对共轭亚油酸的保护作用和灭活d p p h 自由基的能力。 3 研究喷雾干燥法微胶囊化技术制取黄酮苷元微胶囊的工艺。 江南大学硕士学位论文 2 1 前言 第二章银杏叶提取物的提取及纯化工艺研究 银杏叶提取物提取方法主要有水蒸气蒸馏法、有机溶剂提取法和超临界流体提取 法。水蒸气蒸馏法设备简单，但提取率较低，现已很少采用。 有机溶剂提取法国内外使用最为广泛，其提取工艺的专利可归纳为两种形式：一种 是制备银杏叶粗提物；另一种是制备银杏叶精提物。通常在粗提物制各基础上，进一步 精制，常用方法为：液一液提取法，沉淀法和吸附一洗脱法。国内学者在这方面做了大量 研究，使得银杏叶提取物( g b e ) 中银杏黄酮的含量大大提高。其中吸附一洗脱法中大孔 吸附树脂法具有简单易行的特点，应用较为广泛。 此外，近年来还有学者研究了微波法、超声波、水酶法等方法在银杏叶黄酮提取中 的应用。”。3 “。国内游海等。3 1 研究了超临界萃取法在银杏叶黄酮类化合物提取中的运用， 实验结果表明，采用s f e c o ：方法能够有效提取银杏叶中黄酮类化合物，产品中银杏黄酮 含量达至i j 2 8 以上，高于欧洲e g b 7 6 1 的质量标准( 2 4 ) ，且产品中无有害物质残留，有 毒物质银杏酚酸的含量叶得到了有效的控制，但由于设备投入巨较大，产品有限，目前 应用还很有限。 为了制备黄酮苷元，本文首先研究了溶剂提取法提取银杏叶中黄酮的工艺条件，并 采用大孔吸附树脂对粗提物进行了纯化。 2 2 实验材料与设备 2 2 。1 实验材料 实验材料名称 银杏叶 芦丁 大孔树脂 无水乙醇 氢氧化钠 亚硝酸钠 硝酸铝 2 2 2 实验设备 规格 a r a r a r a r a r a r 生产厂家 江苏泰兴 美国s i g m a 公司 天津南开大学化工厂 中国医药集团上海化学试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂有限公司 中国上海振欣试剂厂 第二章银杏叶提取物的提取及纯化工艺研究 设备名称 玻璃层析柱 h l - 2 恒流泵 电子天平f a l l 0 4 7 2 2 分光光度计 s h z - 8 8 台式水浴恒温振荡器 双层铝合金电炉 冷藏冷冻箱 k q 2 2 0 0 d b 型数控超声波清洗器 l g j 一1 0 冷冻干燥机 中药粉碎机 旋转蒸发仪 2 3 实验方法 2 3 1 芦丁标准曲线制备 生产厂家 上海锦华玻璃仪器厂有限公司 上海精科实业有限公司