HPV培训课件.ppt

,HPV分型检测在宫颈疾病检查中的应用及亚能HPV基因分型检测,HPV发展进程,70年代德国人哈拉尔德楚尔豪森提出人乳头瘤病毒与宫颈癌有关系1995年国际癌症学会确定：人乳头瘤病毒是宫颈癌的主要病因。2008年10月6号哈拉尔德楚尔豪森获得诺贝尔奖。,宫颈癌生物学病因研究的进程,子宫颈癌,唯一病因明确唯一可以早期发现和治疗唯一可望消灭HPV感染，特别是高危性、持续性感染引起子宫颈癌前病变，子宫颈上皮内瘤变，CIN和宫颈癌预防HPV感染就可以预防宫颈癌没有HPV感染就可以不罹患宫颈癌,我国宫颈癌流行现状,我国妇女患宫颈癌的比例15/10万，是仅次于智利的宫颈癌高发国家目前患者约40万，每年新增15万，据女性生殖道肿瘤首位我国的宫颈癌死亡率为11.34%，据女性癌症死亡率第二位，特别在西部地区，宫颈癌居女性癌症死亡率之首我国已婚女性HPV感染率在10%左右。我国需惊醒宫颈癌相关筛查的适龄女性，不少于1亿,HPV病毒学基础知识,小环状双链DNA病毒2.直径50-55nm3.癌基因E6E7,14,66,低危型HPV,高危型HPV,HPV16,L1:主要衣壳蛋白，是疫苗的主要成分,L2:次要衣壳蛋白，是市售抗体的主要识别位点,E4：结合并破坏细胞角蛋白网，形成挖空细胞的外观,E2：负性调节E6和E7，维持凋亡和细胞周期的调控。通常在病毒发生整合（病毒整合时会破坏E2基因的结构）时失活,HPV的主要致癌基因E6通过抑制p53而阻断凋亡E7通过抑制pRB使细胞周期失控,X,生殖道HPV感染,高危型HPV感染通常没有症状，为一过性并可自愈。90%以上的病人两年内可痊愈。常见其他亚型继发或并发感染多重HPV亚型感染极为常见自然免疫力差感染后只有50%-60%的女性产生抗HPV抗体，因此对同种基因型的HPV可再度感染！,E6348:518-27,Luminex100TM多功能流式点阵仪,流式荧光杂交法-不定量,流式荧光杂交法总结,结合普通PCR技术，核酸分子杂交技术和荧光标记技术尚不成熟，灵敏度和特异性有待提高无洗涤步骤，无法去除非特异性杂交，且有背景荧光信号干扰技术难点为探针与微球的交联，产品性能上存在不稳定性只分型，不定量需价格昂贵的流式荧光检测仪,（二）二代杂交捕获HybridCapture2,HC2,基本原理：利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测检测通量：13种高危HPV基因型,不能提示具体的基因型,计算机判读15min,杂交60min,抗体捕获60min,第二抗体结合，化学发光30min,DNA变性45min,HC2实验步骤图示,吸取变性剂于对照和样本管中,旋涡振荡10秒,65孵育45分钟，采用MicroplateheaterI,HC2操作步骤-DNA变性,将已变性的样本混匀，吸取75ul于“杂交微孔板”中,20-25孵育10分钟,加入25ul高危HPV探针于微孔板中,65孵育60分钟,置于RotaryShakerI中，1100rpm，32分钟,准备HPV探针混合物,HC2操作步骤-杂交,将杂交产物转移至“捕获微孔板”相应的小孔中,20-25孵育30-45分钟,20-25孵育60分钟，1100rpm,加入75ulDetectionReagent1（碱性磷酸酶偶联的抗体）于“捕获”微孔板相应的小孔中,HC2操作步骤-抗体捕获及酶标,洗涤微孔板：采用AutomatedPlateWasherI或进行手动洗板，重复洗6次,加入75ulDetectionReagent2（化学显色底物）于“捕获”微孔板相应的小孔中,20-25孵育15-30分钟,采用Digenemicroplateluminometer(DML2000)读数,HC2操作步骤-洗板及化学显色,HC2如何进行结果判读?,1、阴性对照每次实验必须同时做3份阴性对照。阴性对照的结果必须为10-250RLU（相对光单位）。变异系数（%CV）应该25%，如果25%，那么去掉偏离平均值最远的一个阴性对照，用剩下的两个阴性对照计算平均值以及变异系数。%CV必须25%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告,2.标准品每次实验必须同时做3份高危HPV标准品。%CV应该15%，如果15%，那么去掉偏离平均值最远的一个标准品，用剩下的两个标准品计算平均值以及变异系数。%CV必须15%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告3.用标准品平均值（MHRC）以及阴性对照平均值MNC计算MHRC/MNC比值.2.0MHRC/MNC15。如果2.0或15，本次实验结果无效，必须重做。4.如果符合以上的标准，检测结果是可靠的。此时的Cutoff值（阳性标本评判的标准）就是MHRC,Cutoff值=318，所有标本的相对光单位（RLU）应该转换为与Cutoff值的比值，比值大于1为阳性，比值小于1则为阴性,阳性结果的判定,质控,HC2技术总结,技术上，采用核酸分子杂交，抗体捕获（吸附杂交体），化学显色不分型不能检测HPV多重感染不定量有交叉杂交反应每次需要消耗8个参考品，试剂成本高手动操作很多，步骤繁琐需价格昂贵的基因杂交信号放大系统,(三)荧光定量PCR技术,原理：在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累,实时监控整个PCR过程,最后通过标准曲线对起始模板量进行定量分析.定量，不分型,荧光基团的分类,化学原理,荧光定量PCR-基于Taqman探针,化学原理,荧光定量PCR技术总结,能定量检测HPV拷贝数灵敏度高不分型不能检测HPV多重感染检测通量有限，目前最多检测13种高危型需价格昂贵的荧光定量PCR仪,（四）原位杂交,采用荧光、生物素、地高辛等标记的探针，依据碱基互补配对原理，与组织切片、细胞涂片等标本中的靶序列特异杂交，经信号放大及显色后，显微镜下观察结果,原位杂交试剂盒,代表厂家：北京中杉金桥生物技术有限公司,原位杂交实验步骤,以地高辛标记HPVDNA探针为例4-6mm切片，用处理过的玻片捞片。56-60烤片，2-16小时。新鲜二甲苯脱蜡，10分钟2次。100%乙醇5分钟2次，空气干燥。加入50ml胃酶工作液，37消化30分钟。弃去胃酶工作液，逐级酒精脱水1分钟3次，空气干燥。加10-20ml探针，加盖玻片。用橡胶水泥将盖片周围密封（目录编号ZLI-9601）。变性955-7分钟。杂交372-16小时。揭去橡胶水泥，将切片插入PBS/TBS缓冲液中以便去掉盖玻片，约5-10分钟。每张切片加入2-3滴杂交后洗液，37孵育15分钟。PBS/TBS缓冲液洗，1分钟3次。每张切片加入适量辣根酶标记抗地高辛抗体，37孵育30分钟。PBS/TBS缓冲液洗，1分钟3次。滴加适量DAB工作液，镜下观察显色结果，约3-10分钟。弃去显色液，蒸馏水或自来水冲洗。选择：每张切片加入1滴复染剂，5-10秒钟。蒸馏水或自来水冲洗。脱水、透明、封片。,原位杂交技术总结,灵敏度低（无PCR扩增）特异性高检测通量低不能分型不能定量操作步骤繁琐非常费时，需要两天HPV检测产品无注册证，仅仅用于科研,（五）表面等离子体谐振（SPR）技术,93,表面等离子谐振现象,SurfacePlasmonResonance，SPR入射光(单波长偏振光)在玻片-金膜界面全反射，激发金膜中的自由电子产生表面等离子体。当光波激发频率与表面等离子体的振动频率相等时，二者发生谐振，光能被吸收,反射光几乎完全消失,此时入射光的角度被称作SPR角（谐振角）。,SPR检测核酸原理示意图,反应曲线,Time(s),SPR角(m),1）核酸提取试剂2）PCR反应试剂3）SPR检测试剂和芯片,北京金菩嘉-HPV分型检测试剂盒组成,HPV基因检测芯片，共26个通道，一个阴性，一个IC，24个hpv探针,通道217：高危HPV;通道1825：低危HPV,SPR检测芯片探针点阵,SPRHPV检测芯片,SPR技术检测HPV流程图,样品制备,DNA,PCR,扩增产物,线上检测,输出报告,成品芯片,SPR设备简介,W2600型生物传感芯片阅读仪,W2600工作流程,开始检测后系统自动进行以下动作：,SPR技术检测HPV总结,同样需要DNA提取采用普通PCR扩增，核酸分子杂交采用SPR技术（物理手段）检测杂交信号无临床应用文献无注册证,（六）HPVDNA