（生态学专业论文）青岛文昌鱼antithrombin基因的克隆、表达和功能分析.pdf

中国海洋大学硕士学位论文 青岛文昌鱼a n t i t h r o m b i n 基因的克隆、表达和功能分析 摘要 凝血是一个由多种蛋白质因子参与的复杂的级联过程。在哺乳动物中，与凝 血相关的因子都是高度保守的。除此之外，在两栖类，爬行类，鱼类和鸟类中也 发现了类似功能的凝血系统的相关因子二最近研究表明无颌类七鳃鳗中含有类似 、脊椎动物的凝血因子，但是在尾索动物海鞘中并没有发现类似的凝血因子存在。 文昌鱼( a m p h i o x u s ) 是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型，是现存的与脊 椎动物祖先最接近的原索动物，是研究脊椎动物起源和进化的重要模式动物。研 究文昌鱼体内是否存在凝血系统的相关因子对于探索凝血系统的起源与进化有着 重要的意义。 抗凝血酶( a a t i t h r o m b i n ) 是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族( s e r p i n ) 的成员之一，是 凝血系统中的一个关键蛋白，作为凝血酶的主要抑制剂在血液凝集过程中维持着 凝血与抗凝的平衡。 本文克隆了青岛文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u n e s e ) 的抗凝血酶基因， 命名为b b a r ，并对它的结构、进化、表达和功能进行了研究。 首先，利用兼并引物p c r 和r a c e 技术克隆得到了具有完整编码框的文昌鱼 的抗凝血酶基因( 曰鲥r ) ，并利用生物信息学方法对其基因结构及系统进化地位进 行分析。该e d n a 的阅读框编码3 3 8 个氨基酸，在1 - 3 3 6 个氨基酸残基之间包含 一个完整的s e r p i n 结构域。系统进化分析表明它属于s e r p i n 超家族的c 分支 ( a n t i t h r o m b i n ) ，但是与b 分支( 较古老的一类s e r p i n ) 也有一定的同源性。进一 步将b b a t 和其他物种的a n t i t h r o m b i n 比较，发现此蛋白分别和爪蟾，鸵鸟，和人 的a n t i t h r o m b i n 同源性较高，大约有4 0 的同源性。对b b a t 的结构预测表明：其 3 个p 折叠和7 个0 【螺旋的结构与人的类似，尤其是它的反应中心环( r c l ) 在 氨基酸组成上与脊椎动物的具有高度的相似性，这表明b b a t 的功能很可能与脊椎 动物的类似。 哺乳动物的肝脏是a n t i t h r o m b i n 基因的主要合成器官，其他脏器如肺、脾、肾、 心、肠、脑等也有少量合成。长期以来，文昌鱼的肝盲囊一直被认为是脊椎动物 肝脏的前体。利用原位杂交技术检测b b a t 在m r n a 水平上在成体文昌鱼中的组 织表达模式，结果表明b b a t 基因在肝盲囊表达量较高，在卵巢、后肠、腮也有表 中国海洋大学硕士学位论文 达，而在精巢、肌肉、神经管和脊索没有杂交信号。可见，与哺乳动物类似，b b a t 基因在成体文昌鱼组织中呈组织特异性表达。 为了了解文昌鱼的b b a t 是否与脊椎动物的一样具有抑制凝血酶的功能。本文 利用毕赤酵母表达系统体外表达了b b a t 的重组蛋白，命名为r b b a t 。并用原核表 达的重组蛋白制备了多克隆抗体，分别用发色底物法和w e s t e r nb l o t 的方法验证了 r b b a t 的蛋白功。利用发色底物试剂盒，根据以人的标准血浆为标准品制得的标 准曲线，得出r b b a t 抑制凝血酶的活力呈浓度依赖性，且肝素对它的抑制活力有 一定的促进作用。另外r b b a t 可以与凝血酶形成一种稳定的复合物，且体内也存 在着的天然b b a t 也有类似功能。 综合以上结果，我们认为：文昌鱼体内存在着一类a n t i t h r o m b i n ，且其功能与 脊椎动物的a n t i t h r o m b i n 类似。 关键词：抗凝血酶；进化；文昌鱼 i l 中国海洋大学硕士学位论文 j 1 - i j l o n l n g ，e x d r e s s l o na n dl u n c t i o n a la n a l y s t so ia n t i t n r o mb l n g e n e sf r o ma m p h i o x u sb r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i a b s t r a c t c o a g u l a t i o ni sac o m p l e xp r o c e s s i nm a m m a l st h ec o a g u l a t i o nf a c t o r sa r eh i g h l y c o n s e r v e d ，a n ds i m i l a rf a c t o r sa l s oe x i s ti nf r o g , t u r t l e ，s a l m o na n do s t r i c h r e c e n t l y , t h e j a w l e s sf i s hl a m p r e y sh a v eb e e ns h o w n t op o s s e s sar e d u c e ds e to ft h em a n yc l o t t i n g f a c t o r so b s e r v e di i lh i g h e rv e r t e b r a t e s ，w h i l en o n eo ft h ep r i n c i p a lc l o t t i n gf a c t o r sa r e f o u n di bt h eu r o c h o r d a t ec i o n ai n t e s t i n a l i s a m p h i o x u so rl a n c e l e t ，ac e p h a l o c h o r d a t e ， h a sl o n gb e e nr e g a r d e da st h el i v i n gi n v e r t e b r a t em o s tc l o s e l yr e l a t e dt ot h ep r o x i m a t e i n v e r t e b r a t ea n c e s t o ro fv e r t e b r a t e s ，w h i c hi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta n i m a lm o d e lt o r e s e a r c ha b o u tt h eo r i g i na n de v o l u t i o na b o u tv e r t e b r a t e s s t u d yo nt h ep r o j e c tm a ti ft h e c o a g u l a t i o nf a c t o r se x i s tma m p h i o x u si sv e r yi m p o r t a n tt od e v e l o pt h eo r i g i na n d e v o l u t i o no ft h ec o a g u l a t i o ns y s t e m a n t i t h r o m b i ni sam e m b e ro fs e r p i ns u p e r f a m i l y a sak e yp r o t e i nw o r k i n gi i lt h e c o a g u l a t i o ns y s t e m ，i ti sr e s p o n s i b l ef o rm a i n t a i n i n gt h eb a l a n c eo fc o a g u l a t i o na n d a n t i c o a g u l a t i o n nv i v o i nt h i sp a p e r , w er e p o r tt h ec h a r a c t e r i z a t i o n , e x p r e s s i o n , a n df u n c t i o no f a n t i t h r o m b i nf r o ma m p h i o x u s ( b b a t ) f r i s t ，w ec l o n e dt h ea m p h i o x n sa n t i t h r o m b i ne d n aw i t h 趾o l 强c o d i n gf o ra p r o t e i no f3 3 8a m i n oa c i d s ，n l eo r fc o n t a i n sac o n s e r v e ds e r p i nd o m a i nb e t w e e n r e s i d u e s1t o3 3 6 ap h y l o g e n e t i ct r e ec o n s t r u c t e ds h o w st h a tt h eb b a tb e l o n g st ot h e e l a d ec ( a n t i t h r o m b i n ) o fs e r p i ns u p e r f a m i l y , t os o m ee x t e n ta l s os i m i l a rw i t ht h ec l a d e b ( a n c e s t o ro ft h e e x t r a c e l l u l a rm e m b e r s ) f u r t h e rc o m p a r i s o no fb b a tw i t h a n t i t h r o m b i n sf r o mt h eo t h e rv e r t e b r a t e s ，r e v e a l e dt h a tb b a ts h a r e sa b o u t4 0 i d e n t i t y 、) l ，i t l lf r o g ，o s t r i c ha n dh u m a na n t i t h r o m b i n s t h ep r o t e i ns t r u c t u r eo fb 酣汀p r e d i c a t e d b ys w i s s - m o d e l i n d i c a t e dt h ep r e s e n c eo f31 3 - s h e e t s ，7a - h e l i c e sa n dr c l ，w h i c h a r ea l ls i m i l a rt oh u m a na n t i t h r o m b i n ，a n ds u g g e s t i n gt h a tt h e ym a yp e r f o r mas i m i l a r r o l e a n t i t h r o m b i ni sm a i n l ye x p r e s s e di l ll i v e ro fv e r t e b r a t e ，a n da l s oa tal o wl e v e li n l u n g ，s p l e e n ，k i d n e y , h e a r te t c i ti st ob eb e l i e v e dt h a tt h eh e p a t i cc a e c u mi na m p h i o x u s i sh o m o l o g o u st ot h ev e r t e b r a t el i v e r ns i t uh y b r i d i z a t i o nh i s t o c h e m i s t r yd e m o n s t r a t e d i i i 中国海洋大学硕士学位论文 t h a tb b a t t r a n s c r i p tw a sm o s ta b u n d a n ti nt h eh e p a t i cc a e c u n l ，a n da l s op r e s e n t e di nt h e h i n d - g u t , g i l la n do v a r y , w h i l ei tw a sa b s e n ti nt h em u s c l e ，t e s t i s ，n e u r a lt u b ea n d n o t o c h o r d t h i sb a s i c a l l ya g r e e sw i t ht h en o t i o nt h a tt h e h e p a t i cc a e c u m i st h ep r e c u r s o r o fv e r t e b r a t el i v e r t h er e c o m b i n a n tp r o t e i no fb b a t ( r b b a t ) w e r ep u r i f i e df r o mp p a s t o r i sx 33 a f t e ri n d u c i n gf o rt h ef u n c t i o n a la s s a y ，b o t hc h r o m o g e n i ca s s a ya n dw e s t e r nb l o tw e r e u s e dt oe x a m i n et h ef u n c t i o no fr b b a t ，i tw a sf o u n dt h a tt h ea c t i v i t yo fr b b a tw a s h o m o l o g o u sw i t hh u m a na n t i t h r o m b i n i nc o n c l u s i o n ，b b a th a st h ef e a t u r eo fa l la n c e s t o ro fa n t i t h r o m b i ni nv e r t e b r a t e s ， a n dt 1 1 ef u n c t i o ni sa l s os i m i l a rt ot h a to fa n t i t h r o m b i ni nv e r t e b r a t e s k e yw o r d s ：a n t i t h r o m b i n ；e v o l u t i o n ；a m p h i o x u s i v 中国海洋大学硕士学位论文 缩略语 a m p ( a m p i c i l l i n ) a p ( a l a k a l i n ep h o s p h a t a s e ) b p ( b a s ep a i r ) b s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) c d n a ( c o m p l e m e n t a r yd n a ) d a ( d a l t o n ) d e p c ( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ) d i g ( d i g o x i g e n i n ) d m s o ( d i m e t h y ls u l f o x i d e ) d n t p ( d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ) f d t r ( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) e b ( e t h i d i u mb r o m i d e ) e d t a ( t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ) e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) h ( h o u r ) i p t g ( i s o p r o p y l t h i o n b - d g a l a c t o s i d e ) k b ( k i l o b a s e ) k d a ( k i l o d a l t o n ) m c s ( m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s ) 一 r a i n ( m i n u t e ) m o p s ( 3 一( n - m o r p h o l i n o ) m r n a ( m e s s e n g e rr n a ) n b t ( n i t r o b l u et e t r a z o l i u m ) o r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) p a g e ( p o l y a c r y l a m i d eg e l p b s ( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ) p c r ( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ) p g n ( p e p t i d o g l y c a n ) r n a s ea ( r n a e n z y m ea ) r p m ( r e v o l u t i o np e rm i n u t e ) s ( s e c o n d l s d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) v 氨卞青霉素 碱性磷酸酶 碱基对 牛血清白蛋白 互补d n a 道尔顿。 焦碳酸二乙酯 地高辛 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷三磷酸 二硫苏糖醇 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 表达序列标签 小时 异丙基硫代半乳糖苷 千碱基对 千道尔顿 多克隆位点 m i n 3 ( n 玛琳代) 丙黄酸 信使r n a 氯化硝基四氮唑蓝 开放阅读框 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 肽聚糖 核糖核酸酶a 每m i n 转数 秒钟 十二烷基硫酸钠 中国海洋大学硕士学位论文 t e m e d ( n ，n n n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n ) 强s u t r ( u n t r a n s l a t e dr e g i o n ) v ( v o l t a g e ) v i n ，n n n 四甲基乙二胺 三( 羟甲基) 氨基甲烷 非翻译区 电压 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注；翅遗直其他盂錾挂别虚疆丝：奎栏亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构( 如中国科学技术信息研究所等) 送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：耀叫茼导师签 签字日期：础年6 月p 日签字日期：瑚年6 月1 3 n 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编 文昌鱼a n t i t h r o m b i n 基因的克隆、表达和功能分析 第一章文献综述 1 文昌鱼 1 1 文昌鱼概述 文昌鱼属于脊索动物门头索类，状似小鱼，是一种不大引人注意的小型动物， 但长久以来，文昌鱼却一直在脊椎动物如何由无脊椎动物进化而来这一著名的生 物学难题中占据着重要的位置。脊椎动物起源的问题一直是生物学家感兴趣的问 题。不仅因为脊椎动物起源代表动物进化过程中一次质的飞跃一由无脊椎骨到 有脊椎骨和由无背神经索到有背神经索，而且因为有关脊椎动物起源涉及我们人 类自身起源的问题( 张士璀等，1 9 9 5 ) 。关于脊椎动物起源，目前为大多数学者接 受的观点是由g a r s t a n g ( 1 8 9 4 ) 提出的，头索动物文昌鱼和脊椎动物亲缘关系最近。 脊索动物系统进化树如图1 1 。因此，文昌鱼是研究脊椎动物发育机制、起源和 进化的宝贵材料，也是发育生物学的经典试验模型之一，具有极高的学术价值。 c h o r d a t e s o 口 f i g u r e1 1p h y l o g e n e t i ct r e eo fc h o r d a t e s 图1 1 脊索动物系统进化树。 文昌鱼的成体结构与脊椎动物有相似之处但又具有不同的特征( 图1 2 ) 。 ( 1 ) 文昌鱼的皮肤和肌肉。 皮肤由单层细胞的表皮和冻胶状的真皮构成，可以透见下方的肌肉。肌肉分 节现象明显，肌节( m y o m e r e ) 虽v 字形，尖端向前。肌节的数目是文昌鱼分类 上的重要特征之一，我国厦门所产的文昌鱼，其肌节数为6 3 6 6 个。 文昌鱼a n t i t h r o m b i n 基因的克隆、表达和功能分析 ( 2 ) 文昌鱼的消化系统。 文昌鱼的消化系统比较简单，有口、咽、肠、肛门等。咽部约占消化管全长 的二分之一。口位于身体前端的腹面，周围有触须环绕。触须的作用在于保护口 部并阻止粗物进入口中。咽的两侧有许多鳃裂，咽的内壁也和海鞘的一样，具有 纤毛、背板、内柱等构造，它们的作用也分别和海鞘的相同。水流入口，经鳃裂 进到围鳃腔，再从腹孔排出体外。在水流入的过程中，文昌鱼就可进行呼吸和摄 食。肛门位于尾鳍腹面的左侧，离身体末端不远。肠为一条直管，在其前段从腹 侧向前右方伸出一个盲囊，称为肝盲囊，从形态上相当于脊椎动物的肝脏。 ( 3 ) 文昌鱼的脊索和神经管 脊索纵贯全身，有脊索鞘包围，这是原始的中轴骨骼。脊索背方为稍短于脊 索的神经管，这是原始的中枢神经系统。神经管分化程度很低，仅前端略显膨大， 称为脑泡( c e r b r a lv e s i c l e ) 。神经管本身已有神经分开。 ( 4 ) 文昌鱼的排泄系统 排泄器官包含一组肾管( n e p h r i d i u m ) ，约有9 0 1 0 0 对，位于咽壁背方的两侧， 其结构与非脊索动物的原肾很近似。肾管收集废物，排入围鳃腔中。此外，在咽 部后端背方的左右，共有一对称为褐色漏斗( b r o w nf u n n e l ) 的构造，有人认为 也有排泄的功能。 ( 5 ) 文昌鱼的生殖腺 文昌鱼是雌雄异体的动物，沿体壁两侧排列2 6 对生殖腺，向围鳃腔内突入。 生殖细胞成熟后，随水流从腹孔排到体外，在水中受精发育。 ( 6 ) 文昌鱼的循环系统 循环系统属于闭管式，类似于脊椎动物，但比较原始，没有分化成形的心脏， 具有等搏动的腹大动脉，血液无色。 文昌鱼具有脊索、背神经管、鳃裂和分节的肌肉，具有和脊椎动物基本相同 的循环系统( 金德祥，1 9 5 3 ) 。但是，和脊椎动物相比，文昌鱼没有头部，身体不 对称，具有脊椎动物所没有的围鳃腔( a t r i u m ) ，分泌器官和环节动物相似，为原 肾。在胚胎发育发面，经过c o n k l i n 等人和童第周先生的研究之后，其发育过程 已经基本明确。文昌鱼如无脊椎动物中的棘皮类一样，胚胎有纤毛能游泳。但是， 在诸如生殖细胞起源和器官发生尤其是脊索形成等方面，文昌鱼又表现出与脊椎 动物相似的特征。在生物化学上，文昌鱼具有脊椎动物所具有的磷酸肌酸等物质， 2 文昌鱼a n t i t h r o m b i n 基因的克隆、表达和功能分析 但却不具备脊椎动物所有的血红蛋白。在生殖内分泌方面，国内外学者先后发现 文昌鱼哈氏窝能够合成脊椎动物促性腺激素样物质，体内存在促性腺激素释放激 素与性腺周期呈现正的相关性，而且其性腺中还存在着性类固醇激素。这就表明 文昌鱼存在原始的生殖内分泌调控轴，即脑泡一哈氏窝一性腺轴。所以从形态学、 胚胎学以及生理生化角度都说明文昌鱼是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类 型动物。 a f i g u r e1 - 2a t h es t r u c t u r a lp a t t e r no fa m p h i o x u s 图1 2 a 文昌鱼内部结构模式图 文昌鱼a n t i t h r o m b i n 基因的克隆、表达和功能分析 b f i g u r e1 - 2b t h es t r u c t u r a lp a ：t t e mo fa m p h i o x u ss e c t i o n e dc r o s sp h 龇y n x 图1 2b 文昌鱼经咽部横切组织切片模式图 古老脊椎动物化石的发现也支持了上述观点。尽管大约5 5 亿年前文昌鱼和 脊椎动物分开，现代文昌鱼的外型仍然类似于寒武纪时期( c a m b r i a n ) 脊椎动物化 石海口虫( h o l l a n de ta 1 ，2 0 0 1 ；e l s d a l ee ta 1 ，1 9 8 3 ) ，表明文昌鱼的形体结构并未从 它和脊椎动物的共同祖先进化得太远( 图1 3 ) 。 a 4 文昌鱼a n t i t h r o m b i n 基因的克隆、表达和功能分析 f i g u r e1 - 3d i a g r a mo ft h ec a m b r i a ne h o r d a t ef o s s i lh a i k o u e l l a ( a ) a n da m p h i o x u s ( b ) 图1 - 3 寒武纪时期的脊索动物化石( 舢和文昌鱼的示意图( b ) 1 2 文昌鱼是分子发育进化生物学模式动物 关于脊椎动物是如何起源于无脊椎动物的，仅靠形态学方面的证据还是不够 的，还必须了解形态学变化的遗传基础以及它们在发育中是如何引起这些变化 的。利用分子生物学手段，对脊椎动物和分类地位接近的一些无脊椎动物进行比 较基因组研究、发育调控基因系统发生的研究，并结合比较解剖学研究，可为这 一问题提供一些重要答案。近年来，随着分子生物学技术的发展，首先在果蝇的 发育调控基因和发育机制的研究上有了重大的突破和较深入的了解。随后，利用 发育调控基因的保守性，开展对脊椎动物发育机制的研究，也已经取得一系列重 要进展。斑马鱼作为一种脊椎动物的模式生物，对其发育调控基因也有了较多的 了解。在此基础上，作为介于脊椎动物和无脊椎动物之间的过渡类型，对文昌鱼 进行发育和进化的分子生物学研究，就显得尤为重要。 文昌鱼作为分子发育进化生物学研究的模式动物主要有以下优点： ( 1 ) 文昌鱼为小型的半底栖生物，雌雄异体，繁育能力强。一条成熟的雌鱼每 次可排1 0 0 0 - - 5 0 0 0 个卵，卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速 度快。 ( 2 ) 文昌鱼的胚胎和幼虫是完全透明的，使得研究者不仅能方便的观察其内部 形态结构，而且还可以跟踪观察每一个细胞的发育命运。 ( 3 ) 文昌鱼的胚胎发育具有典型性。文昌鱼的胚胎发育从受精卵开始，经历囊 胚、原肠胚、神经胚、幼虫等阶段。其囊胚期的发育类似棘皮动物，后面 的发育时期又与脊椎动物相似。 ( 4 ) 文昌鱼的发育事件及胚胎结构简单原始，与脊椎动物相比，研究文昌鱼的 基因表达图式更为容易。 ( 5 ) 发育周期短。文昌鱼1 天即可由受精卵发育成幼虫，发育快，便于观测其 发育周期及监测与之相关的生化生理指标。 ( 6 ) 文昌鱼的成体呈半透明，形体结构也很简单，文昌鱼没有脊椎动物复杂的 内脏器官，器官少，且多是脊椎动物同源器官的原型。 ( 7 ) 文昌鱼个体小，适于在实验室中培养，室内产卵技术的成熟为我们方便地 文昌鱼a n t i t h r o m b i n 基因的克隆、表达和功能分析 收集到大量胚胎进行观察研究提供了便利。 所以，文昌鱼很快成为进化发育生物学家开展科学研究的新宠。 近十几年来，由于文昌鱼基因组文库( c h a r te ta 1 ，1 9 9 0 ；h o l l a n de ta 1 ，1 9 9 2 ； g a r c i a f e r n a n d e za n dh o l l a n d ，19 9 4 ) 和成体及胚胎e d n a 文库的构建( c h a r te t a 1 ，1 9 9 0 ；r i e m e re ta 1 ，1 9 9 2 ；h o l l a n de ta 1 ，1 9 9 5 ) 以及p c r 等技术的应用，现 在大量的文昌鱼基因在世界各地的实验室被克隆。2 0 0 5 年，美国能源部基因组 研究所完成了佛罗里达文昌鱼( b r a n c h i o s t o m af l o r i d a e ) 基因组的测序。不断增多 的文昌鱼分子生物学方面的研究信息，为研究脊椎动物的起源和进化提供了越来 越多地证据。 1 3 文昌鱼的分子生物学研究 1 3 1 文昌鱼基因的克隆 1 9 9 2 年h o l l a n d 等克隆了佛罗里达文昌鱼( b r a n c h i o s t o m al l o r i d a e ) a m p h i h o x 3 基因，并研究了它在文昌鱼胚胎发育过程中的表达图式，这是文昌 鱼中克隆的第一个发育调控基因( h o l l a n d ，1 9 9 2 ) 。近十几年来，由于文昌鱼基因 组文库( c h a r te ta 1 ，1 9 9 0 ；h o l l a n de ta 1 ，1 9 9 2 ；g a r e i a - f e m a n e l e za n dh o l l a n d , 1 9 9 4 ) 和成体及胚胎e d n a 文库的构建( c h a r te ta 1 ，1 9 9 0 ；r i e m e re ta 1 ，1 9 9 2 ；h o l l a n de t a 1 ，1 9 9 5 ) 以及p c r 等技术的应用，现在大量的文昌鱼基因在世界各地的实验室 被克隆。佛罗里达文昌鱼基因组的测序完成，为利用分子生物学手段，研究文昌 鱼基因的结构、进化和表达，揭示文昌鱼发育的分子生物学机制提供了便利的条 件。目前，在g e n b a n k 中能搜索到的文昌鱼基因有1 6 0 0 0 多个( 包括许多e s t 片 段) ，其中有功能意义的文昌鱼基因有6 0 0 多个。这些基因可依据不同的基因家 族进行人为分组。“基因家族”这个词用来描叙具有相似d n a 序列的一系列基 因，它们起源于一个共同的祖先基因。d n a 序列的相似性，反应在其氨基酸序 列上也是相似的。既然蛋白质的功能依赖于其氨基酸序列，因此来自同一家族的 基因编码的蛋白质功能也是相似的，但也经常并不完全一致。文昌鱼基因组大小 是人类基因组的1 7 ，相对于人类基因组大小5 的尾索动物而言，其基因组异 化较少( h o l l a n de ta 1 ，2 0 0 3 ；d e h a le ta 1 ，2 0 0 2 ；c a s t r oe t 讲，2 0 0 4 ) 。如文昌鱼有一 个h o x 基因簇包含1 4 个h o x 基因，而尾索动物的一个基因簇丢失了4 个h o x 基因( h o x 7 9 ，h o x l l ) ，并且这个基因簇分裂成5 个不同的支架结构( s c a f f o l d s ) ( h o l l a n de ta 1 ，2 0 0 3 ；d e h a le ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 6 文昌鱼a n t i t h r o m b i n 基因的克隆、表达和功能分析 1 3 2 文昌鱼与比较基因组学和进化 通过不同基因组之间的比较可以获得大量的遗传进化信息，随着在该领域研 究的深入逐渐发展成为一门新学科一比较基因组学。比较基因组学是通过对系 统发育中代表性物种之间全方位基因和基因家族的比较分析，构建系统发育的遗 传图谱，揭示基因、基因家族的起源和功能及其在进化过程中复杂化和多样化的 机制。对脊椎动物和分类地位接近的一些无脊椎动物进行比较基因组研究和基因 家族系统发生( p h y l o g e n y ) 的研究，可以揭示基因组和基因在进化过程中的演变， 为探讨脊椎动物起源的问题提供一些重要的启示。 1 9 7 0 年，o h n o 开创性的工作使人们开始广泛接受如下的观点：脊椎动物之 所以比无脊椎动物拥有更多的基因是由于其在进化过程中经历了大规模基因复 制，基因的倍增会产生更复杂的发育机制，从而产生更为复杂的形体结构。o l m o 指出，早期脊椎动物的进化至少发生过两次基因组的倍增。h o l l a n d 等( 1 9 9 4 ) 在 o h n o 有关基因倍增假说的基础做了修改，提出脊椎动物在进化过程中经历了两 轮大规模的基因复制，第一轮复制发生在文昌鱼同脊椎动物分离之后，即脊椎动 物起源之时；第二轮复制发生在有颌类同无颌类分离之后，这就是所谓的“2 r 假 说”( t w or o u n d so f g e n o m ed u p l i c a t i o nh y p o t h e s i s ) ，该假说示意图如图1 - 4 所示。 但人们在揭示基因复制历史的过程中常要面对重重迷雾，因为有的复制基因会发 生丢失而另一些基因则独立自主复制，这就使基因复制的规律变得复杂化。因此 大规模基因复制是涉及到整个基因组还是只是基因组中的一部分的问题长期以 来一直悬而未决，这就需要通过不同物种的基因组之间的比较来解决( h u g h e s ， 1 9 9 9 ；m c - l y s a g h te ta 1 ，2 0 0 2 ；g ue ta 1 ，2 0 0 2 ) 。要研究脊椎动物的进化过程中的基 因复制，需要将脊椎动物的基因组同另一低等无脊椎动物的基因组进行比较。 因为原口动物很早就同后口动物分离了，作为无脊椎动物的模式动物的果蝇 和线虫在形体结构上与脊椎动物差别很大，并且它们的基因组中存在有大量的基 因丢失的现象，很难通过与脊椎动物基因组的比较了解基因的演化过程 ( k o r t s c h a ke ta 1 ，2 0 0 3 ) 。因此，我们需要寻找一个物种作为纽带将果蝇和脊椎动 物联系起来。文昌鱼正是我们所需要的理想的生物，文昌鱼是无脊椎动物到脊椎 动物之间的过渡类型，它的基因组结构简单，单倍体基因含量约为0 6p g ( 5 0 0 m b ) ，比哺乳动物的含量少得多，是人基因组的1 7 ( a t k i na n do h n o ，1 9 6 7 ；c a s t r o e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。而且文昌鱼具有许多脊椎动物的结构特征，系统进化分析表明文昌 7 文昌鱼a n t i t h r o m b i n 基因的克隆、表达和功能分析 鱼处于脊椎动物的基部，是脊椎动物的姊妹类群，是现存的与脊椎动物原始祖先 最为接近的物种，这对了解进化过程中基因复制是非常重要的。尽管尾索动物海 鞘也有类似的进化地位，但海鞘的基因组过于原始( 海鞘基因组仅为人的5 ) ， 而文昌鱼的基因组约为海鞘基因组的三倍，在基因组比较时能提供更多的信息 ( d e h a le ta 1 ，2 0 0 2 ) ，并且文昌鱼有原肾和肌节，在结构上更接近脊椎动物i 正是 文昌鱼独特的进化地位和它未经复制的基因组使文昌鱼在揭示脊椎动物基因组 的结构组成和进化历史方面有着无可比拟的优越性。 一- 芒 妻茎詈堂量董董萎妻重量耋 f i g u r e1 - 4p h y l o g e n yo f t h ee h o r d a t ep h y l u m ，s h o w i n gt h er e l a t i v et i m i n g so fl a r g e s c a l eg e n ed u p l i c a t i o n sp r o p o s e db y2 rh y p o t h e s i s 图1 - 42 r 理论预测的脊索动物大规模基因倍增的示意图。 文昌鱼是脊椎动物的姊妹类群。p i k a i a 是一种寒武纪化石，被认为是文昌鱼 和脊椎动物的原始祖先。虽然文昌鱼不是现代脊椎动物的直接祖先，但通过文昌 鱼和人类基因组的比较我们可以推测生活在5 亿年前的人类原始祖先的基因组 的结构，进而探索人类起源的奥秘。j a i l l o n 等( 2 0 0 4 ) 通过将每条河豚染色体上的 基因同人的相关基因进行比对、定位推断出早已灭绝的祖先有1 2 对染色体。此 外，对另外的一些基因组的分析研究也证实了这一观点( p o s t l e t h w a i te ta 1 ，2 0 0 0 ； n a r u s ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。文昌鱼基因组同人类基因组的比较将为刻画原始祖先的基因 组增加更多的细节，如有可能可以将每个基因定位在原始祖先的具体的染色体 e 。 8 一篙e藿董葛鼍墨案一番吒 文昌鱼a n 舶r o m b m 基因的克隆、表达和功能分析 2 抗凝血酶研究进展 哺乳动物的凝血系统参与止血反应，是机体一种独特的保护性机能。凝血与 溶血处于动态平衡状态，是一个精密控制的过程。血管破损时血液必须快速准确 地在破损处凝集，阻止血液外流。如果止血反应不够迅速，将血流不止，危及生 命。相反，如果止血反应一直进行下去，也会导致血栓，同样危及生命。血凝过 程是一个复杂的级联过程，参与反应的多种物质称凝血因子，主要是蛋白质。抗 凝血酶，也叫抗凝血酶m ( a n t i t h r o m b i n , a t ) ，就是这个过程中的一个关键蛋白酶。 当抗凝血酶在人体血液内以一个较高浓度( 2 3 心d 存在时它能够较好维持凝血平 衡，并防止血栓发生( j o h n s o ne la 1 ，2 0 0 6 ) 。目前已在哺乳动物、鸟类、两栖类、 硬骨鱼和软骨鱼类中鉴定了a t 的存在( b o c l q1 9 8 2 ；j o r d a n , 1 9 8 3 ；k o i d e ，1 9 7 9 ； k u m e h i ，1 9 7 6 ；m a k , 1 9 9 6 ；m e j d o u b ，1 9 9 1 ；n a k a y a m a , 2 0 0 0 ；n i e s s e n , 1 9 9 7 ； s h e f f i e l d ，19 9 2 ；t o k u n a g a , 19 9 4 ；w u ，19 9 2 ；d o o l i t t l e ，19 9 3 ；a n d e r s e n , 2 0 0 0 ；f r o s t ， 2 0 0 2 ；k o i d e ，1 9 8 2 ) 。然而，关于a t 的起源可以向前推进到哪一类动物，目前尚 不清楚。 2 1a t 的蛋白质结构 a t 是一类分子量约为5 8k d a 的糖蛋白，它是由肝细胞和血管内皮细胞分泌 的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族( s e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r , s e r p i n ) 重要成员之一，主 要通过抑制凝血酶和其他凝血因子的活性来维持体内凝血与抗凝血的平衡，从而 保持正常的生理平衡状态。在正常情况下，抗凝血酶直接的抗凝作用弱且慢， 但与肝素结合后，抗凝血酶的活性和抗凝作用显著增强。 a t 为单链糖蛋白，一般含有四个糖基化位点。a t 在体内以两种形式存在： 0 【型和p 型。其中p 型抗凝血酶a s n l 3 5 没有糖基化，只有三个位点糖基化，在 体内约占a t 总量的1 0 。 a t 与丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的其他成员有着极其相似的三维结构构象， 包括三个p 折叠( a 、b 和c ) 、九个a 螺旋( a i ) 和一个反应中心环( r c l ) ，还有3 个与其空间折叠密切相关的分子内二硫键。反应中心环( r c l ) 突出于整个分子的 顶部，插入ad 折叠中，其活性中心含有能够捕获目标酶的氨基酸序y u ( q u i n s e y e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。在抑制凝血酶的过程中，r c l 首先识别凝血酶的底物结合位点，其 自身a r g s e r 肽键被分解，促进a t 与凝血酶形成一种稳定的1 ：1 共价复合物， 9 文昌鱼a n t i t h r o m b i n 基因的克隆、表达和功能分析 使凝血酶失去活性，同时a t 也因r c l 的断裂而失去活性( 图1 - 7 ) ( c a r r e l l ，1 9 9 9 ) 。 f i g l - 7t h ep r o c e s so fi n h i b i tt h r o m b i nb ya n t i t h r o m b i n a c t i v es i t el o o p ( b l u e ) ； h e p a r i n ( g r e e n ) i ：i n i t i a l l yi n a c t i v ea n t i t h r o m b i n ；i i ：a f t e ri n t e r a c t 谢廿lh e p a r i n ， t h r o m b i nb