（食品科学专业论文）番茄果实乙烯信号转导组分EREBPs基因克隆和表达研究.pdf

摘要 乙烯对植物的生长发育起重要的调控作用，随着乙烯信号转导研究的不断深入，许多乙烯信 号转导组分已被分离和鉴定，并在模式植物拟南芥中已建立乙烯信号传递过程中的核内级联反 应：e 1 n 3 手e r f i ( e r e b p s ) 病原相关蛋白，但在番茄中还没有建立e i n 3 e r e b p s 果实成熟相关基因的相似路径。e r e b p s ( 乙烯反应元件结合蛋白) 是一个转录因 子家族，通过与乙烯调节的目标基因的启动子区结合而调节目标基因的表达。番茄是研究果实成 熟的模式植物对番茄e r e b p s 基因的研究，将使我们对乙烯调控果实成熟相关基因表达的机制 更加明确，进一步丰富和完善乙烯信号转导理论。 本课题根据g e n b a n k 中的拟南芥、烟草、番茄e r e b p s 家族成员的序列比较，在保守区( e r f 结构域) 设计简并引物( d e g e n e r a t ep r i m e r ) ，以破色期普通番茄果实r n a 为模板，进行r t - p c r 扩增，获得1 1 4b p 的同源片段，以此片段为探针筛选破色期普通番茄果实e d n a 噬菌体文库， 获得两个包含全长编码区的阳性克隆。序列分析表明这两个基因都属于e r e b p s 家族，依次命名 为l e e r f l 、l e e r f 2 。l e e r f le d n a 为1 0 4 1b p ，开放阅读框编码2 0 4 个氨基酸；l e e r f 2e d n a 为2 8 9 8b p ，开放阅读框编码2 1 0 个氨基酸。l e e r f l 与e r e b p 4 、d d t f r i o a 在氨基酸水平上的 序列相似性为3 3 ，l e e r f 2 与e r e b p 3 、p t i 5 在氨基酸水平上的序列相似性为4 6 ，是新的基 因。l e e r f l 、l e e r f 2 的核酸序列已在g e n b a n k 登录，登录号分别为a y 0 7 7 6 2 6 、a y 2 7 5 5 5 4 。 n o r t h e r n 杂交分析表明：l e e r f l 、l e e r f 2 ；p a 4 ( 已发表的番茄e r e b p s 成员) 基因在普通 番茄果实的成熟过程及果实的不同部位都有差异表达，表现出与成熟进程的相关性。在转反义 a c s 和n r 番茄果实中，l e e r f l 、l e e r f 2 、p t i 4 基因表达总体水平上比普通番茄中的低，但仍然 表现出与成熟进程的相关性。 乙烯处理( 1 0 0p 1 l ) 绿熟期普通番茄果实0 5h 后，l e e r f l 、l e e r f 2 基因表达明显增强， p t i 4 基因在乙烯处理后1 2h 表达增强；而用乙烯受体抑制剂1 - m c p ( 1g l e ) 处理普通番茄破色 期果实1 0h 后，l e e r f l 、l e e r f 2 、p t i 4 基因表达都受到了抑制，表明l e e r f l 、l e e r f 2 、p t i 4 基因表达受到乙烯的正调控。 激素和化学试剂处理结果表明：0 1m ma b a 处理绿熟期普通番茄果实8h 后，乙烯生成增 加，l e e r f l 、l e e r f 2 基因表达增强；im ms a 处理绿熟期普通番茄果实8h 后，乙烯的生成稍 有抑制，l e e r f l 基因表达受到抑制，l e e r f 2 基因表达与对照基本相近；而a b a 和s a 处理对 删4 基因的表达没有影响，表明果实中p t i 4 基因表达不受a b a 和s a 的诱导。o 1m m a b a 处理 番茄幼苗，随着处理时间的延长，l e e r f l 、l e e r f 2 、p t i 4 基因表达都逐渐增强；1m m s a 处理 番茄幼苗0 5h 屙，l e e r f l 、l e e r f 2 、p t i 4 基因表达明显增强，然后随着处理时间的延长逐渐下 降，表明a b a 和s a 对l e e r f l 、l e e r f 2 、p t i 4 基因表达的诱导具有组织特异性。c a c l 2 渗透处 理绿熟期番茄整果，随着c a c l 2 处理浓度的增加，l e e r f l 、l e e r f 2 、p t i 4 基因表达逐渐减弱，表 明钙可调控乙烯信号转导组分。 构建了正义植物表达载体p g a 6 4 3 l e e r f l 、p g a 6 4 3 一l e e r f 2 和反义植物表达载体 p b l l 2 1 l e e r f l 、p b l l 2 1 - l e e r f 2 ，并转入农杆菌菌株e h a l 0 5 。 关键词：乙烯，番茄，e r e b p s ，基因克隆，基因表达 a b s t r a c t t h e p l a n th o r m o n ee t h y l e n eh a sap r o f o u n dr o l ei np l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t an u m b e ro f e t h y l a n es i g n a l i n ge l e m e n t sh a v eb e e ni s o l a t e da n di d e n t i f i e d a l t h o u 【g hn u c l e a rc a s c a d e si ne t h y l e n e s i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a yf r o me i n 3t oe r f lt op rp r o t e i n sh a sb e e ne s t a b l i s h e di na r a b i d o p s i s t h a l i a n a ，as i m i l a rr o u t ef r o me i n 3t oe r e b p s t of r u i tr i p e n i n ga n ds e n e s c e n c eh a sn o tb e e ne l u c i d a t e d i nl y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ( t o m a t o ) e r e b p s ( e t h y l e n e r e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n s ) b e l o n g t oa f a m i l yo ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，w h i c hr e g u l a t ee t h y l e n er e s p o n s e st h r o u g hb i n d i n gt ot h ep r o m o t e r r e g i o no fe t h y l e n e r e g u l a t e dt a r g e tg e n e s s t u d i e so ne r e b p s i nt o m a t o ，w h i c hi sam o d e lp l a n ti nf r u i t a n dv e g e t a b l er i p e n i n ga n ds e n e s c e n c er e s e a r c h e s ，w i l lm a k eu sb e r e ru n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mo f r i p e n i n g - r e l a t e dg e n e se x p r e s s i o nr e g u l a t e db ye t h y l e n ea n df u r t h e re l u c i d a t ee t h y l e n e t r a n s d u c t i o n p a t h w a y a p a i ro fd e g e n e r a l ep r i m e r sw e r ed e s i g n e di nt h ec o n s e r v e dd o m a i n ( e r fd o m a i n ) w h i c hb a s e d o nt h ea l i g n m e n to fe r e b p sg e a ef a m i l yi nt o m a t oa n do t h e rp l a n ts p e c i e s a114b pf r a g m e n tw a s a m p l i f i e db yr t p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) ，w h i c hw a su s e d a sap r o b e f o rs c r e e n i n gt o m a t of r u i t ( p i n ks t a g e ) c d n al i b r a r y t w op o s i t i v ec l o n e sc o n t a i n i n ge n t i r ec o d i n g r e g i o nw e r ei s o l a t e d ，w h i c hw e r ei d e n t i f i e da sn e w m e m b e r so fe r e b p s f a m i l yb yb i a s ts e r v e r , a n d n a m e da sl e e r f la n dl e e r f 2 t h el e e r f lc d n ai s1 0 4 1b pa n dt h ep r e d i c t e dt r a n s l a t i o np r o d u c ti s 2 0 4a m i n oa c i d st h el e e r f 2c d n ai s2 8 9 8b pa n dt h ep r e d i c t e dt r a n s l a t i o np r o d u c ti s2 1 0a m i n o a c i d sl e e r f lw a sh o m o l o g o n sw i t he r e b p 4a n dd d t f r l 0 a ，w i t h3 3 s i m i l a r i t ya tt h ea m i n oa c i d l e v e l l e e r f 2w a sh o m o l o g o u sw i t he r e b p 3a n dp t i 5 ，w i t h4 6 s i m i l a r i t ya tt h ea m i n oa c i dl e v e l t h ec d n as e q u e n c e so fl e e r f la n dl e e r f 2w e r ed e p o s i t e di ng e n b a n k ( g e n b a n ka c c e s s i o n n u m b e r a y 0 7 7 6 2 6 ，a y 2 7 5 5 5 4r e s p e c t i v e l y ) n o r t h e mb l o th y b r i d i z a t i o ns h o w e dt h a tl e e r f l ，l e e r f 2a n dp t i 4 ( am e m b e ro fe r e b p si n t o m a t o ) e x p r e s s e dd i f f e r e n t i a l l y i nd i f l e r e n t p a r t so fw i l dt o m a t of r u i td u r i n gr i p e n i n g ，w h i c h w a s r e l a t e dw i t hf r u i tr i p e n i n g i nb o t hn rf r u i ta n da n t i s e n s ea c s t r a n s g e n i ct o m a t of r u i t ，e x p r e s s i o nl e v e l s o fl e e r f i ，l e e r f 2a n d p t i 4w e r eg e n e r a l l yl o w e rt h a nt h o s ei nw i l df r u i tb u ts t i l l r e l a t e dw i t hf r u i t r i p e n i n g t h ee x p r e s s i o n l e v e l so f o f l e e r f l ，l e e r f 2 i n c r e a s e d i n t h e w i l d m a t u r eg r e e n t o m a t o f r u i t sa f t e r 0 5ho ft r e a t m e n tw i t he t h y l e n e ( 1 0 0 i 几) ，a n dp t i 4m r n aa b u n d a n c ei n c r e a s e d a f t e r1 2ho f e x p o s u r e t oe t h y l e n e f l 0 0u i l ) a f t e r l 0ho f t r e a t m e n to f b r e a k e r t o m a t o f r u i t s w i t h1 m c p ( 1g v l ) ，a p o t e n ti n h i b i t o ro fe t h y l e n ea c t i o n ，d e c r e a s e dt h em r n a a b u n d a n c eo fl e e r f l ，l e e r f 2a n dp t i 4 t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tg e n ee x p r e s s i o no fl e e r f l ，l e e r f 2a n dp t i 4w e r ep o s i t i v e l yr e g u l a t e db y e t h y l e n e t r e a t m e n to fm a t u r eg r e e nf r u i t sw i t h0 1m ma b ae n h a n c e dt h ee t h y l e n ep r o d u c t i o na n dg e n e e x p r e s s i o n so fl e e r f i ，l e e r f 2t r e a t m e n to f m a t u r eg r e e nf r u i t sw i t h1m ms ah a ds l i g h ti n h i b i t i o n o ne t h y l e n ep r o d u c t i o n s at r e a t m e n ti n h i b i t e dt h ee x p r e s s i o no fl e e r f la n dh a dn oe f f e c to nt h e e x p r e s s i o no f l e e r f 2 h o w e v e r , t r e a t m e n t sw i t ha b a a n ds ah a dn oe f f e c t so nt h e e x p r e s s i o no f p t i 4 t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta c c u m u l a t i o n o f p t i 4m r n a w a sn o ti n d u c e db ya b aa n ds a t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o t l e e r f l l e e r f 2 a n d p t i 4 i ns e e d l i n g s g r a d u a l l y i n c r e a s e da f t e r t r e a t m e n t w i t h0 1m ma b a n em r n a so f l e e r f l l e e r f 2a n d p t i 4a c c u m u l a t e di nr e s p o n s et olm ms a w i t h i n3 0m i ni ns e e d l i n g s t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e r ee x i s t e dt i s s u es p e c i f i c i t yw i t hr e g a r dt o a c c u m u l a t i o no f l e e r f i l e e r f 2 a n d p t i 4m r n a i n d u c e db ya b aa n ds a t h em r n aa b u n d a n c eo f l e e r f l l e e r f 2a n dp t i 4d e c r e a s e dg r a d u a l l yi nt h em a t u r eg r e e nt o m a t of r u i t s t h et r e a t m e n t c o n c e n t r a t i o no f c a c l 2 i n c r e a s e d w h i c h i n d i c a t e d t h a t c 一+ i n v o l v e d i n t h e e t h y l e n es i g n a l t r a n s d u c t i o n s e n s ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r so fp g a 6 4 3 - l e e r f ia n d p g a 6 4 3 - l e e r f 2a n da n t i s e n s ep l a n t e x p r e s s i o nv e c t o r so fp b l l 2 1 - l e e r f la n dp b i l 2 1 - l e e r f 2w e r ec o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t o a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r a i ne h a l 0 5 k e yw o r d s ：e t h y l e n e ，l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ( t o m a t o ) ，e r e b p s ，g e n ec l o n i n g ，g e n ee x p r e s s i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名 赫 时间：z 前j 年月k 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名 觚弓 嘤三犯 l 时间：2 如2 年月切日 时间： 刎弓1 年f 月- b 日 缩略词 a b b r e v i a t i o n a b aa b s c i s i ca c i d 脱落酸 a c c l - a m i n 。c y c i o p r 叩a n e 1 c a r b o x y i i ca c i d 1 一氨基_ 1 羧基环丙烷 a c oa c co x i d a s e a c c 氧化酶 a c sa c cs t h a s e a c c 合酶 c b f c r e p e a t - h i n c l i n gf a c 协r c 重复结合因子 c t rc o n s t i m “v et r i p l er e s p o n s e 组成型三重反应 d e p c d i e t h y l p y r o c a r b o n a t c 焦碳酸二乙酯 d p a d a y sp o s ta r 曲e s i s 花后天数 d r e d m u g h t - r e s p o n s i v ee l e m e n t 干旱反应元件 e d t a e f h v l e n ed i a m i n et e t r a c e t i ca c i d 乙二氨四乙酸 e i n e t h y l e n ei n s e n s i t i v e 乙烯不敏感型 e r fe t h y l e n er e s p o n s ef a c t o r 乙烯反应调节因子 e t re t h v i e n er e c e p t o r 乙烯受体 e r e b p s e t h y l e n e r e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp m t e i n s 乙烯反应元件结合蛋白 m a c cm a l o n y l a c c 丙二酰基- a c c 1 m c p | - m e t h y l c y c l 叩r o p e n e 1 一甲基环丙烯 m e tm e t h i o n i n e 蛋氨酸 m o p s 3 一 n m o r p h o l i n o l 】p r o p a n e s u l 丘m i ca c i d 吗啉代丙烷磺酸 m t a 5 - m e t h y l t h i o a d e n o s i n e 5 - 甲硫腺苷 n rn e v e r r i n e 永不成熟 o r f o p e n i n gr e a d i n g f r a m e 开放阅读框 p g p o l y g a l a c t u r o n a s e 多聚半乳糖醛酸酶 r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p 0 1 y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 反转录_ 聚台酶链反应 s a s a l i c y l i ca c i d 水杨酸 v 第一章 引言 乙烯，作为五大植物激素之一，化学结构最简单，但在植物的正常发育和胁迫反应中起着很 重要的作用。植物组织的乙烯生成速率可达5 0 0 n l g h ，并且在低浓度( 1 0 1 0 0 n l l ) 时就可引起生 理反应。在正常发育过程中，乙烯可以调节种子发芽、花的衰老、果实成熟衰老、叶片脱落等过 程( a b e l e se t a l ，1 9 9 2 ) 。在植物受到外界刺激包括伤害、病原侵入、干旱等时，乙烯的生物合成 增加，增加的乙烯会促进防卫化合物的生成。启动这些过程，包括对乙烯生物台成和细胞感受激 素以及作出合适反应的能力的复杂调控( c h a oe t a l ，1 9 9 7 ) 。 自2 0 世纪7 0 年代末杨祥发等人提出乙烯生物合成的杨循环以来，对乙烯的生物合成途径以 及合成过程中的a c c 合酶和a c c 氧化酶己研究得比较清楚( k e n d e n ，h ，1 9 9 3 ：o l s o ne t a l ，1 9 9 1 ； o e t i k e re l a l ，1 9 9 7 ) 。近来的研究主要集中在乙烯信号传递途径中基因的分离以及受体如何与乙烯 结合，结合后又如何把信号传递给下游组分。 1 1乙烯的生理作用及生物合成 1 1 1乙烯的生理作用 乙烯调控植物的许多生理生化过程，可影响植物的生长发育，启动植物器官的衰老，在植物 受到生物或非生物胁迫时作为胁迫激素，呈现出各种形态效应( b l e e c k e r a ba n dk e n d eh ，2 0 0 0 ) 。 乙烯调控植物的许多营养生长过程并显著诱导了茎和叶柄的不对称生长。这种反应的一种表 现是在三重反应中提到的抑制下胚轴和根细胞的延伸，不对称生长的另一种表现是顶钩弯曲的生 成，可以保护双子叶植物的顶端组织和幼叶在穿透土壤时不受伤害。 几乎所有的生物和非生物胁追条件都可刺激植物中的乙烯生成。胁迫乙烯通常在受到刺激 1 0 3 0 分钟后产生，随后几个小时内达到高峰。机械伤害( h o f f m a na n dy a n g ，1 9 8 2 ；h y o d oa n d n i s h i n o ，1 9 8 1 ；o d o n n e l le ta l ，1 9 9 6 ) 、病毒侵染、臭氧、冷害、水淹及干旱都可刺激乙烯的生成 ( b o i l e r , 1 9 9 1 ；e e k e ra n dd a v i s ，1 9 8 7 ) 。反过来，乙烯使植物的生长变慢直至胁迫条件消失( k l e e ， 2 0 0 2 ) 。在某些情况下，乙烯参与了调节胁迫反应，但有些时候胁迫乙烯的生理功能还不清楚。 乙烯在跃变型果实的成熟过程中起着很重要的作用( y a n ga n dh o f f m a n ，1 9 8 4 ) 。跃变型果实 在成熟过程有明显的呼吸高峰出现，研究表明呼吸高峰是由乙烯引起的。在果实的呼吸高峰出现 之前，伴有一个乙烯的合成高峰，去除环境中的乙烯可抑制果实成熟而使用外源乙烯可加速成 熟过群。同时乙烯可促进未熟果实中的新的r n a 和蛋白质合成( g r i e r s o ne t a l ，1 9 9 2 ；m a u n d e r se t a l ，1 9 8 7 ) 。大量结果显示乙烯是通过调节果实中的基因表达而影响成熟过程( 李正国，2 0 0 0 ) 。 1 1 2 乙烯的生物合成及其调控 早在1 9 6 4 年l i e b e r m a n 等提出了乙烯来源于蛋氨酸，但直到1 9 7 9 年a d a m s 和y a n g 发现了 1 一氨基环丙烷基羧酸( a c c ) 是乙烯生成的直接前体，才确定了植物体内乙烯生物合成的途径一 杨循环。至今分析的所有植物的乙烯合成都是通过杨循环，在此过程中首先蛋氨酸在蛋氨酸腺苷 转移酶的作用下转变成s 一腺苷蛋氨酸，s 一腺苷蛋氨酸是许多细胞分子的甲基供体，包括核酸、 蛋白质和脂类。s 一腺苷蛋氨酸可转变成乙烯前体a c c ( y a n ga n dh o f f m a n ，1 9 8 4 ) 。催化这个反应 的a c c 合酶( a c s ) 的表达被促进乙烯生成的刺激所诱导，表明a c c 合酶的活性是乙烯合成的 限速因素。除a c c 外，这个反应过程中还生成5 - 甲硫腺苷( m t a ) ，m t a 可通过蛋氨酸循环转 变成蛋氨酸，成为下一轮乙烯生成的甲基供体，因此即使游离蛋氨酸库很小，乙烯也可连续生成。 a c c 可通过a c o ( a c c 氧化酶) 转变成乙烯( 见图1 - 1 ) 。已经从许多植物物种中克隆了a c s 和 a c o 基因，都是由多基因家族所编码( t a n ge ta 1 ，1 9 9 3 ；f l u h ra n dm a o o 1 9 9 6 ) 。实验表明许多 外部和内部刺激都可诱导乙烯生物合成基因的表达( f l u h ra n d m a t t o o ，1 9 9 6 ；k e n d e 1 9 9 3 ) 。 1 1 ，2 ，1a c c 合酶( a c s ) a c c 合酶( s - a d e n o s y l - l m e t h i o n i n em e t h y l t h i o a d e n o s i n el y s a s e ，e c 444 1 4 ) 是一种以磷酸吡哆 醛( p l p ) 为辅基的酶，对s 一腺苷甲硫氨酸具有立体专一性，是乙烯合成途径中的限速酶( k e n d e , 1 9 9 3 ) 。a c s 最初是由a d a m s 和y a n g 于1 9 7 9 年从番茄果皮中分离出来，同年b o i l e r 等人在对番 茄组织的研究中，首先证实了a c c 合酶的活性。a v g ( m i n o e t h o x y v i n y l g l y c i n e ，氨基羟乙基甘 氨酸) 和a o a ( a m i n p o x y a c e t i ca c i d ，氨基氧乙酸) 能强烈地抑制该酶的活性( n a k a j i m a , e la 1 ， 1 9 9 0 ) 。 编码a c c 合酶的基因最早是从西葫芦中分离出来，随后很快从其它物种如番茄( o l s o ne t a l 1 9 9 1 ) 、拟南芥( l i a n ge t a l ，1 9 9 2 ) 、水稻( z a r e m b i n s k ia n d t h e o l o g i s ，1 9 9 4 ) 、兰花、康乃馨( p a r k e ta 1 ，1 9 9 2 ) 、烟草( b a i l e ye ta l ，1 9 9 2 ) 中克隆了同源物，迄今研究的所有植物中的a c s 都是由 一个以上的基因所编码，在反番茄中已克隆了9 个a c s 基因，在拟南芥中也克隆了7 个( v o g e le t a 1 ，t 9 9 8 ；s a m a c he t a t ，2 0 0 0 ) ，每个a c s 基因的表达具有器官和刺激的特异性，每个基因都随发 育、环境和激素信号差异表达( k e n d e1 9 9 3 ；z a r e m b i n s k ia n dt h e o l o g i s ，1 9 9 4 ) 。有趣的是a c s 的 基因表达可被蛋白合成抑制剂放线( 菌) 酮所诱导，受放线( 菌) 酮诱导是初级反应基因的特点 ( t h e o l o g i se ta 1 ，1 9 8 5 ) 。这些研究结果表明a c s 基因的表达受到不稳定的抑制因子的调控或者 它们的转录本是不稳定的，放线( 菌) 酮只是通过去除不稳定的核酶来使转录本稳定。 近来的药理学证据表明a c s 的活性可能在翻译后水平上受到调控( c h a p p e l le t a l ，1 9 8 4 ；f e l i x e t a l ，1 9 9 1 ；s p a n ue l a l ，1 9 9 4 ) 。番茄悬浮细胞中加入真菌激发子可使a c s 的活性快速增加，加入 蛋白激酶抑制剂k - 2 5 2 a 或星形孢菌素后，a c s 很快失活( s p a n ue ta l ，1 9 9 4 ) 。用蛋白磷酸酶抑 制剂花萼海绵诱癌素a 处理番茄悬浮细胞，不仅可在没有真菌激发子的情况下刺激a c s 的活性， 而且可大大提高真菌激发子处理的效果。这两种抑制剂对a c s 产生效应都需从新合成蛋白质， 因为放线( 菌) 酮阻断这种效应( w a n ge t 口f ，2 0 0 2 ) 。这些研究结果表明在激发子诱导条件下，增 2 图1 - l 乙烯的生物台成及其调控 f i g 1 - 1 b i o s y n t h e s i s p a i h w a ya n dr e g u l a t i o no f e 曲叮l e n e ( w a n ge t a l ，2 0 0 2 ) 加的a c s 活性需要由从新蛋白质合成来维持或稳定，并且磷酸化可能参与了此过程。 1 1 2 1 a c c 氧化酶( a c o ) 乙烯生物合成途径中最后一个步骤是a c o 将a c c 氧化成乙烯，把外源a c c 供给植物组织 就能使乙烯产生量增加，表明这个酶是固有的，一般不成为乙烯生成的限速酶( 李振国，1 9 9 8 ) 。 可能a c c 氧化酶的活性依赖于细胞结构的完整性，用传统的生化方法不能分离到a c o ，但通过 在酵母中表达一个成熟相关c d n ap t o m l 3 鉴定了a c o ( h a m i l t o ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 。由于该c d n a 推导出的氨基酸序列与烷酮一3 一羟化酶的序列同源，用提取该酶的方法首次从甜瓜中分离到有活性 的a c c 氧化酶( v e r v e r i d i sa n dj o h n ，1 9 9 1 ) 。发现完整的a c c 氧化酶活性可被f e ”和抗坏向酸所 恢复。以后又相继从苹果( d o n ge t a l ，1 9 9 2 a ) 、鳄梨和香蕉中纯化出了a c c 氧化酶a 植物组织中a c o 催化a c c 生成乙烯完全依赖于0 2 ，而且f e ”和抗坏血酸对其活性是必需 的。a c o 的活性需要组织和细胞膜的完整性，可能是一种膜结合酶。c o “、氧化磷酸化解偶联剂 ( 2 , 4 d n p 和c c c p ) 、自由基清除剂( 没食子酸丙酯等) 、多胺、一些能改变膜性质的物理和化 中国农业太学搏士学位论文第一章概述 学处理( 如去垢剂等) 都能抑制植物组织中乙烯产生( 李振国，1 9 9 8 ) 。h o f f m a n 等( 1 9 8 2 ) 研究 发现a c o 对底物具有高度的专一性，这是它区别于其它能使a c c 转化为乙烯的非生理性氧化反 应的重要特征。 a c c 氧化酶不象a c c 合酶受到严格的调控，在大多数的植物组织中a c c 氧化酶是组成型 表达的( y a n ga n dh o f f m a ne ta l ，1 9 8 4 ) 。但在果实成熟( m c g a r v e ye ta l ，1 9 9 0 ) 、衰老( w a n ga n d w o o d s o n ，1 9 9 2 ) 的过程中可被诱导，同时伤害( c a l l a h a ne la l ，1 9 9 2 ) 、真菌激发子( s p a n ue ta 1 ，1 9 9 1 ) 也能诱导a c c 氧化酶的表达。象a c s 一样，a c o 也是由多基因家族所编码( j u r g e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 从番茄中分离到了4 个不同的a c o 基因，用基因特异的探针研究表明，这些基因在成熟果实和 伤害叶片里差异表达。不同种植物的a c o 基因及同一植物的a c o 基因家族不同成员在蛋白质水 平上的同源性在8 0 以上( b a r r ye t a l ，1 9 9 6 ) 。 1 2 乙烯信号转导 黑暗中生长的双子叶植物幼苗在乙烯存在的条件下，会发生巨大的表型变化，称作“三重 反应”。在模式植物拟南芥中，这些变化包括f 胚轴的辐射膨胀，增加顶钩弯曲，抑制下胚轴和 根细胞的延伸( b l e e k e r e l a l ，。1 9 9 8 ；g a 力a n d e c k e r , 1 9 9 0 ) 。拟南芥幼苗三重反应的表型使得从 人量幼苗中筛选失去三重反应的突变体( e i n 突变体) 或甚至在缺乏乙烯的条件下也组成型地表 现三重反应的突变体成为可能。因此乙烯三重反应突变体为我们打开了研究乙烯信号传递机制的 一扇大门( c h a n ge t a l ，1 9 9 3 ；l e h a ne l a l ，1 9 9 6 ；c h a oe t a l ，1 9 9 7 ) 。 1 2 1 拟南芥乙烯反应突变体 已鉴定的拟南芥三重反应突变体( e c k e rj r , 1 9 9 5 ；r o m a na n dl u b a r s k y ，1 9 9 5 ) 主要分为两类。 一类突变体是乙烯不敏感型或乙烯耐受型，包括e t r l ( b l e e k e re ta 1 ，1 9 8 8 ) 、e i n 2 ( g u z m a na n d e c k e r , 1 9 9 0 ) 、e i n 3 ( r o t h a n b e r g a n d e c k e r , 1 9 9 3 ) 、a i n l ( s t r a e t e n a n dd i u d z m a n ，1 9 9 3 ) 、e t i 突变体 和e i n 4 ，e i n 5 ，e i n 6 ，e i n 7 ( r o m a na n dl u b a r s k y , 1 9 9 5 ) 。另一类是组成型乙烯反应突变体，即在 缺乏外源乙烯的条件一1 - 也表现乙烯反应。组成型表型可能是由丁乙烯过量产生，如e t 0 1 、e t 0 2 和 e t 0 3 突变体( g a z m a na n de c k e r ，1 9 9 0 ) ，乙烯生物台成抑制剂或乙烯作用拮抗剂可消除这类突变 体的组成型三重反应，说明e t o 突变体是乙烯生物合成缺陷型的。另种组成型乙烯反应突变 体是由于乙烯信号传递途径的组成型激活的结果，如c t r l 突变体。这些基因在乙烯反应途径中作 j 刳的遗传学模式： c z 地 一e r s 1 一c t r l 一e i n 2 眦e i l ：1 一e r f l 一? 一r e 唧n s e s e r s 2 “ 最近又鉴定出了几个乙烯反应突变体。l a r s e n 和c h a n g 分离出r 拟南芥促进乙烯反应突变体e e r 4 中国农业大学博士学位论文 第一章概述 ( e n h c m c e de t h y l e n er e s p o n s e ) 。e e r l 突变体的下胚轴和茎表现出乙烯敏感性增加，而根乙烯敏感 性降低。与乙烯过量生成突变体e t o 相似，品r l 突变体的表型可被乙烯生物台成抑制剂a v g 抑制。 关于番茄乙烯反应突变体印，有一些新的研究进展，黑暗中生长的印f 幼苗的表型与乙烯不存在 条件下的三重反应类似( b a r r ye ta 1 ，2 0 0 1 ) 。印f 和r 双突变分析表明倒可能作用于乙烯受体 n r 的上游。 图l - 2 乙烯信号转导途径( 拟南芥) f i g1 - 2 e t h y l e n es i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a yi na m b i d o p s i s ( w a n g ，e ta l ，2 0 0 2 ) 1 2 2 乙烯受体家族 拟南芥e t r l 基因的多重突变导致了明显的乙烯不敏感性( b l e e c k e re ta l ，1 9 8 8 ) ，e t r l 蛋 白能够高亲和力地饱和结合乙烯( s c h a l l e ra n db l e e e k e r ，1 9 9 5 ) ，基于这些研究结果，认为e t r l 蛋白在拟南芥中是作为乙烯受体存在的。目前研究表明在拟南芥中的乙烯受体足由多基因家族所 编码的膜结合蛋白，包括e t r l 、e t r 2 、e r s l 、e r s 2 和e 1 n 4 ( h u aa n dm e y e r o w i t z ，1 9 9 8 ；s a k a ia n d h u a , 1 9 9 8 ) ，这些基冈的跨膜结构域的突变导致显性乙烯不敏感。e t r i 与细菌双组分系统表现出 极大的序列同源性( c h a n ge t a l 1 9 9 3 ) 。受体可分为两个亚族：亚族i 包括e 1 r 1 和e r s l ，_ 二者 在氢基酸水平上的序列同源性为6 4 7 8 ：族i i 包括e t r 2 ，e r s 2 和e i n 4 ，序列同源性为 5 中国农业大学博士学位论文第一章概述 4 8 5 8 。所有成员都有一个n 一端乙烯结合域，证明e r t l 蛋白n 一端疏水结构域是乙烯结合位点 的证据有两个：一是在酵母表达体系中仅含有疏水结构域的截短了的e r t i 蛋白仍能结合乙烯； 二是e t r l 的四个基因突变都是由疏水结构域中一个氨基酸发生改变而引起的点突变。两个c y s 残基也在e t r i 的n 末端，调节e t r i 单体的二硫键连接( a n n ea n dj e n n i f e r , 2 0 0