（食品科学专业论文）藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究.pdf

华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究 摘要 藤茶( a m p e l o p s i sg r o s s e d e n t a t a ) 是葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本植物，经 化学分析，藤茶是富含黄酮类化合物的一种植物，有效部位黄酮总量高达4 0 左右， 其中二氢杨梅素( d i h y d r o m y r i c e t i n ，简称d m y ) 含量高达2 7 左右，近年来引起人 们极大的关注。本文就藤茶中二氢杨梅素的提取、分离、降血糖及抗氧化的活性进 行了系列的研究，主要结果如下： 1 二氢杨梅素的提取、分离和结构分析 采用乙醇提取藤茶中的总黄酮，通过单因素试验选取试验因素与水平，根据二 水平试验确定对总黄酮得率影响较大的三个因素，通过三因素三水平的响应面分析 确定提取的最佳工艺条件为：提取温度为7 0 ( 2 时，用6 0 的乙醇，按1 ：3 0 的料液 比进行提取可以使藤茶总黄酮的得率最高，得到的o d 值与温度( x ) 、溶剂浓度( y ) 、 料液比( z ) 三因素之间的响应曲面拟和方程为： o d = i 0 4 9 8 3 3 0 0 2 0 5 2 5 x + 0 o 1 0 0 5 0 y 0 0 0 5 6 5 0 z + 0 0 0 4 0 9 6 x 2 - 0 0 0 0 4 2 5 x y + 0 0 2 4 4 4 6 y 2 + 0 0 2 0 6 2 5 z x 0 0 0 2 8 2 5 z y 0 0 0 2 8 5 4 2 2 。 采用丙酮萃取法分离总黄酮中的二氢杨梅素，通过正交试验得到的最佳分离条 件为料液比1 ：1 2 ，回流时间为2 0 m i n ，提取三次。 通过紫外一可见光谱分析、红外光谱分析和高效液相色谱分析，用丙酮处理得 到的样品中主要是二氢杨梅素。 2 二氢杨梅素降血糖的功能研究 分别以l o m g k g b w 、5 0 m g k g b w 、l o o m g k g b w 剂量的二氢杨梅素连续腹腔注 射四氧嘧啶糖尿病小鼠，末次给药后禁食1 0 h 后眼眶取血测定血糖、血脂指标；取 胸腺、脾脏、肝脏和肾脏计算免疫器官的相对重量；分离肝组织测定抗氧化指标。 结果表明：q l o m g l ( g b w 、5 0 m g k g b w 、l o o m g k g b w 剂量组均可显著降低四氧嘧 啶糖尿病小鼠的血糖( p b e d c 且a 、b 、 e 、d 这4 个因素的f 值的置信度均在9 0 以上，而c 因素的置信度低于9 0 ，选 择a 、b 、d 这三个因素作进一步的响应面分析，以确定这些因素所对应的最优水平。 2 2 4 响应面实验分析结果 2 2 4 1 晌应值结果 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 响应面分析的实验设计及对应的响应值如表8 所示，表中x ，y ，z 分别对应温度、 酒精浓度和料液比。 表8 响应面分析实验方案及结果 t a b l e 8r e s u l t so fr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s 2 2 4 2 回归方程 藤茶中黄酮提取过程中，响应值( 夕与温度( x ) 、溶剂浓度( y ) 、料液比( z ) 三因素之间的响应曲面拟和方程为： o d = i 0 4 9 8 3 3 0 0 2 0 5 2 5 x + 0 0 1 0 0 5 0 y - 0 0 0 5 6 5 0 z + 0 0 0 4 0 9 6 x 2 - 0 0 0 0 4 2 5 x y + 0 0 2 4 4 4 6 y z + o 0 2 0 6 2 5 z x 0 0 0 2 8 2 5 z y 0 0 0 2 8 5 4 2 2 。 2 2 4 3 回归方程及各项的方差分析结果 回归方程的一次项和二次项的f 值均大于f d 贴( 3 ，2 ) - 1 9 1 6 ，表明一次项和二 次项都具有比较高的显著性，说明响应值的变化相对复杂，各个具体的试验因子对 响应值的影响不是简单的线性关系，交互项的f 值大于f o 9 5 ( 3 ，2 ) ，而小于 藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究 f o 9 9 ( 3 ，2 ) = 9 9 1 7 ，说明这3 个因素之间的相互影响很大，失拟项的f 值也很小，表明 该方程对实验拟和情况好，实验误差小，可以用该方程对不同反映条件下的o d 值 进行预测。 回归方程各项的方差分析结果列出如表9 表9 回归方程各项的方差分析 t a b l e 9a n o v a a n a l y s i so ft h er e g r e s s i o ne q u a t i o n 注：f o 9 5 ( 3 ，2 ) = 1 9 1 6 ，f o 9 9 ( 3 ，2 ) = - 9 9 1 7 回归方程的方差分析结果列表如表1 0 方程的f 值为3 2 7 0 ：f f o 9 9 ( 9 ，5 ) = 1 0 1 6 。说明上述回归方程在描述各因子与响 应值之间的关系时，应变量与全体自变量的之间的关系是显著的，即证明该实验方 法是可靠的。 表l o 回归方程的方差分析表 t a b l e l 0v 撕e n c ea n a l y s i so ft h er e g r e s s i o ne q u a t i o n 2 2 4 4 回归方程的结果分析 根据响应面的结果可以得出稳定点是一个鞍形点，在该区域内没有最大值，运用 岭脊分析( r i d g ep r o g r a m ) ，取y - l ，则x - - 0 6 2 3 5 、z = 0 7 6 8 1 ，根据回归方程得出 o d 值为1 0 4 1 9 1 ；另外，对回归方程进行数学分析，得到距点坐标为x - - 0 4 7 5 0 、y = 0 1 5 5 0 、z = 0 8 0 3 3 ，根据回归方程得出o d 值为1 0 7 4 5 4 。从o d 值看出，上述 两组值都不是最大值，可以认为最大值可能就是边界值。 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 从表1 1 看出，x 、y 、z 分别取1 、1 、1 时有最大平均值，代入回归方程可得o d 值为1 1 3 5 6 ，将此值与前面的值相比较，可以看出是最大值。 表1 1 三因素各水平的平均值 t a b l e l lm e a n sv a l u eo ft h ef a c t o r s 图6 响应面图 f i g 6f i g u r eo fr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s 由图6 可见，随着x 值的减小，y 值的增大，z 值的减小，响应值有明显的增加， 但是在所选定的区域内没有最大值。这可能是与试验中所选的水平值有关。与平均 藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究 值相结合，确定最大值就是边界值，即( - 1 ，1 、1 ) ，也就是在提取温度为7 0 c 时， 用6 0 的乙醇，按1 ：3 0 的料液比进行提取可以使得率最高。 2 3 二氢杨梅素的分离纯化结果 表1 2 正交实验设计方案和实验结果 t a b l e l 2r e s u l t so fl 9 ( 3 。) o r t h o g o n a ld e s i g ne x p e r i m e n t s 序号 a bc得率( ) 4 2 3 5 4 8 4 l 5 3 2 9 6 6 9 7 6 0 2 3 6 2 6 2 7 4 0 9 7 9 6 2 7 0 1 0 r2 6 5 8 1 6 15 0 7 表1 3 二氢杨梅素分离纯化正交实验的方差分析 t a b l e l 3v a r i a n c ea n a l y s i so fi s o l a t i n ga n dp u r i f i n gd i h y d r o m y r i c e n t i n 方差来源偏差平方和 自由度f 值显著性 1 0 6 7 9 8 5 62 3 9 2 7 22 1 2 3 6 0 5 72 6 6 5 2 1 2 4 5 7 6 9 9 水木 宰 误差1 6 0 5 5 2 2 5 醯 屹 豁 弱 n 鹋 l 2 3 3 1 2 2 3 l 舷 慨 m 张 队 钇 钉 弱 缸 m ；2 ， 2 3 1 2 3 1 2 3 m 姚 | 錾 乩 i 娩 眩 乩 眙 暂 ， 。 。 2 2 2 3 3 3 m m 撒 讯 他 1 2 3 4 5 6 7 8 9 n 配 髂 蛆 姚 媳 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 正交实验的方差分析如表1 3 ，从中可知，提取次数( a ) 和料液比( c ) 两个因 素具有显著差异性，是影响分离过程中二氢杨梅素得率的主要因素，其p 值分别为 p 0 0 1 和p 0 0 5 ，所以各因素的主次顺序是a 、c 、b ，即为提取次数、料液比和回 流时间。由表1 2 可知分离的最优水平为a 3 8 2 c 3 ，即选取料液比1 ：1 2 ，每次回流时 间为2 0 r a i n ，提取三次。 2 4 结构分析 2 4 1u v v is 分析 4 5 4 3 5 3 粤2 5 米 螫 2 1 5 1 0 5 0 1 9 02 9 03 9 04 9 05 9 0 波长( 咖) 5 4 测3 米 登2 1 0 1 9 02 9 03 9 04 9 05 9 0 波长( 册) 4 5 4 3 5 型 3 蓍2 5 2 1 5 l 0 5 0 j 四 米 督 1 9 02 9 03 9 04 9 05 9 0 波长( 衄) 1 9 0 2 9 03 9 0 4 9 05 9 0 波长( r i m ) 图7 化合物的紫外一可见光谱图 f ig 7u v v iss p e c t r u mo ft h ep r o d u c t 由图7 可知，提取物甲醇溶液在2 9 4 n m 处有最大吸收，这与文献( 田森林等， 2 0 0 2 ) 报道的二氢杨梅素的紫外吸收一致。 藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究 2 4 2ir 分析 图8 所示为提取物的红外光谱图，与文献报道的二氢杨梅素的红外光谱图基本 一致。 a ) 丙酮纯化一次的样品 b ) 丙酮反复处理的样品 图8 提取物的红外光谱 f i g 8i rs p e c t r u mo ft h ep r o d u c t 由图8 所示，3 2 7 2 c m d 处的吸收峰说明分子中有羟基( o h ) 存在，游离羟基红 外吸收在较高波数( 3 6 1 0c m - 1 _ 3 6 4 0 c m d ) ，峰形尖锐；当羟基在分子间缔合时，形成 以氢键相连的多聚体，红外吸收位置向低波数方向移动( 3 3 0 0 c m 1 ) 附近，峰形钝 而宽。1 6 2 9 c m 。1 和1 4 7 0 c m 1 处的吸收峰说明分子中存在苯环。苯环的骨架振动在 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 1 4 5 0 e m l 、1 5 0 0 c m 、1 5 8 0 c m l 、1 6 0 0 e r a ，其中1 4 5 0 c m 1 的吸收与c h 2 、c h 3 的吸 收靠近，因此特征不明显，后三处的吸收则表明苯环的存在，一般只要在1 5 0 0 e m d 或1 6 0 0 c m 1 附近有一处有吸收就可知苯环( 或杂芳环) 的存在。8 0 8 c m 1 处有尖峰， 说明苯环上有两个h ，一般在8 6 0 8 0 0 e r a d 之间存在尖峰说明苯环上有两个氢，常出 现在8 2 0 8 0 0 e m 1 之间。由上图可以看出用丙酮处理一次和用丙酮反复处理样品的瓜 图谱差异不是很大，主要吸收峰都是一致的，可以认为经过丙酮一次处理的样品其 纯度已经比较高了。 2 4 3h p l c 分析 1 t 0 1 3 1 0 9 0 0 咖 7 鲫 寄湖 枷 如 枷 o 1 0 1 3 0 嘲 鲫 0 5 0 0 0 0 7 7 e 咖 苫锄5 5 0 髻裟 a ) 用丙酮一次处理的样品 b ) 用丙酮反复处理的样品 图9 提取物的液相色谱图 f i g 9h p l co ft h ep r o d u c t 图9 所示为提取物的高效液相色谱图。根据文献报道，藤茶中主要含有二氢杨 梅素和杨梅素两种黄酮类物质，其中二氢杨梅素可以溶于丙酮，而杨梅素是不溶于 藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究 丙酮的，一般二氢杨梅素的标准品是通过用丙酮反复处理得到的。从图9 可以看出， 经过丙酮处理一次和反复处理得到的样品，都是只有一个吸收峰，保留时间分别为 1 4 2 5 7 、1 4 2 8 2 ，因而可以认为经过丙酮处理一次的藤茶黄酮，其中的主要物质已经 为二氢杨梅素了。 3 讨论 一般情况下，总黄酮含量的测定采用的是亚硝酸钠、硝酸铝法，用芦丁做标准 品，在5 0 5 r i m 处测吸光值。但是藤茶黄酮提取液中加入亚硝酸钠和硝酸铝后，其最 大吸收波长不在5 0 5 r i m ，同样，在用筒a 3 做显色剂时也存在这个问题，因而不能 用芦丁做标准品，而必须用二氢杨梅素做对照品。为了便于操作，本文选用h l c l 3 的乙醇溶液做显色剂。 r s a 有许多方面的优点，可以在给出的整个区域上找到因素与响应值之间的一 个明确的函数表达式，也可以找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值， 不但实验次数较少，而且还可以考虑几种因素的交互作用。但它也有其自身的局限 性，首先，如果实验因素水平选的太宽，或选的关键因素不全，将会导致响应面出 现吊兜和鞍点；其次通过回归分析得到的结果只能对该类实验做估计；第三当回归 数据用于预测时，只能在因素所限定的范围内进行。在本实验中，稳定点是鞍点， 没有最大值，其原因可能是所选的因素不全，在二水平实验得出p h 值对藤茶黄酮 提取率的影响很大，但是考虑到实际操作，在r s a 实验中没有涉及，这可能是导致 响应面图出现鞍形点的原因。 色谱法中一般用保留时间或保留体积定性，但前提是要有标准品，由于没有二 氢杨梅素的标准品，在液相色谱中采用保留时间来定性显得非常不足。考虑到原料 的特殊性，藤茶中二氢杨梅素的含量高达2 7 ，文献报道中二氢杨梅素的对照品就 是用丙酮反复处理得到的样品，因而也可以把用丙酮反复处理得到的样品作为对照 品。 4 小结 藤茶粉末中含有1 0 6 4 的水分、1 9 5 2 的脂肪和8 4 7 4 的蛋白质，此外还含 有相当丰富的金属元素，尤其是c a 、m g 、f e 的含量很高，而重金属元素如p b 、c r 在实验条件下没有检出。 先用乙醇提取藤茶中的总黄酮，然后用丙酮分离纯化可以得到比较纯的二氢杨梅 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 素。用响应面分析的方法确定了藤茶总黄酮提取过程中的最佳工艺：提取温度为7 0 时，用6 0 的乙醇，按1 ：3 0 的料液比进行提取可以使藤茶总黄酮的得率最高， 得到的o d 值与温度( x ) 、溶剂浓度( y ) 、料液比( z ) 三因素之间的响应曲面拟和方程为： o d = i 0 4 9 8 3 3 0 0 2 0 5 2 5 x + 0 0 1 0 0 5 0 y 0 0 0 5 6 5 0 z + 0 0 0 4 0 9 6 x 2 - 0 0 0 0 4 2 5 x y + 0 0 2 4 4 4 6 y 2 + o 0 2 0 6 2 5 z x 0 0 0 2 8 2 5 z y 0 0 0 2 8 5 4 2 2 采用丙酮萃取法分离总黄酮中的二氢杨梅素，通过正交试验得到的最佳分离条件 为料液比1 ：1 2 ，回流时间为2 0 m i n ，提取三次。 通过对丙酮萃取物的u v - v i s 、i r 和h p l c 分析可知，其主要成分是二氢杨梅素。 藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究 第三章二氢杨梅素降血糖的功能研究 糖尿病是一种常见的代谢性疾病，近年来其发病率在世界范围内逐年上升，据 统计目前全球约有1 2 亿糖尿病患者。该病已成为继心血管疾病、肿瘤之后严重威 胁人类健康的第三大疾病( 严钟德，2 0 0 0 ) 。许多专家指出在糖尿病治疗的三大原则 即饮食、运动和药物治疗中，饮食治疗是糖尿病综合治疗中的基础措施( 谭长磊和 吕丽萍，2 0 0 2 ) ，b i e r m a n 认为关注糖尿病人的饮食才是关注糖尿病、冠心病和动脉 粥样硬化的根本。因此研究天然降血糖活性成分用以开发降血糖药物甚至是功能食 品，具有重要意义。近十多年来研究者们从各种途径寻找抗糖尿病及其并发症的活 性成分，已取得很大进展，目前发现的天然降血糖成分包括：黄酮类，主要影响b 细胞功能，作用比较缓慢而持久；萜类和三萜皂甙，主要影响血糖代谢；多糖类； 生物碱和苯丙素酚类；甾体类，降糖作用类似磺脲类；硫键化合物；多肽以及不饱 和脂肪酸等( 郭舜民和郭尧惠，2 0 0 0 ) 。 近年来的许多研究表明，黄酮类化合物具有降血糖作用，如槲皮素 ( q u e r c e t i n ，q e ) 能显著降低糖尿病大鼠空腹血糖及胰岛素水平，而且随着时间的延 长，它的降糖作用逐渐增强，同时它能显著降低糖尿病大鼠血清甘油三酯、总胆固 醇和脂质过氧化物含量，而对正常大鼠血糖无影响( 何晓英等，2 0 0 3 ；曾云先和刘尚 勤，1 9 9 9 ；n e g r es a 和s m b a y e rr ，1 9 9 2 ) 。水飞蓟素( s i l i b i n ) 是一种自由基清除剂 和膜稳定剂，s o t oc p 等研究发现，水飞蓟素可增加四氧嘧啶糖尿病小鼠胰脏和血液 中谷胱甘肽含量，组织四氧嘧啶引起的脂质过氧化，从而对四氧嘧啶引起的糖尿病 动物的胰脏损害具有保护作用( s o t oc p ，e ta l ，1 9 9 8 ；孙丰雷，2 0 0 3 ) 。钟正贤，覃 洁萍等对于二氢杨梅素的降血糖作用进行了研究，但只是报道了二氢杨梅素对糖尿 病小鼠的血糖水平的影响( 钟正贤等，2 0 0 2 ) 。本文就二氢杨梅素的降血糖功能进行 了系统的研究和探讨。 1 材料与方法 1 1 药品与试剂 1 1 1实验药品 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 二氢杨梅素( d m y ) ：按第二章方法分离纯化得到。实验时用t w e e n - - 8 0 作乳化 剂，用生理盐水配成所需的浓度。 1 1 2 实验动物： 昆明种小鼠( s p f 级) ，雄性，体重1 8 2 2 9 ，由湖北省医学动物实验中心提供， 医学实验动物合格证号：医动字第1 9 0 8 2 号。 1 1 3 主要试剂： 四氧嘧啶( a l l o x a n ) s i g m a u s a 葡萄糖试剂盒( g l u )中生北控生物科技股份有限公司 s o d ，g s h p x ，m d a 试剂盒南京建成生物工程研究所 t c ，t g , h d l - c 测试盒浙江东瓯生物工程有限公司 其他试剂均为国产分析纯 1 1 4 主要仪器 a b 2 0 4 e 电子天平m e t r l e rt o l e d o s w i t z e r l a n d 不锈钢电热恒温水浴锅北京市医疗设备厂 紫外可见分光光度计h i t a c h i j p l g r l 6 w 医用离心机北京医用离心机厂 1 2 方法 1 2 1 实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型的建立( 郑建仙，1 9 9 9 ) 将四氧嘧啶配成2 的生理盐水溶液。小鼠禁食2 4 h 后按2 0 0 m g k g 剂量腹腔注 射四氧嘧啶溶液，7 2 h 后用尿糖试纸检测尿糖，用血糖测定试剂盒检测空腹血糖， 选取血糖值大于1 1 1 m m o l l 、尿糖呈强阳性的小鼠作为高血糖模型小鼠。 1 2 2 二氢杨梅素对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响 将试验性糖尿病小鼠随即分为5 组，即正常对照组( c o n t r 0 1 ) 、高血糖模型组 ( a u o x a n ) 、和3 个d m y 剂量组。实验期间，正常对照组和高血糖组腹腔注射生理 盐水，3 个剂量组腹腔注射二氢杨梅素( d m y ) ，剂量分别为1 0 m g k g b w 、5 0 m g k g b w 、 1 0 0 m g k g b w 。实验期间自由饮水和摄食。试验期为1 4 d ，每日记录动物进食、饮水、 尿量和体重数据，并观察其皮毛、活动等生长情况。末次给药后，所有动物禁食1 0 h ， 眼眶静脉丛采血，离心1 0 m i n ，3 0 0 0 r m i n ，分离血清，做相应血液指标的检测。处 藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究 死动物，取动物肝、肾、脾、胸腺称重，并将肝组织作成肝匀浆以测定s o d 、g s h p x 、 m d a 。 1 2 3 观察指标与方法 血糖的测定：各实验小鼠禁食1 0 h 后采血，用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定。 血清甘油三酯( t g ) 、血清总胆固醇( t c ) 及血清高密度脂蛋白胆固醇( 皿l c ) 测定：分离血清，按试剂盒方法进行，以h 1 t a c h i 紫外可见分光光度计比色测定。 肝超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g s h - p x ) 及丙二醛( m d a ) 测定：分离肝组织作成肝匀浆液，按试剂盒方法进行。 1 2 4 统计学处理 结果以虿s 表示，采用s p s s l 0 0 统计软件进行方差分析 2 结果与分析 2 1 二氢杨梅素对实验性糖尿病小鼠血糖的影响 四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠空腹血糖水平极显著地高于正常对照组 ( p 0 0 1 ) ，在四氧嘧啶造模7 2 h 后，小鼠呈现明显的“三多一少”的糖尿病症状， 表明高血糖模型成功。如表1 4 所示，d m y 对高血糖模型小鼠具有降低血糖的作用， 在1 0 m g k g b w - - 1 0 0 m g k g b w 剂量范围内，其降低率存在量效关系，其中与高血糖 模型对照组相比，d m y 的高、中、低剂量组的血糖值均有明显降低( p o 0 1 ) 。 表1 4 二氢杨梅素对血糖的影响( i s ) t a b l e l 4 e f f e c to fd m yo ns e r u mg l u c o s ei na l l o x a n i n d u c i n gd i a b e t i cm i c e ( x s ) a ：p 0 0 1c o m p a r e dw i t hc o n t r o l ，c ：p 0 0 1c o m p a r e dw i t ha l l o x a n 2 2 二氢杨梅素对实验性糖尿病小鼠胸腺、肝、脾和肾的影响 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 由表1 5 所示，高血糖对照组小鼠的胸腺指数与脾脏指数重量均极显著低于空白 对照组( p 0 0 1 ) ，d m y 各剂量组小鼠均能增加胸腺和脾脏的相对重量，其中中剂 量组小鼠的胸腺重量显著地高于高血糖对照组( p o 0 5 ) ，而脾脏重量则极显著的高 于高血糖对照组( p 0 0 1 ) ，高剂量组小鼠的脾脏指数和胸腺指数均极显著高于高血 糖对照组( p 0 0 1 ) 。高血糖模型组中小鼠的肝脏重量极显著高于空白对照组 ( p o 0 5 ) ，表明d m y 没有明显的毒副作用。 表1 5 二氢杨梅素对实验性糖尿病小鼠器官的影响( x s ) t a b l e l 5 e f f e c to fd m yo no r g a nw e i g h ti i la l l o x a n - r e d u c i n gd i a b e t i cm i c e ( x s ) a ：p 0 0 1b ：p 0 0 5 m p a r e dw i t ha l l o x 姐，e ：p 0 0 1d ：p 0 0 5c o m p 删w i t hc o n t r o l 2 3 二氢杨梅素对实验性糖尿病小鼠血脂的影晌 表1 6 二氢杨梅素对糖尿病小鼠血脂的影响( 一x s ) t a b l e l 6 e f f e c to fd m yo ns e r u ml i p i d si 1 1a l l o x a n i n d u c i n gd i a b e t i cm i c e ( x s ) a ：w ：0 0 1b ：p 0 0 5c o m p a r e d 谢t h l o x a n ，e ：p 0 0 1d ：p 0 0 5c o m p a r c d 研t hc o n t r o l 藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究 实验小鼠血清t c 、t g 、h d l - c 的变化如表1 6 所示，由表可知高血糖对照组 t c 显著高于空白对照组( p o 0 5 ) ，h d l - c 显著低于空白对照组( p 0 0 5 ) 。腹腔注射二氢杨梅素后，各剂 量组小鼠t c 、t g 、h d l - c 均有一定的恢复，尽管没有恢复到正常对照组的水平， 但是高剂量组小鼠的t c 值极显著低于高血糖对照组( p o 0 1 ) 。结果表明二氢杨梅 素能够有效促进糖尿病小鼠血脂水平的恢复，对防治糖尿病及其并发症有良好的作 用。 2 4 二氢杨梅素对实验性糖尿病小鼠抗氧化能力的影响 表1 7 二氢杨梅素对糖尿病小鼠肝脏抗氧化能力的影响( i s ) t a b l 7 e f f e c to fd m yo i ll i v e ra n t i o x i d i t i v i t yi nm l o x a n i n d u c i n gd i a b e t i cm i c e ( x s ) a ：p o 0 1b ：p 0 0 5e o m p a r e x lw i t ha l l o x a n , c ：p 0 0 1d ：p 0 0 5c o m p a r e dw i t hc o n t r o l 机体的s o d 、g s h p x 和m d a 含量是评价其抗氧化能力的重要指标。由表1 7 可知，与正常对照组相比，高血糖模型组s o d 、g s h p x 活性极显著降低( p o 0 1 ) ， m d a 含量极显著上升( p 0 0 1 ) ，表明高血糖模型小鼠的抗氧化能力明显低于正常 小鼠。但在腹腔注射d m y 后，各剂量组小鼠s o d 、g s h p x 和m d a 有明显的恢 复，其中g s h p x 活性显著高于高血糖模型组，m d a 含量极显著低于高血糖模型 组。表明二氢杨梅素能有效促进糖尿病小鼠肝脏抗氧化能力的恢复，其中 1 0 0 m g k g b w 对糖尿病小鼠肝脏抗氧化能力的恢复作用最好。 3 讨论 3 1 调节血糖作用 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 四氧嘧啶在体内可选择性地迅速被胰腺b 细胞吸收，所产生的超氧阴离子等自 由基能直接破坏b 细胞的膜结构，损伤b 细胞的d n a ，大量的b 细胞损伤与坏 死导致胰岛素原合成障碍，引起糖尿病( 刘京等，1 9 9 4 ) 。本实验中糖尿病小鼠与正 常小鼠比较，其血糖值差异极显著( p o 0 1 ) ，表明造模成功( 胡绍文和郭瑞林，2 0 0 1 ) 。 上述的实验结果表明，二氢杨梅素对四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖值有明显的降低作 用，与高血糖对照组相比差异显著，具有防治作用，而且1 0 0 m g k g b w 剂量组的降 血糖效果最好，表明二氢杨梅素可能减弱四氧嘧啶对胰腺1 3 细胞的损伤或改善受损 伤细胞的功能，有益于缓解糖尿病小鼠的症状。 胸腺和脾脏是机体的重要免疫器官，胸腺是机体t 淋巴细胞的主要形成器官， 脾脏则是b 淋巴细胞的主要形成器官。机体免疫反应增强时，可促进免疫器官的增 生，产生较多的免疫细胞。故免疫器官的增重可作为机体免疫功能提高的标志之一。 因胸腺和脾脏的重量与体重相关，故用其与体重的比例来表示其相对重量，反映其 增殖的真实情况。本研究显示二氢杨梅素能恢复糖尿病小鼠的胸腺指数和脾脏指数， 表明二氢杨梅素能调节糖尿病小鼠的免疫功能。 3 2 调节血脂作用 较多糖尿病患者存在脂代谢紊乱，表现为高血脂症和高脂蛋白症，尤其是以肥 胖患者居多。机体血脂水平异常改变，可导致体内脂质异常蓄积，诱发机体产生高 脂血症，严重者可引起动脉粥样硬化、冠心病等的发生，目前对糖尿病人的血生化 分析结果均显示，血清胆固醇、甘油三酯异常增多、高密度脂蛋白胆固醇异常降低。 一般认为血清胆固醇、甘油三酯是导致体内脂质代谢异常的危险性因素，而高密度 脂蛋白则是保护性因素( 严钟德，2 0 0 0 ) 。本研究表明，二氢杨梅素对糖尿病小鼠体 内甘油三酯的异常升高有极显著防治作用( p 0 0 1 ) ，对血清胆固醇的升高和高密度 脂蛋白的降低有防治作用，效果不是很显著，这可能是由于实验的时间比较短，对 它们的防治效果没有完全显示出来。从上述结果可以看出，二氢杨梅素可使机体血 脂水平趋于正常，防止糖尿病导致的脂类代谢紊乱，对糖尿病的并发症有防治作用。 3 3 提高糖尿病小鼠抗氧化能力的作用 糖尿病及其并发症的发病机理十分复杂，至今尚未完全阐明。近年来，许多研 究发现糖尿病及其并发症的发生与机体的氧化应激水平有关( o b e r l e yl w ，1 9 9 2 ) j e m i n g s ，p e ，1 9 9 2 ) 。叶于薇等研究发现经四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠血清s o d 降 藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究 低，外周组织膜脂蛋白代谢末端产物一咖s ( 或脂质过氧化物) 升高，m d a s o d 比值增加，说明糖尿病大鼠抗氧化防御体系受抑制，自由基产生率大于清除率，氧 化应激增加( 叶于薇等，2 0 0 0 ) 。本研究证明，提高其抗氧化酶系统( s o d 、g s h p x ) 的活力，有助于糖尿病小鼠肝脏抗氧化能力的恢复，提示这可能是其降血糖作 用的机理之一。 4 小结 四氧嘧啶糖尿病小鼠腹腔注射1 0 m g k g b w 、5 0 m g k g b w 、1 0 0 m g k g b w 剂量的二 氢杨梅素，结果表明，各个剂量均可显著降低小鼠的血糖值( p o 0 1 ) ，且以高剂量 1 0 0 m g k g b w 的降血糖效果最佳。二氢杨梅素可以使四氧嘧啶糖尿病小鼠的胸腺指 数、脾脏指数增加，提高免疫力；降低肝脏指数，减小四氧嘧啶对肝脏的损伤；对 于肾脏指数基本没有影响，说明二氢杨梅素的毒性较低。二氢杨梅素可降低四氧嘧 啶糖尿病小鼠血脂的t c 、t g 含量，提高h d l - c 含量，有利于糖尿病小鼠血脂水 平的恢复。二氢杨梅素可降低四氧嘧啶糖尿病小鼠肝脏m d a 的生成量，提高s o d 、 g s h - p x 的酶活，表明二氢杨梅素可改善糖尿病小鼠氧化应激水平。 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 第四章二氢杨梅素抗氧化活性研究 自由基学说是英国h a r m a n 于1 9 5 6 年最早提出的，该学说是认为自由基攻击生命 大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的基本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的 重要起因。自由基衰老理论的中心内容为：衰老来自机体正常代谢过程中产生自由 基随机而破坏性的作用结果，由自由基引起机体衰老的主要机制可以概括为以下几 个方面：1 生命大分子的交联聚合和脂褐素的累积。自由基作用于脂质发生过氧化 反应，氧化终产物丙二醛等会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，这是衰 老的一个基本因素。脂褐素是丙二醛与蛋白质等生命大分子的交联聚合产物，由于 它不溶于水故不易排出，就会在细胞内大量堆积。脂褐素在皮肤细胞的堆积形成老 年斑；在脑细胞终的堆积，则会出现记忆力减退或智力障碍甚至出现老年痴呆。2 器官组织细胞的破坏与减少。器官组织细胞的破坏与减少，是机体衰老的症状之一。， 主要是由于自由基引起的脂质过氧化而造成对细胞膜和细胞器的损害，另外自由基 作用于核酸引起基因突变改变了遗传信息的传递，导致蛋白质与酶的合成错误以及 酶活性的降低；生物膜上的不饱和脂肪酸易受到自由基的清晰发生过氧化反应，氧 化终产物丙二醛会使生命大分子发生交联作用，形成西夫碱交联物并出现各种代谢 障碍，过氧化作用还使膜不饱和脂肪酸含量减少，因不饱和脂肪酸为保持膜流动性 与柔软性所必需，所有过氧化结果改变了生物膜的结构和功能，影响膜的流动性与 通透性，导致了膜功能的紊乱；微粒体、线粒体和溶酶体三类亚细胞器，在膜受损 之后会出现一系列的紊乱现象，微粒体和线粒体膜会因此而增加通透性与脆性，并 易于崩裂，只是镶嵌在膜上的一系列酶的排列发生错位或破坏而丧失功能。膜上与 呼吸链有关的酶系统发生变化会影响三羧酸循环及电子传递位置，致使细胞能量产 生系统陷于瘫痪。3 免疫功能的降低。自由基作用于免疫系统，或作用于淋巴细胞 膜使其受损，引起老年人细胞免疫于体液免疫功能减弱，并使免疫识别力下降出现 自身免疫性疾病。自由基清除剂能够清除机体代谢过程中产生的过多的自由基，是 一种可增进人体健康的重要活性物质，也是一类重要的功能型食品原料。因此，寻 找利于人体吸收的能清除体内过量自由基的外源植物活性清除剂目前正成为人们研 究关注的热点。 藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究 对于二氢杨梅素的抗氧化作用，何桂霞，杨伟丽等研究表明，二氢杨梅素对v c - v d + 体系、f e 2 + 一双氧水体系和f e z + - - c y s 体系诱导的脑、心、肝匀浆及线粒体的 脂质过氧化有抑制作用，并表现出的剂量依赖关系( 何桂霞等，2 0 0 3 ) 。林淑英，张 友胜等研究表明纯度为9 5 的二氢杨梅素在猪油体系中的最优添加量为0 0 4 ；当 添加量为0 0 2 时，l 一抗坏血酸、柠檬酸和e d t a 可有效地提高二氢杨梅素的抗 氧化性能( 林淑英等，2 0 0 3 ；张友胜等，2 0 0 3 ；杨书珍等，2 0 0 3 ) 。本文旨在系统研 究二氢杨梅素清除羟基自由基、超氧阴离子和脂质过氧化自由基的效果，以期进一 步探讨二氢杨梅素的抗氧化机理。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 。1 实验材料 二氢杨梅素( d m y ) ：按第二章的方法分离纯化得到，实验时用t w e e n - - 8 0 作 乳化剂，用生理盐水配成所需要的浓度。 1 1 2 实验动物 昆明种小鼠( s p f 级) ，雄性，体重1 8 2 2 9 ，由湖北省医学动物实验中心提供， 医学实验动物合格证号：医动字第1 9 0 8 2 号。 1 1 3 主要试剂 维生素c ( v c )a r上海化学试剂采购供应站试剂厂 三氯化铁( f e c l 3 ) a r广东西垄化工厂 双氧水( h 2 0 2 ) a r武汉市江北化学试剂厂 正丁醇a r上海太平洋化工( 集团) 公司溶剂厂 三氯乙酸( 他) a r 中国医药集团上海化学试剂公司 d 一脱氧核糖( d r )生化试剂 s i g m a u s a 硫代巴比妥酸( t b a )生化试剂中国医药集团上海化学试剂公司 超氧阴离子试剂盒南京建成生物工程研究所 1 1 4 主要仪器 a b 2 0 4 e 电子天平m e l r ie rt o l e d o s w i t z e r l a n d 不锈钢电热恒温水浴锅北京市医疗设备厂 紫外可见分光光度计h 礅c h i j p 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 l g r l 6 w 医用离心机北京医用离心机厂 1 2 方法 1 2 1 二氢杨梅素对羟基自由基的清除作用 在干净磨口试管中依次加入0 4 m 1 5 0 m m o l l p h 7 5 k h 2 p 0 4 一k o h 缓冲液，一定 浓度样品，0 1 m 1 1 0 4 m m o l l e d t a 溶液，o 1 m l l o m m o l l h 2 0 2 ，0 1 m 1 6 0 m m o l l d r ( 对照不加) ，0 1 m 1 2 m m o 虮，以及0 1 m l l m m o l l f e c l 3 ，各试管终体积为1 0 m l 。 3 7 保温1 h 后取出，加入l m l 2 5 h c l 终止反应，再加入1 0 m 1 1 0 t b a ，将每个 试管中溶液混合均匀，于沸水浴上煮沸1 5 m i n ，立即冷却，加入3 m l 正丁醇萃取， 取上清液在波长5 3 2 n m 处比色( b a r r yh e ta l ，1 9 8 7 ) 。按下列公式计算样品对o h 的清除率： s = 【一( a 1 一a 2 ) 】a o x1 0 0 其中：s 表示清除率，舢、a 1 、a 2 分别代表空白、样品及样品对照度的吸光度。 1 2 2 二氢杨梅素对超氧阴离子的清除作用 抗超氧阴离子试剂盒法：分别取不同浓度的样品溶液，按试剂盒所标明操作方 法进行实验。按下式计算样品对0 2 。的清除率： s = 一( a 1 - a 2 ) a o x1 0 0 其中：s 表示清除率，舢、a 1 、a 2 分别代表空白、样品及样品对照度的吸光度。 1 2 3 二氢杨梅素对小鼠红细胞自氧化溶血的影响 小鼠眼眶静脉丛取血，加入肝素抗凝后以3 0 0 0 r r a i n 离心l o m i n 分离得到红细 胞，生理盐水洗涤三次后，以生理盐水配成0 5 的悬浮液。取红细胞悬浮液5 0 m l 与0 2 m l 不同浓度的样品溶液混合，于3 7 c 温浴2 4 h ( 对照管以生理盐水代替样品 液) 后，1 0 0 0 r m i n 离心l o m i n 取上清液，于5 4 0 n m 处比色，根据吸光度计算抑制 率，公式如下 溶血抑制率( ) = ( 1 一样品管吸光度对照管吸光度) x1 0 0 1 2 4 二氢杨梅素对小鼠红细胞自氧化溶血时丙二醛( m d a ) 生成的影响 取上述上清液0 3 m l ，t b a 比色法( 向荣和王鼎，1 9 9 0 ；蔡秀成等，2 0 0 1 ；陈 勤，1 9 9 6 ) 测红细胞溶血时丙二醛的生成量，以吸光度表示丙二醛生成量的多少。 1 2 5 二氢杨梅素对h ：0 ：导致红细胞溶血的影响 藤茶中二氢杨梅素的提取、分离和功能研究 取上述0 5 的红细胞悬浮液0 5 m l ，加入0 1 m l 不同浓度的样品，再加入 o 1 m l l 0 0 m m o l l 的h 2 0 2 ，3 7 水浴1 h 后1 0 0 0 r m i n 离心1 0 r a i n 取上清液，稀释6 倍后于5 4 0 r i m 处比色，计算抑制率。 1 2 6 二氢杨梅素对小鼠肝组织匀浆丙二醛( m d a ) 生成的影响 1 2 6 1 1 0 肝组织匀浆的制备 取肝组织块0 5 9 在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，称重，放入5 m l 或1 0 m l 的小烧杯中。取总量( 总量为4 5 m 1 ) 2 3 的生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪 碎组织块，一起倒入匀浆器中，再将剩余的1 3 的生理盐水用来冲洗残留在烧杯中 的组织块，一起倒入匀浆器中进行匀浆，使组织均匀化。将匀浆液3 0 0 0 r r a i n 离心 1 5 m i n 。取适量上清液进行各种测定。 1 2 6 2 小鼠肝匀浆丙二醛( m d a ) 含量的测定 每支试管中加入0 2 0 m 1 1 0 肝组织匀浆，给药组每管分别加入不同浓度的样品 液0 1 m l ，对照组加入等体积生理盐水，3 7 温浴1 h 后分别加入1 0 t c a l 0 m l 、0 6 7 t b a l 0 m l ，充分混合均匀，沸水浴1 5 r a i n 后立即冷却，3 0 0 0 r r a i n 离心取上清液， 测定其在5 3 2 m 处的吸光度，以吸光值表示m d a 含量，并计算清除率。 另取三组试管，一组先加入0 1 m b 0 m m o l l 过氧化氢，一组先加入0 1 m 1 5 m m o l l 硫酸亚铁，另一组加入2 0 a 0 0 1 m o l l 的半胱氨酸( c y s ) 和2 0 a l m m o l l 的f e s 0 4 ， 再向这两组试管中依前述加入肝组织匀浆和样品液，温浴冷却后测定其m d a 含量。 1 2 7 二氢杨梅素对小鼠肝线粒体肿胀度的影响 取1 0 的肝组织匀浆液5 0 m l ，先以3 0 0 0 r r a i n 离心1 0 m i n ，弃去沉淀，取上清液 以1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，所得沉淀即为线粒体，用生理盐水将所得线粒体配成蛋 白质浓度为0 5 m g m l 的线粒体悬液。在试管中加入不同浓度的样品液0 4 m l ，对照 加生理盐水，再加入3 0 m l 线粒体悬液和0 4 m 1 0 5 m m o l l 的f e s 0 4 溶液及 0 4 m 1 0 5 m m o l l 的v c 溶液，迅速混匀后于5 2 0 n m 处比色测定吸光度，吸光度降低 表示线粒体发生肿胀。 1 2 8 二氢杨梅紊对小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响 在试管中加入1 0 m l 线粒体悬液( 蛋白质含量约为0 5