（生物化学与分子生物学专业论文）人的上游结合因子hubf中的两个hmg+box结构域：hubf+hmg+box+1和hubf+hmg+box+5的克隆、表达纯化以及结构和功能的比较研究.pdf

摘要 r n a 聚合酶i 负责核糖体的1 8 s ，5 8 s ，2 8 sr n a 的前体的转录。人的上游 结合因子h u b f ( h u m a nu p s t r e a mb i n d i n gf a c t o r ) 是r n a 聚合酶i 转录起始活动 中所必需的核转录因子。它由7 6 4 个氨基酸组成；在h u b f 中一共有6 个被称为 h m gb o x 的结构域。尽管这六个结构域在一级序列上同源，但是它们对实现 h u b f 在转录起始中的功能各具有不同的贡献。研究它们功能上的这种差异性对 于深入了解h u b f 在r n a 聚合酶i 转录调控中的作用具有重要意义。在本论文 中，我们有选择性的比较研究了位于n 端的第一个和位于c 端的第五个h m gb o x 结构域。这两个 玎v i gb o x 结构域( b o xl 和b o x5 ) 被成功克隆，表达和纯化。 通过g e ls h i ra s s a y 和s p r ( s u r f a c ep l a s m o n r e s o n a n c ea s s a y ) 的方法，重点分析 了这两个结构域在d n a 结合能力上的不同；并通过光谱学以及异核多维核磁共 振方法来研究它们的结构( 本文中讲述的是b o x5 的结构解析，实验室的前期工 作已完成b o xl 的结构解析) ，以图了解这两个h m gb o x 蛋白质结构域功能上差 异的分子基础。通过这项研究加深我们对于h m gb o x 这种结构域的结合d n a 特性的理解，并在更深层次上审视这种蛋白质结构域的结构和功能的相关性。 论文第一章对两个部分内容进行了综述。第一部分是对r n a 聚合酶i ( d n a p o l y m e r a s e1 ) 所控制的转录调控进行了一个总体上的介绍。主要介绍了转录调 控在细胞核内的定位，启动子的结构，转录起始复合物中所涉及的因子，以及转 录的起始，延伸和终止；重点介绍了转录过程中所需要的些辅助因子以及它们 所受到的调控。第二部分讲述了如何通过核磁共振研究来测定生物大分子的结 构，重点总结了核磁样品的同位素标记方法及其应用。 在论文第二章中，我们首先通过生物化学和分子生物学的方法，比较研究了 人的上游结合因子h u b f 的两个h m gb o x 结构域卸gb o x1 和h m gb o x5 。 这两个结构域的基因亚克隆后都在大肠杆菌中获得高效表达。利用n i2 + 亲和层析 法，可以得到每升2 0 一3 0 m g ，纯度大于9 0 的重组蛋白。通过凝胶迁移率变动实 验( g e ls h i f ta s s a y ) 和表面等离子共振实验( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e a s s a y ) ，我们比较分析了h u b f h m g b o x1 和h u b f h m gb o x5 同d n a 结合特 性。h u b fh m gb o x1 无论是对4 - w a y d n a j u n c t i o n ( 一种d n a 重组的中间类 似物) 和一段1 5 个碱基对的富含g c 的r r n a 基因启动子片断都有非常强的结 合力；而h u b fh m gb o x5 恰恰相反，对两者都表现出非常弱的结合力。 从蛋白质分子结构上对这种差异的阐明无疑可以增进人们对这种结构域的 了解。我们首先通过园二色性和红外光谱的方法，研究了它们的二级结构。结果 发现它们和其它已知结构的h m gb o x 结构域一样，主要由螺旋构成。然后通过 异核三维核磁共振的方法，获得了这两个结构域的溶液结构。h u b fh m gb o x1 和h u b fh m gb o x5 结构上包括三段螺旋，它们通过柔性l o o p 连在一起，并交 叉在一起形成一个“l ”形分子。有一个由芳香族氨基酸组成的疏水核心来稳定 这种结构。它们的三维结构上同其它许多种h m gb o x 蛋白具有相似性，这表明 这种结构域在空间结构上有相当的保守性。尽管如此，基于这两个结构域的三维 结构，我们对它们的表面静电势以及一些关键残基的性质进行了对比，发现其它 的h m gb o x 结构域在这个凹面上具有正的表面静电势( e l e c t r o s t a t i cs u r f a c e p o t e n t i a l ) ，而h u b fh m g b o x5 具有负的表面静电势。h m gb o x 结构域正是通 过这个凹面与d n a 结合的。另外，在与d n a 结合的某些位点上，在h u b fh m g b o x1 和其他h m g b o x 结构域中通常都是疏水氨基酸。这些疏水氨基酸可以插 入d n a 的碱基对之间，但是在h u b fh m gb o x5 中，这些位置的氨基酸是极性 的，不具有插入d n a 碱基对的功能。这些不同点可以帮助我们了解为何h u b f h m gb o x5 丧失了它的d n a 结合能力。 a b s t r a c t t h ee u k a r y o t i cr n a p o l y m e r a s e it a k e sr e s p o n s i b i l i t yi nt r a n s c r i p t i n g18 s 5 8 s a n d2 8 sr r n a p r e c u r s o r s h u m a nu p s t r e a mb i n d i n gf a c t o r ( h u b f ) i san u c l e o l a r t r a n s c r i p t i o nf a c t o ri n v o l v e di nt r a n s c r i p t i o nb yr n a p o l y m e r a s ei i tc o n t a i n s7 6 4 a m i n oa c i d s ；s i xh m gb o xd o m a i n sh a v eb e e nf o u n di nh u b f a l t h o u g ht h e s es i x b o x e sa r ec o n s e r v a t i v ei np r i m a r ys e q u e n c e ，t h ec o n t r i b u t i o no f e a c hh m gb o xm o t i f t oi t sf u n c t i o ni sd i f f e r e n t i tm a k e ss e n s ei i l s t u d y i n gt h e s ed i f f e r e n c e s w h i c hw i l l c o n t r i b u t et od e e p l yu n d e r s t a n dt h ef u n c t i o no fh u b fm t r a n s c r i p t i o n i nt h i sa r t i c l e ， w es e l e c t e da n dc o m p a r a t i v e l ys t u d i e dt w oh m gb o xd o m a i n si nh u b f ( t h ef n s t h m gb o xa n dt h ef i 髓h m g b o x ) t h e y ( b o xl a n db o x5 ) h a v eb e e na c h i e v e di n c l o n i n g ，h i g h l ye x p r e s s i n ga n dp u r i f i c a t i o n t h r o u g hg e ls h i f ta s s a ya n ds p r ( s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c ea s s a y ) t e c h n i q u e s ，t h ed i f f e r e n c e so f t h e i rd n a b i n d m gp r o p e r t i e s w e r e e m p h a t i c a l l yc o m p a r e da n da n a l y z e d a l s ot h es e c o n d a r ya n dt e r t i a r ys t r u c t u r e s w e l ed e t e r m i n e d b ys p e c t r at e c h n i q u e s ( c d a n df t i 黜a n dh e t e r o n u c l e a r t h r e e d i m e n s i o n a l s p e c t r o s c o p y m e t h o d sf o rt h e s et w o d o m a i n s t h r o u g ht h e s e s t u d i e sw et r i e dt oe l u c i d a t et h em o l e c u l a rb a s i sf o rt h e i rd i f f e r e n c ei nf u n c t i o n t h i s w o r kw i l l h e l pu s t o d e e p l yu n d e r s t a n dt h e s e c r e t so ft h i ss o r to fd n a b i n d i n g d o m a i n - - h m g b o x ，a n dp r o v i d eap r o f o u n di n s i g h ti n t ot h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e n m e i rs t r u c t u r e sa n df i m c t i o n s c h a p t e r o n ec o n s i s t so ft w or e v i e w si nc o n j u n c t i o nw i t hm yr e s e a r c hw o r k t h e f i r s t p a r tp r o v i d e s ab r i e fr e v i e wo ft r a n s c r i p t i o n a lc o n t r o l b yp o l y m e r a s e1 m e u k a r y o t i co r g a n i s m s w i t hi t sl o c a l i z a t i o ni n n u c l e a r , s t r u c t u r eo fp r o m o t e r , t r a n s c r i p t i o n f a c t o r si n v o l v e di n i n i t i a t i o n c o m p l e x a n d t r a n s c r i p t i n i t i a t i o n ， e l o n g a t i o n ，a n dt e r m i n a t i o n ；e m p h a t i c a l l yp r e s e n t sa ni n t r o d u c t i o no ft h ea s s o c i a t e d f a c t o r st h a ti n f l u e n c ei nt r a n s c r i p t i o na n dt h e i rc o n t r o li l lc e l l t h es e c o n d p a r tr e v i e w s t h es o l u t i o ns t r u c t u r ed e t e r m i n a t i o ni nb i o m o l e c u l a r n m r , e m p h a t i c a l l ys u m m a r i z i n g t h e t e c h n i q u e s i i l i s o t o p el a b e l i n gs t r a t e g i e s f o rp r o t e i ns a m p l eo fn m ra n di t s a p p l i c a t i o ni nd e t e r m i n ep r o t e i n ss t r u c t u r e i n c h a p t e rt w o ，w e h a v e c o m p a r a t i v e l ys t u d i e dt w oh m g b o xd o m a i n si nh u m a n 拍i u p s t r e a mb i n d i n gf a c t o r ( h u b f ) t h r o u g ha s e r i e so fb i o c h e m i c a la n dm o l e c u l a r b i o l o g i c a l m e t h o d s t h e s et w od o m a i n sw a ss u b c l o n e da n dh i g h l ye x p r e s s e di n e s c h e r i c h i a c o i l u s i n gi m m o b i l i z e dn i ”a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , 2 0 3 0m g o fb o t h r e c o m b i n a n tp r o t e i n sw i t ht h ep u r i t yg r e a t e rt h a n9 0 w a so b t a i n e df r o mi l i t e ro f b a c t e r i a lc u l t u r e t h r o u g hg e ls h i ra s s a ya n ds u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) a s s a y , t h ed n ab i n d i n gp r o p e r t yo f b o t hr e c o m b i n a n tp r o t e i n sh a v eb e e nc o m p a r e d a n da n a l y z e d o u rw o r kc o n c l u d e dt h a th u b fh m g b o x1s h o w sav e r ys t r o n g b i n d i n ga f f i n i t y t ob o t ht h e 4 - w a y d n a j u n c t i o n ( a n i n t e r m e d i a t ei nd n a r e c o m b i n a t i o n ) a n da15 - b pg c - r i c hr r n ag e n ec o r ep r o m o t e rf r a g m e n t ，b u th u b f h m gb o x5s h o w s p r e t t ym u c h w e a k e r b i n d i n ga f f i n i t yt ob o t h d n a i fo i l ec o u l di l l u s t r a t em o l e c u l a rb a s i so ft h e i rd n ab i n d i n gd i f f e r e n c e ，i tw o u l d s u r e l yp r o m o t eo u ru n d e r s t a n d i n go ft h i s s o r to fd n a b i n d i n gd o m a i n w ef i r s t s t u d i e dt h e i r s e c o n d a r ys t r u c t u r et h r o u g hc da n df t i r t h e s et w od o m a i n sa r e m a i n l yc o m p o s e do f 仪- h e l i x w h i c hi s s i m i l a rt oo t h e rk n o w n s t r u c t u r eh m gb o x d o m a i n s t h e nt h es o l u t i o ns t r u c t u x e so ft h e mw e r eo b t a i n e d b yh e t e r o n u c l e a r t h r e e d i m e n s i o n a l s p e c t r o s c o p y b o t hs t r u c t u r e s o fh u b fh m gb o x1a n dh u b f h m gb o x5a r ef o r m e db yi n t e r s e c t i o no ft h r e eh e l i c a la r m s ，w h i c hw e r ec o n n e c t e d b yf l e x i b l el o o p ，r e v e a l i n gac o m m o n l s h a p e df o l d ah y d r o p h o b i cc o r ea m o n g t h r e eh e l i c e s ，m a k i n gu po fa r o m a t i cr e s i d u e s ，i sf o r m e dt om a i n t a i nt h ef o l d t h e i r t e r t i a r ys t r u c t u r e sa r e s i m i l a rt oo t h e rk n o w n s t r u c t u r eh m gb o xm o t i f s ，s h o w i n g c o n s e r v a t i o ni n t e r t i a r ys t r u c t u r e a l t h o u g h t h e r ei s s i m i l a r i t y b e t w e e nt h et w o s t r u c t u r e s ，n e g a t i v ec h a r g e de l e c t r o s t a t i c s u r f a c e p o t e n t i a l i nt h ec o n c a v ef a c eo f m o l e c u l eo fh u b fb o x5e x h i b i t sg r e a td i f f e r e n c et ot h a to fh u b fb o x1a n do t h e r k n o w n s t r u c t u r eh m gb o x e sw i t hp o s i t i v e c h a r g e de l e c t r o s t a t i c s u r f a c e p o t e n t i a l d n a b i n d i n go c c u r r e di nt h ec o n c a v ef a c e b e s i d e s ，i np o s i t i o n st h a tc o r r e s p o n dt o i n t e r c a l a t i n gi n t od n a b a s ep a j r , t h e r ea r eh y d r o p h o b i cr e s i d u e si nh u b fh m gb o x1 a n do t h e rh m gb o x e sb u t p o l a r r e s i d u e si nh u b fh m gb o x5 t h e s ed i f f e r e n c e sm a y c o n t r i b u t et ol o s i n go f d n a b i n d i n ga b i l i t yo f b o x 5 第一章综述 第一部分由r n ap o l y m e r a s e i 控制的转录 在原核生物中，仅有一种r n a 聚合酶。所有的三种r n a ：m r n a ，r r n a 和t r n a 都是由它转录产生。但是在真核生物中，情况要复杂的多。在1 9 6 9 年， r o b e r tr o e d e r 和w i l l i a l lr u t l e r 发现有三种r n a 聚合酶存在于真核生物细胞中。 它们被分别命名为r n a 聚合酶i ，i i ，i i i 。其中r n a 聚合酶i i 负责信使r n a 的前体的转录：r n a 聚合酶i i i 负责t r n a 和5 sr n a 等的前体；而r n a 聚合 酶i 则负责蛋白质合成的工厂一核糖体的1 8 s ，5 8 s ，2 8 sr n a 前体的转录。 一个活跃的正在繁殖的真核细胞大约将它的3 5 6 0 的核转录能力花费在 生产1 8 s ，5 8 s ，2 8 s 核糖体r n a ( r r n a s ) 上( 1 ) 。这个过程是由r n a 聚合酶 i ( r n a p o l y m e r a s ei ) 控制的。另外，5 s r n a 和其它为核糖体生成所必需的小 的核r n a 大约花费核转录能力的1 0 2 0 。这样酵母组就要把它8 0 的转录 能力花费在转录机器的组装上；而在一个增殖的哺乳动物细胞中此项活动就要花 费大约5 0 的转录能力。由此可见，在这个事件上一个小小的扰动也会对细胞的 命运造成极大的影响。从一个细胞的分化到衰老，从细胞的快速增殖到细胞的限 养生长，这些过程都伴随着核糖体的生成，特别是r r n a 合成的调节( 2 ) 。从某 种意义上说，r r n a 基因的转录事件是细胞核的中心环节之一。 不象原核的r n a 聚合酶自身具有结合启动予的能力，真核生物的r n a 聚 合酶控制的转录需要很多转录因子的参与才能完成聚合酶与启动子的结合，转录 的起始和延伸以及终止这一系列的事件。在这篇综述中，我们将要具体的对由 r n a 聚合酶i 所控制的转录进行讨论。 1 r n a p o l y m e r a s el 控制的转录在核内的定位 一个早已被人熟知的事实便是由r n ap o l y m e r a s ei 控制的转录是被严格的 控制在细胞核的核仁区。打一个比方，核仁区可以被比作核糖体的加工工厂。 首先在核仁的纤维中心由p o l y m e r a s ei 合成r r n a ，然后在环绕核仁周围的颗粒 区被加工组装成核糖体( 3 ) 。相对于p o l y m e r a s ei 来说，p o l y m e r a s ei i 和i i i 的定 位并不严格。在h e l a 细胞中，我们可以发现在核质中大约有2 0 0 0 个p o l y m e r a s e i i i 的定位点( 4 ) ；p o l y m e r a s ei i 的定位区更加随意，不过仍然可以在h e l a 细 胞发现8 0 0 0 个p o l y m e r a s ei i 的活跃转录单位( 4 ) 。 2 r n a p o l y m e r a s ei 的亚单位 真核生物的r n a 聚合酶是一个由多种亚基组成的复合体，至少有1 2 亚单 位参与其中( 5 ) 。这1 2 个亚单位有些是为另外的两种聚合酶( p o l y m e r a s ei i 和 i i i ) 所共享的。例如在啤酒酵母( s c e r e v i s i a e ) ，其中5 个亚单位( a b c i o c t ， a b c l 0 d ，a b c l 4 5 ，a b c 2 3 ，a b c 2 7 ) ，在三种r n a 聚合酶分子的复合物中都含 有。另外，聚合酶i 和i i i 又有共同的因子。同样是在啤酒酵母( s c e r e v i s i a e ) ， a c l 9 和a c 4 0 这两个亚单位为二者所共有( 6 ) 。但是在p o l y m e r a s ei i 中并没 有发现这两个因子，而是分别由b 1 2 5 和b 4 4 这两个亚单位执行相似的功能 ( 7 - 9 ) 。这种共同亚单位的存在使得协同性的调节成为可能。它是细胞高效调控 转录的一个手段。 3 p o li 的启动子 在不同的物种中由p o li i 和i i i 组建转录机器具有广泛的兼容性。但是对于 p o li 来说，它的转录是严谨的，尽管不是绝对的物种专一性( 1 0 ，ii ) 。不同物 种之间r r n a 启动子的碱基序列的相似性是极其有限的( 1 2 1 4 ) 。然而从酵母到 人都由大致相似的启动子功能单位的结构框架构成。 许多重复的r r n a 基因通常头尾相连形成一条重复的串联的结构。在两个基 因之间的空隙区i g s ( i n t e r g e n i cs p a c e r ) ，启动子被安置在其间以进行转录调控( 图 1 - 1 - 1 ) 。在从转录起始位点( + 1 ) 至上游大约5 0b p 的位置存在一个称之为核心 启动予的区域( c o r ep r o m o t e r ) 。在许多物种中发现核心启动予是转录起始所必 需的( 1 2 - 1 5 ) 。在核心启动子中环绕+ l 的位置有一个被称为r l n r ( f i b o s o m a l i n i t i a t o r ) 的区域( 1 6 ) 。这个区域的碱基相对保守，富含t a ，类似于t a t a b o x 。 但是这个成分既不能结合t b p ( t a t ab i n d i n gp r o t e i n ) ，也无力调节转录的正确 起始。恰恰是核心启动子的剩余部分可以结合转录因子，以执行p o ! i 为核心的 起始转录复合物的组装。 图1 - 1 - 1g e n e t i co r g a m z a t i o no f1 o lit r a n s e r o p t i o nu n i t s ( a ) t h er r n ac o d i n gu n i t sa r e s e p a r a t e db yi n t e r g e n i cs p a c e r s ( b ) t h e1 g sc o n t a i n sas e r i e so f t e r m i n a t o r s ( t e r m ) ，e n h a n c e r s ，a s p a c e rp r o m o t e r ( s p xap r o x i m a lt e r m i n a t o r ( 盯xt h eu p s t r e a mc a a t r o le l e m e n t s ( u c e ) ，a n dt h e c o r ep r o m o t e r , w h i c hi n c l u d e st h er l m t h es i t e so f t r a m e r i p t i o ni n i t i a t i o n 鼬i n d i c a t e db yt sa n d t h eb e n da l r l o w s ( t h i sr 喀u r ei sa d a p t e df r o mn u c l e i ca d dr e s e a r c h 2 0 0 0 v o l2 8 1 2 8 3 - 1 2 9 8 ) 图1 - 1 2t w oe l e m e n t s ( u p a t r e a mc o n t r o le l e m e ma n dc o r ep r o m o t e r ) f i eh o u s e di nt h e h u m a n r r n a g e n e p r o m o t e r ( t h i s n g a r e i sa d o p t e d f r o mn u c l e i c a d dr e s e a r c h 2 0 0 0 v m 2 8 1 2 8 3 1 2 9 8 ) 除了核心启动子( c o r e p r o m o t e r ) 外，在许多物种中，另外一个重要的成分 u c e ( u p s t r e a mc o n t r o le l e m e n t ) 被发现对转录的起始也很重要。u c e 一般位于 转录起始位点( + 1 ) 上游1 5 0 - 2 0 0b p 的位置( 1 2 1 5 ) 。例如在人的r r n a 基因的 启动子上，u c e 是位于1 5 6 - - 1 0 7 之间( 图1 1 - 2 ) 。u c e 对转录有增强的功能， 但是很多情况下并非为转录的起始所绝对必需( 1 7 ，1 8 ) 。那些位于这两个结构 成分之间的碱基序列并不重要。但是这两个成分之间的空间距离非常关键。如果 在这个部位插入或者缺失5 1 5 个碱基，使得d n a 双螺旋正好多或者少了半个 螺旋的话，将会比少或多整数螺旋对转录造成的影响更大( 1 1 ，1 9 ) 。令人惊奇 的是，半个螺旋的改变竟然造成启动子的物种特异性的改变( i i ) 。 在u c e 的上游有一个近侧终止子p t ( p r o x i m a l t e r m i n a t o r ) 。近侧终止予p t 有很多重要的功能。它可以把一串r r n a 基因在核内组建成一个有序的结构单位 ( 2 0 ，2 1 ) ；可以保护下游启动子不受上游未脱落的聚合酶的破坏( 2 2 ，2 3 ) ；还 可以将启动子附近的染色体重新塑造以适应转录的需要( 2 4 ) 。近侧终止子p t 在增强转录的过程中具有重要的作用。在啤酒酵母中，p t 被安排在错误的方向 上，从而不能调节转录的终止。因此，它也不能起到保护启动子的作用。尽管如 此，它仍然可以起到结合终止因子和_ 束0 激转录的作用。 i g s 的剩余部分是由增强子( e n h a n c e r ) 组成，起到增强转录的作用( 2 5 2 7 ) 。 通常增强子是以多个重复的形式出现于于i g s 中。啤酒酵母是个例外，仅有一 个增强子的拷贝存在( 2 5 ，2 8 ，2 9 ) 。在许多多细胞动物中，i g s 通常还包括另 外一种功能启动予s p ( s p a c e rp r o m o t e r ) ( 3 0 3 5 ) 。s p 转录本的转录终止点在的 p t 下游，但是其功能未知。系统进化分析表明增强子( e n h a n c e r ) 是由间隙启 动子( s p a c e r p r o m o t e r ) 复制并加以裁剪而来( 3 6 ) 。 4 以p o li 为核心的起始转录复合的组装所涉及的转录因子 与p o li i 比较起来，p o li 转录所需要的转录因子要少得多。在很多系统中只 要p o li ( 可能附带1 - 2 个相关的因子) 加上1 2 个启动予结合蛋白就可以了。 另外的因子可以起到辅助这种转录的作用。在体内，细胞的快速繁殖需要高水平 r r n a 的合成，以组装核糖体来生产蛋白质。表1 - 1 1 是对功能上相联系的蛋白 因子的一个总结。 选择因子复合4 郧e l e c t i v 洳c o m p l e x ) - - 在蹰有生物中( 除了s 。c e r e v i s i a e ) ， 这种因子都是由t a t a 结合蛋白t b p ( t a t a b i n d i n g p r o t e i n ) ，外加3 q 个p o l i 特异性的蛋白因子t a f s ( t b p - a s s o c i a t e d f a c t o r s ) 组成( 3 7 4 3 ) 。在sc e 旭v 捃f 口p 中，t b p 与之的结合在细胞功能上的实现上是可能的，但这种结合并不牢靠。由 于这种因子和t b p 相关，因此很容易让人们把它和p o li i 和p o li i i 系统中的 4 综述 t f i i d 和t f i i i b 因子联系起来。它们都可以起到招募聚合酶p o l1 分子的功能。 这种复合物在人中被称为s l l ，在大鼠中称之为t i f 1 b ，而在x c n o p u s 被称为 r i b l ( 表1 - 1 1 ) 。在人，大鼠和酵母中都含有三个t a f s 。分子量大约为1 1 0 9 5 ， 6 8 6 3 ，4 8k d a ( 1 ，4 2 4 5 ) 。人和大鼠的t a f s 具有相似的分子量，而且序列上 非常相似。但是酵母的t a f s 的碱基序列上与其它哺乳动物有非常大的差异。在 a c a s t e l l a i i 中，t i f i b 含有4 个t a f s 外加t b p 蛋白。这些t a f s 的分子量分 别为1 4 5 ，9 9 ，9 6 和9 1k d a 。它们的分子量和上述的具有差别( 4 1 ) 。t a f s 因 子之间存在相互作用而且和t b p 蛋白相结合。一旦t b p 和t a f s 的复合物组装 起来，就能有效排斥p o li i 特异的t a f s 加入其中形成p o li - p o li i 杂和物( 4 3 ) 。 t b p 在各种生物中具有很高的同源性，它也为其它聚合酶( p o li i 和p o ll i d 所 使用。酵母的t b p 在体内可以替代人的t b p 发挥作用( 4 6 ) 。这也揭示t b p 的 非保守性的n 端并不为选择因子所必需。研究发现， 在p o li i 和p o li i i 转录的 过程中加入含t a t ab o x 的核苷酸序列，可以有效阻止转录的进行，但是p o li 可以抵抗这种影响( 4 0 ) 。这也从一方面说明在p o li 的转录过程中t b p 并不用 来结合r r n a 基因启动子。事实上，已经发现t a f 4 s 可以把t b p 的d n a 结合部 位给堵塞( 4 7 ) 。在酵母中，由p o li 所控制的基本水平的转录也无需t b p 存在。 这也表明，在p o l1 控制的转录系统中t b p 的功能实现是根本不同于p o li i 和p o l i i i 转录系统的。对a c a s t e l l a n i i 的转录复合物结构的深入研究发现，当t i f i b 因子与个倾斜的右手超螺旋d n a 相互缠绕的时候，其与四个相互衔接的d n a 小沟的发生紧密接触( 4 8 ) 。此时，其中的因子t a f 9 6 是同r l n r 成分存在相互作 用。这个作用可以支持很微弱的转录起始( 4 9 ) 。 表1 - 1 1 t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa s s o c i a t e dw i t hr r n ag e n et r a n s c r i p t i o n s e l e c t i v i t yc o m p l e xs l l ( h u m a n ，r a t ) r i b l ( x e n o p u s ) c f ( y e a s 0 t i f i b ( m o u s e ，a c a s t e l l a n i i ) u p s t r e a mb i n d i n gf a c t o r s u b f ( h u m a n ，m o u s er a t ，x e n o p u s ) u a f c e r e v i s i a e ，y e a s t ) t e r m i n a t i o nf a c t o r st t f - i ( m o u s e h a m a n ) r e b l p c e r e v i s i a e ) e n h a n c e rb i n d i n gf a c t o r s u b f ( h u m a n ，m o u s e ，r a t , x e n o p u s ) r e b l p 限c e r e v i s i a e ) 上嬲镏曾涵r 亍l 在人和x e n o p u s 中，转录的起始强烈地依赖于上游结合因子 u b f 的存在( 5 0 ，5 1 ) ，但是在其他生物中并无此种强依耐性( 5 2 ，5 3 ) 。从哺 乳动物中纯化的u b f 通常是以两种形式存在，分别称为u b f i 和u b f 2 ，这是蛋 白不同方式剪切的结果( 5 4 ，5 5 ) 。序列分析表明，在各种不同生物的u b f 中含 有4 6 个h m gb o x 这种结构域。其中在不同的剪切体u b f 2 的h m gb o x2 结构 域内有一段3 7 个氨基酸的缺失；n 端有一个大约包含1 0 0 个氨基酸的二聚体结 构域，使得在体内u b f 都是以二聚体的形式发挥功用；以及在c 端有一段富含 丝氨酸的酸性的尾巴，可以起到调节得作用( 5 6 ，5 7 ) 。从现在已知的同源的h m g b o x 结构域的溶液结构，我们知道h m gb o x 结构域是通过同d n a 的小沟相互 作用来调节基因转录的。h m gb o x 结构域可以结合d n a 并使之弯曲，自身结 合在这种弯曲的外表面上( 5 8 ) 。根据深入的足迹法的实验( 5 9 ) ，m o s s 认为通 过u b f 的二聚体结构，8 1 2 个h m gb o x 可以把段1 3 5 一1 6 0 碱基对的d n a 绕成一个成左手手性的环，并一次为基础形成所谓的增强小体的结构。u b f 可 以直接和选择因子s l l 作用，引导其到启动子上( 6 0 ，6 1 ) 。在人体内，u b f 是 通过它的酸性尾巴和s l l 因子的t a f 4 8 相互作用( 4 7 ) 。在酵母和c e r e v 括f 口e 中t 上游结合因子u a f ( u p s t r e a ma c t i v a t i n gf a c t o o 与以上的u b f 似乎并无联系。 它是由六个亚基组成的复合物( r r n s p ，r m 9 p ，r m l o p ，u a f 3 0 p ，组蛋白h 3a n d h 4 ) ( 6 2 ，6 3 ) 。组蛋白的存在使得类似与增强小体的d n a 的环化成为可能。如 果把u a f 敲除的话，并不影响酵母的生存能力，但是生长缓慢。缺失u a f 的酵 母或者p o li 转录被抑制的酵母可以由p o li i 来替代p o li 进行转录。奇怪的是， 此时酵母的生长速度更快了( 6 4 ，6 5 ) 。同样的现象也在别的生物中发现( 6 6 ， 6 7 ) 。这一转变估计在细胞的衰老过程中发挥积极的作用( 6 8 ) 。 增缉于彩动舳r n a 基因增强子可以起到增强转录的作用，但其精确的机 制目前还不清楚。在脊椎动物中，r r n a 增强子可以促进转录起始复合物的形成， 但对后续事件没有什么影响( 6 9 - 7 2 ) 。此外，r r n a 增强子可能并非是作为一个 顺式元件来调控启动子上的转录。d l l i l a w a y 等进行了这样一个试验：他们把r i 斟a 增强子和启动子连接起来，然后注入x e n o p u s 卵母细胞中：当注入以后，让r r n a 增强子和启动子很快的分离；结果转录的增强作用还能维持一天( 7 3 ) 。这个试 验表明，r r n a 增强子或许只是对转录起始复合物的形成提供某种组份。在脊椎 动物中，这种组份最可能是u b f 。它可以结合重复的r r n a 增强子序列( 3 5 ) 。 相应的是，在r r n a 启动子附近，结合到启动子上的u b f 和自由u b f 之间存在 快速的交换。这最终使得在启动子附近可以聚集高浓度的u b f 分子( 7 4 ) 。另外 的佐证在于发现，当r r n a 增强子距离启动子较远，或者以反式元件存在的时候， 它就可以竞争性结合u b f 从而抑制转录( 6 9 ) 。然而，在x e n o p u s 中，体外试验 表明r r n a 增强子并非起到传递u b f 的作用。这是因为u b f 的剪切异构体u b f 2 可以结合到r r n a 增强子上增强转录。但是u b f 2 是不能代替u b f l 在转录起始 中发挥作用的( 6 1 ) 。由此，作者认为r i 州a 增强子也许通过结合u b f ，依靠蛋 白相互作用征募前述的选择因子s l l 或者r i b l 。单拷贝的r r n a 增强子存在于 酵母和s c e r