（物理化学专业论文）青霉素酰化酶性质及应用研究.pdf

摘要 本论文研究了有机溶剂、温度、p h 值对工业上广泛应用的青霉素酰化酶活 性的影响，优化反应条件，如反应介质、温度、p h 值、底物浓度等因素，研究 了青霉素酰化酶在催化合成阿莫西林中的应用。主要进行了如下工作： 1 根据l o g p 规律筛选出1 2 种有机溶剂，考察了它们对青霉素酰化酶活性的影 响。在p h 值等于7 的缓冲溶液和有机溶剂各占5 0 ( v v ) 的体系中，通过 测定酶在此体系中活性的变化，选出对酶活性影响较小的有机溶剂。发现丙 三醇、乙二醇、二甲基亚砜等有机溶剂对酶活性影响较小；研究了温度及p h 值对青霉素酰化酶活性及稳定性的影响，发现在2 0 5 5 的范围内，随着 温度升高，酶的活力增大，但酶的稳定性逐渐降低，综合得出温度为4 0 时 酶的活性及稳定性较好；p h 值在6 8 的范围内变化时，酶的活力先升高后下 降，p h 值等于7 5 时，活力达到最大，而酶稳定性却随着p h 值增大而下降， 综合得出p h 值为6 5 或7 时酶的活性及稳定性较好。 2 从对羟基苯甘氨酸邓钾盐出发制备了对羟基苯甘氨酸甲酯q o h p g m e ) ，红 外和熔点分析表明，制备的产物纯度较高。测定了对羟基苯甘氨酸甲酯 ( p o h p g m e ) 在7 _ , - - 醇，1 ，4 丁二醇，环己烷，正丁醇，丙三醇，叔丁醇等几 种溶剂中的表观溶解度，发现对羟基苯甘氨酸甲酯( p o h p g m e ) 在正丁醇， 乙二醇等溶剂中的表观溶解度较好，底物的溶解性好在酶催化合成p 一内酰胺 抗生素反应中有利于向合成方向进行。 3 优化了青霉素酰化酶催化合成阿莫西林的反应条件，分别考察了温度、p h 值、 底物浓度以及不同反应介质时，6 - a p a 的转化率和对羟基苯甘氨酸甲酯 ( p o h p g m e ) 的水解率，得出较理想的反应条件为：乙二醇缓冲溶液体系、 温度为2 0 、溶液p h 值为6 5 、底物6 - a p a 浓度为7 5m m o l l 、原料浓度 配比：6 - a p a ：p o h p g m e 为1 ：2 。 关键词：青霉素酰化酶有机溶剂活性稳定性合成 a b s t r a c t t h ee f f e c to fo r g a n i cs o l v e n t , t e m p e r a t u r ea n dp hv a l u eo nt h ea c t i v i t yo ft h e i n d u s t r i a lw i d e l yu s e dp e n i c i l l i nga c y l a s e ( p g a ) w e r es t u d i e di n t h i st h e s i s t h e r e a c t i o nc o n d i t i o n s ，i n c l u d i n gt h er e a c t i o nm e d i u m , t e m p e r a t u r e ，p hv a l u ea n dt h e c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e ，w e r eo p t i m i z e da n du s e di nt h es y n t h e s i so fa m o x i c i l l i o n w i t hp g aa st h ec a t a l y t i s t t h ef o l l o w i n gw o r k sh a v eb e e nd o n e ： 1 s o m eo r g a n i cs o l v e n t sw e r es e l e c t e da c c o r d i n gt ot h el a wo fl o 妒f o rt h ef u r t h e r i n v e s t i g a t i o na b o u tt h e i re f f e c to nt h ea c t i v i t yo fp g a t h ep r e f e r a b l eo r g a n i cs o l v e n t w h i c hh a ss l i 曲t l ye f f e c to nt h ea c t i v i t yo fp g aw a s c h o s e no u tb ym o n i t o r i n gt h e c h a n g e o ft h e a c t i v i t y o fp g a g l y c e r i n ，e t h y l e n e g l y c o l a n d d i m e t h y l s u l p h o x i d e ( d m s o ) s h o w e ds l i 曲t l ye f f e c to nt h ea c t i v i t yo fp g a t h ee f f e c t so f t e m p e r a t u r ea n dp hv a l u eo nt h ea c t i v i t ya n ds t a b i l i t yo fp g a w e r ea l s oi n v e s t i g a t e d i tw a sf o u n dt h a tt h ea c t i v i t yo fp g ai n c r e a s e da n dt h es t a b i l i t yo fp g ad e c r e a s e da s t h et e m p e r a t u r ei n c r e a s e df r o m2 0 ct o5 5 。c t h em o s ts u i t a b l et e m p e r a t u r ew a s 4 0 。c t h ea c t i v i t yo fp g ai n c r e a s e df i r s t l ya n dt h e nd e c r e a s e dw h e nt h ep hc h a n g e d f i o m6t o8 h o w e v e r , t h es t a b i l i t yo fp g ad e c r e a s e da st h ep hv a l u ei n c r e a s i n g t h e a c t i v i t ya n ds t a b i l i t yo fp g a r e a c h e dt ot h eb e s tp o i n ta tp h6 5o r7 2 t h em e t h y lp - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n a t eq - o h p g m e ) w a ss y n t h e s i z e df r o mt h e p - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n a t ed a n es a l t t h ei ra n dm e l t i n gp o i n ta n a l y s i sw e r eu s e dt o c h a r a c t e r i z e dt h es y n t h e s i z e dp - o h p g m e t h ea p p a r e n ts o l u b i l i t yo fp - o h p g m e i ns o m es o l v e n t sw a sm e a s u r e d t h en b u t y la l c o h o la n de t h y l e n eg l y c o la r eb e r e r s o l v e n t sf o rp - o h p g m e t h eb e r e rs o l u b i l i t yo fs u b s t r a t ei s p r o p i t i o u st o t h e s y n t h e s i so fi - l a c t a ma n t i b i o t i c 3 t h er e a c t i o nc o n d i t i o n si nt h es y n t h e s i so fa m o x i c i l l i o nu s i n gp g aa sc a t a l y s tw e r e o p t i m i z e d t h ec o n v e r s i o nr a t i oo f6 - a p aa n dh y d r o l y t i cr a t i oo fp - o h - p g m ea r e i n v e s t i g a t e du n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s a sar e s u l t ，t h ef a v o r a b l er e a c t i o nc o n d i t i o n s i n c l u d i n gt h er e a c t i o nm e d i u m , t e m p e r a t u r e ，p hv a l u eo fs o l u t i o n ，c o n c e n t r a t i o no f 6 - a p a ，t h er a t i oo f6 - a p aa n dp - o h - p g m ea r ee t h y l e n eg l y c o l - b u f f e rs o l u t i o n , 2 0 c ，6 5 ，7 5m m o l l ，1 ：2 ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：p e n i c i l l i nga c y l a s e ( p g a ) ，o r g a n i cs o l v e n t ，a c t i v i t y , s t a b i l i t y , s y n t h e s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨洼盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：殍查给签字日期：如。7 年p 6 月j 王日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤姿态堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫鲞盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：译杏泠 导师签名： 歹弓窿 签字日期：沙。7 年o i 月f 日签字日期：& 口少年石月，2 日 第一章文献综述 1 1 青霉素酰化酶简介 第一章文献综述 1 1 1 青霉素酰化酶的来源及分类 青霉素酰化酶最初从黄青霉( p e n i c i l l i u m s h r y s o g e n u m ) q 1 7 6 q p 发现t 1 1 ，自 然界中许多放线菌，细菌，真菌，酵母菌等也可产生青霉素酰化酶2 】【3 】。但该酶 的产生菌主要是杆菌及单孢菌【4 】，如：巨大芽孢杆菌、无色杆菌、醋酸杆菌、大 肠杆菌、粘性节杆菌、巴氏醋酸杆菌、混浊醋杆菌、假单孢菌、产黑假单孢菌、 坏死单孢菌等。尽管这些产生菌所产生的酶均能催化相同的反应，但不同来源的 酶其底物专一性明显不同，活性中心也不同。有人对此进行了系统的总结，并将 青霉素g 钾盐裂解过程中起关键作用的酶统一定义为青霉素酰化酶( p e n i c i l l i n a c y l a s e ，e c3 5 1 1 1 ) ，同时根据它们各自催化水解反应时对底物的优先性不同， 又将它们分为主要的三大类5 】【6 1 ： 1 青霉素g 酰化酶( p g a ) ，主要由细菌产生，属于球蛋白，分子量较大，由2 个亚基组成：分子量为1 9 5 0 0 的含有侧链结合位点的亚基和分子量为6 0 0 0 0 的含 有催化位点的亚基【7 1 ；等电点为6 5 - 6 7 ，大多数属于胞内酶，优先水解青霉素g ， 对底物专一性不太严格，属非专一性催化酶： 2 青霉素v 酰化酶( p v a ) ，主要存在于霉菌、放线菌及酵母菌中，对底物专一 性很高，仅水解青霉素v ，都属于胞外酶； 3 苄基青霉素酰化酶( a p c a ) ，主要存在于黑色假单孢杆菌和卵形假单孢杆菌 中，专一性地水解氨苄基青霉素。 目前在国外主要使用大肠杆菌产生的青霉素酰化酶，国内主要使用巨大芽孢 杆菌产生的青霉素酰化酶。与大肠杆菌胞内酶不同，巨大芽孢为胞外酶，易于分 离纯化。 1 1 2 青霉素酰化酶的结构及催化机制 青霉素酰化酶是一种酰胺键水解酶，其系统名是青霉素氨基水解酶，一般沿 第一章文献综述 用习惯名，如青霉素酰化酶、青霉素氨基酰基转移酶。从活体中刚提取的青霉 素g 酰化酶是一条无活性的前体蛋白，包括信号肽、a 亚基、连接肚和b 亚基， 经过后加工处理，去除信号肽和连接肽得到有活性的蛋白酶p g a 。该酶由a ， b 两个亚基组成：两亚基通过氨键作用结合在一起。单独的a 和b 亚基均不具有酶 活性，只有当两者以适当的形式结合后才具有活性。分子量2 0 - - 2 3k d a 的a 亚基 含有侧链结合的位点，它的1 6 8 1 9 1 位的氨基酸残基与青霉素o 的侧链相结合， 决定酶的底物专一性：分于量6 5 9 0k d a 的b 亚基的n 端s e t 作为活性中心含 有催化位点以及与催化有关的残基。 p g a 是一种n 端水解酶。这种酶都有共同的结构特征。它们都包含两层b 片， 中间夹着a 螺旋链嘲( 图卜1 ) 。在催化底物的合成和水解反应中它们通常作为亲 核体存在，催化裂解多肚产生一个a 链和一个b 链且具有自身催化活性，所产 生的b 链的n 端残基通常是丝氨酸、苏氨酸或者半胱氨酸唧。 圈1 1 柬自大肠杆菌的青霉豢酰化酶( p g a ) 的结构 f i g u r e l - 1t h e f o l do f e s c h e r i c h i ac o l ip i c i l l i n ga c y l a s e p g a 催化水解青霉素g 时，亲核的丝氨酸攻击母核6 氨基青霉烷酸 ( 6 - a m i n o p e n i c i l l i n i ca c i d ，以下简称6 - a p a ) 和苯乙酸侧链之间的酰胺键羰基碳原 子，生成6 - a p a 并且形成一种酰化酶。然后酰化酶被水解，生成苯乙酸和一个新 的活化位点。对苯乙酰侧链以及涉及到对羟基苯甘氨酸降解的基因编码酶定位的 研究表明，p g a 能使苯乙酰混合物发牛转化呻1 。研究显示三维立体状的酶对苯 一 第一章文献综述 乙酰及其衍生物有明确的结合位点，同时该酶也能结合其它的化合物，因为它能 对相关侧链移动尤其是a a r 9 1 4 5 和a p h e l 4 6 构象发生转变起到作用。p g a 也能用 来在苄基内酰胺环上连接侧链，生成一种新的衍生物。该过程中，酶首先被该酰 基侧链的酯或氨酰基化，然后被苄基内酰胺氨解，产生一个新的半合成抗生素。 酰化酶也能与一个水分子反应而发生水解，同样抗生素产品也能被酰化酶水解， 因此，目前很多研究都致力于降低这些水解反应来提高抗生素产量。 1 1 3 青霉素酰化酶的特性 1 1 3 1p h 值稳定性 酶同其它蛋白质一样，分子中有许多极性基团。在不同的酸碱环境中，这些 基团的游离状态不同，所带电荷也不同。只有当酶蛋白处于一定的游离状态下， 酶才能与底物结合。许多底物或辅酶也具有离子特性( 如a t p ，n a d + ，氨基酸 等) ，p h 值的变化也影响它们的游离状态，同样可影响与酶的结合。因此，溶 液的p h 值对酶活性影响很大。若其他条件不变，酶只有在一定的p h 值范围内才 能表现催化活性。且在某一p h 值时，酶的催化活性最大，此p h 值成为酶作用的 最适p h 值。各种酶的最适p h 值不同，但多数在中性、弱酸性、弱碱性范围内。 青霉素酰化酶的p h 值稳定性与酶分子问的化学交联有关。k a z a n 1 1 】等以二甲 基己二酸( d m a ) 作交联剂，发现p h 值为7 0 和p h 值为8 0 时酶最稳定。另外也 有报道，多羟基化合物( p h c ) 如葡萄糖、蔗糖和p e g 对p h 值稳定性也有一定影响， 并且蔗糖、p e g4 0 0 和p e g4 0 0 0 n - 以使p g a 的p h 值稳定性明显提耐1 2 1 。 1 1 3 2 热稳定性 、 热稳定性是衡量酶的工业用途大小的重要参数之一。对于大多数反应而言， 升高温度有利于提高反应速度，保持系统热力学平衡，增大反应物溶解度和降低 反应介质的粘度，但酶催化反应不可忽略酶不耐高温易失活的特性。研究表明， 青霉素酰化酶( p a ) 的热稳定性与其在水中的构象互变性有关，这种互变性又 与游离水分子的数量有关，所以可以通过降低酶分子周围游离水分子的量来提高 其热稳定性。当前人们已经研究了许多提高p a 热稳定性的方法，一般通过加入 稳定剂来实现，如加入多元醇、聚乙二醇、中性盐、清蛋白或其它蛋白质、硫代 乙酸还原剂和多羟基糖等。 d i l e k 等研究了葡聚糖对大肠杆菌产生的p g a 热稳定性的影响，结果表明 3 第一章文献综述 分子量分别为1 1 5k d 、3 7 7k d 和7 1k d 的葡聚糖的最适宜增稳浓度分别是5 0 、 2 0 和7 5c c 。其中5 0 时，加入1 1 5k d 葡聚糖后p a 稳定性可提高1 0 0 倍。a z e v e d o 掣1 4 1 研究了盐、醇、糖等多种物质对酶热稳定性的影响，发现1 5 0g l f 拘( n m ) 2 s 0 4 或n a 2 s 0 4 的增稳效果最好。 1 1 4 青霉素酰化酶的固定化 1 1 4 1 固定化酶的优点 作为生物催化剂，酶对周围环境较为敏感，活性、稳定性容易发生改变。通 常通过物理或化学方法将酶包埋或连接到载体上，制成固定化酶以提高酶的活性 和稳定性。 固定化酶过去曾用过固相酶、水不溶性酶、不溶酶、固着酶等名称。1 9 7 1 年，第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”( i m m o b i l i z e de l l z y m e ) 的名称，用以表示“物理限制或定位在特定的空间区域内，保存了催化活性并可 重复、连续使用的酶”。固定化酶通常具有很高活性和比活力，可以耐受杂质的 污染并有较长的使用寿命，正是固定化酶的这种特性，才使许多实验室酶催化反 应实现工业化生产成为可能。众多实验表明固定化酶与游离酶相比具有以下优 点： ( 1 ) 固定化酶可以反复使用，大多情况下，稳定性较高，单位酶的生产力高； ( 2 ) 固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，使产率产品质量提高； ( 3 ) 固定化酶反应时，条件容易控制，易于实现自动化生产； 游离酶经固定化后引起酶性质的改变，可能原因有以下几种：( 1 ) 酶分子构 象的改变；( 2 ) 微环境的影响；( 3 ) 底物在载体和溶液中存在着分配效应；( 4 ) 扩散 效应。 1 1 4 2 青霉素酰化酶固定化的方法 制备固定化酶的方法主要有吸附法、共价结合法、交联法、微生物包埋法等， 不同的固定化方法、不同载体对酶性能的影响是不同的。 吸附法是利用载体表面与酶分子表面问的次级键相互作用而达到固定l = i 的 的方法，又可以分为物理吸附和离子结合法。物理吸附法是最古老的固定化方法。 c h a n h 锄【1 5 】等利用硅藻土作为吸附载体对p g a 进行固定，并对其动力学反应进行 了研究，发现具有较高的回收率。离子结合法是指酶蛋白与载体通过离子键结合， 4 第一章文献综述 将酶固定到具有离子活性基团的非水溶性载体上的一种方法。 共价结合法是在酶的非活性基团与载体的功能基团之间形成稳定的共价键， 来使酶固定化到载体上。可与载体结合的酶的功能团有氨基、羟基、羧基、酚基 等。韩辉等【1 6 】将巨大芽胞杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键结合到聚合物载体 e u p e r g i tc 颗粒的环氧基团上，制成的颗粒状固定化青霉素酰化酶表观活力达 1 4 0 0 眺左右，成功地获得了高活力的固定化青霉素酰化酶。用这种酶水解青霉 素的最适p h 值为8 0 ，最高操作温度可达到5 5 。近年来己发展了很多廉价的载 体材料，通过许多方法活化载体获得能与酶结合的反应基团。 交联法即是利用双功能或多功能试剂在酶分子与载体间进行交联反应，通过 形成共价键制备固定化酶的方法。鲜海军掣1 。7 】用酸部分水解丙烯腈纤维为载体， 以戊二醛为交联剂制备了固定化的胞外青霉素g 酰化酶。这种固定化酶的活力达 到2 3 0 0i u g ，可以将浓度为2 5 1 2 5 的青霉素g 钾盐水解9 8 以上，其在 室温中的半衰期长达1 3 0 天。 包埋法是指将酶包埋于聚合物中的固定化方法，主要有以下几种类型：胶格 包埋、微囊包埋和脂质包埋。用聚丙烯酰胺包埋青霉素g 酰化酣侣】，所得的固定 化酶对头孢菌素g 的最适p h 值高达9 0 ，最适温度为5 0 。固定化酶的p h 值稳 定性和热稳定性皆优于游离酶。可以应用于许多酶、微生物或细胞器的固定化。 徐冠珠等将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键连接到醋酸纤维素载体 上，制成的固定化青霉素酰化酶的宏观活力达2 0 0 0i u 左右( p d a b 法) 。水解 1 0 ( w v ) 的青霉素g 钾盐溶液，使用3 0 批，保留活力7 0 以上【1 9 】。 另外，也有人用氧化铝吸附法来固定青霉素酰化酶，这种方法原料廉价易得， 固定方法简单，但所得固定化酶容易在高离子强度和高p h 值下解吸，造成固定 化酶活力下降【2 0 1 。为此石家骥等在用吸附法制备固定化酶后，进一步用戊二醛交 联，所得固定化酶可以耐高离子强度和高p h 值洗涤，固定化酶水解青霉素g 的活 力也高于吸附法固定化酶 2 1 1 。用聚丙烯腈作载体的丝状固定化青霉素酰化酶也可 以克服氧化铝的上述缺点【2 2 1 。 酶与载体的结合方式由载体材料和酶的特性共同决定。表1 1 列出了几种主 要固定化方法的优缺点。 第一章文献综述 表1 1 酶的几种固定化方法的优缺点 t a b l el - 1a d v a n t a g ea n dd i s a d v a n t a g eo fs o m ei m m o b i l i z a t i o nm 劬o d so fe n z y m e 1 2 青霉素酰化酶的应用 1 2 1 在催化水解中的应用 6 氨基青霉烷酸( 6 a p a ) 、7 氨基3 氯头孢烷酸( 7 a c c a ) 、7 氨基头孢 霉烷酸( 7 - a c a ) 以及7 氨基3 去乙酰氧基头孢烷酸( 7 a d c a ) 是半合成p 内 酰胺类抗生素的关键中问体，它们最初主要通过化学法进行生产，但整个过程非 常复杂，涉及到高温、高压以及有毒试剂如吡啶、五氯化磷和亚硝酰氯的使用等 问趔2 3 】【2 4 】，酶法水解工艺反应条件十分温和，不涉及高温、高压、有毒试剂， 显示了很好地发展前景，同时这一过程还不涉及底物侧链羧基的保护过程。 利用青霉素酰化酶对苯乙酰基专一水解的特性，可实现b 内酰胺母核结构的 6 第一章文献综述 生产。b 内酰胺母核生产遇到的主要问题是反应过程中p h 值的控制，即水解产物 之一苯乙酸在反应体系中的去除问题。生产过程中，水解产物苯乙酸可使反应体 系p h 值下降，为维持体系处于酶活力的最适p h 值，需要不断的加碱来调节。苯 乙酸作为酶反应的底物竞争性抑制剂，使水解反应不能进行彻底，通过电渗析工 艺在实际工业生产中己经很好地解决了这一问趔2 5 1 。 1 2 2 在合成p 内酰胺类抗生素中的应用 半合成p 内酰胺抗生素，包括青霉素类及头孢菌素类，具有抗菌谱广、毒性 低、耐b 内酰胺酶等优点。目前，传统工艺中，此类产品主要通过化学法进行生 产。近年来，随着“绿色化学的发展”和人们环保意识的增强，利用生物酶法合成 抗生素的工艺发展较为迅速，品种、产量均不断增多。与化学工艺相比，酶法合 成的优势主要为反应条件温和，易受影响的活性基团不需要保护等。6 - a p a 、 7 - a c a 和7 - a d c a 的许多酰化衍生物均可用酶法合成 2 6 】【2 7 】。 1 2 3 在对映体拆分中的应用 青霉素酰化酶对苯乙酰基团的高度选择性，不仅可催化b 内酰胺环上的苯乙 酰基团的解离，同时还可以催化苯乙酰基团从其它胺、醇或肽链上水解离去【2 8 】。 利用其对映体选择特异性可以将青霉素酰化酶广泛应用于氨基酸以及某些高级 醇的制备过程。医药生产工业中，利用青霉素酰化酶进行外消旋体拆分以及不对 称合成更显重型2 9 1 。青霉素酰化酶具有广泛的底物特性及高度的对映体立体选择 性，将两者结合起来，既可用于许多单一构型光学异构体药物的生产。通常药用 产品的光学异构体生产都是通过不对称合成或非对映体结晶工艺来进行，工艺路 线长，产率低，不能满足大规模生产的要求。相反，青霉素酰化酶酶法拆分技术 可大规模高产率得到光学纯度很好的产品【3 0 】【3 1 】。 1 2 4 在多肽合成中的应用 在多肽合成中，需要对某些基团进行保护，选择保护基团则需要根据脱保护 的具体条件来进行，对酸、碱、溶剂和温度敏感的分子，保护基团的选择是很有 限的。甲酰基常被用作氨基的保护基，但是脱酰基需在强酸的条件下进行，使该 保护基的使用受到限制。青霉素酰化酶可以较温和地水解苯乙酰衍生物，因此， 在多肽的合成中可以利用苯乙酰衍生物代替甲酰基来保护氨基基团，再利用青霉 7 第一章文献综述 素酰化酶来脱出保护基。目前，该方法已被用于一些活性多肽的制备过程，如天 冬氨酸苯甲氨酸甲酯、胰岛素、抗利尿激素和许多其它多肽的制备【j 朋。青霉素 酰化酶的水解速度与多肽的构型、溶解度和组成多肽的氨基酸的种类有关。研究 表明，被乙酰化的氨基酸只有l 构型才能作为青霉素酰化酶的底物，因此青霉素 酰化酶可被用来特异性水解l 异构体以制备d 型氨基酸。青霉素酰化酶的水解行 为并不限于苯乙酰胺，对于苯乙酰酯也可以催化水解。 1 2 5 在去除保护基团方面的应用 寡核苷酸合成过程中，为防止发生副反应，碱基上的氨基必须全部加以保护。 如果采用一般的酰基作为氨基保护基，反应终了需要在强碱性条件下去除保护 基，可能会影响到产物的结构和性质。此时，可将氨基酰化为苯乙酰胺，反应结 束后，利用青霉素酰化酶在温和的条件下水解去除苯乙酰这一保护基团【3 3 】。 青霉素酰化酶可水解与半胱氨酸的巯基基团相结合的苯乙酰胺，从而释放其 巯基基团。许多有机合成反应要求用苯乙酰胺保护巯基，这样，利用青霉素酰化 酶的水解能力可在反应结束后释放巯基 3 4 1 。 1 3 酶法合成b 内酰胺类抗生素的一般性问题 青霉素酰化酶有上述多种应用，目前许多仍处于尝试阶段，研究相对成熟的 只有青霉素酰化酶催化水解和半合成抗生素。催化水解已经取得初步进展并用于 工业生产，取得了显著的成绩。半合成1 3 内酰胺抗生素将是2 l 世纪酶法合成发展 的必然趋势，成为研究的主题。因此，目前的研究主要倾向于应用于半合成青霉 素和头孢菌素类的工业生产中，可以催化制备高效、广谱、适用于不同用途的新 型p 内酰胺抗生素。该酶一方面可以催化青霉素或头孢霉素水解，得到半合成抗 生素的重要中间体6 氨基青霉烷酸( 6 a p a ) 和7 氨基头孢霉烷酸( 7 a c a ) ；另一方 面可以催化酰化反应由6 a p a 合成新型青霉素或由7 a c a 合成新型头孢霉素。半 合成抗生素是通过酶法或化学法修饰原抗生素的结构，改进天然抗生素的性能， 包括克服耐药性、增强抗菌活性、降低药物的毒副作用、扩展抗菌谱、提高稳定 性等。但酶法合成过程尚有许多问题导致产率不高，酶使用率较低，成本较高等。 首先，酶作为一种生物催化剂具有不稳定的性能，合成反应环境必须保证其 性能良好，酶活性高，可连续使用等。另外，合成反应主要是通过对反应体系的 8 第一章文献综述 选择，温度的控制，p h 值的调配，侧链与母核的浓度及配比的选择使反应得以 优化。因而，目前主要解决的问题是提高催化剂在合成环境中的稳定性，在此前 提下通过优化反应条件提高反应转化率。许多研究工作都一直在寻求一个比较经 济合理的方法来开发利用这一酶催化合成反应。 1 3 1 酶促合成反应控制策略 1 3 1 1 热力学控制合成策略 p 内酰胺抗生素半合成主要是指酰胺键的缩合，合成控制策略主要有热力学 策略和动力学控制策略。人们认为在均一的有机相水共溶体系下，采用热力学 平衡来控制b 内酰胺抗生素的合成是最简单和行之有效的策略。如图l 一2 所示。 s o h 为酰基供体，n h 为抗生素母核，s n 为所合成的抗生素。热力学平衡控制合 成反应一般在酸性条件下进行，且这反应过程是一可逆过程。 s o h + 瑚石兰p g a刚+ h o 图1 2 平衡控制的抗生素合成方式 f i g u r ei - 2e q u i l i b r i u m - c o n t r o l l e ds y n t h e s i so fa n t i b i o t i c s 从热力学的角度看来，均相中有机溶剂的存在将会提高反应的合成效率。这 主要是因为有机溶剂可以降低水活度以及改变底物的离子化常数，可以提高非离 子形式的比例，有利于反应向正向进行。在有机共溶体系下进行b 内酰胺抗生素 的合成主要有以下优点： ( 1 ) 作为酰基供体的化合物不需要活化即可进行反应； ( 2 ) 由于羰基和氨基在此条件下的解离常数( p k a ) 相差不大，有机溶剂有效地抑 制了羧基和氨基的解离，使它们大多呈现一种状态，相当于增加了物质的有 效浓度，故在中等浓度的有机溶剂中即能获得较高的转化率； ( 3 ) 可以通过调整反应物中廉价组分的比例而使成本较高的组分( 如抗生素母 核) 的转化率达到较高水平；热力学控制的反应不存在侧链的水解问题，增 加一种较便宜组分的比例，必然会使反应向需要的方向进行，从而获得较高 的效益； ( 4 ) 后期纯化较为简单。 但有机溶剂的使用也可能带来负面影响，如可能影响到酶的活性和稳定性。 不同种类的有机溶剂，对酶的影响的差别较大。因此，选择适当的有机溶剂和改 9 第一章文献综述 善酶在共溶体系下的稳定性就成为热力学控制合成中最关键的两个问题。同时， 热力学平衡控制过程中存在的另一个问题是，底物苯甘氨酸在催化体系中保持非 离子化形式较为困难，底物在合成体系中大量以离子化形式存在，使得底物与酶 活性中心有效结合的概率下降，对反应不利。正因如此，关于热力学控制合成过 程的文献报导较少。 1 3 1 2 动力学控制合成策略 与热力学控制相比，p 内酰胺抗生素合成的动力学控制则显得复杂得多。合 成的效率与图1 3 所示的一系列反应有关。反应主要有：( 1 ) b 内酰胺抗生素的合 成；( 2 ) 活化酰基供体的水解反应；( 3 ) 所合成的抗生素的水解反应。在动力学 控制下要获得高的转化率，首先要将酰基供体活化成酶的最适底物形式，如酰胺、 甲酯或酸酐。这些酰基供体在酶催化反应中，与酶结合生成不稳定的酶底物复 合物，该复合物与另一底物反应生成产物，但是同时它也会与水反应，使酰基供 体发生水解。己生成的抗生素也可再发生水解反应，这必然会对转化率产生重要 影响。 回 o 时w 图1 - 3 动力学控制的合成( 选择) 模式 f i g u r e1 - 3t h ep a t t e r no fd y n a m i c s c o n t r o l l e ds y n t h e s i s 与热力学相比，动力学控制对酶的催化特性要求更高。源于不同菌种的青霉 素酰化酶在催化上述反应时催化效率存在较大差异。因此，选择恰当来源的酶也 成为重要因素。对某一特定抗生素最合适的酶可能并不适合合成其他类型的抗生 素。 1 3 2 反应体系的选择 合成策略选择上，多数文献均报道采用动力学策略来控制合成p 一内酰胺抗生 1 0 第一章文献综述 素地合成过程。研究的关键在于如何调整青霉素酰化酶同时具有的三种催化活力 的相互关系，以及如何除去对催化剂催化活力有抑制作用的物质。为此，许多研 究工作对不同体系中b 内酰胺抗生素的合成效果进行了详细的研究。 s h a w 掣”】系统考察了缓冲溶液体系中p h 值，温度、底物浓度以及底物添加 量的配比对动力学控制的头孢噻吩合成得率的影响。实验发现，底物2 噻吩乙酰 胺过量存在时，母核7 - a c a 转化率可得到大幅度提高，但继续提高侧链的量， 因副反应加剧，转化率无明显提高。有学者报道了在水有机共溶体系中热力学 控制合成头孢噻吩的研究情况【3 6 】，目的在于通过添加有机共溶剂和控制合成过 程，来降低合成体系的水活度和催化剂水解底物和所合成产物的活力，从而使反 应的平衡向合成的方向进行。但其缺点为，此体系中催化剂的稳定较差，主要是 有机溶剂易使生物催化剂变性失活。 1 3 3 底物形式的影响 青霉素酰化酶催化的酰化反应一般在偏酸性条件下进行。影响反应效果的因 素主要有酰化反应不能彻底进行、酰基供体的溶解性差、未转化的试剂的再循环 利用等，在一定程度限制了这一酶促合成反应的实际应用。为此，许多研究都着 眼于寻找比较经济有效的方法来将此反应过程向工业化生产推进。动力学平衡控 制下的合成反应要获得较高的转化率，首先必须将酰基供体活化为酰胺或酸酐的 形式，因为这样的酰基供体可在微酸环境中维持较高比例的非解离形式，而非解 离状态的底物是与酶活性中心进行有效结合的底物形式，当底物分子维持较高的 非解离程度时，可提高有效四面体中间物形成的数量，从而加快反应的速度以及 提高反应产物的收率。另一方面，已合成的抗生素发生水解反应也是合成反应产 率较低的另一个重要原因。这往往可通过加入有机共溶剂以改变酶分子周同的水 活度来加以调节。聚乙二醇、甲醇、山梨醇、d m s o 、丙三醇和d m f 为最常使用 的有机共溶剂。此外，对溶解度较低的产物，以底物的悬浊液参加酶反应也可以 提高底物转化率【3 7 | 。 1 3 4 催化剂形式的影响 应用交联、吸附、共价和包埋等方法使生物催化剂和固定化载体结合起来， 形成固定化酶，可在一定程度上提高生物催化剂的半衰期，同时利于催化剂重复 利用及后续产品的分离纯化。酶固定化以后便处于固相载体上和或固相载体内， 第一章文献综述 当进行反应时，其催化环境由游离酶反应时的均相体系变为固一液两相体系。这 样，固定化酶的催化性能和游离酶相比就有所差异，产生这些区别的因素主要有： ( 1 ) 酶在固定化过程中被修饰，从而在一定程度上影响其空问构象或空间结构， 甚至影响其活性中心构象； ( 2 ) 固定化酶进行催化作用的固液两相体系中，固相周围和固相内的微环境往往 和主体溶液不一致； ( 3 ) 由产物在载体周围和内部产生的扩散限制往往引起酶表观活力下降； ( 4 ) 载体的基质骨架结构造成一定的空间屏障，影响催化剂活性中心和底物分子 的有效接触。 上述四种过程的共同作用，在一定程度使酶的活力曲线、表观p h 值、米氏 常数等发生一定的改变。 固定化青霉素酰化酶在水解生产p 内酰胺抗生素中间体工业中发挥了重要 的作用。不同材料固定的青霉素酰化酶合成p 内酰胺抗生素的效果各不相同。如 图1 3 所示，动力学控制的b 内酰胺抗生素酶法合成中，其产物收率主要取决于 青霉素酰化酶同时催化进行的三个反应的综合结果，这些反应各自进行的程度在 一定程度上取决于青霉素酰化酶固定化的载体特性。因为载体的亲水疏水特性对 酶的活性中心与底物的结合方式以及产物的离去形式有一定的影响。同时，载体 性质还可能影响固定化酶的重复利用性、产物分离过程等。 f e m a n d e z l a f u e n t e l l 3 8 】等应用琼脂糖凝胶固定的青霉素酰化酶合成小羟氨苄青霉 素，发现多点结合固定化的酶可在一定程度消除底物类似物抑制，同时相对单点 结合的固定化酶而言，其稳定性和合成活力也有了很大提高。 1 3 5 有机溶剂的影响 传统的酶反应通常是在以水为介质的系统中进行，但是对酶本身而言，当酶 分子周围含有足够的水分子( 必需水) 维持其天然构象时，介质对酶性质的影响 并不紧要，酶即使在有机溶剂中也显示出催化活性。有机相体系合成p 内酰胺类 抗生素目前已有较多文献报道。研究结果表明，采用有机相体系进行合成具有较 好的工业开发前景。这主要是因为有机相酶催化合成抗生素有以下优点：( 1 ) 提 高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续生物转化；( 2 ) 降低了可逆反应 中酯的水解等，相对促进了其逆反应即p 内酰胺抗生素的合成；( 3 ) 酶不溶于有 机介质，易于回收再利用；( 4 ) 从低沸点的溶剂中分离纯化产品比从水中更容易。 1 2 第一章文献综述 在热力学控制的反应体系中，有两种方法可以提高合成p 内酰胺类抗生素反 应的产物收率：降低反应体系水活度和提高底物其非离子化形式的比例，这通常 可通过加入有机共溶剂来实现。 不同性质有机溶剂对底物和生物催化剂的影响差别很大，因此有机溶剂的选 择将直接影响催化合成反应的最终效果。a n - o y o 等 ”】发现，青霉素酰化酶在有机 共溶剂体系中的水解活力与该溶剂的极性参数l o g p 的大小有关。l o g p 越大，青 霉素酰化酶的残余活力越小。f e m a n d e z 等m 1 从有机溶剂对底物的影响的角度出 发寻找了筛选有机溶剂的规律。根据溶剂对母核和侧链底物解离常数丛的影响， 有机溶剂可被分为三大类：强离子性溶剂、中等强度离子性溶剂和弱离子性溶剂。 强离子性溶剂对底物p k a 影响最大，使侧链表观解离常赘g p k a 最接近酰胺键合成 的p h 值范剧4 1 】( 见表1 - 2 ) 。所以，强离子性溶剂通常成为合成过程中的首选溶 剂。强离子型试剂一般有甘油、乙二醇，中等强度离子试剂一般包括1 ，4 丁二醇、 甲醇、乙醇等，弱离子型试剂一般包括丙酮、二氧杂环己烷、二甲基亚砜、n ，n 二甲基甲酰胺等。 f e r m a n d e z 等【删将非水相酶催化应用于合成p 内酰胺抗生素，在 5 0 d m f 5 0 w a t e r 共溶体系中，以6 氨基青霉烷酸为母核，以苯乙酸甲酯为侧 链，用固定化青霉素酰化酶合成青霉素g ，转化率达到9 0 。同时在该体系中， 分别以7 - a d c a 和7 - a c a 为母核，苯乙酸甲酯和对羟基苯甘氨酸甲酯为酰基供体 合成头孢拉定和其它头孢抗生素，转化率分别达到9 0 和9 5 。由此可见，有 机相中的酶法合成能达到较高的转化率。 动力学控制合成反应中，加入有机共溶剂不但可同时达到降低反应体系水活 度和提高底物其非离子化形式的比例的目的，提高转化率外，还可以降低侧链的 水解、增加底物和产物的溶解、使产物的分离更容易、调节酶合成的活力、降低 水解产物的活力等。但是在反应体系中加入有机溶剂也可能存在一些有不利的方 面，如导致酶的稳定性和催化活力下降等，这种影响随添加有机溶剂的种类和浓 度的不同而不同。因此，选择适当的有机溶剂以及降低它们对催化剂的影响成为 有机相体系酶催化的关键问题。酶的稳定性可通过基因工程或蛋白质工程等手段 来加以改善；也可通过酶的化学修饰或固定化技术加以调节，通过酶分子与一定 的修饰剂交联，酶分子的柔性得以降低，有利于维持酶分子稳定必要的空间构型， 从而使酶分子在有机溶剂中的稳定性得以增强。 1 3 第一章文献综述 表l - 2 有机溶剂对苯甘氨酸( p g ) 和6 - a p a 的p k a 的影响 t a b l e 1 - 2e f f e c to fo r g a n i cs o l v e n t so nt h ep k av a l u e so fp ga n d6 - a p a 1 3 6 酶催化合成8 内酰胺抗生素的优势 传统的抗生素生产以化学法为主，图1 - 4 是化学法制备氨苄西林的经典路线。 反应过程中，苄基青霉素l 与羧基保护基2 反应生成甲醛酯3 ，3 再与五氯化磷 反应，生成相应的氯化亚胺基化合物4 ，依次用丙醇和酸进行处理，使酰胺键水 解成带保护基的6 - a p a 的衍生物5 ，5 与苯甘氨酸6 反应生成三甲基乙酰亚甲基 二氧衍生物7 。7 本身就可以作为药物使用，服药后可水解成氨苄青霉素8 ，在 体外用中等酸处理，能进行与体内相同的转化，得到氨苄西林产品。 1 4 第一章文献综述 o | i c h 广c l o i i c h 广c l i o 。 j oc h 3 i ii + c 1 c h 2 0 c - - 下- c h 3 h c h 3 2 c l i c h 广c = 4 o o c h 2 0 c 冀埋 7 l o l p c l s i + 曰 彳h ， i i l c h 2 0 c c c h l i 。 c h 3 芦 h 3 + l i o o o c h 2 0 c n h 2o i i | c h c 一 上 8 o 彳h 3 o i l c h c 一0 h i n h 2 6 0 h 图1 4 化学法合成氨苄西林