（农药学专业论文）蔬菜和水果中农药多残留快速仪器分析方法开发、验证与应用.pdf

摘要 近年来，由于农药残留引起的事故频频发生，严重地影响了我国出口贸易和国内农产品市 场，食品安全问题日益引起各界重视。对食品中有毒有害物质的检测、监控，建立农产品中农 药多残留检测方法是当前研究的重点。q u e n c h e r s 方法是近年来发展起来的农残样本快速前处 理方法，样本提取后用同相吸附材料选择性吸附干扰物质，然后离心分离吸附剂以达到快速净 化。本论文在q u e n c h e r s 方法的研究基础之上，优化改进了q u e n c i l e r s 方法，建立了蔬菜和水 果中农药多残留的快速气相色谱质谱联机的分析方法，并在其他实验室进行了验证。 建立和优化的方法是用乙腈( 含l 乙酸) 提取、固相分散法净化，气相色谱质谱( 选择 离子模式) 分析检测蔬菜和水果中常用的5 1 种农药多残留。通过在分析过程中添加分析保护剂 的方法有效地补偿了基质效应对农残定量的影响，且改善了一些极性农药，如甲胺磷、乙酰甲 胺磷、乐果、氧乐果、久效磷等农药的峰形，提高了检测的灵敏度，降低了方法的检出限。方 法采用了保留时间锁定技术和解卷积报告软件，使得气相色谱质谱检测农药残留化合物的确证 更简单有效；仪器和实验室之间方法的转换更加方便，易于方法的推广和实验数据的比较 避 免了样品数据处理过程中的人为因素的干扰，使数据的处理过程自动化，且减少了分析结果中 的假阳性和假阴性的几率。 在苹果、黄瓜、韭菜，梨、甘蓝、胡萝h ，草莓、西红柿、油菜等蔬菜和水果中试验了0 0 5 、 0 1 0 、0 2 5m g k g 三个添加水平的添加回收试验，回收率在6 2 1 3 3 之间，相对标准偏差在 0 3 7 1 5 2 _ 问。方法最低检出限( 油菜基质) 在0 0 0 0 2m g k g o 0 4 5 3m g k g 之间。为了进 一步验证此方法的有效性，分别按照我国的国家标准和国际上惯用的验证方法统计方法的精密 度数据，给出了不同基质不同水平f 的重复性限和再现性限，为以后方法的推广和使用提供了 质量控制和依据。为了考察方法中采用的纯溶剂标样定量的准确性，以草莓为基质，分别使用 纯溶剂标样定量和基质匹配标样定量，并对两种方式的定量结果进行了t 检验，结果表明这两 种校正方式对大部分农药的定量结果没有显著差异，本方法中采用的在保护剂存在f 纯溶剂标 样校正分析结果的步骤简化了目前基质匹配标样定量的繁琐步骤，且结果准确可靠。 通过本论文的研究，建立了一种快速、简单、有效且灵敏的气相色谱质谱检测蔬菜和水果 中农药多残留的分析方法，并通过实验室内和实验室间的方法验证，论文中建立的方法已经申 报国家农业行业标准。 关键词；农药多残留分析，基质效应，分析保护剂。气相色谱质谱 a b s t r a c t n o w a d a y s , t h eo c c m t e u c eo f t h ep e s t i c i d er e s i d u e sa c c i d e n t sh a p p e n sm o l la n dm o r ef r e q u e n t l y t h a ne v e rb e f o r e ，w h i c hs o n e r e r l yt h r e a t e nt h ee x p o r tm a r k e ta n dn a t i o n a la g r i c u l t u r ep r o d u c t sm a r k e t , a n dm a d et h ef o o ds a f em o r ei m p o r t a n c e t h em u i t i i l s i d u ea n a l y s i sw a sc o n c e r n e db ym a n ya n a l y s i s s c h c o l e r s b a s e do nt h eq u e c h e r sm e t h o d , au e wf a s ta n de a s ym e t h o df o rt h ed a 把r m i n a t i o no f m u l t i p l ep e s t i c i d er e s i d u e si nf r u i t sa n dv e g e t a b l e su s i n gg c m sw a sd e v e l o p e d a n dv a l i d a t e di n d i 位r e n tl a b s 5 1p e s t i c i d e sw e r ee x t r a c t e du s i n ga c e t o n e i t r i l ( w i t h1 a c e t i ca c i d ) f r o mf r u i t sa n dv e g e t a b l e s s a m p l e s , c l e a n e du pb yd i s p e r s i v es o l i d - p h a s ee x t r a c t i o nw i t hp r i m a r y - s e n c e n d a r ya m i n ea n dc m a b s o r b e n t ，d e t e c t e db yg c m s ( s l , v t 3 t h ep r o t e c t a n t si m p r o v e st h ep e a k ss h a p eo f s o m ep o l a r p e s t i c i d e ss u c ha sa c e p h a t e ，o m e t h o a t e , m o n o c r o t o p h o se t c ，a n dc e m p e n c a t et h e m a t r i xe f f e c t e f f i c i e n t l ya n da l s oe n h a n c e dt h es e n s i t i v i t y , r e d u c i n gt h el i m i to fd e t e c t i o ns u c c e s s f u l l y t h e r e t e n t i o n t i m e l o c k i n g t e c h n o l o g y a n d t h e d e c o n v o l u t i o n r e p o t t i n g s o f t w a r e w a s a p p l i e d i n r e s i d u e sa n a l y s i st or e m o v et h ec o - e x t r a c t i o nd i s t u r b a n c ee f f e c t i v e l y t h em e a nr e c o v e r yo f e a c hp e s t i c i d e sf r o mt h ef r u i ta n dv e g e t a b l es a m p l e ss p i k e da t0 0 5 ，0 1 0 ， o 2 5m g k gw a s6 2 一1 3 3 w i t hr s do f 0 3 7 1 5 t h el o do f c o l em a t r i xi sb e t w e e n0 0 0 0 2 0 0 4 5 3 m g k g f o r f u r t h e rs t u d i n g t h e v a l i d a t i o n o f t h e m e t h o d ，t h en a t i o n a l s t a n d a r d t e s t e d m e t h o d a n dt h ei n t e r n a t i o n a lt e s t e dm e t h o dw a su s e dt oc a l c u l a t et h ea c c u r a c ys e p a r a t e l y , a n dt h ed i f f e r e n t r e p e a t a b i l i t yl i m i ta n dr e p r o d u c i b i l i t yl i m i to fd i f f e r e n tm a t r i xa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nl e v e i sw a s t e s t e d , w h i c hb e c a m eap o w e r f u l 班f o rt h em e t h o dq u a n t i t yc o n t r o la n dp o p u l a r i z a t i o ni nt h ef u t u r e t od e t e r m i n et h ep r e c i s i o no fp u r es t a n d a r ds o l u t i o n ，t h ep u r es t a n d a r ds o l u t i o na n dt h em a t r i x m a t c h e ds t a n d a r ds o l u t i o ni nt h es t r a w b e r r ym a t x i x w u st e s t e d t h er e s u l th a ss h o w nt h a tt h e r ei sn o s i g n i f i c a n c ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w om e t h o d s s o ，t h em e t h o do f t h ep a p e ra v o i d e dt h er e d u n d a n c y s t e p so ft h et h em a t r i xm a t c h e ds t a n d a r ds o l u t i o nm e t h o da n dt h er e s u l ti sr e l i a b l e t h i sp a p e rh a se s t a b l i s h e daf a s t ，e a s y , e f f i c i e n c ya n ds e n s i t i v em e t h o df o rd e t e r m i n e m u l t i r e s i d u e s i n f r u i t a n d v e g e t a b l e u s i n g g c m s ，a n d t h e c e r t i f i c a t i o n i n t h e l a b s w a sr e l i a b l ea n d t h em e t h o dh a sb e e na p p l i e daa g r i c u l t u r es t a n d a r dm e t h o d k e y w o r d s ：m u t i i l s i d a e s ，m a t r i xe f f e c t , p r o t e c t a n t , g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s sd e t e c t o r 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意 研究生签名： 狭儆时间：w 刁年b 月2 1 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：药备叹 导师签名： 泐住 v 时间：劲刁 年月叫日 时问芦多月2 日 中中国农业人学博七学位论文第一章绪论 第一章绪论 1 。l 研究背景 食品是人类赖以生存和发展的物质基础，食品安全是关系到人类健康和国计民生的重大问 题。1 9 9 6 年世界卫生组织对食品安全的定义是：对食品按其原定用途进行制作、食用时不会使 消费者健康收到损害的一种担保。基于国际社会已经基本形成4 点共识，食品安全的概念也可 以表述为：食品( 食物) 的种植、养殖、加工、包装、贮藏、运输、销售、消费等活动符合国 家强制标准和要求，不存在可能损害或威胁人体健康的有毒有害安全物质以导致消费者病亡或 者危机消费者及其后代健康的隐患1 1 1 。 食品安全是各国政府的主要政策目标之一，我国政府也十分重视食品安全问题。从粮食的 统购统销，到食品卫生法的颁布，充分体现了政府对食品的重视。经过几十年的努力，特别是 1 9 9 5 年中华人民共和国食品卫生法颁布以来，我国的食品安全卫生状况有了明显的改善。 根据国内外的研究成果归纳起来，影响食品质量安全的因素主要有：( 1 ) 环境污染；( 2 ) 农业种植业、养殖业的源头污染；( 3 ) 食品添加剂、防腐剂；( 4 ) 微生物引起的食源性疾病； ( 5 ) 新原料、新工艺带来的食品污染；( 6 ) 市场和政府现有措施不完善，仍存在着假冒伪劣产 品、食品标签滥用、违法生产经营等；( 7 ) 科技进步对食品安全的控制带来新的挑战；( 8 ) 境 外食品安全问题的影响。其中农业种植业、养殖业的源头污染，也就是我们现在经常提到的农 药、兽药残留的污染已经广泛引起了人们的重视。 农药在防治病虫害、去除杂草、控制人备传染病、提高农产品的产量和质量等方面起着积极 作用，农药的发明和使用无疑大大提高了农作物的产量，但随着农药的大量及不合理地使用，食品中 的农药残留对人类健康造成的负面影响也日益显露出来。农产品农药残留超标问题直接影响人民 身体健康。引起各国政府和社会各界的广泛关注。中国农药用量居世界首位，每年达8 0 1 0 0 万吨； 年产4 0 多万吨( 1 0 0 有效成分) 。居世界第二位。2 0 0 0 年国家质检总局公布的产品质量国家监 督抽查结果表明，蔬菜农药残留量超标问题突出。一是有机磷残留最超标，二是一种蔬菜中含有 多种农药残留的现象比较普遍。重点抽查的2 3 个大中城市的大型蔬菜批发市场的菜花、番茄、 甘蓝、黄瓜、茄子、韭菜、油菜等十余类1 8 1 种蔬菜中，有8 6 种蔬菜农药残留量超过国家标准限 营值，超标率为4 7 5 p l 。农产品中的农药残留鼍超标问题，直接影响消费者的身体健康。在当前 的国际贸易中许多发达国家以农药残留限颦问题作为符合霄t o s p s 协议的止当理由，设置技术 性贸易肇垒，严重影响了我国农产品的国际贸易。因此关注食牖中农药残留问题在当前显得尤为 重要。为保护消费者的健康，消除发达国家对我国农产品出口设置的技术壁垒。提高我国农产龆 国际市场竞争力，我国对农药残留的监管与指导1 = 作应进一步加强。 农药残留污染已经成为影响食晶安全的重要因索之一，为全世界共同关注。方面，各国政 府将其作为一个重要的公共下生问题予以高度重视，制定了完绍的的法律、法规和标准体系，以 保护本国消费者的健康和安全。另一方面，以技术性贸易措施为核心的新贸易阜垒成为实行贸易 保护主义的主要手段，农药及其残留的管理成为农产晶领域最重要的技术性贸易措施之一一些 中中国农业人学博七学位论文第一章绪论 第一章绪论 1 。l 研究背景 食品是人类赖以生存和发展的物质基础，食品安全是关系到人类健康和国计民生的重大问 题。1 9 9 6 年世界卫生组织对食品安全的定义是：对食品按其原定用途进行制作、食用时不会使 消费者健康收到损害的一种担保。基于国际社会已经基本形成4 点共识，食品安全的概念也可 以表述为：食品( 食物) 的种植、养殖、加工、包装、贮藏、运输、销售、消费等活动符合国 家强制标准和要求，不存在可能损害或威胁人体健康的有毒有害安全物质以导致消费者病亡或 者危机消费者及其后代健康的隐患1 1 1 。 食品安全是各国政府的主要政策目标之一，我国政府也十分重视食品安全问题。从粮食的 统购统销，到食品卫生法的颁布，充分体现了政府对食品的重视。经过几十年的努力，特别是 1 9 9 5 年中华人民共和国食品卫生法颁布以来，我国的食品安全卫生状况有了明显的改善。 根据国内外的研究成果归纳起来，影响食品质量安全的因素主要有：( 1 ) 环境污染；( 2 ) 农业种植业、养殖业的源头污染；( 3 ) 食品添加剂、防腐剂；( 4 ) 微生物引起的食源性疾病； ( 5 ) 新原料、新工艺带来的食品污染；( 6 ) 市场和政府现有措施不完善，仍存在着假冒伪劣产 品、食品标签滥用、违法生产经营等；( 7 ) 科技进步对食品安全的控制带来新的挑战；( 8 ) 境 外食品安全问题的影响。其中农业种植业、养殖业的源头污染，也就是我们现在经常提到的农 药、兽药残留的污染已经广泛引起了人们的重视。 农药在防治病虫害、去除杂草、控制人备传染病、提高农产品的产量和质量等方面起着积极 作用，农药的发明和使用无疑大大提高了农作物的产量，但随着农药的大量及不合理地使用，食品中 的农药残留对人类健康造成的负面影响也日益显露出来。农产品农药残留超标问题直接影响人民 身体健康。引起各国政府和社会各界的广泛关注。中国农药用量居世界首位，每年达8 0 1 0 0 万吨； 年产4 0 多万吨( 1 0 0 有效成分) 。居世界第二位。2 0 0 0 年国家质检总局公布的产品质量国家监 督抽查结果表明，蔬菜农药残留量超标问题突出。一是有机磷残留最超标，二是一种蔬菜中含有 多种农药残留的现象比较普遍。重点抽查的2 3 个大中城市的大型蔬菜批发市场的菜花、番茄、 甘蓝、黄瓜、茄子、韭菜、油菜等十余类1 8 1 种蔬菜中，有8 6 种蔬菜农药残留量超过国家标准限 营值，超标率为4 7 5 p l 。农产品中的农药残留鼍超标问题，直接影响消费者的身体健康。在当前 的国际贸易中许多发达国家以农药残留限颦问题作为符合霄t o s p s 协议的止当理由，设置技术 性贸易肇垒，严重影响了我国农产品的国际贸易。因此关注食牖中农药残留问题在当前显得尤为 重要。为保护消费者的健康，消除发达国家对我国农产品出口设置的技术壁垒。提高我国农产龆 中中国农业大学博i ：学位论文 第一章绪论 发达国家，不断颁布新的技术法规，扩大管制范围，增加检测项目，提高标准水平，对发展我国 家农产品出口设置障碍，达到限制进口保护本国产业的目的。据统计，“入世”以来，约有9 0 9 i 的我国农产品受到技术性贸易措施的限制和影响。日本政府根据2 0 0 3 年5 月3 0 e l 发布的食品卫 生法修正案，在食品中引入农业化学品残留物肯定列表制度，并将于2 0 0 6 年5 月2 9 日起正式实 施。2 0 0 5 年6 月2 1 日，日本厚生劳动省通过w t o 正式向我国通报“肯定列表制度”及为实施该制 度而制定的“残留限量标准”最终草案( 通报号g s p s j p n 1 4 5 ) “肯定列表制度”对所有农 业化学品在食品中的残留提出了限量要求，与日本原农药残留标准相比，设限数量大幅增加，限 量标准更加严格。日本是我国农产晶的第一大出口市场，约占我出口总额的三分之一，以日本为 主销市场的出口企业占农产品出口企业总数的3 8 。日本实施“肯定列表制度”农药残留限量新 标准，迸一步提高了技术j 槛，将对我国对日出口农产品，特别是植物性农产品产生重大影响， 我国农产品再次面临严峻考验。日本实施“肯定列表制度”后，检测范围的扩大、检测项目的增加、 技术标准的提高将形成新的技术性贸易壁垒，对我国农产品出口造成桎梏。部分出口农产品可能 达不到日方要求而被迫退出日本市场。为满足日方要求，我国农产品企业需进行人员培训、生产 方式的改进、农药品种的更新，加强农产品安全质量自控体系建设，增加对农业环境治理的投入， 支付高额的检测费用，生产成本将相应上升。 1 2 农产品中农药多残留分析前处理技术概述 在食品检验过程中，除了选择准确、可靠的测定方法，还应重视食品样品采集的代表性和 样品前处理的合理性，它们关系到最终检验结果的正确性。食品化学分析中第一步就是从食品 样品中萃取、净化和或浓缩目标物，特别是食品样品在进行色谱分析之前尤为重要。选择性好、 高分离能力的检测技术快速发展。使农药多残留的检测工作逐渐简化，而样品的前处理越来越 成为农药多残留分析过程中的关键。有专家分析：检测分析的误差近5 0 来源于样品的准备和 处理，而真正来源于分析的还不到3 0 ，而且大部分样品前处理所占用的工作量超过整个分析 的7 0 。因此，样品前处理系统平台是快速、准确的农药多残留检测体系的基础和保障”食 品样品基质比其他性质样品( 如水、土、气等) 复杂得多，因而食品样品前处理方法，包括摹 取，净化等步骤，有其特殊性。在食品品质、成分和污染物的检测中。有机污染物分析存在更 多难题。其突出问题是：根据目标物的毒性、致突变性、致癌性的强弱，它们在食品中允许限 量特别低，因此要求高灵敏度的测定方法；食品样品基质与目标物含晕相差百万倍、千万倍甚 至更多，在此情况下，由样品中萃取目标物，选择适宜的溶剂是十分重要的；应尽鼍减少共萃 取物存在，增加了分析的复杂性。样品中目标物含颦极微，同时共存的人量干扰物质必须除去。 为此，采用多种分离技术以高度地净化样品，这是现代食品化学分析的突出特点。 分析检测之前。样品的前处理主要包括：萃取、浓缩和净化，有些分析物还需衍生化。常 用的传统技术有：溶剂萃取( 同液萃取和液液萃取) 、液液分配和柱色谱分离以及化学衍生化技 术。在此基础上，近年来。发展了一些样品前处理技术，如 州相萃取、同相微萃取、超临界流 体葶取、微波辅助萃取、加速溶剂萃取和免疫亲和色谱以及主要针对含脂样品净化的凝胶渗透 苹取法等。 2 中中国农业大学博十学位论文 第一章绪论 1 1 1样品的提取 样品的提取是化学分析中用溶剂把农药从试样中提取出来的步骤。 残留分析试样中农药含量甚微，提取效率的高低直接影响结果的准确性。故应根据试样类 型、农药种类、试样中脂肪、水分含量和最终测定方法等来选择提取方法和提取溶剂，以便尽 可能完全地提取出试样中所含的农药，而尽量少地提取出干扰物质。残留农药的提取方法，应 根据样品的组分、农药的性状以及农药在样品中存在的形式和数量而有所不同。 提取总的要求是尽可能完全地提取出样品中所含的农药成分，而又尽量少提取出干扰物质。 要达到这样的要求，就必须对样品的性质，特别是水分的含量和油脂的多少，以及被测定农药的 物理、化学性质，以及最后的分析溯定方法，综合考虑后，慎重选择适宜的提取溶剂和提取方法 第一，对于极性较小的农药，如有机氯农药，可以用非极性溶剂来提取，常用的有正己烷， 苯等溶剂，也可以用极性溶剂如丙酮、乙腈来提取；而对于极性较强的有机磷等农药，则必须 采用极性较强的溶剂如氯仿、丙酮来提取 第二，对含水量比较高的样品，如蔬菜、水果等，用极性溶剂为宜，例如用丙酮、乙腈、 甲醇等溶剂。结合捣碎法，提取率就很高。过滤后，可用硫酸钠水溶液稀释并转溶于正己烷、 二氯甲烷等溶剂中。 第三，对于很多有机氟样品。可用混合溶剂，如己烷一丙酮( 2 ：1 ) ，氯仿一甲醇( 3 ：7 ) 来提取，然后加水，除去极性溶剂，而农药转入非极性溶剂中 第四，对于豆类、谷类和风干土壤等含水量较低的样品，可用甲醇、丙酮，二氯甲烷提取， 用含3 5 水的乙睛提取也较好。 第五，在弱酸性条件下提取，提取物就容易与植物成分和腐殖质分开，所以对于稳定的有 机磷农药和苯氧乙酸类除草剂，先使之成为磷酸酸性后，再用极性溶剂提取较为有利， 第六，含水样品，提取时常加入二分之一重量左右的无水硫酸钠后，用研磨法提取，由于 盐析作用，有利于有机溶剂提取，过滤也较为方便。 第七，对于含糖量高的样品，一般可适当加水后，用热的乙腈或丙酮提取。 第八。对于水样本，尤其是环境水样本，由于农药含量极低，仅p p b 级，因此多用固相萃 取或固相微萃取方法。对于小体积水样本，多采用液液分配的方法 下面介绍几种新的分离提取技术： 所谓超临界流体( s u p e r c r i t i c a lf l u i d ) 是物质处在临界温度和临界压力之上的状态，介于 气态和液态之间，既不是气体亦不是液体，兼有气体和液体的某些物理性状，如类似于液体具 有较人的密度和溶解度，类似丁气体具有较强的穿透能力。称为超临界流体或高密度气体嘲。 快速溶剂萃取( p r e s s u r i z e ds o l v e n te x t r a c t i o n ，p s e ) 、压力溶剂葶取( p r e s s u r i z e df l u i d e x t r a c t i o n ，p f e ) 、溶剂分解萃取( s o l v o l y t i ce x t r a c t i o n ) ，它是采用常规溶剂，在高温( 5 0 2 0 0 ) 和高压( 1 0 0 0 3 0 0 0 p s i ) 1 , - 用溶剂对固体或半同体样品进行萃取的新颖的样品前处理 方法。高温提高溶剂萃取的能力，而高压可使溶剂保持液态，增加物质溶解度和溶质扩散小效 率，提高萃取效率】。传统的葶取方法( 如索氏提取) 所需时间很长( 4 小时以上) ，已经不 能满足现代分析技术对样晶前处理的要求，而快速溶剂萃取可在1 5 r a i n白动完成样品葶取过 程，节省火麓时间；而且每1 0 9 样晶仅朋1 5 m l 的溶剂，节省了大量溶剂，减少了- 二次污染。 3 中中国农业大学博卜学位论文第一章绪论 加速溶剂提取法( a s e ) 是在高温( 5 0 c - - 2 0 0 c ) 及加压( 1 0 2 1 3 6 a r m ) 条件f 的溶剂提 取法。温度高于1 0 0 c 的溶剂穿透力强且溶解力大，加快分析物从基体解吸进人溶剂；加压使溶 剂保持液态，用少量溶剂可快速提取固体样品中的分析物。样品密封在高压不锈钢提取仓内，经 过起始的加热过程，样品在静态下与加压的溶剂相互作用一段时间然后用压缩氮气将提取液吹 扫至收集瓶中。现在已有商品a 娆自动化提取系统，如d i o n e x - 2 0 0 ，玻璃样脯提取瓶密封于不锈 钢圆筒内，2 4 位样品传输架，可以连续自动提取2 4 个样品。提取瓶容量有3 种：1 1 、2 2 、3 3 m l ， 收集瓶有4 0 及6 0 m l 两种，每个提取瓶可设置多次提取程序。a s e 提取溶剂的选择与索氏提取法一 样，提取液同样也需净化才能检测，其作用只是减少提取溶剂用量，缩短提取时间州。 微波辅助萃取( m a e ) 技术是将微波技术和萃取技术相结合，利用极性分子可以迅速吸收微 波能量来加热一些具有极性的溶剂，达到萃取样品中目标化合物，分离杂质的目的。目前常用的 微波萃取溶剂有甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷、苯、乙腈等。其中正己烷、苯 等非极性溶剂必须与丙酮等极性溶剂混合方可使用。常规的m a e 是将装有样品和萃取溶剂的样品 杯( 聚四氟乙烯材料制成) 放入密封好、又不吸收微波能量的萃取罐中进行微波萃取1 9 j 。b a m a d a - - p e r e i r a 等建立了一种微波辅助萃取一固相萃取前处理方法，g c - e c d 测定2 1 种有机氯农药的残 留分析方法，且多数有机氯农药的添加回收率都在1 0 0 左右【l 哪。p r a d o s - r o s a l e s 等利用微波辅助 萃取装置，采用高效液相色谱一柱后衍生荧光检测，检测了土壤中的氨基甲酸酯类农药，结果表 明该方法的添加回收率最高可达9 7 ，且在萃取过程中目标化合物无降解，所用的有机溶剂量较 少【1 1 1 1 2 2 样本浓缩 样本浓缩是指化学分析中，通过减少提取液中的溶剂，而使农药浓度增加的步骤。 用溶剂提取残留分析试样中的农药后，提取液体积大，农药含量甚少，因此在净化和测定前 必须进行浓缩。在浓缩过程中，要特别注意农药的损失，特别是蒸汽压高、稳定性差的农药。在 残留分析的各个操作步骤中，以浓缩对农药损失最大，故不能使用一般的蒸馏法。但不论用何法 浓缩，均应注意，决不可把提取液蒸干，因蒸干时农药最易损失。 下面介绍几种常用的浓缩方法。 k - - d 浓缩器( k u d e m a - d a n i s ha p p a r a t u s ) 是一种简单、高效的浓缩装置。在进行浓缩的同时 并可回流洗净器壁和最后定容。既防止了浓缩时农药被溶剂带走，又避免了溶液转移所造成的 损失。加热的水浴温度一般5 0 左右，超过8 0 者很少。在农药残留分析中广泛应用，各国的 标准方法中几乎全用k d 浓缩器浓缩。普通k d 浓缩器是在常压f 进行的。目前，也可以减 压浓缩。 旋转蒸发器是指盛蒸发溶刺的圆底烧瓶，可以边减压边旋转，故温度变化不人时，热龉传 递较快，使蒸馏能快而平稳地进行，而不发生暴沸；在使州中还可根据浓缩液体积，更换各种 容量( 1 0 毫升l 升) 的烧瓶。旋转蒸发器是农药残留分析中最常用的浓缩仪器，特点是浓缩速 度快，但不能用作高度浓缩用，而且浓缩后还需转移洗涤。 连续液液分配提取装置是用丁水样中农药残留的一种提取方法。其原理与索氏提取有类似之 处。 气流吹蒸浓缩装置是利用空气或氮气流吹带出溶剂的浓缩方法，适_ h j 丁体积小、易挥发的提 4 中中国农业大学博b 学位论文第一章绪论 取液，但对于蒸汽压较高的农药就比较容易损失。 1 2 3 样品净化 使用有机溶剂提取样本中的农药时，样本中的油脂、蜡质、蛋白质、叶绿素及其他色素、 胺类、酚类、有机酸类、糖类等会同农药一起被提取出来，提取液中既有农药又有许多干扰物 质，这些物质亦称共提物，会严重干扰残留量的测定。故必须将农药与上述杂质进行分离，然 后才能对痕量农药进行分析测定。这一操作步骤就是所谓净化。净化过程中常常会使农药丢失， 所以样本净化是农药残留分析中难度较大的亦是最重要步骤之一，是残留分析成败的关键。 净化的要求与方法在很大程度上取决于农药和样本的性质、最终检测方法、对分析时间和 对分析结果准确度的要求。如采用专一性强的火焰光度检测器测定有机磷或有机硫农药时，不 需复杂的净化步骤。而使用抗干扰能力差的电子捕获检测器测定有机氯或菊酯类农药和使用氮 磷检测器时，对净化要求必须严格，否则杂质会影响测定结果，还可能污染检测器。 农药残留量分析中净化的方法很多，常用的方法有液一液分配法、柱层折法、吹扫蒸馏法、 磺化法、凝结剂沉淀法和薄层色谱法等。 液一液分配法( l i e ，l i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o n ) 是指利用样本中农药和干扰物质在互不相溶 的两种溶剂( 溶剂对) 中分配系数的差异进行分离的净化方法。 通常使用一种能和水相溶的极性溶剂和一种不与水相溶的非极性溶剂配对来进行分配，这 两种溶剂称为溶剂对，经过反复多次分配，使农药残留与杂质分离。有的样本经液液分配后即 可直接测定。常用的溶剂对有丙酮一己烷、乙腈一已烷( 石油醚) 、二甲基甲酰胺( d m f ) 一 己烷( 石油醚) 、二甲基砸砜( d m s o ) 一己烷( 石油醚) 等。 柱层析法是指利用色谱原理在开放式柱中将农药与杂质分离的净化方法。是一种最普遍应 用的方法，其基本原理就是将提取液中的农药与杂质一起通过一支适宜的吸附柱。使它们被吸 附在表面活性的吸附剂上，然后用适当极性的溶剂来淋洗，农药一般先被淋洗出来，而脂肪、 蜡质和色素等杂质留在吸附柱上，从而达到分离、净化的目的 凝胶色谱净化技术( g e l p e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，g p c ) ，凝胶色谱是六十年代发展起来 的净化技术，又称体积捧阻色谱，是按溶质分子的大小进行分离的一种色谱技术。通过多孔性凝 胶固定相，使得样品中的大分子先被洗脱出来，小分子后被洗脱出来。当样本提取液随流动相流 经凝胶柱时，分子量较大的干扰物质如油脂、蛋白质，色素等，被捧阻在凝胶颗粒之外，直接随 流动相捧出色谱柱，绝大多数农药分子比较小，扩散进入凝胶孔内，较晚流出色谱柱，从而使农 药和杂质分离。g p c n - j 分离相对分子质量从4 0 0 到1 0 7 的分子【”】。凝胶色谱方法要求凝胶和彼分 离的试样没有任何相且作h j ，完全靠分子本身的人小进行分离，这种分离方式决定了被分离物质 在净化过程中不会发生任何化学变化。冈此。在一个州定的淋洗系统，凝胶可以反复使用。 g r i f f i t t 和c r a u n “”对自动化的g p c 系统进行了验证，发现用g p c 方法分离所得回收率比用液一 液萃取法( 如乙酸乙酯一石油醚分配法) 和柱层析法( 如f l o r i s i l 分离法) 所得同收率要好得多。 a r m i s h a w 等人研究表明相对于s w e e pc o d i s t i l l a t i o n 和f l o r i s i l o 色谱来讲，g p c 有自动化程 度高重现性好等特点。而g p c 净化法彝l a l u m i n a 桂：层析法相比，g p c 可去除人分子干扰物，能够 适h j 丁更多种复杂基质”。 吹扫蒸馏法( s w e e pc o - d i s t i l l a t i o n ) 吹扫蒸馏实际上是一种动态顶空技术，是指在较高温度下， 5 中中国农业大学博十学位论文第一章绪论 通入惰性气体( 如n 2 ) ，进行吹扫蒸馏，利用农药易丁二气化的特性，使农药或其他有机物质先挥发。 动物油脂或植物提取物保留在分馏管的玻璃珠上，从而达到分离纯化技术，挥发的农药可被收集 管的f l o r i s i l 硅土吸附，用溶剂洗脱下来。经浓缩即可测定。含油脂量较高的农畜产品，采用常 规的液一液分配、柱色谱等方法。不能将油脂除去，且步骤复杂，可采用此法。经过预处理的样 本提取液由进样口注入分馏管的内管中；残留农药在一定温度下气化，随载气( 氮气) 经装有硅 烷化玻璃珠的外管进入装有吸附剂弗罗里硅土的收集管中。而油脂等高沸点物质则留在分馏管外 管的玻璃珠上；取下收集管，用适当淋洗剂将农药淋洗下来，经浓缩即可测定【1 6 】。 磺化法是指利用脂肪、蜡质等杂质与浓硫酸的磺化作用，生成极性很大的物质而与农药进行 分离，一般来说，不被浓硫酸分解的农药是可以用磺化法净化的。所以此法通常用于有机氯农药 的净化，也可以用于部分菊酯类农药样品( 水、土、植株) 的净化。遇酸易分解或起反应的有机 磷、氨基甲酸酯和菊酯类农药，则不能使用此法。 凝结荆沉淀法是指使用凝结剂将杂质沉淀的净化方法。对于极性较强，在水中有一定溶解度 的农药，如有机磷、氨基甲酸酯或其他含氮农药，可用此法。凝结剂由氯化铵与磷酸按一定比倒 配制而成，可使样本中蛋白质等杂质沉淀。测定时将样品提取液浓缩后，溶于一定浓度的丙酮水 溶液中，加入凝结剂，使干扰物质沉淀，过滤除去。其他沉淀剂如醋酸铅等亦可使用。 低温冷冻法的基本原理是动植物组织中的脂肪和蜡质在低温- 卜的丙酮溶液中沉淀析出，而 农药则留在冷的丙酮溶液中，经过滤达到分离净化的目的。低温冷冻法的效果很好，农药回收 率也很高。 下面介绍几种新的净化方法。 固相萃取技术( s o l i dp h a s ee x t r a e t i o a s p e ) 液液分配( u 上) 有许多局限性，例如需要大量不互溶溶剂；样品处理步骤复杂；样品回收 率和精密度不理想；处理过程中乳液的形成，和溶剂蒸发时产生的样品损失等等。 固相萃取( s p e ) 主要用于样品分析前的净化或浓缩富集。与传统的液一液萃取相比，由于其采 用了高效、高选择性的固定相，能显著减少溶剂用量，简化样品预处理过程同时所需费用也有 所减少，一般来说，固相萃取所需时间为液一液萃取的1 1 2 ，费用为液液分配的1 5 。固相萃 取能用于气相色谱、液相色谱、红外光谱、质谱、核磁、紫外和原子吸收等各种分析方法的样品 预处理。正因为固相萃取柱独特的性能，f l t 0 年代问世以来，其全球需求量迅速增长。k a r c f l n o r d m e y e r 等采用同相萃取小柱代替传统的二氯甲烷液液分配的方法，建立一种蔬菜和水果中3 1 种不同极性和化学性质的农药的残留分析方法，回收率在8 0 以上旧。水或水溶液中农药的提取， 过去一直采_ h j 人分液i i i i 斗的液一液分配提取法，费时费力。用嗣相提取法，大量水样( 1 l ) 流过 吸附柱，农药吸附在柱上，然后埘少鼙有机溶剂淋洗农药，比液一液分配法已经简化很多v a l e f i e p i c h o n 通过一系列的研究证明了s p e 的前处理方法在处理水中的有机污染物时具有很大的优越 性，对极性差异比较大的化合物也可以达到很好的净化吸附效果“。 固相微萃取技术( s o l i dp h a s em i c r oe x t r a c t i o n ，s p m e ) 微型吲相萃取法( s p m e ) 是近儿年刚刚发展起米的新技术，是同相萃取法中的新成员，同 相微蒂取( s p m e ) 是在i 卉| 相葶取( s p e ) 基础上发展起来的新刑萃取分离技术。s p m e 装置形如 一微量进样器，某些气相色谱的同定液涂渍在根熔触f l 英细丝( 有效长度l c m ，直释为1 7 0 u r n ) 6 中中国农业大学博l 学位论文 第一章绪论 表面构成萃取头( f i b e r ) 。平时萃取头收纳于萃取头鞘内；使用时刺入一封闭体系，旋转控制杆， 探出萃取头。萃取头可浸于液体中或于液上( 顶空s p m 匠) 萃取浓缩样品中的某些化合物，而后 萃取头收纳于鞘内。不经任何洗脱直接进人气相色谱仪汽化室，再探出萃取头被萃取物在汽化 室内解吸附后，靠流动相将其导人色谱柱，完成提取、分离、浓缩的全过程。微型周相萃取法的 机制是吸附和热解吸，取样、提取、浓缩、进样是一个步骤，全过程无需溶剂，是分析方法上的 重大突破。进样不用溶剂，改善了色谱分离效率，纤维可重复使用多次，十分经济。常用的固定 相为聚二甲基硅氧烷( p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e ) 。涂布厚度l o o u m ，用于提取非极性有机物；聚丙 烯酸酯( p o l y a c y l a t c ) 涂布厚度8 s u m ，用于提取极性有机物，有现成的商品供应。s p m e g c m s 的检测限可以达到蟾级，分析物转移的随机误差来源少，因而精密度很好，一般r s d 1 0 0 的情况，。一些国外的资料将这种原因归结为基质效应( m t ri xe f f e c t ) 、 基质诱导色谱相廊值增加( m a t ti xi n d u c e dc h r o m a t o g r a p h i ce n h a n c e m e n t ) “”1 。即检测 农药时，由于受到蔬菜介质的影响常常使得部分农药的色谱峰的面积发生显著增加而导致同收 率远远人于1 0 0 。主要原因是由于采用纯溶剂配制的标准溶液进行定量时，由于衬管中的活性位 点对一些农药存在着吸附作用，导致农药进入色谱柱的速度变慢，使这些农药的色谱峰变宽， 峰形变差，峰面积偏低。另外。由于这些活性位点会诱导部分农药发生分解，也会导致农药标样 峰面积偏低，定量结果就会比实际值偏高，即【亓l 收率 1 0 肼。采用蔬菜空白样鼎溶液配制农药 标准溶液进行定餐，可以有效的防i r 同收率远远 1 0 暇，是消除介质效应对农药碱留检测的影响 比较有效的方法。由于基质效戍是因为进入气相色谱系统的溶液非纯溶剂配制的标准溶液，而 中中国农业人学博 学位论文第一章绪论 含有蔬菜样品介质等干扰物质，衬管中的活性位点就会部分被这些干扰物质所占领，不再吸附农 药组分，农药进入色谱柱的速度加快，就能得到较好的峰形，其次这些活性位点部分被蔬菜样品 介质等占领后，也不再诱导农药发生分解，由于标准溶液和待测的样品溶液有相同的样品介质， 标准溶液色谱峰面积的变化和样品溶液色谱峰面积的变化接近，定量结果就能够满足农药多残留 检测的要求。 ，4 1 基质效应的定义 按照欧盟农残分析质量控制规程中的定义，基质效应是指样品中的一种或几种非待测物浓 度或质量对测定准确度的影响。按照美国临床实验室标准化委员会的定义，基质效应指样品 中除目标分析物以外的其它成分对目标化合物定量结果的影响。根据基质对检测信号响廊值的 不同影响，基质效应可分为基质增强效应和减弱效应。增强效应即基质成分的存在减少了色谱 系统活性位点与待测物分子作用的机会，使得待测物检测信号增强的现象；减弱效应是指基质 成分的存在使仪器检测信号减弱的现象。在气相色谱分析中大多数农药表现出不同程度的基质 增强效应，严重影响了分析结果的准确性抵“删。图1 - - 1 为基质效应的基本原理图。国内为 了解决基质效应的问题大部分采用基质匹配标样来做为定量标样，但是由于基质种类繁多，配 制基质标样的前处理过程复杂，不确定混合基质标样是否能够代表单一的基质标样，且基质标 样由于基质的存在使得标样有效的贮存时间很短，为残留分析造成了很大的影响。 篓篷事 团一固一 覃b - - - - - - t - 目i 1 r f - t 一 图1 1 基质效应的基本