（农药学专业论文）交沙霉素生产菌株的菌种选育研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 通过对本实验室保藏的交沙霉素产生菌那波链霉菌交沙霉素变种( s t r e p t o m y c e s n a r b o n e n s i sv a r j o s a m y c e t i c u s ) j m 6 、j m 8 、j m l 4 、3 m 3 0 和j m 31 0 菌株进行活化、 摇瓶发酵和传代稳定性试验，确定遗传性能较为稳定的j m 8 ( 9 3 p , g m l ) 为诱变育 种的出发菌株。 对j m 8 菌株进行氯化锂紫外线诱变育种，结合链霉素抗性平板筛选，获得比出 发菌株j m 8 效价分别提高9 3 2 倍和6 3 4 倍的菌株u v 9 0 ( 9 6 o p e d m l ) 和u v 5 0 ( 6 8 3 p , g m l ) ，对l r v 9 0 进行6 0 c o 吖射线辐射诱变，所得诱变菌株效价不高且易发 生回复突变，未能筛选到高产菌株。对氯化锂紫外线诱变获得的另一高产菌株u v 5 0 ( 6 8 3 肛g m l ) 进行分离复壮，获得一株效价较高、遗传性能较为稳定的菌株u v 5 0 2 0 ( 7 0 7 p g m l ) 。以u v 5 0 2 0 为出发菌株，探索菌龄和溶菌酶浓度、酶解时间及酶解 温度对原生质体形成和再生的影响，确定制各原生质体的适宜条件为：选用种子液 中培养3 4 小时的菌丝体，在4 m g m l 的溶菌酶浓度下，于3 2 水浴中酶解9 0 m i n 。 对菌株u v 5 0 2 0 进行了原生质体再生筛选，获得了遗传性能较为稳定的菌株y 1 9 ( o p g m l ) 和效价比u v 5 0 - 2 0 提高1 2 2 倍的菌株y 1 3 ( 1 5 7 3 p g m l ) ；对y 1 3 进行 原生质体紫外线诱变，得到比y 1 3 效价提高1 5 8 9 的菌株y u l 5 ( 1 8 2 3 p g m l ) 。 通过紫外灭活y u l 5 原生质体，并与y 1 9 原生质体融合筛选得到一株比亲本菌株效 价提高1 7 7 2 的融合子r 2 9 菌株( 2 1 4 6 p g m l ) 。传代试验表明菌株j m 8 、u v 5 0 、 u v 5 0 2 0 、y 1 9 、y 1 3 、y u l 5 和r 2 9 传代均比较稳定。 利用s a s 软件以菌株r 2 9 为试验菌株进行了发酵培养基配方的优化研究。首先， 采用p l a c k e t t b u r m a n 设计法法筛选出影响r 2 9 发酵合成交沙霉素的主要因素为棉籽 饼粉和豆油，继而利用最陡爬坡路径试验找到试验中心点，综合中心组合设计和响 应面分析法确定主要因素的最佳浓度。试验发现采用1 9 棉籽饼粉和o 4 1 豆油， 交沙霉素生物发酵效价达到最大值5 5 g m l ，比优化前的原始配方提高1 0 6 6 。 另外，对菌株j m 8 和菌株r 2 9 发酵过程中的菌丝湿重、滤速、糖含量、铵离子 含量及效价进行了测定，为交沙霉素工业发酵提供参考指标。 关键词：交沙霉素；育种；原生质体融合；响应面分析法；优化 注：本课题为武汉天惠生物工程有限责任公司自选课题，由武汉天惠生物工程有限责任公司提供全部经费 交沙霉素生产菌株的菌种选育研究 a bs t r a c t as t a b l ea n dh i g h y i e l d i n gs t r a i nw a sc h o s e nt h r o u g hj m 6 ，j m 8 ，j m l4 ，j m 3 0a n d j m 310s t r a i n so f j o s a m y c i np r o d u c e rs t r e p t o m y c e sn a r b o n e n s i sv a r j o s a m y c e t i c u sw h i c h p r e s e r v e di no u rl a b o r a t o r yb ys t a b l ee x p e r i m e n t a t i o n f i r s t l y , j o s 8s t r a i nw a sm u t a t e db yl i c l - 巩a n du v 9 0a n du v 5 0 s t r a i nw h i c hb o t h h a dt h eh i g h e rf e r m e n t a t i o na b i l i t yw e r eo b t a i n e d s e c o n d l y ，u v 9 0s t r a i nw a sm u t a t e db y 6 0 c o 吖i r r a d i a t i o n , a n dn oh i g h e rf e r m e n t a t i o na b i l i t ys t r a i nw a so b t a i n e d t h i r d l y , as t a b l e a n d h i g h - y i e l d i n g s t r a i nu v 5 0 2 0w a so b t a i n e df r o mu v 5 0s t r a i n b y s t a b l e e x p e r i m e n t a t i o n f o u r t h l y , t h ec o n d k i o no ft h ee n z y m ef o rp r o t o p l a s tf o r m i n ga n d r e g e n e r a t i n gw a ss t u d i e du s i n gu v 5 0 2 0s t r a i n t h eo p t i m a lc o n d k i o n sw e r e3 4 - h o u r - a g e s e e d sh y d r o l y z i n gi nt h ee n z y m ec o n c e n t r a t i o no f4m g m la t3 2 f o r9 0m i n f i f t h l y , w ef i l t r a t e dt h ep r o t o p l a s tr e g e n e r a t i o ns t r a i n so fu v 5 0 2 0 ，a n do b t a i n e dt h eh i g h e r f e r m e n t a t i o na b i l i t ys t r a i no fy 13a n dt h ez e r of e r m e n t a t i o na b i l i t ys t r a i no fy 19 t h e n , w et r e a t e dy 1 3s t r a i nb yp r o t o p l a s t u va n do b t a i n e dy u l 5s t r a i n f i n a l l y , w ef u s e dt h e p r o t o p l a s to f s t r a i n sy 1 9 a n dy u l 5w h i c h w a su v i n a c t i v a t e d ，a n dt h e no b t a i n e das t r a i n r 2 9 t 1 1 er e s u k ss h o w e dt h a tt h o s em u t a t i o nm e t h o d sc o u l de n h a n c et h ef e r m e n t a t i o n a b i l i t yo ft r a i n s t h ec h e m i c a lt i t e ro ft h ef i v eh i g h y i e l d i n gm u t a n ts t r a i n su v 5 0 ， u v 5 0 2 0 ，y 1 3 ，y u l 5 ，a n dr 1 9w e r ei n c r e a s e db y6 3 4 4 1 ，3 5 1 ，1 2 2 4 9 ，1 5 8 9 ， 17 7 2 r e s p e c t i v e l yc o m p a r e dw i t ht h e i rp a r e n ts t r a i n s s u b c u l t u r et e s ti n d i c a t e dt h a t j m 8 ，u v 5 0 ，u v 5 0 2 0 ，y 19 ，y 13a n dr 2 9h a dr e l a t i v e l ys t a b l eh e r e d i t a r yc h a r a c t e r i s t i c s s a ss y s t e mw a su s e dt o o p t i m i z e t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mc o m p o n e n t sf o r j o s a m y c i np r o d u c t i o nb yr 19 f i r s t l y , t h ep r i m ef a c t o r sa f f e c t i n gp r o d u c t i o nj o s a m y c i n w e r es e l e c t e db ym e a n so fp l a c k e t t - b u r m a nd e s i g n ；t h es e l e c t e do n e st h a ta f f e c t e dt h e f e r m e n t a t i o nw e r ec o t t o n s e e dp r o t e i np o w d e ra n ds o y b e a no i l t h e n , t h es t e e p e s ta s c e n t e x p e r i m e n tw a sa d o p t e dt oa p p r o a c ht h eo p t i m a lr e g i o no ft h em e d i u mc o m p o s i t i o n l a s t l y , ac e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g nw a su s e dt oo p t i m i z et h ep r i m ef a c t o r sa n dt h er e s u l t s w e r es h o w ni nt h er e s p o n s es u r f a c ep o l t s w h e nt h em e d i u mc o m p r i s e dc o t t o n s e e dc a k e 1 9 a n ds o y b e a no i l0 4 1 ，t h eb i o l o g i c a lf e r m e n t a t i o nt i t e ro f j o s a m y c i nc o u l dr e a c h t h eh i g h e s ta t5 5 0 x g m l ，w h i c hw a s10 6 6 h i g h e rt h a nt h ei n i t i a lm e d i u mc o m p o n e n t s b e f o r eo p t i m i z a t i o n ， l a s t l y , w ec h e c k e dp h ，t h ef i l t r a t i o nr a t e ，t h et i t e r ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s e 注：本课题为武汉天惠生物工程有限责任公司自选课题，由武汉天惠生物工程有限责任公司提供全部经费 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 a n dn h 4 + i nt h ef e r m e n t a t i o nf l u i da td i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nt i m e t h e yc o u l dp r o v i d et h e r e f e r e n c ef o rl a r g e s c a l ef e r m e n t a t i o no f j o s a m y c i n k e yw o r d s ：j o s a m y c i n ，s t r e p t o m y c e sn a r b o n e n s i sv a r j o s a m y c e t i c u s ，b r e e d i n g ，t i t e r , p r o t o p l a s tf u s i o n , r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ，o p t i m i z a t i o n 注：本课题为武汉天惠生物工程有限责任公司自选课题，由武汉天惠生物工程有限责任公司提供全部经费。 3 交沙霉素生产菌株的菌种选育研究 m c l 删 l m u u m c t h p r s d r p h p l c h p l c p e g l c m s l c e s i m s l o q l o d r a s s a s p d c 缩略语 m a c r o l i d e s ( 大环内酯类) j o s a m y c i n ( 交沙霉素) l e u c o m y c i n ( 柱晶白霉素) u r e a p l a s m au r e a l y t i c u m ( 解脲支原体) m y c o p l a s m ah o m i n i s ( 人型支原体) c h l a m y d i at r a c h o m a t i s ( 沙眼衣原体) h e l i c o b a c t e r p y l o r i ( 幽门螺杆菌) r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( 相对标准偏差) r e v e r s e dp h a s e - h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( 反相高效液相色谱法) h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( 高效液相色谱) p o l y e t h y l e n eg l y c o l ( 聚乙二醇) l i q u i dc h r o m a t o g r a l b h y - m a s ss p e c t r o m e t r y ( 液相色谱质谱 联用技术) l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n - m a s s s p e c t r o m e t r y ( 液相色谱电喷雾离子质谱联用技术) l i m i to f q u a n t i t a i t o n ( 定量限，最低检测量) l i m i to f d e t e c t i o n ( 检出限) r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ( 响应面分析法) s t a t i s t i c a la n a l y s i ss y s t e m ( 统计分析系统) p o r t f o l i od e s i g nc e n t r e ( 中心组合设计) 4 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 召 如需保密，解密时间 年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同2 r _ 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签各钠矛帆& 9 7 占年月多日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存使用学位论文的规定，印学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括但不限于汇编、 复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密，商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签缸缃尹导师签名：辨移 签名日期：a 口a 劳石月弓日签名日期：毋扩年岁月二夕日 。 ? 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 前言 交沙霉素( j o s a m y c i n ，j m ) 为那波链霉菌交沙霉素变种( s t r e p t o m y c e sn a r b o n e n s i s v a t j o s a m y c e t i c u s ) 产生的一种大环内酯类( m a c r o f i d e s ，m c l ) 抗生素，与柱晶 白霉素( l e u c o m y c i n ，l m ) 的a 3 组分相同( o s o n oe ta 1 ，1 9 6 7 ；o m u r ae ta 1 ，1 9 7 0 ) ， 于1 9 6 4 年由日本山之内制药株式会社研制而成，自诞生以来，它就在世界范围内广 泛应用于临床t ( k u n i a k i ，1 9 7 8 ；b u r c h ，2 0 0 4 ) 。临床用于呼吸道感染、支气管炎、肺 炎、副鼻窦炎、中外耳炎、皮肤感染、术后感染、泌尿科、五官科、口腔科感染等， 但是目前我国尚无厂家生产原药。 1 1交沙霉素的产生菌 那波链霉菌交沙霉素变种( s n a r b o n e n s & v a t j o s a m y c e t i c u s ) 是链霉菌属的一 种放线菌，代表菌株为a 2 0 4 p 2 ，分离自日本土样，能产生抑制革兰氏阳性细菌、分 枝杆菌的交沙霉素( 阎逊初，1 9 9 2 ) 。其孢子丝直、柔曲。孢子椭圆形、柱形，表面 光滑，在不同培养基平板上的培养特征见表1 。该菌明胶液化强，有时少量黄褐色素。 牛奶凝固并胨化，无色素。水解淀粉。纤维素上生长少。硝酸盐不还原。不产生类 黑色素和酪氨酸酶。利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蔗糖、棉子糖以及半乳 糖、麦芽糖、糊精、淀粉、菊糖、甘油；不利用鼠李糖、肌醇、甘露醇以及乳糖、 山梨醇、卫矛醇。 表1 那波链霉菌交沙霉素变种的培养特征 t a b l e1t h ec u l t i v a t e dc h a r a c t e ro fs n a r b o n e n s i sv a r j o s a m y c e t i c u s 1 2 交沙霉素的基本性质 1 2 1交沙霉素的理化性质 交沙霉素是日本微生物化学研究所梅泽滨夫教授研究成功的，与l m 中的a 3 组分相同，分子量为8 0 64 - 8 ( h i l l 蒸汽压法) 、8 6 5 ( 滴定法) ，分子式为c 4 2 h 6 8 0 1 5 n ， 结构式见图1 。 交沙霉素生产菌株的菌种选育研究 a i l 图1 交沙霉素分子结构式 f i g 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f j o s a m y c i n 交沙霉素是无色针状晶体( 苯) ，弱碱性，p k a 7 1 。熔点为1 3 0 1 3 3 。易溶于 甲醇、乙醇、丙酮，氯仿、醋酸乙脂、醋酸丁脂、二氧六环及酸化水，可溶于丁醇、 乙醚、四氯化碳、苯及甲苯，难溶于水、石油醚、石油英、正己烷。其盐酸盐、硫 酸盐溶于水( 王岳和方金瑞，1 9 8 8 ) 。 交沙霉素用硫酸做红霉素试验为红色，加热变暗紫色；用盐酸作碳霉素试验为 红色；间苯三酚盐酸试验为橙黄色。薄层层析板上d r a g e n d o r f f 反应为橙色。三氯化 铁、碱性硝酸银、茚三酮、双缩脲、f e h l i n g 、e l s o n - m o r g a n 及m i l l o n 反应阴性。 交沙霉素紫外光谱，入m 舣( e l c m l ) 分别为2 3 2 ( 3 2 0 ) 毫微米( 甲醇) 和2 3 2 ( 3 2 5 ) 毫微米( o 0 0 1 n 盐酸) 。交沙霉素纸层析结果和薄层层析结果见表2 和表3 ： 表2 交沙霉素纸层析结果 t a b l e2t h er e s u l to fj o s a m y c i nb yf i l t e rp a p e rc h r o m a t o g r a p h y 纸层析液 r f 值 苯：氯仿( 1 ：1 ) 苯：水饱和醋酸乙酯( 9 ：1 ) 苯：丙酮( 9 5 ：5 ) 四氯化碳：氯仿( 1 ：1 ) 0 4 9 0 6 8 0 6 5 0 7 6 表3 交沙霉素薄层层析结果 t a b l e3t h er e s u l to f j o s a m y c i nb yf o l i u mc h r o m a t o g r a p h y 氧化铝薄层层析 r f 值 醋酸乙酯 醋酸乙酯：甲基乙基丙酮：水( 8 0 ：1 8 ：2 ) 硅胶g 正丁醇：醋酸：水( 3 ：1 ：1 ) o 6 7 0 4 7 0 6 4 1 2 2 交沙霉素的抗菌活性和特点 1 9 7 5 年，l a r r y 等对交沙霉素的体外活性与红霉素进行了比较研究( l a r r ye ta 1 ， 1 9 7 6 ) ，结果表明交沙霉素抗菌谱与红霉素相似。同年，e r i e 等进行了交沙霉素对 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 革兰氏阳性需氧菌和厌氧菌体外活性的研究( e r i ce ta 1 ，1 9 7 6 ) ，r i c h a r d 等采用琼 脂稀释法研究了临床分离的1 4 5 种厌氧菌和9 6 种革兰氏阳性需氧菌在体外对交沙霉 素的敏感性( r i c h a r de ta 1 ，1 9 7 6 ) ，结果表明，9 5 的需氧菌对1 5 6 1 t g m l 甚至更 低浓度的交沙霉素敏感，且其最低抑制中浓度均不大于0 3 9 p g m l ；在体外，小于 3 1 2 “卧n l 浓度的交沙霉素对1 0 0 的厌氧菌均有活性。 交沙霉素与青霉素、链霉素、四环素、氯霉素无交叉耐药性，是非诱导耐药性 的抗生素，且在金葡萄球菌中不诱导耐药性。但是与红霉素、碳霉素交叉耐药，口 服给药，对小鼠的葡萄球菌或肺炎双球菌均有显著的保护作用。 交沙霉素对革兰氏阳性细菌及部分阴性细菌包括金黄葡萄球菌、溶血性链球菌、 淋球菌、百日咳杆菌、支原体、衣原体等有很高的活性。交沙霉素对部分病原菌的 最低抑制浓度见表4 。 表4 交沙霉素对部分病原菌的最低抑制浓度 t a b l e4t h em i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o no f j o s a m y c i nt os o m ep a t h o g e n y 病原菌最低抑制浓度( 微克毫升) 藤黄八叠球菌p c i l 0 0 1 金黄葡萄球菌2 0 9 p 枯草杆菌6 6 3 3 大肠杆菌o 1 2 肺炎克氏菌p c i 6 0 2 伤寒沙门氏菌h 9 0 1 w 化脓性链球菌s s 4 5 8 分支杆菌6 0 7 肺炎双球菌i 型 ( 摘自王岳，方金瑞抗生素北京：科学出版社，1 9 8 8 ：2 9 - 3 1 ) 1 3 交沙霉素的合成和化学改造 1 3 1交沙霉素的全合成 微生物代谢产物的全合成一直以来都受到科学家的关注，自从1 9 7 2 年 w o o d w a r d 及e s h e m m o r 两公司完成了v b l 2 的合成，人们对大环内酯类抗生素的合 成更加关注。1 9 7 5 年，m a s a m u n e 等首先完成了酒霉素的全合成( m a s a m u n ee ta 1 ， 1 9 7 5 ) ，同年，c o r e y 等完成了红霉素b 的合成( c o r e ye ta 1 ，1 9 7 5 ) ，1 9 8 0 年t a t s u t a 等完成十六元环大环内酯交沙霉素的全合成( t a t s u t ae ta 1 ，1 9 8 0 ) ，以d 葡萄糖对称 碳源，塑造c 1 - c i o ，与c 1 l 一15 两片断偶联后，经2 次糖苷化，最后脱去保护基， 具体过程见图2 。 7 一 如 煳 吣 c h 交沙霉素生产菌株的菌种选育研究 0 o h a t - o a c b 7 p 一卜一 o a c 图2 交沙霉素全合成途径 空沙簿紊( 桂d 自霉袁a l f i g 2t h e f u l lc h e m o s y n t h e s i sp r o c e s so f j o s a m y c i n ( 摘自张致平， 微生物药物学，化学工业出版社，2 0 0 3 ：2 4 2 4 8 ) 8 h 叭姆i叭宴i 腻 l， 、0 1。菇 二， o c-、【t门舛 伽的 片心尸。 tit 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 3 2 交沙霉素的生物合成 交沙霉素由那波链霉菌交沙霉素变种产生，是该菌的一级代谢产物( k u n i a k ie t a 1 ，1 9 7 8 ) 。其生物合成内脂环是由5 个乙酸单位、一个丙酸单位、一个丁酸单位、 一个羟基乙酸单位通过与脂肪酸合成相似的聚酮体途径缩合而成。其基本过程是由 低级脂肪酸经活化后，以丙二酰，丙酰或甲基丙二酰的形式，由酰基携带蛋白( a c p ) 介导经聚酮缩合酶将碳链不断延长，最后由硫酯酶催化进行碳链的环化形成聚酮体 内脂。在碳链的延长过程中可伴随还原、脱水等反应，导致聚酮内酯环中酮基或烯 基形成。聚酮内酯环形成后再进行核糖体的糖苷化、内脂环不同碳位上的甲基化、 羟基化及糖分子c 位上的酰基化修饰，最终合成了交沙霉素( 孙益和姚瑜，1 9 9 7 ) 。 1 3 3 交沙霉素的化学改造 交沙霉素同一般的大环内酯类抗生素一样难溶于水，味极苦，且在体内易酶解 而打开内酯环或脱去酰基失活，但可以通过对它的结构进行化学改造来克服这些缺 点，结果开发了乙酰交沙霉素和丙酸交沙霉素等( 村上恭子，1 9 7 3 ) 。目前对交沙霉 素改造的半合成新品种中有效的还不多，在国内仅有丙酸交沙霉素( 交沙咪) 投入 生产和临床应用，其结构式见图3 。从图3 结构中可看出丙酸交沙霉素主要是把丙酯 环上的羟基酯化，变成了一个丙酸酯。这一改造使它的性质显著改观，既增加了对 酸的稳定性，不受胃酸的影响，又提高了在血液中的浓度，同时还降低了毒性。这 主要是因为羟基酯化阻止了内酯环的打开，同时增加了整个分子的亲酯性，使之更 容易被吸收，也容易穿透细菌的细胞膜而发挥抗菌作用，而且这种改造消除了原有 交沙霉素的苦味，使之更容易被儿童服用。婴幼儿毛细支气管炎中的应用效果研究 表明( 汪濒和帅春，2 0 0 6 ) ，治疗毛细支气管炎除使用传统的常规治疗方法以外， 加用交沙咪有较好的药物依从性和较少的胃肠道反应与红霉素相比较，更适合低 幼儿童服用，能轻松解决儿童服药困难问题，提高患儿依从性，调节患儿失调的免 疫状态，让患儿很好配合治疗，疗效更佳。 ：屿 ： c 如 图3 丙酸交沙霉素分子结构式 f i g 3t h e m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f j o s a m y c i np r o p i o n a t e 9 交沙霉素生产菌株的菌种选育研究 1 4 交沙霉素的作用机理和临床应用 1 。4 1交沙霉素的作用机理 大环内酯类抗生素的作用机制主要是与细菌5 0 s 核糖体亚单位2 3 sr n a 的v 结 构域结合，促进转录阶段肽的早熟性解离。2 0 0 0 年n i s s e n 等( n i s s e ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 通过高分辨x 衍射测定了h a l o a r c u l am a r i s m o r t u i ( 一种古细菌) 中的5 0 s 核糖体亚 单位的晶体结构，同时测定a 、p 位点结合了底物类似物的核糖体亚单位的结构， 证明只有2 3 sr n a 的v 结构域存在肽转移酶结合位点，认为a 2 4 5l 位点可能与催 化有关。s c h t i n z e n 等对d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ( d e i r a 菌) 中的5 0 s 核糖体亚单位 及其与红霉素、克拉霉素、罗红霉素复合物晶体结构的研究进一步表明( s c h t i n z e ne t a 1 ，2 0 0 1 ) ，这几种大环内酯类抗生素均位于肽转移酶中心肽释放通道的入口处，并 且与2 3 sr n a 的v 结构域相连。s c h t m z e n 与合作者建立了一个较为理想的键合模型 ( 图4 ) ，在此模型中，德糖胺糖2 羟基通过三个氢键与a 2 0 5 8 、a 2 0 5 9 位点结合， 内酯环的6 羟基或6 甲氧基、1 1 羟基和1 2 一羟基各自键合a 2 0 6 2 、u 2 6 0 9 、u 2 6 0 9 位点，1 4 元环的大环内酯类抗生素依赖此结合位点阻断肽释放通道。 a 2 0 5 9 1 3 2 6 0 9 声 h o h o m e 图4 大环内酯与肽转移酶核苷的键合模型 f i g 4t h eb i n d i n gm o d e lo fm a e r o l i d et op e p f i d et r a n s f e r a s en u c l e o s i d e ( 摘自郑忠辉，石和鹏，金洁大环内酯类抗生素的发展与展望药学进展，2 0 0 5 ，2 9 ：1 7 ) 现有资料表明( 陈代杰，1 9 9 9 ) ，所有大环内酯类抗生素均可不同程度地抑制细 菌蛋白质的合成。大环内酯类抗生素能与细菌核糖体5 0 s 亚单位的2 3 s 核糖体r n a ( 2 3 s r n a ) 上的特殊靶位及核糖体上的l 1 6 蛋白质结合。而1 6 元环大环内酯类抗 生素能抑制肽酰基的转移反应，从而抑制肽链的延长。交沙霉素的作用机理与大环 内酯类的作用机制基本相同( 顾觉奋，2 0 0 1 ) ，主要是与核糖核蛋白体5 0 s 亚基结合， 选择性的抑制病原体蛋白质的合成过程。 1 4 2 交沙霉素的临床应用 交沙霉素于1 9 6 4 年由日本山之内制药株式会社研制而成，自诞生以来，它就在 世界范围内广泛应用于临床了。交沙霉素在国内的应用仅处于起步阶段，但是它独 1 0 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 特的优点和优秀的临床效果已越来越受人们的关注和重视。临床用于呼吸道感染、 支气管炎、肺炎、副鼻窦炎、中外耳炎、皮肤感染、术后创口感染、泌尿科、五官 科、口腔科感染等。k a s a h a r a 等以f 3 4 4 小白鼠为试验对象，进行了交沙霉素的慢性 毒性研究( k a s a h a r ae ta 1 ，2 0 01 ) ，评估交沙霉素的服用量应该在每天lo m g k g 体重 以下。 在口腔疾病的治疗中，交沙霉素显示了很强的优势( 孙大麟，1 9 9 4 ) 。厌氧茵是 口腔感染性疾病常见的病原体，目前临床上一些常用的抗生素对其感染的治疗都不 甚理想。浙江医科大学附属二院口腔科用交沙霉素和其他9 种常用抗生素对临床分 离的1 3 5 株厌氧菌进行药敏试验( 朱仲珍等，1 9 9 1 ) ，抑菌效果和临床实验研究结果 表明：交沙霉素对口腔常见的急性感染疾病有良好的临床疗效，其有效率可达 9 0 3 ，且均未出现不良反应，且交沙霉素对引起口腔疾病的常见病原体产黑素类杆 菌的抑菌作用明显强于其他9 种临床常用的抗生素，因此，交沙霉素更适用于治疗 口腔感染性疾病。刘剑刚采用替硝唑、交沙霉素及其联用对5 种厌氧菌的最低抑菌 浓度进行试验( 刘剑刚，2 0 0 0 ) ，结果表明，替硝唑与交沙霉素联合用药在抑制牙周 炎主要致病菌方面效果显著。 在毛细支气管炎的治疗中，交沙霉素显示了特殊的优势。交沙霉素具有减少气 道粘膜的粘液分泌，增加纤毛运动，加快排痰速度等作用，有助于毛细支气管炎咳 喘的缓解和气道炎症的消退。因此，交沙霉素治疗毛细支气管炎，能改善咳嗽、喘 憋等症状，促进肺部喘呜音的消失。治疗儿童毛细支气管炎除使用传统的常规治疗 方法以外，加用交沙霉素可获得更好的疗效，同时可调节患儿失调的免疫状态，治 疗总有效率可达到9 5 ( 汪灏和帅春，2 0 0 6 ) 。无独有偶，王胜兴等选择2 0 0 5 年4 月2 0 0 6 年4 月在山东省枣庄市立医院儿科就诊的毛细支气管炎患儿1 1 2 例进行临床 研究( 王胜兴，2 0 0 6 ) ，结果表明硝苯吡啶联合交沙霉素治疗毛细支气管炎疗效较 好，能有效缩短憋喘和肺部罗音持续的时间，。治疗总有效率可达到9 3 5 。 在治疗人类泌尿生殖道疾病中，交沙霉素疗效显著。解脲支原体( u r e a p l a s m a u r e a l y t i c u m ，u u ) 、人型支原体( m y c o p l a s m ah o m i n i s ，m h ) 和沙眼衣原体( c h l a m y d i a t r a c h o m a t i s ，c t ) 是人类泌尿生殖道常见的致病支原体。赵艳琼等采用体外培养和药 物敏感实验对妇科门诊1 1 1 例女性生殖道感染者的宫颈分泌物标本进行支原体感染 及药物敏感性检测( 赵艳琼等，1 9 9 9 ) ，结果表明，u u 对交沙霉素最敏感( 9 0 9 9 1 ， 其次为强力霉素( 7 8 3 8 ) 和克拉霉素( 6 7 5 7 ) ，u u 对1 2 种抗生素均存在不同程度耐 药，对交沙霉素的耐药率最低为2 ；卓佳对2 0 0 3 年国内医学期刊所刊登的有关解脲 支原体2 7 9 2 株对1 5 种抗生素耐药性分析的文章进行了回顾性统计、分析，结果见表5 ( 卓佳，2 0 0 4 ) 。由表5 可见，解脲支原体对原始霉素的耐药率最小，仅4 2 ，其次 为交沙霉素，仅5 0 ，其它抗生素的耐药率均超过了1 5 。原始霉素属氨基糖苷类， 虽其耐药率仅为4 2 ，在体外药敏试验中表现出高度敏感性，但由于毒性较大，且 交沙霉素生产菌株的菌种选育研究 来源困难价格贵，故临床上一般很少使用，只能在长期治疗效果不明显的情况下可 适当考虑。交沙霉素耐药率较低，毒副作用小，来源方便，应为目前治疗解脲支原 体的首选药物。三四年过去了，u u 、m h 等对交沙霉素依然表现出高度的敏感性和较 低的耐药率。林兰英在交沙霉素治疗泌尿生殖道解脲支原体、沙眼衣原体感染疗效 的研究中( 林兰英，2 0 0 6 ) ，应用交沙霉素治疗1 2 5 例u u 和c t 引起的泌尿生殖道感染， 2 疗程后治愈率累计达9 0 4 0 ，显示交沙霉素对解脲支原体、沙眼衣原体具有良好 的抗菌作用；陈国菊等在探讨深圳市非淋菌性宫颈炎单纯解脲支原体感染的耐药趋 势研究中( 陈国菊等，2 0 0 7 ) ，对3 0 8 例单纯u u 感染所致的非淋菌性宫颈炎患者的 宫颈管分泌物进行支原体培养及药物敏感试验，结果发现，u u 对强力霉素、交沙 霉素及美满霉素的敏感率高，耐药率低；赵政龙等在测定泌尿生殖道u u 和( 或) m h 感染对1 3 种抗生素的敏感性试验中( 赵政龙等，2 0 0 7 ) ，发现解u 谛( 或) 染的 2 6 3 f f 0 均对美满霉素、强力霉素和交沙霉素敏感性高，且耐药率低。各项研究结果表 明，解脲脲原体与人型支原体对常规抗生素已产生较高的耐药l 生率，在被u u 和( 或) m h 感染时交沙霉素可作为治疗首选药物。 、 表5 解脲支原体对1 5 种抗生素的药敏试验结果 t a b l e5t h es u s c e p t i b i l i t yr e s u l t so fu r e a p l a s m au r e a l y t i c u mt o1 5a n t i b i o t i c s 1 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 此外，在治疗由幽门螺杆菌( h e l i c o b a c t e r p y l o r i ，h p ) 引起的慢性胃炎和十二指 肠溃疡等疾病中，交沙霉素也显示出了较好的疗效。陆建云等通过临床试验发现， 交沙霉素、甲硝唑与果胶铋低剂量联合2 周疗法对h p 根除率达9 0 6 ，无严重副反应， 价格低廉，更适合国情，值得临床上广泛应用( 张驶和高胜华，2 0 0 0 ) 。 1 5 交沙霉素的定量检测方法 1 5 1微生物检定法 日本抗生物质基准解说( 1 9 8 6 年版) 收载的交沙霉素片效价测定使用b a c i l l u s s u l l i l i s a t c c 6 6 3 3 为试验菌( 即我国枯草芽孢杆菌6 3 5 0 1 ) ，培养基i ，p h7 8 8 o 。 在3 5 3 6 培养约9 h 后，抑菌圈产生明显双圈，因而影响了测定结果的准确性。黄 西萍等选用培养基i i ( 枯草芽孢杆菌，p h 7 8 8 0 ；藤黄八叠球菌，p h6 5 6 6 ) ，以枯 草芽孢杆菌和藤黄八叠球菌分别为指示菌，对交沙霉素效价进行测定，可得到清晰 且不易产生双圈的抑菌圈，其结果在统计学上无显著差异( 黄西萍等，1 9 9 3 ) 。 梁好容等对交沙霉素效价测定的实验条件进行了探讨( 梁好容和洪建文，1 9 9 6 ) ， 结果表明交沙霉素效价测定时，影响抑菌圈清晰度的主要因素是培养基成分和氯化 钠浓度，采用含3 氯化钠的i i 号培养基( p h7 8 8 0 ) ，以磷酸盐缓冲液( p h7 8 ) 为稀释溶剂，代替卫生部标准( 试行) 规定的i 号培养基及日抗基采用的培养基， 进行交沙霉素微生物效价测定，抑菌圈清晰，边缘光滑，无双圈，能准确测量，改 进后的主要生物检定统计指标优于当时标准检定条件下的结果。 ， 赵长敏等对交沙霉素效价测定的方法进行了改进( 赵长敏等，1 9 9 9 ) ，结果表明 在培养基i 号( p h7 8 。8 o ) 中加入0 2 0 3 的葡萄糖时，抑菌圈边缘清晰，菌层生 长适中，无菌膜无双圈，便于测量，效果优于i i 号培养基( p h7 8 8 o ) 和i i 号培养 基( p h7 8 8 0 ) 加入0 2 0 3 的葡萄糖。 1 5 2 高效液相色谱法 国内外很多研究人员利用高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 法进行了交沙霉素的定量检测。 农以宁采用反相高效液相色谱法( r p h p l c ) ，以p , b o n d a p a k c 1 8 ( 1 0 9 , m ，3 9 m m 3 0 c m ) 为固定相，甲醇0 。0 2 m o l lk i - - 1 2 p 0 4 缓冲液( 6 5 ：3 5 ，p h = 3 3 ) 为流动相，己 烯雌酚为内标，测定了交沙霉索原料和片剂的主成分含量，同时分离出5 种未知成 分( 农以宁，1 9 9 3 ) ，结果表明在o 0 2 0 1 m g m l 范围内，交沙霉素峰面积与浓度 呈线性关系，测试样品的相对标准偏差为o 1 4 0 3 9 ，方法回收率1 0 0 1 o 2 4 ； 1 9 9 8 年，r o e t s 等建立了一种等强度液相层析法( r o e t se ta 1 ，1 9 9 8 ) ，以非常稳定 的聚苯乙烯二乙烯多孔树脂p l r p s ( 8p m ，1 0 0 0 a o ) 为固相萃取顶柱( 2 5 0 4 6 m m i d ) ，乙腈0 2 m 磷酸缓冲液，p h1 0 0 水( 体积比5 2 ：2 0 ：1 0 0 ) 为流动相，结果很好 交沙霉素生产菌株的菌种选育研究 的将含有交沙霉素，丙酸交沙霉素，丙酸柱晶白霉素a 4 等8 种交沙霉素类似物混 合物分离开来，且各交沙霉素类似物的浓度线性范围为o 5