（法医学专业论文）常染色体三个ministr同步检测和mtsnp的微测序检测研究.pdf

四川大学博= 论文扯冰 声明 压人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论又中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四 川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 本学位论文成果是本人在四j | l 大学读书期间在导师指导下取得 的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 1 1 7 沁淋 艮编 触剥 四川大学博士论文杜冰 常染色体三个m i n i s t r 同步检测和 m t - s n p 的微测序检测研究 研究生杜冰 导师张林教授 法医物证教研室 四川大学华西基础医学与法医学院 中文摘要 目的d n a 降解检材的检测是当前法庭科学面临的重要挑战，m 觚s 1 r 技术和线粒体饼峨检澳5 是目前解决这一难题的重要途径和研究热点栅缸i s 琢 技术可望显著提高d n a 降解检材的检测成功率，但由于其扩增片段大，j 、受限 于s t r 重复序列的长度，导致仍有部分严重降解的检材无法检测：m t d n a 检 测可用于核d n a 无浚；检测的检书扎但尚存在个人识别力低的不足。本课题旨 在：建立新的m i a i s t r 荧光标记复合扩增检钡n 系统，为检测降解d n a 样本 提供有效手段。筛选成部汉族群体中具遗传多态性的m t - s n p 位点，在此基 础上建立多重m t - s n p 孵检测方法，提高m t d n a 的个 、识别能力，为 快速、高通量的m t - s n p 检测打下基础。 方法通过检索数据库，筛选出适宜的m 毡i s t r 基因座，进行群体遗传学 研究，建立加如i s 豫荧光# 示记复合扩增检测系统，应用毛细管电泳和荧光标记 四川大学博士论文杜冰 自动分型系统检钡艄产物。依据国际d 】吼蝴技术工作组( t w g d a m ) 的 指导方案，对面抽i s i r 复合扩增系统的灵敏度、基因座的种属特异性、案铡应 用、降解模型、陈旧血痕等法医学应用进行研究。在嘣刚p 数据库中选择在其 他群体具有多态性的7 0 9 、6 4 弱、8 0 2 0 、8 9 6 4 、1 0 3 9 8 、1 2 7 0 5 、1 2 _ 7 7 1 、1 4 5 6 9 、 1 5 0 4 3 等9 个m t s n p 位点，通过片段长度差异等位基因特异性p c r ( f id a s 阳t ) 技术对成都汉族群体遗彳亍了群体遗传学研究，获得具有多；蠡1 生 的六个皿圆q p 位点，建立相应的复合p a l 体系，采用s n a 酬彩r 埝进行复合 微测序反应并用美鼠a b l 3 1 0 j i 萎f 分析仪迸行分析检测。 结果成功构建了d i s l 6 7 6 、d 6 s 1 2 7 4 和d 1 7 s 1 2 9 9 的m h l k s t r s 荧光标 记复合扩增检测系统( 圳鼹- 加如i s 丁r 系统) 。经法医学应用性研究显示： 3 p 奴m 如i s 】m 系统的检浈i 灵敏度为魄模板d n a 并有较高的种属特异性； 通过6 个实际检案证明，该体系能用于法医学个人识别和亲权鉴定：通过对陈 旧血痕和降蒯的研究证明，该体系对降解检材有良好的扩增效果，较常规 试剂盒扩增成功率高，可用于降解样本的分型。 采用f i d a s - p c r 技术获得了成都汉族群体9 个吣n p 位点的群体遗传学 数据，在1 4 叫呒关个体的样本中检出了1 2 种单倍型，单倍型变异度为0 7 6 3 8 。 采用s i p s b 0 疖蛴盒，成功地建立了7 0 9 、6 4 5 5 、1 0 3 9 8 、1 2 7 0 5 、1 4 弱9 、1 5 0 4 3 等b 个皿s n p 位点的复合扩增及复合微测序方法。 结论本课题按照m i n i s i r 引物设计策略，成功地构建了3 个常染色体 m i n i s t r 基因座的复合扩增系统，能够在激光诱导荧光毛细管电泳自动分型的 检测平台上运用，获得可靠的遗传学数据。该系统具备了法医学实践应用的可 行性，为分析降解d n a了种有效的新方法。 采用f id a s 羽啄技术筛选出在成都汉族群体具遗传多态性的6 个删& 四 位点，观察到1 2 种单倍型，为比较不同群体间的数据提供了基础。采用跚蝴 试剂盒建立了多重m t 刚p 的微澳惦；检测方法，可用其对如蜊a 进行快速、高通 四川大学博士论丈杜沫 量检澳4 ，提高了m t d 小队的个 识别能力，为骨骼、毛发等样本的检测提供了一 种新的检验途径，其法医学应用尚需作进步研究。 【关键词】微小片段短串联重复；常染色体；线粒体d n a ； 单核苷酸多态性；复合扩增；d n a 降解；片段长度差异等位基因特异 性p c r ；微测序法 四川大学博士论文杜冰 a s t u d y o f m u l t i p l e x m i n i s t r w i t h t h r e e a u t o s o m a l l o c i a n d m t - s n pg e n o t y p i n gb ym i n i s e q u e n c i n g p o s i g r a d n a t eb 迦d “ t a t o rp r o l i nz h a n g d e p a r t m e n t o f f o r s i cg e 批t i c s w e s t c h i n a s c h o o l o f p 把c l i n i c a l a n d f o r e n s i c m e d i c i n e , s j 西蚴u 菌咒r 蚰y ，c h c n g d u , 6 1 0 0 4 1 ，p t lg a i n 色 o b j e c t i v ea n a l 螂o f d e g r a d e d d n a s a m p l e s i s a 驰t c h a l l e n g e f m f o r e n s i c 萨如m i n k s y ra m a y s a m dm 证o c h o n d d a ld n a ( m o n a ) 恼堍t h ec m m mh o t r e s e a r c hf i e l di nf o r e n s i cg e n e t i c s , 勰t l mp o m n t i a l 越c 瞄t os o l v et h i s 曲l a n 1 1 1 0 l 】| g hm i n i 娜t 啪h e i p 麒矧旧g 蜘- 瑚妇f m m nd c 删d n as a m p l e s , i t s t i l l 锄n o tb e1 0 0 s l l 嘲b e c a u s ei t sa m p l i f i e dl 唧i s 璐t z i c t e db yt h a to f s t r 砧p e 呶c m m n f l ym t d n a h a sb e 船r 印嘶e da sau s e f u lm a r k e rf o rt h ea m i y s i so f d e g r a d e dm a t e r i a l sa n ds a m p l e sc o n t a 倒n g l i t t l eo fn og e n o m i cd n a h d 】眠t h e t w om u t i n d ya n a l y z c dm t d n ah y p e r v a r i a b l er e g i o n s 毋r c s - r a ) p r o v i d el i m i m d i x w v e r o f d i s c d m i n a t i o n i n a f o r e n s i c c o n t e x t t h ep i l i 滞o f t h i ss t u d y i s t o e s t a b l i s h a 蜊3 p l e x - m i n i s t rm u l t i p l e xm “s t r 印咖a n d t oe s t a b l i s ha1 1 钾m t - s n p s m u l t i p l e x s y s t e m f o r t e s t i n g d e g r a d e d d n a s a m p l e s m e t h o d s p o t e n t i a lm i n i s t rl o c iw o t 出d n e df r o mg 衄b 越kt h e p o p i l l a 硒n 础鲻衄吐o f t h 蹴蚓e d e d i n i n 矾rl o c i w c r e p e r f l m m e d u s i n g t h e f l u o r e s c e n tp r i m c i s ，am u l t i p l e 蔗m i n i s t rs y s t e mi n c l u d i n gd 1 s 1 6 7 6 , d 6 s 1 2 7 4a n d 4 四j h 大学博士论文社冰 d 1 7 s 1 2 9 9w 罄c o n s t r u c t e d p c rp r o d u c t so ft h em u l t i p l e xm i n i s t rs y s t c l nw e m d e t e c t e db ya b i3 1 0g e n e t i ca n a l y z 比as e r i e so fv a l i d a t i o n 嘶e n t sw 哦 p e r f o m l e df o rt h em i n i s t rm u l t i p l e xs y s t e ma c c o r d i n gt o 曲br 咖m e d d 刮j o 咀0 f t b 时 t e c h n i c a lw o r kg r o u pd n a a m l y s i sm e t h o d sf r w g d a m ) n - m em t - s n pl o c i , i n c l u d i n gp o s i t i o n7 0 9 , 6 4 5 5 , 8 0 2 0 ，8 9 6 4 , 1 0 3 9 8 ，1 2 7 0 5 , 1 2 7 7 1 ，1 4 5 6 9a n d1 5 0 4 3 , w c r es e l e c t e d 细t h ep c l p i l l 商o ng e n e t i cr e s e a r c hb yf r a g m e n tl e n g t hd j s c 【p a ma l l e l e s p e , 旒p c r ( f m a s - e c r ) t c r 妇懿w a t ed c 咄尹e da c c o r d i n gt ot h er e v i s e d a n d e r s o f f s 辩q l l e 是6m t - s n p1 0 c if r o ma b o v e - m e n t i o n e d9m t - s n l l o c iw 锶 s c l l x ：t c do u tf o rt h e i rp o l y m o r p h yi na l e n 咖h a l lp o p u l a t i o n t h e y ms t u d i e db y m u l t i p l e xp c ra n df o l l o w e db ym 如j s e q 眦啷t h e 班d h l 曲o fm 面i s c q 伴岫喀 础w e r e d e t e c t e d b y a b l 3 1 0 g e n e t i c a n a l y z 既 r e s u l t s 3 p l e x - m i n i s t rw i t hd 1 s 1 6 7 6 , d 6 s 1 2 7 4a n dd 1 7 s 1 2 9 9l o c iw 罄 s u c c e s s f u l l yc o n s t n l c t e d m 鲫碰i v 矗yo f t l a i ss y s t e mw a s 0 5n gt e m p l a t ed n a i t s s p e c i e s 蝴w a s g o o d a f t e r t e s t i n g t h e a g e c i b l o o d m i 憾a n t i t h e d e g r , d e d d n a m o d e , i t d m o m l r a l e dt h a tt h i s 如缸琅l 既s y s t e mh a da b i 曲铷c c 鼯s f i 】lr a t ef o r a m l y s i so fa e g r a d e dd n as a m p l e s n i n em t - s n pl o c iw d e t e c t e d1 2d i f f e t 哪 b a p l o t y p e si nc h e n g d nh a l lp o w _ l a t i o ns a m p l e so f1 4 0u n r e l a t e dv o l t m t e e rd o n o r s t h e h a p l o t y p e sd i v e l s i t y 硼c a l c u l a t e d 舔0 7 6 3 8 a6 - m u l l i p l e xm t - s n p 吨f o r 7 0 9 , 6 4 5 5 ，1 0 3 9 8 , 1 2 7 0 5 ，1 4 5 6 9 a n d1 5 0 4 3 w a s e s t a b l i s h e d s u c c e s s f u l l y c o r d u s t o n w e 鲫豫s 曲l ye s t a b l i s h e dt i l em 幻i s l 取m u l t i p l e xs y s t e mw i t h t h r e ea l t l t 0 6 0 m a lm i n i s t rl o c i t h i sm i n i p l e xs y s t 跚锄b es u c c e s s 舢yu s e di nt h e a b i - 3 1 0d e t e c t i o no l a t f o n n t h i s $ y 哦e 1 1 1w a s p r o v e d 幻b er e l i a b l e t h em i n k s t r m u l t i p l e xs y s t e mc o u l d 渤an e wp o t e l 砌t o o l 衙坤v 盯h l gu s e f u li n f o r m a t i o n f r o m d e g r a d e d s , 锄p l e s a n d b e a p p l i e d f o r f o r e n s i c d n a t y p i 赡 s i xm t - s n pl o c i , i n c l u d i n g7 0 9 ，6 4 5 5 ，1 0 3 9 8 , 1 2 7 0 5 ，1 4 5 6 9a n d1 5 0 4 3 ，w h i c h 5 四川大学博士论文杜冰 w e l eo b s e r v e dt ob ep o l y m o w l l i ci no u rp o p u l a t i o n , t o g e t h e rw i t hat o t a lo f1 2 d i t i e r 衄tl l a p 蛔魄 嚣i no l l rs a m p l e sw d e t e c t e db yf i _ d a s - p c ra s s a y t i l e m i 玎j s i ：q 眦啦m e t h o df o r 蛐gm d t i p l e xm t - s n pw i t hs n a p s h o tk i tw a s s u c c e 酬a f l l ye s t a b l i s h e d t h i ss y s t e m 锄i n c r e a s et h ep o w n o fd 证a 由n 妇6 o f m t d n a a n d b e u s e d t o d e t e c t m t d n a w i t h e f l s c i e n c y 越d l i i 毋时虹啊l 蚺 t 脚w o r d s 】面趟，i r s 啦；e 删d 蛐t a 坶m t o r # a i s m s , f l o a s - f l c - x ,m 蛐s a l m a g a u t o s o m e , m i t o c h o i h , l 址g m o m e , m u m p 妇p ( 骂d e 删毗 6 四川大学博士论文牡冰 常染色体三个m i n i s t r 同步检测和 m t - s n p 的微测序检测研究 刖吾 目前法医学领域使用的研峨遗传标记主要有两种：短串联重躺u ( s h o r t t l m d e mr e p e a t ，s r r ) 徽苷酸多态性蟛en u c l e o f i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 。 短串联重复序列是广泛存在于人类d n a 中的一类具有长度多态性的m 渔串联 重复序列，其核心序列为2 - 6 b p ，具有片段短小、信息量大、遗传多态性高、易 于保存和检测等优点，成为目前法医学上应用最广泛的遗传标记。单核苷酸多 态性是人类基因组中单个碱基的变异引起的d 1 w 国i 歹0 多态性，在群体中的发生 频率不小于1 ，它是继短串联重复序列后的第三代遗传标记系统，具有数量多、 遗传稳定、易于高通量、自动化检测等特点，可用于个体识别和亲权鉴定，近 年来成为法科学研究的热点。 法医d n a 检材主要来源于现场，由于所处环境因素的作用，尤其是高温、 潮湿、微生物酶解等多种因素的作用，导致检材中d n a 受到破坏，d n a 链 发生断裂、分子变小而出现d n a 降觯q ，在大型灾难事件中( 例如在美国9 1 l 事件和印度洋海啸灾i 勤，d n a 检材更容易发生高度降解，导致d n a 严重破 坏。目前，法医d n a 分析采用的主要方法是利用商品化试剂盒进行s t r - p c r 检验。采用试剂盒对d n a 降唰佥材进行检测时，常发生大片段s i r 基因座分 型丢失甚至分型失败m 。d n a 降解检材的同认定和亲权鉴定，成为现阶段 法医d n a 检验的难题，也制约了许多重要物证的价值。 m i n i s r r 技术是目前检测降解d n a 的个新的发展方向。m i n i s t g 是在 四川大学博士论文 杜冰 原来s t r 基础上，通过重新设计引物，使引物尽可能靠近或位于楱心重复序列， 从而减小扩增产物长剧5 同。m i n i s t r 和原来的s i r 相比较，既要保持原有的 多态性及与原来s i r 分型的致性，又要使扩增片段达到最短。对于降解程 度相同的样本，r n i m s t r 由于其扩增片段很短，降解样本中短的d n a 片段也 可以是其目标模扳，导致m i n i s t r 的目标模板较传统翻取多，其扩增成功率 理论上高于传统姗t 。 线粒体是唯含有核外基因组的小细胞器，人体几乎所有的细胞中都含有 线粒体，线粒体d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 拷贝数远远大于核d n a ， 达数千到上万个，具有突变率高、母系遗传等特点。线粒体d n a 对于核d n a 无法检测的样本、无核d n a 检材( 毛干、指甲、牙齿、陈旧骨骼等) 及母系 亲缘关系的样本往往可进行有效的检测，因此线粒体d n a 检钡4 亦是目前检掰 降解d n a 的个重要途型“。传统的线粒体睑测主要集中在控制区，通过直 接测序的方式对高变i 区和高交i i 区进行检测，然而采用线粒体d n a 直接澳4 序 不仅成本高、耗费时间，而且由此获得的多态信息量很低，导致m t d n a 在法 科学个人识别中的应用能力非常有限。因此，提高m t d n a 的个人识别能力， 建立新代遗传标记m t - s n i 的检测方法十分必要。 当前检测s n p 所采用的方法较多，有直接测序、单链构象多态性技术 ( s s c ! p ) 、等位基因特异性p c r 、t a q m a n 法、单碱基引物延伸法、焦测序技术 等，不同的检测方法具有各自的特点和优势。片段长度差异等位基因特异性 p c r 技术( f i a g m e n tl 衄g f hd j t e p a n ta l l e l es p e c i f i cp c r ，f i d a s - p 僳) 是基 于等位基因特异性p c r 发展的种改良s n p 分型新方法，该方法简便，成本 低，但比较耗时，适宜子中、小实验室对已知s n p 位点进行群体遗传学分析； 建立在引物延伸法基础匕的微测序睑测法具有快速、准确的特点，是基于目前 法医d n a 检测设备的项新型技术，可对m t - s n p 进行多位点、高通量的检 测，从而弥补现有d n a 检测手段的不足，为法科学进行m t d n a 检验提供新 四川大学博士论文杜冰 的检测途径。 本课题的目的在于，通过研究复合扩增技术，构建常黼r n i m s t r 复合 扩增的荧光检测系统，并依据国际肼峨分析技术工作组f r w g d a m ) 指导方案 进行法医学可行性研究，以期为法医学常用的商品化试剂盒在分析降解m i a 受 限时提供有效的补充手段。通过f id a s _ p a t 技术，筛选在成都汉族具多态性的 m t - s n p 位点，并利用其建立多豇- $ n p 的微测序检测方法，提高 m t d n a 的个 人识别能力，为快速、高通量的m t - s n p 检测打下基础。 四川大学博士论文杜冰 第部分 三个常染色体minis t r 复合扩增分型及法医学应用研究 短串联重复彰0 ( s h o nt a r l d c mr e p e a t ，s i r ) 是法医学上应用最广泛的遗传 标记。s t r 具有体细胞的稳定性、遗传的稳定性以及不同分型方法、不同实验 室之间、单位点扩增与复合扩增分型的致性唧，s 1 限- p 皿检测己日益成为法 医学个人识别和亲权鉴定的主要方法。各种商品化期限检澳4 试剂盒不断涌现， 极大提高了实践检案能力，并有力推动了大规模的法庭科学叭a 数据库建设【堋。 大部分法医物证检材来源于现场。由于检材所处环境的物理、化学因素等 作用，造成检材中d n a 受到破坏，d n a 链发生断裂、分子变小而出现d n a 降 解。大量的研究已证明，应用商品化试帮睑检测降解d n a 时，经常得不到完整 的s 1 r 分型甚至分型失败，s 1 r 基因座扩增成功率与其等位基因的长度成反比 【俐。d 1 瞄阁嘲 检材的检测，成为现阶段法医d m 蛾濒4 的难题，也制约了许多 重要物证的价僮，进而影响到对结果的判断。 重新设计引物，减小扩增产物片段长度的“m m i s t r ”技术是目前解决d 0 峨 降解检刺栅4 的一个新的研究方向阿。 本研究拟通过检索数据库，筛选j o d i s ( c o m b i n e dd n ai n d e xs y s t c m ， c o d 璐) 系统且具有潜力能发展为m 面i s n i 的基因座，重新设计引物并进行群 体遗传学的调查。选择在中国汉族人群中多态性分布较好、个人识别能力较高 的三个s 1 r 基因座，发展为常染色乖耘m 面i s i r s ，用荧光分子标记引物后依靠毛细 管电泳仪自动分析平台构建常染色体m 妇i 趼i 复合扩增检测系统，并依据d n a 分析技术工作组( t w g d a m ) 指导方案进行法医学可行性研究，为检测降解 四川大学博士论文杜冰 功怕样本提供有效的补充手段。 材料与方法 1 材料 1 1 样本 本研究使用三组样本 第组：常染色体田缸i 锄基因座群体遗传学研究样本。从成都地区汉族 群体中，随机抽取l o o 名无亲缘关系个体的血样，班y i ：a 抗凝，- 2 0 保g 。 第二组：建立常染色体嘶口i s 砸谨因座复合扩增方法样本。从成者跳区汉 彭群体中，随机抽9 9 2 0 名无亲纺戋系卟钵的血群，e d t a 抗凝，- 2 0 c 保存，用 于建立常染色巾陆姗基因座复合扩增体系及参数优化。 第三组：法医学应用性研究样本 a 用于系统重复性研究的样本：抽取2 名志愿者血样2 皿l ，日玎划葱毙2 0 保存。 b 用于组织同性研究的样本：取同一尸体上的肌肉组织、皮肤、肝脏、 肾和尸血血痕用于研究。 c 用于种属特异性研究的样本：取常见动物猪、狗、羊、牛、兔、鸡、鱼、 豚鼠、鳝鱼、猴子的样本。 d 用于系统灵敏度的研究样本：美国p i 叩婚公司商品化掣 d n a 标准品 9 9 4 7 a 。 e 取同个体血液，分别涂于瓷砖、滤纸、白布、黑布等不同载体上，一 天后提取聊姨，用于载体基质对常染色体m 抽i 趼；复合扩增体系影响的研究。 f 从四川大学华西基础医学与法医学院物证教研室物证检案中抽取6 例样 四川大学博士论文杜冰 本，检验常染色体面j 期限复合扩增体系的实际应用能力。 g 用于降解检材的研究：四川大学华西基础医学与法医学院物证教研室保 存的陈旧血痕2 例，保存时间分别为1 7 年和2 哞。 h 制作降解模型的样本：采用慢性髓细胞性白血病细胞株k 5 6 2 细胞株。 1 2 试剂 罅合酶( t a i 强吼国产) ；心r 1 1 咿怕曲a d 每瑞典) ；p i 嘛氆c i ： h a l 珂a c i a ， 瑞典) ；3 s d n a i s o l a t i o n k i t f o r b l o o d a n d c e l l s v 3 0 ( 上海申能博采生物有限 公司，国产) ；d n ai q m 系统( p r o m e g a ，美国) ； 9 9 4 7 a ( p t t m 】e g a ，美 国) ；h i - d i t m f o t m a m i d e ( a p p l i e d b i o s y s t c m s p n 4 3 1 1 3 2 0 , 美国) ；g s s 0 0 r o x s i z e s t a n d a r d ( a p p l i e d b i o s y s t e m s p n 4 0 1 7 3 4 ，美郾；1 g 骶位a n a l y 珊b 恼 试i h 儿唾p p l i c db 蛔，s t i 洳s 踟蝌0 2 8 2 4 ，美国) ；a m p f s t ri d e n t i f i l e r ( a p p l i e d b i o s y s t e m s 美国) ；其余试剂均为国产分析纯。 引物分别由上海西缸咎n 和燃生橛懒司合成，大醢生，既吏术公 司荧光标记。 1 3 仪器 p 氓仪器( b i or a d ，美国) ；a b ip r i s m3 1 诽分析仪( a b i 从司，美 国) ；高速离心机( e p l 蜘d o r f , 德国) ；连续可调移液器( e p i c , 德国) ： u 弘2 6 0 紫外分光光度计( s h i m a d mu v - 2 6 0 ，日本) ；纯水系统( m m m ，法 国) ；超纯水系统( e a s y p u 佗r f ，美国) 等。 2 方法 四川大学博士论文杜冰 2 1 d i 峨的提取和定量 ac h c l e x - 1 0 0 法提取研峨( 详见附录一) 。 b 酚氯仿法提取d n a ( 详见附录二) 。 cd n ai q 聊系统提取陈旧检材吒a ( 详见附录三) 。 d 3 s d n a i s o l a t i o n k i t f o r b l o o d a n d c e l l s v 3 o 提取k 5 6 2 细胞株 吒a ( 详观 附录四) 。 ed i 妊的定量( 详见附录五) 。 2 2 三个常染色体m d n i s t r 群体遗传学研究 乞z 1 基因座的筛选 按照如下原则，选择基因座： a 在c m c 国印：伽啊m ，砌c 卿湖库，选择等应基因频率分布较均匀，杂 和度 0 7 ，重复单位为四核苷酸的基因座。 b 简单重复。 c 等位基因数为5 - 1 0 + 。 d 目前商品化荧光标记毛细管电泳激光自动分析试剂盒以外的并且不与之 有连锁关系的基因座。 e 引物之间特别是3 端不出现互补亭列。 f 扩增条件相近。 根据上述要求，查阅3 0 0 多个常染色体s n i 基因座，初步筛选出2 0 多个候选 基因座。 z z 2 引物的设计 根据c h l c 数据库得到上述基因座已公布的引物序列，并据此引物序列在 四川大学博士论文杜冰 n c b i ( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o l o g yi n f o r m a t i o n ) 数据库通过a 刚翌序获 取e 述基因座的完整序列信息，观察核心重复区域融0 的侧翼序列是否适宜设 计m 幻i 铘t 引物，然后应用在线引物设计程序p i 蛔c r 3 l n 】重新设计候选基因座的 引物，设置的主要参数包括：t m 值范围5 7 4 5 3 ，选择最佳温度为6 0 ；g c 含量的范围是2 a j 6 8 0 6 ；最短引物设为含有1 8 个碱基；引物结合区尽可能靠近 或位于杨嗵复序列，限制扩增片段长度 2 0 0 0 b p d n a s ei 作用后，高分子量的d n a 被消化为大小不等 的片段；随着d n a s ei 作用时间的延长，d n a 大分子片段明显减少，小分子 片段增加；在d n a s ei 作用1 2 0 分钟时，大部分的d n a 降解为小分子片段， 如图1 - 2 2 。 四川大学博士论文杜冰 图卜2 2d n a s ei 作用下，不同时间段d n a 降解的琼脂糖凝胶电泳图 未消化腿5 6 2 细胞阱情分子量 2 0 0 0 b p ；d & i 作用后，高分子量的d n a 被清化为 大小不等的片段， 鹱着d n a s ei 作用时间的延长，n 大分子片段明显减少，小分子片段 增加；在d ei 作用1 2 0 分钟时，大部分d n a 降解为小分子片段。 2 2 8 2 3 p i n s i 鼠对酶件解样本的分型能力 分别采用3 p l e x - m i n i s 漯统和商品化谤蒯盒( a m p f f s t ri d c n f i f i l c r ) 检测 未清化样本和d l n a i 作用1 2 0 分钟的酶降解研妊样本。采用3 p l c x - m i n i s t r 系 统和d e 埘国蓟砒凇潮4 未消化样本均可得到良好的分型结果。采用i d m l i f i l e r 试剂盒检测酶降解d n a 样本，大部分基因座无分型结果；采用3 p l c x - m i n i s 漯 4 1 - 四川大学博士论文杜冰 统进行检测，3 伽i n i s l r 基因座均可成功分型，并且与未消化样本的分型结果 致。陆蛐酮矗式剂盒检测未消化样本的结果见图l - 2 3 ，检测酶降解样本结果 见图1 - 2 4 ；3 p l e x - m i r d s t r 系统检测未消化样本的结果见图l _ 2 5 ，检测酶降解 样本结果见图1 - 2 6 。 固1 - 2 3 酗咖曲h 试剂盒检测未消化样本的分型结果 图中所示各基因座分型良好 四川大学博士论文杜冰 图中所示因喇a 样本高崩i 晕解，导致扩增产锄靶，大部分基因座无分型结果。 4 3 四川大学博士论文杜冰 固衢割汹j s r r 系统检测未消化懒分型练粜 图中所示三个曲i s l m 基因座分型良好 郾笳却】捌磁m 港测晦肖化l 岫1 聋本的分嘴果 图中所示三个向娜t 基因座均可成功分型目与未消化样本分型结果致。 4 4 泗川大学博士论文杜冰 讨论 1 3 p l e x - m i n i s l r 荧光标记复合扩增系统的建立 1 1 基因座的选择及特征 本研究选择的d 1 s 1 6 7 6 、d 6 s 1 2 晰d 1 7 s 1 2 9 9 三个基因座，分别定位于人 类第1 、6 和1 7 号染色体上，d 1 s 1 6 7 6 的杨堙复序列为【g a a 吼，d 6 s 1 2 7 4 的核 心重复序列为 c - t a t ，d 1 7 s 1 2 9 9 的杨喱复序列为【q 钮地，均是简单的四核 苷酸重复，易于标准化分型。三个锄基因座经法医学遗传多态性分析后，在 成都汉族群体中，d i s l 6 7 6 、d 6 s 1 2 7 4 采 d 1 7 s 1 2 9 9 的等位基因数目分别是9 、9 、 7 ；三个基因座分别进行卡方检验，结果表明各基因座基因型分布符合 吣w 缸i b c 曙平衡；d i s l 6 7 6 、d f 落1 2 7 骄口d 1 7 s 1 2 9 9 的个 识别能力分别达到 0 9 4 0 、0 8 7 9 、0 8 8 1 ，非父排除概率分别为0 7 3 7 、0 5 1 4 、0 3 4 3 ；此三个基因座 复合扩增累积的个人识别能力为0 9 9 9 1 3 6 0 6 ，累积非父排除概率为o 9 1 6 0 2 3 5 7 4 ， 豳比这三个锄基因座有较高的法医学应用价值。重新设计引物后，d 1 s 1 6 7 6 、 d 6 s 1 2 7 4 和d 1 7 s 1 2 9 9 的扩增片段大小范围在7 6 b p 1 1 3 b p 之间，由于其扩增片段 小，有利于检澳嗽a 降解检材，故选择此三个锄基因座构建常染色体l 玎矗l j 期 r 荧光标记复合扩增系统。 1 2 复合扩增引物设计 1 2 1 引物设汁与优化策略 复合扩增( m u l t i p l e xp c p ) 也称为多重p c r ，即在个p c r 反应体系中有 四川大学博士论文杜冰 两对或两对以上的引物同时扩增多个目标澎0 f 嘲。复合扩增可大幅度地简化 操作程序、节约时间和试剂，在法科学实践中可用极少量的检材同时扩增出多 个遗传标志而更显其优越性。对于锄基因座，成功的复合扩增应达到如下要 求：所有待扩增的基因座均得至怦衡扩增，无非特异性扩增产物。复合扩增方 法能否成功建立的关键在于引物设计，良好的引物设计能使复劬增条件的优 化容易觌! 蝴。 m 觚s 1 r 的显著特征是p a l 扩增产物片段小，因l h 柚面i 跚l 的引物设计特别 强调要尽可能减小扩增片段的长度，要求设计的e j i 物n - j 能靠近或位予防c f 重 复序列，同时引物又要能进行复合扩增，因此引物设计的要求和难度明显提高 旧。我们在i d 酐r 引物设计过程中，特别注意以下4 点：第一，从大量的备选 基因座中筛选目标基因座。在基因座筛选过程中，我们发现部分啾因座由 于杨l = l ：重复次数较多，不可能将其缩短到理想的长度；部分的基因座其核心重 复序列外的侧翼区序歹! i 存在寡核苷酸重复或多核苷酸重复等结构，不适宜设计 m i n i s l 佩引物，如我们初筛的备选基因座d 7 s 2 8 4 6 ，其为i c b 、的简单重复，具 7 1 峰争位基因，杂合度为o 9 3 7 5 ，但其杨d 重复序列外的侧翼区具有t 啦圮的二 核营酸重复，可自皂具有多态性，故此区域不宜设计引物，若远离其进行设计， 又背离了扩增片段近可能小的设计思路，由此导致部分基因座无法找到合适的 引物，需要从大量的备选基因座中筛选目标基因座。第二，采用p r i m e r 3 软件 设计引物时，各选基因座均采用相同的设定参数、固定引物的r 【r 值以满足复合 扩增要求，限定扩增片段长度 5 0 c ，否贝b 会引起 非特异性产物的延伸，导致产生错误的信息；此外，由于检测峰的位置主要由 微测序引物的片段长度决定，在同一反直管中，为有效地将各位点的蜂完全区 分开，不同位点的微测序引物长度应相差描个碱基。为了改变引物的长度， 区分不同的位点，q i l 妇等人在引物的5 端添加p o l y ( d c 卿p 0 1 y ( d ( “c 叫1 司。 本研究中亦采用了此方法，例如在7 0 9 位点的5 端增加了4 个c ，使测序弓i 物的长度为3 0 b p ，最终的电泳位置为3 1 b p ；同样，1 2 7 0 5 位点的的5 端增加 了1 7 个c ，使测序引物的长度为4 9 b p ，最终的电泳位置为5 0 b p 处，从而使 引物长度发生改变。 为了达到s n p 位点的特异性检测，必须对d n a 模板进行纯化处理，d n a 模板的纯化与s n p 分型的准确度密切相关【搠。在第步扩增产物中多余的引 物和d n t p 残留会影响单碱基延伸反应的进行；单碱基延伸反应后荧光标记的 d d n t p 残存会产生额外的荧光，导致样本不能被分型或者分型不正确。b e n d e r 等采用e x oi s a p 法去除多余的引物和d n t p ，取得较好的效梨雄”。我们也 采用e x oi 细谨法去除多余的引物和d n t p ，观察到这种方法简单、有效，在 四川大学博士论文杜冰 几乎所有检测的电泳图谱中均未发现干扰峰。 2 2 检测结果的分析 通过a b i3 1 0 型遗传分析仪检测微测序反应产物，我们可以得到m t - s n p 各位点的检测峰，多重单碱基延伸产物的片段大小可以通过内标g e n e s c a n l i z r u l 2 0 的标识来确定，并通过荧光标记物的颜色区分不同的碱基，从而判断 其分型结果。简言之，即根据峰的荧光标记物颜色确定s n p 碱基类型，根据 峰出现的位置来判断不同的m t - s n p 位点。但在实5 剥佥测结果中，我们发现峰 的检出位置常常与微测序引物所预计的位置存在些偏差，片段越短越容易出 现偏差，片段越长所受到的影响越小，我们推测其原因可能与单碱基延伸反应 产物长度、碱基组成、延伸引物中标记的荧光染料的种类等多种因素有关。例 如1 5 0 4 3 位点其微澳焖i 物长度为2 2 b p ，在1 5 0 4 3 - 4 3 和1 5 0 4 3 - a 的检出位置 之间存在一些偏差，但不影响分型结果，其原因可能与延伸引物中标记的荧光 染料的种类不同有关。此外，我们还注意到，同样本的不同m t - s n p 检测峰 中，显现出荧光信号强、弱不同，具体表现为峰高和峰面积的不同，这可能是 微测序反应是针对多个m t - s n p 位点而建立起的检测体系，具有综合性的扩增 和延伸条件，因而对不同m t - s n p 就体现出一定的差异。 3 群体遗传学研究 在成都汉族群体1 4 0 个无关个体的鲥、n 卜蹴点检测中，我们分别在7 0 9 、 6 4 5 5 、1 0 3 9 8 、1 2 7 0 1 5 、1 4 5 6 9 和1 5 0 4 3 等六个位点观察到多态性，而8 0 、8 9 6 4 、 1 2 7 7 1 等位点未发现有变异；在莸f f 】观察的样本中，这些位点的碱基变异均为转 换，且转换类型主要是嘌呤之间的转换，嘧啶之间的转换较少；呈现菠异较多 的s n p 位点为1 2 7 0 5 、1 0 3 9 8 和1 5 0 4 3 - - - 个s n p 位点，其碱基变异频率分别为 四川大学博士论文杜冰 5 7 1 、5 7 , 9 a x l 4 4 3 。a n d r e a s s o n 等 、报道在瑞典人1 0 3 9 8 碱基变异占1 1 1 ， 7 0 9 6 i 9 8 ，1 2 7 0 5 占5 9 阎，两者相比较，具有明显的群体差异，这些差异可 能是由于m t d n a 的商进眦率所引起自勺i 捌。因此，本研究结果t , 仅为m t d n a 多 态性在法医学中的应用提供基础数据，也为不同群体间的数据比皎提供了依据。 为了使这些m t l s n 啦点更好地应用于法医学，还有待分析这些加瞳s n p 位点 的异质性，分析在各种条件下保存的检材及各种介质上的生物性瘢痕的应用结 果。 4 s n 】啦澄方法的选择 作为第三代遗传标记，s n p 是当前法医学领域研究的热点。目前已建立起 来的对单核苷酸多态性进行分析的方法有直接澳孵法、等位基因特异性p c r 、 单碱基引物延伸技术又称为微测序( m i n i s e q u 删、焦测序技术 劬仰鲥种删、基质辅助激光解吸飞行时间质谱( m a i d i - t o fm s ) 等。不同 的检验方法有各自的优势和特点，这往往根据实验室的自身条件和检验目的而 选择相应的检测方法。 f l d a s - p c r 是基于等位基因特异性p 嘎发展的一种改良s n p 分