氯化血红素提取中超声波细胞破碎条件的研究.docx

氯化血红素提取中超声波细胞破碎条件的研究马永征 ,宋宏新 ,李敏康(陕西科技大学生命科学与工程学院 ,陕西 咸阳 712081)摘要 : 将超声波细胞破碎法应用于氯化血红素的提取 ,研究了破碎功率、时间和红细胞浓度(以红细胞与加入水的比例表示 ,v 红细胞 v 水 ) 对红细胞破碎程度的影响。实验得出 ,红细胞破 碎的最佳条件为 :超声波破碎功率为 200 w ,时间为 10 mi n ,红细胞与加入水的比例为5 1 。 关键词 : 超声波 ;氯化血红素 ;细胞破碎法中图分类号 : q681文献标识码 : a0前言血红素存在于红细胞内 ,红细胞经过破碎才能提取得到氯化血红素 。超声波是频率高于 20 k hz 的机械波 ,它在媒质中传播时可产生空化现象 ,空化中产生的极大压力会造成被破碎物的扩散及溶解 。因此 , 在提取细胞内物质的过程中可用超声波进行细胞破碎 。超声破碎的效率与声频 、声能 、处理时间 、细胞浓 度及细胞种类有关。20 k hz 左右的超声波作用于细胞悬浮液时细胞膜和细胞壁受到破坏 ,而频率增加对 细胞无明显影响 1 ,因此超声波对于一种细胞的破碎效率的影响可以从其功率、处理时间和细胞浓度 3 个 因素来探讨。目前 ,在氯化血红素提取过程中 ,红细胞的破碎方法主要采用机械搅拌的方法。细胞破碎的时间较 长 ,氯化血红素的得率不高 。为了缩短细胞破碎的时间并提高得率 ,文中采用了超声波破碎的方法 ,主要 研究了破碎功率、时间和红细胞浓度 3 个因素对超声波破碎红细胞的影响 ,并确定了最佳的细胞破碎条 件。1材料 、设备与方法1 . 1材料与设备1 . 1 . 1材料新鲜猪血 (陕西省咸阳市西郊屠宰场) 、氯化血红素标准品 ( 美国 acro se 公司进口 ,纯度为 99 %) 、丙 酮、鞣酸、碳酸钠、盐酸 (均为分析纯) 。1 . 1 . 2设备kq2250d e 型超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司) 、u v2265 f w 型紫外光谱仪 ( 日本岛津公 司) 、ir2440 红外光谱仪 (日本岛津公司) 、722 分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司) 。1 . 2方法1 . 2 . 1氯化血红素提取的工艺 2 将用 3 . 8 %的柠檬酸钠溶液抗凝的猪血离心 ,获得红血球。用超声波对红血球进行细胞破碎后 ,加入3 收稿日期 : 2004 - 11 - 16作者简介 : 马永征( 1979 - ) ,男 ,山东省安丘市人 ,在读硕士生 ,研究方向 :生化产品制备分离工程42 陕西科技大学学报第 23 卷5 倍体积含 3 %盐酸的酸性丙酮溶液 ,用 1 mol/ l 的盐酸调溶液的 p h 值为 2 . 2 ,充分搅拌 ,抽提 10 mi n ,离心收集提取液 ,向提取液中加入 5 %的鞣酸 ,搅匀静置过夜 ,氯化血红素呈针状晶体析出 ,离心收集沉淀 ,用蒸馏水洗涤 3 次 ,干燥后获得氯化血红素。1 . 2 . 2氯化血红素纯度的测定 3 氯化血红素溶于 0 . 25 % na2 co3 ,在 610 nm 处有最大吸收 ,可用分光光度法测其纯度。具体方法为 准确 称量干燥好的氯化血红素标准品溶于 0 . 25 % na2 co3 , 将其 分 别 配 成 浓 度 为 0 mg/ l 、4 mg/ l 、8 mg/ l 、12 mg/ l 、16 mg/ l 、20 mg/ l 的溶液 ,并分别在 610 nm 处测定其对应的 吸光度。以氯化血红素的浓度为横坐标 ,以对应的吸光度为 纵坐标 ,作曲线 ,结果如图 1 所示。准确称量干燥后的氯化血红素样品 , 将其溶于 0 . 25 % na2 co3 溶液 ,并配成 12 mg/ l 的待测溶液 ,在 610 n m 处测其图 1氯化血红素标准品的浓度曲线吸光度 ,其计算公式如下 :样品中的氯化血红素纯度 ( %) = 样品吸光度 99 %/ 0 . 0831 . 2 . 3氯化血红素的得率氯化血红素的得率 ( %) = 产品质量 纯度/ 0 . 382猪血中红细胞与血浆的体积比约为 1 1 。100 ml 血液理论上可得氯化血红素 0 . 382g ,即 50 ml 红细 胞理论上可获得 0 . 382 g 氯化血红素 4 ,本研究实验中投料量均为 50 ml 红细胞 。1 . 2 . 4正交试验设计选定破碎功率、时间和红细胞浓度进行单因素试验 ,在单因素试验的基础上确定正交试验的工艺条 件 ,通过正交试验确定优化的提取工艺条件。结果与分析22 . 1单因素实验2 . 1 . 1红细胞浓度对氯化血红素产量 、纯度和得率的影响 实验中红细胞的浓度以红细胞与加入水的比例表示 ,即 v 红细胞 v 水 。在破碎功率为 250 w ,破碎 10mi n 的条件下 ,研究了红细胞浓度对氯化血红素产量、纯度和得率的影响 ,结果见表 1 。表 1红细胞浓度对氯化血红素产量 、纯度和得率的影响 v 红细胞 v 水 10 1 5 1 1 1 产品质量/ g纯度/ %得率/ %0 . 326588 . 2675 . 430 . 328690 . 6577 . 980 . 330089 . 4577 . 27从表 1 看出 ,随着加水量的增加 ,氯化血红素的产量呈增加趋势 。当 v 红细胞 :v 水 为 5 1 时纯度最高 ,这时得率也最高 ,故应选用 v 红细胞 v 水 为 5 1 的红细胞浓度 。2 . 1 . 2破碎功率对氯化血红素产量 、纯度和得率的影响在 v 红细胞 v 水 为 5 1 的条件下破碎 10 mi n ,考察了破碎功率对氯化血红素产量、纯度和得率的影 响 ,结果见表 2 。从表 2 可以看出 ,随着功率的增大产量有所提高 ,纯度以 200 w 时最高 ,这时氯化血红素的得率也最 高。 1994-2013 china academic journal electronic publishing house. all rights reserved. 第 2 期马永征等 :氯化血红素提取中超声波细胞破碎条件的研究43 表 2功率对氯化血红素产量 、纯度和得率的影响破碎功率/ w 100 150 200 250 产品质量/ g纯度/ %得率/ %0 . 306189 . 4571 . 680 . 318590 . 6575 . 580 . 32891 . 8478 . 980 . 328888 . 2675 . 97破碎时间对氯化血红素产量 、纯度和得率的影响2 . 1 . 3在 v 红细胞 v 水 为 5 1 ,破碎功率为 200 w 的条件下 ,研究了破碎时间对氯化血红素产量、纯度和得率的影响 ,结果见表 3 。表 3时间对氯化血红素产量 、纯度和得率的影响破碎时间/ min51015产品质量/ g纯度/ %得率/ %0 . 305189 . 4571 . 440 . 373187 . 0785 . 040 . 351988 . 2681 . 31从表 3 可看出 ,破碎 10 mi n 时产量最高 ,这时纯度虽比 5 mi n 时低 2 . 38 % ,但得率却高出 13 . 6 % 。2 . 2正交试验结果在讨论了各项单因素影响的基础上 ,为试验中设计了三因素三水平正交试验 ,结果见表 4表 7 。表 4正交试验的因子和水平 a b c 1210 :15 :1150200510 3 1 : 1 250 15 注 : a v 红细胞 v 水 , b 破碎功率/ w , c 时间/ min ,下同 。表 5正交试验的结果试验号纯度/ %得率/ %abc1234567811122233123123123121232379 . 9285 . 8884 . 6987 . 0790 . 6588 . 2684 . 6983 . 4968 . 4872 . 9172 . 0575 . 3378 . 8174 . 1869 . 7974 . 69 9 3 3 1 81 . 11 72 . 36 表 6纯度的极差分析优水平k1k2k3r1r2r3r250 . 49251 . 68265 . 98260 . 02249 . 29254 . 0683 . 5083 . 8988 . 6687 . 0183 . 1084 . 695 . 563 . 12a 2 b 2 c2 254 . 06 260 . 03 251 . 67 84 . 69 86 . 68 83 . 89 2 . 79 表 7得率的极差分析优水平k1k2k3r1r2r3r213 . 44213 . 60228 . 32226 . 41216 . 84218 . 5971 . 1571 . 2076 . 1187 . 0183 . 1084 . 695 . 563 . 12a 2 b 2 c2 220 . 60 220 . 65 215 . 02 73 . 53 86 . 68 83 . 89 2 . 79 1994-2013 china academic journal electronic publishing house. all rights reserved. 44 陕西科技大学学报第 23 卷由表 6 、表 7 可知 ,影响氯化血红素纯度因素和得率的主次顺序是 : a b c。影响两者的主要因素是红细胞的浓度 ,即 v 红细胞 v 水 。在超声波破碎红细胞过程中 ,加入适量体积的水可使红细胞具有一定 的膨胀度 ,在有助于细胞破碎的同时又能减少血红蛋白在提取液中的溶解 ,这对于提高氯化血红素的纯度 是至关重要的。破碎功率和时间也不同程度影响了红细胞的破碎。在超声波破碎过程中会产生热量 ,如 果温度上升太高 ,可能使部分血红蛋白变性沉淀 ,阻碍血红素的释放 。另一方面 ,血红素在高温下不稳定 , 通冷却水可以防止温度上升。2 . 3 超声波法和机械搅拌法细胞破碎得到的氯化血红素的纯度和得率比较机械搅拌时间为 30 mi n ,而超声波破碎的时间仅为 10 mi n ,破碎的时间缩短了 2/ 3 。比较表 8 的结果 可以看出 ,两种破碎方法所得氯化血红素的纯度差不多 ,但是超声波破碎法制备的氯化血红素得率要比机 械搅拌法高 15 %左右 。表 8两种破碎方法制备氯化血红素的结果细胞破碎方法序号纯度/ %得率/ %12391 . 3490 . 4691 . 1577 . 9678 . 0577 . 99超声波法12391 . 2592 . 0192 . 1664 . 3963 . 8963 . 12机械搅拌法结论3(1) 通过正交试验可以确定超声波细胞破碎的最佳条件为 :红细胞与加入水的比例为 5 1 ,超声波破碎功率为 200 w ,时间为 10 mi n 。(2) 尽管超声波破碎法产生的噪音较大且破碎过程中会产生热量 ,但是该法操作简单 ,处理容量大 ,适 用于氯化血红素的大规模生产 ,因此具有一定的应用前景。参 考 文 献1王霜 ,吴振强 ,余若黔 ,等. 谷氨酸菌体破碎条件的优化研究j . 生物技术 ,1997 ,7 ( 5) : 2630 .2张爱华. 高纯度血红素的制备j . 中国医药工业杂志 ,1993 ,24 ( 1) :45 .3谢新华 ,马晓国. 新法制备血红素及纯度分析 j . 今日科技 ,1998 , ( 10) :11 .4丁建平 ,蒋长苗 , 刘旭光 ,等. 猪血红细胞中超氧化物歧化酶和血红素同步提取纯化的研究 j . 吉林农业大学学报 , 1996 ,18 ( 2) :6568 .study o n usi ng s uperso nic wa ve to d is rupt red cell i n extractio n of hem i nma yo ng2zhe ng , so n g ho ng2xi n ,l i mi n2ka ng( school of l if e science a nd engineering , shaa nxi u niver sit y of science & technolo gy , xia nya ng 712081 , china) abstract : sup er so nic wave wa s u sed to di sr up t red cell i n e xt ractio n of he mi n . we st udied t he eff ect of po we r , ti me a nd co nce nt ratio n of re d cell ( u si ng p ropo r tio n of vol u me bet wee n re d cell a nd di stilled wa2t er to e xp re ss t he co nce nt ratio n . v red cell v water ) to di sr up tio n of re d cell . exp e ri me nt s i ndicat ed t he op ti2mu m co