（有机化学专业论文）毛细管电泳与高效液相色谱之间导向关系的研究.pdf

ab s t r a c t q u a n t i t a t i v e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e a n d h p l c h i g h -p e r f o r m a n c e c a p i l l a ry e l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) a n d h i g h =p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a r e t w o o f t h e m o s t f r e q u e n t l y u s e d m o d e rn s e p a r a t i o n t e c h n i q u e s . i n t h i s p a p e r w e h a v e u s e d 0 -c d a s c h i r a l s e l e c t o r f o r t h e s e p a r a t i o n o f a s e r i e s o f p o s i t i o n a l i s o m e r s a n d c h i r a l p h a r m a c e u t i c a l s , t h e a i m o f t h e p a p e r i s r a t h e r t o f o c u s o n s e p a r a t i o n w h e r e t h e m e c h a n i s m i s t h i s s a m e i n b o t h c e a n d h p l c . b a s e d o n t h e r e l a t i o n s h i p o f m o b i l i t y a n d t h e c o n c e n t r a t i o n , w e u s e d n a t u r a l r -c d a s c h i r a l s e l e c t o r i n c a p i l l a ry z o n e e l e c t r o p h o r e s i s ( c z e ) t o s e p a r a t e a s e r i e s o f p o s i t i o n a l i s o m e r s a n d c h i r a l p h a r m a c e u t i c a l s . w e m e a s u r e d t h e b i n d i n g c o n s t a n t b y c o m p u t e r - d o u b l e re c ip r o c a l m e t h o d , w h i c h g i v e s g o o d f i t f o r a s i m p l e t r e a t m e n t o f 1 ; 1 b i n d i n g e q u i l i b r i a . f u r th e r m o r e , t h e e ff e c t s o f p h o f b a c k g r o u n d e l e c t r o l y t e , 0一c d s c o n c e n t r a t i o n a n d o r g a n i c a d d i t i v e s w e r e i n v e s t i g a t e d , a n d o p t i m i z e d c o n d i t i o n f o r s e p a r a t i o n w a s a l s o o b t a i n e d . i n o u r w o r k u s i n g a n a s t e c c y c l o b o n d i r -c d c o l u m n , w e s e p a r a t e d a s e r i e s p o s i t i o n a l i s o m e r s a n d c h i r a l p h a r m a c e u t ic a l s i n h p l c . t h e e ff e c t s o f t h e m o b i l e p h a s e s , p h a n d c o n c e n t r a t i o n o f t h e b u ff e r , t y p e s o f o r g a n i c s o l v e n t s ， e t c , w e r e i n v e s t i g a t e d i n t h e e n d , w e h a v e s u c c e s s f u l l y p r o v e d t h e q u a n t i t a t i v e l i n k b e t w e e n r e t e n t i o n f a c t o r ( k ) i n h p l c a n d b in d i n g c o n s t a n t ( k ) i n c e . o t h e r w i s e , t h e c a c u l a t i o n v a l u e o f e ff e c t i v e c o n c e n t r a t i o n o f 0 -c d i n a c y c l o b o n d i c o l u m n w as o b t a i n e d . k e y w o r d s : 叭 d -c d ( 13 -c y c l o d e x t r i n ) c a p i l l a r y e l e t r o p h o r e s i s ( c e ) c a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s ( c z e ) h i g h -p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ch i r a l s e l e c t o r e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n 元素所:t级硕士毕业论文 2 0 0 1 年5 月 第一章前 言 一 毛细管电泳和高效液相色谱导向关系建立的意义 1 .毛细管电泳和高效液相色谱两种分析手段的特色 高 效液 相色谱( h p l c ) 和 毛细管电 泳 ( c e ) 作为 两 种现代分离 分 析技术， 各有 千 秋。 高效液相色谱发展到今天已 相对成熟， 它具有重现性好， 浓度检测限低等特点， 且能用于分析和制备分离。虽然目 前在手性分离理论上还没有实质性的突破，但人 们己积累了丰富的应用研究成果;然而，其方法开发时间长，分析运行耗时， 成本 昂贵，对于手性物质的分离更是如此，一根手性液相色谱柱的售价往往不低于一万 元， 况且迄今还没有发现适用性广的手性柱，往往一根手性柱所能分离的手性物质 的种类和数量极其有限。 与高 效液相色谱( h p l c ) 相比， 高效毛细管电 泳( c e ) 分离效率高， 在极短的时 间内即可获得令人满意的分离.另外，毛细管电泳运行试剂和样品消耗量少， 容易 通过改变电解质的组成或不同的手性选择剂以提高分离选择性n -z i ;但是毛细管电 泳是近十余年才出现的新技术，尚不十分成熟，而且它也难以用于制备分离3 1 2 .建立导向关系的意义 鉴于以上综合考虑高效液相色谱和高效毛细管电泳各自 的特点、局限性以 及今 后发展的趋势，可以认为研究二者之间的定量关系，建立一种相互导向的关系很有 必要。它不仅能将h p l c和c e优势互补，减少建立手性分离方法的时间和费用， 同时也能促进分离理论的发展。 最近国际上有人对毛细管电泳和高效液相色谱之间的内在联系以热力学理论为 基础进行了初步探讨(4 1 ，并且用少数几个手性药物进行了验证【5 -6 1 .本论文将选择一 系列碱性手性医药化合物和位置异构体为待分离化合物，系统深入地研究含手性添 加剂的毛细管区带电泳和手性高效液相色谱( 手性柱含相同手性选择剂) 之间的关 系，以热力学和数理统计学为基础，建立二者分离条件之间的相互导向模型。 二.论文的意义和成果 元素所9 8 级硕士毕业论文2 0 0 1 年5 月 实现异构体尤其是光学异构体的高效、快速分离一直是国内外分离科学的的难 点和热点。虽然高效液相色谱在异构体分离上已积累了丰富的经验，但是其分离方 法开发时间长，分析运行耗时，成本昂贵。与高效液相色谱相比，毛细管电泳分离 效率高，速度快，成本低，但是它尚处于摸索阶段，还不十分成熟。本论文正是基 于以上考虑，本着优势互补的原则，对 日 p l c和 c e之间的内在联系进行探讨， 研究二者之间的相互导向关系。迄今，国内尚无人开展这方面的工作。该理论可以 推广应用:( 1 ) 对于某些不适于用c e进行分离的 情况( 例如制备分离和痕量分析) ， 可以先用 c e快速优化筛选分离条件，将筛选的最佳条件用于 h p l c ，大大节省 h p l c分析方法开发的时间和费用;( 2 ) 同理， 可以 将 h p l c作为c e的导向， 并 预测分离结果;( 3 ) 既然 c e具有快速、高效、成本低等优点，那么利用它从一系 列手性选择剂中快速筛选出合适的手性选择剂，无疑为研究新的 h p l c的手性固 定相提供了强有力的工具; ( 4 ) 利用该理论还可以推出手性柱的有效手性选择剂的 浓度( c . 小 本论文就详细作了 这方面工作， 成功地推算出手性柱上的有效手性选择 剂 浓度， 并 进一步推算出k e n ( 有效结合常数) 等 参数， 这方面工作尚 无文献 报道。 本文分别在 c e和 h p l c上对一系列碱性手性医药及位置异构体进行分离研 究。利用毛细管电泳法对所选研究对象进行研究，考察了各种影响分离的因素，包 括缓冲液组分， 浓度和 p h值的影响， 还考察了 手性选择剂在分离中的作用机理。 另外， 对手性选择剂的浓度， 有机添加剂含量对分离效率的影响也进行了深入探讨， 总结了一般规律.本文还初步开展分离条件的优化工作，筛选出研究对象的最佳分 离条件。 在h p l c上研究了 流动相组成对分离的影响， 有机添加剂的 种类和含量， 缓冲 液的组成， 离子强度， p h 值对分离的 影响也进行了 详细的 讨论。 元素所9 8 级硕士毕业论文 2 0 0 】 年 5月 第二章建立导向关系的理论依据 众所周知， 在反相h p l c中， 主要依靠分析物疏水性的差别进行分离; 而在c e 中，分析物主要依靠其自身所带电荷与其大小之比不同而得以分离。然而对于异构 体分离， h p l c和c e则都是主要利用各异构体与选择剂结合能力的差异进行分离。 以 手性选择剂环糊精为例，由 于对映体分析物与环糊精之间 存在着不同的相互包结 作用，导致这两种不同的包结络合物以 不同的 洗脱速度1 淌度被检测器所检测v 1 基于 h p l c和 c e具有共同的分离机理， p . d . f e r g u s o n , s h a n o n .g . p e n n和 a b d e lw a h a b a l u n e d 等发现对于的1 : 1的结合平衡可以 找到一种定量关系将h p l c 中 测得的 保留因子和 c e中 测得的结合平衡常数联系起来8 -1 3 1 。该关系表明:当 操 作条件( 温度、背景电 解质、浓度等) 相同时， 导致两种分离技术中化合物保留不同 的主要原因是所采用的手性选择剂浓度不一样。因此，在一定条件下可建立两种分 离 模式的 相互导向 关系。 该理论 可以 推 广应用: ( 1 ) 对于某些不适于 用 c e进行分 离 的 情况( 例如制备分离 和痕量 分析 ) ， 可以 先用c e快速优化h p l c的操作条 件; ( 2 ) 同 样， 可以 将h p l c作为c e的 导向， 并预 测分离的 结果; ( 3 ) 既然c e具有快 速、高效、试剂用量少等优点，那么利用它来快速筛选一系列新型手性选择剂，无 疑为研究新的 日 p l c手性固定相提供了强有力的工具，但目前尚没有这方面的专 门 报道. d .w.a r m s t r o n g等人正是在成功地将大环抗生素 作为 c e手 性添加剂的 基础上才考虑其作为h p l c手性固定相的可能l1 .， 川 。 一高效毛细管电泳中的结合平衡 前面我们以发现，分析物与选择剂之间作用力的强弱通常用结合常数 ( 亦称稳 定常数)k来表示。对于， :， 的快速可逆平衡: a+ s a 一一 分析物5 一手性选择剂 结合常数可表示为: a s 分析物与手性选择剂包结物 元素所9 8 级硕士毕业论文 2 0 0 1 年5 月 k = a s / a s 若用n 代表单位体积内的分子数，式 ( i )可表示为: k = n a s / n a s n a 5 / n ; 可以 看作是分 析物在固 定 相 和流动相中 的 摩尔 数比 。 t e r a b e 等把c e中的 手 性添加剂看作假想的固定相 16 ，则分析物在添加剂和背景电 解质中的摩尔数比 可被 看 作c e 中 的保留因 子狡 e 1 . c e中的结合平衡 s .a . c wr e n 和a . s h ib u k a w a 等 1+ 7 .2 , 定量 研究了以 环糊精为 手性选择剂时的 结 合平衡。关玉福研究了高效毛细管电泳中的化学平衡，总结了电泳淌度及分离度与 化学平衡之间的关系2 2 1 。可用于测定主客体分子相互作用的结合常数的方法很多12 3 - 2 5 1 ，如光谱法12 6 1 、分离法12 7 、量热法国、电 位法四和反应动力学13 0 -3 3 等方法。 毛细 管电泳是近年来发展起来的一种新型分离分析技术，它可有效地被广泛用于测定分 子间相互作用的结合常数，如分子胶束、 环糊精、抗体、蛋白、 r n a和d n a等与 其它分子间的相互作用。本论文求取 k采用如下方法:固定溶质的总浓度不变， 不断改变手性选择剂的浓度，由 溶质迁移率和手性选择剂浓度的关系求解3 1 -3 5 ) 一系 列位置异构体以 及手性医药化合物与手性选择剂 ( 环糊精) 之间相互作用的结合常 数。 2 .结合常数k的求解 用毛细管电 泳法来求解结合常数需满足三个基本条件3 8 1 ，一是溶质分子的迁移 率和结合物的迁移率要有差别。在自由溶液中，中性溶质分子和环糊精的相互作用 不适合于用毛细管电泳来进行研究;二是在毛细管中要有足够浓度的配体和结合物 存在;三是平衡时间要小于电泳的分离时间。本论文是以天然环糊精作为手性选择 剂， 通过不断改变其浓度，测定分析物分子相应的迁移率，因而获得结合常数。 在c 中， 我们以“ ， 代表分析物a在自 由 溶 液中 的电 泳淌 度，“ 。 代 表手 性 选 择剂 s浓度无穷大时分析物 a的电泳淌度，即分析物手性选择剂结合物 a s 的电 泳淌 度。11 , 为 分析 物分子的 表观迁移率， 一 为 校正 迁移率， s 代表手性 选择 n素所9 8 级硕士毕业论文 2 0 0 1 年 5 月 剂的 游离浓度， a s 为结合物 的 浓度.带电的分析物分子 a在电 泳中的 迁移率分 别由自 由 粒子和结合物的迁移率共同 决定13 7 1 . ” . _ 一 i s l s + a s 结合式 ( 1 )和式 ( 2 )可得 u什 s + a s ( 2 ) 协1 = 1 + k c e s ( 3 ) 将式 ( 3 )变形为 p ;，= 一 竺f - 9 c 1 + k c e s 式 ( 4 ) 是求解结合常数的 基本关系式 式 ( 4 )又可整理为: +p c( 4 ) 1_ pf一 pi 1 1 ( “ f - u ; ) k c e s 上一 一上一一 门 二曰吸 j i p f 一护 c 据 式 ( 5 ) 可知，以 1 / s 为自 变量， 1 / u r u : 为因 变量进行线形回归， 可由 直 线截 距3 8 -4 1 和斜率之比 求得环糊精与分析物a 的结合常数k c e - s .a . c . wr e n 和r . c . r o w e 等发现，改变手性选择剂的浓度会引起分析物电泳淌度的变化，引起这种变化的原 因有两个，一是相互结合作用引起淌度的变化，由式 ( 2 )可知，当选择剂的起始 浓度不同时，相应的各物质的平衡浓度不同，分析物和结合物的摩尔分数值也不一 样，因而。 ; 值也随之变化; 另一个是溶 液粘度变化引 起淌度变化，当 手性选择剂 s浓度较高时，由于带电分析物的淌度和溶液的粘度成反比，ua1 / q ,溶液粘度 增加，带电粒子的淌度减小。需要特别指出， 对于分析物与手性选择剂相互作用较 弱的结合体系而言，在较高的环糊精浓度下由于粘度的变化引起带电粒子淌度的变 化远大于由于相互结合作用引起的淌度变化，所以有必要对由于粘度变化导致带电 粒子迁移率的变化进行校正l2l。校正的方法很多，本论文中采用电流值来校正粘度 14 3 ) . u , = “ ; 4 / 4 。 二 u ,ij i ( 6 ) 式中“ 1是校正 后的 迁移率，u : 是实 验测得的 表观迁移率，r . 11 。 和 1 , 1。 分 别是 有环糊精存在时和环糊精浓度为零时溶液的粘度和电 流值。以“ ;.取代“ . 进行计算。 7 l 索 所9 8 级硕士毕业论文 2 0 0 1 年 5 月 s . g . p e n n 和d . m . g o o d a ll 用 热稳定的毛 细管粘度计测定n / r l o ， 其值与 环糊精 的浓度成幂次级数，用数学关系表达式如下: r / q 。 二 1 + 1 .3 9 5 c + 3 5 . 8 9 c z ( 7 ) 校正后的电泳淌度对环糊精浓度作图，与给定的结合平衡曲线一致。 p .d . f e r g u s o n 等也用毛细管粘度计测定了 相对粘度， 他认为 用c e中 测得的电 流比来计算相对粘度重现性不好，因为实验过程中有机溶剂的挥发引起电流基线不 稳 定 (44 1 下面以本论文手性医药扑尔敏为例，以毛细管电泳法求其一对对映体与手性选 择剂0 -c d的 结合常数k s 和k r 0 -c d的 浓 度从0 增加到， 6 m m o l/ l ， 而 扑尔 敏的浓度保持恒定，进样后在毛细管中溶质的浓度和进样前溶质浓度相等。在求解 结合常数的过程中，用0 -c d的总浓度代替其在溶液中的游离浓度进行计算，为 表2 - 1 - 1 0 -c d 的浓度和溶质扑尔敏迁移率的关系 0 一 - c d的浓度 ( mo l/ 1 . 1 0 1 ) 03 . 8 25 . 3 77 . 4 99 . 9 8 1 2 . 1 01 3 . 2 01 6 . 1 0 ( t(m in ) 16 . 0 78 . 6 79 . 1 61 0 . 3 11 0 . 8 51 1 . 5 41 1 . 7 21 2 . 6 1 26 . 0 78 . 8 99 .4 21 0 . 6 91 1 . 1 71 1 . 8 5 1 2 . 0 41 3 . 0 0 p, ( m l v - .s - . 1 0 -8 ) 11 . 5 8 61 . 1 1 11 . 0 5 20 . 9 3 00 . 8 8 80 . 8 3 50 . 8 2 20 . 7 6 4 21 . 5 8 61 . 0 8 31 . 0 2 30 . 9 0 10 . 8 6 20 石1 30 . 8 0 00 . 7 41 “ i ( m w- .s - . 1 0 -8 ) 11 . 5 8 61 . 1 1 21 . 0 5 30 . 9 3 00 . 8 8 80 . 8 5 30 . 8 2 30 . 7 6 3 21 . 5 8 61 . 0 8 31 . 0 2 40 . 9 0 20 . 8 6 20 . 8 1 30 . 8 0 00 . 7 4 2 实 验条件: 0 . 1 m三乙 胺 冰醋酸缓冲液， p h = 4 .0 , 5 % 乙 精 减少系统误差，特别是对于结合常数较大的体系，要求0 -c d的起始浓度远大于 溶质的总浓度，故选择溶质的浓度约小于 0 . 0 5 m m o l/ l 。本实验由于0 -c d溶解 元素所9 8 级硕士毕业论文 2 0 0 1 年5 月 度的限制，选择其最大的浓度为 1 6 m m o l/ l ，在此范围内也能很好地描述整个关系 曲线。对于弱相互作用体系，其结合常数相对较小，所以要求手性选择剂有很大的 溶解度。 溶 质分 子扑 尔敏在不同p -c d浓度时， 其迁移时间t ， 表观迁移率11 ; ， 校正 后 迁移率“ : 列于表2 - 1 - 1 , p -c d 浓度为o m m o l/ l 时 溶质分子的 迁移率为11 , ( 自 表2 - 1 - 2 扑尔敏淌度差倒数 c 1 / d u)随环糊精浓度倒数 ( 1 / l )变化 1 花 l l ( x ) ( u mo l) 6 2 . 1 17 5 . 7 68 2 . 6 4 1 0 0 . 2 0 1 3 3 . 5 01 8 6 . 2 22 6 1 . 7 8 1 怂“ ( y ) 从s . m -2 . 1 0 0 1 1 . 2 1 41 . 3 1 01 . 3 3 2 1 . 4 3 31 . 5 2 31 . 8 7 4 2 . 1 0 5 21 . 1 8 41 . 2 7 1 1 . 2 9 41 . 3 8 11 . 4 6 0 1 . 7 7 81 . 9 8 6 实验条件同 表2 - 1 - 1 其中 【 l l 一p - - c d的 浓度p r 一 扑尔 敏分子的自 由 迁移率 “ !一 一扑尔敏分子的表观迁移率” 。.一 一扑尔敏分子的校正迁移率 u 7 一扑尔 敏分子与0 -c d的 结合 物的迁 移率 k c e - 一 扑尔敏分子与0 -c d的结合物的结合常数 “ 一 即自由 迁移率与校正迁移率之差 结合前面的公式 ( 5 ) 令y = 1 / ( u r u ; ) , x = 1 / c , a = 1 / ( u r “ c ) c e， b = 1 / ( ” 广 p 。 ) 则公式 ( 5 ) 变形为丫 二 a x + b ， 通过计算机数据处理方法 ( 双倒数法) 作出回归直线 ( 图2 - 1 - 1 ) 二司1 勺认 i al i 元素所9 8 级硕士毕业论文 2 0 0 1 年5 月 图2 - 1 一 ， 求解扑尔敏与0 -c d稳定常数的双倒数法 直线1 y = 0 .0 0 4 5 x + 0 . 9 6 0 4 k , = 0 . 9 6 0 4 / 0 .0 0 4 5 = 2 1 3 .4 2 直线2 y = 0 .0 0 4 1 x + 0 . 9 5 5 6 k 2 = 0 . 9 5 6 6 / 0 . 0 0 4 1 = 2 3 3 . 0 7 由迁移率) ，由表中看出0 -c d浓度升高以及溶液粘度增加，会导致迁移时间增 加，溶质表观迁移率变小，所以我们要对由于粘度变化引起带电粒子迁移率的变化 进行校正。 计算结果列于表 2 - 1 - 3 ，扑尔敏对映体和0 -c d环糊精的结合常数分别为 2 1 3 .4 2 u m o l 2 3 3 . 0 7 u m o l e“ 。 是当0 -c d的浓度无穷大时溶质和结合物的迁 移率， 此值很难直接从实验中 得到， 尤其是当0 -c d的 溶解度受限 制时， 但“ 。 值可以 从 方程中 得到. 参数“ d u ， 可用 来描述 溶质分 子形成结合物前后分子大小的 变化14 5 1 ，此值约为。 . 3 5 ，此值与溶质和结合物分子量的比例不同。 表2 - 1 - 3 求解结合常数的结果 化合物 参数 结合常数kce ( u m o q pcv / u ，相关系数r 扑尔敏 12 1 3 . 4 20 . 5 4 50 . 3 40 . 9 8 3 7 22 3 3 . 0 70 . 5 4 00 . 3 50 . 9 8 4 0 实验条件同表2 - 1 - 1 二.高效液相色谱中的结合平衡 作为一种比较成熟的现代分离分析方法，高效液相色谱的手性分离过程中结合 平衡的研究很多(4 8 -5 8 1 。本论文采用手性高效液相色谱柱 ( 手性柱的固定相键合了与 毛细管电泳相同的手性选择剂，0 -c d ) ，并且采用与毛细管电泳相同的实验条件 ( 缓冲液浓度，酸度，温度等) 。与毛细管电泳相比，这里的手性选择剂0 -c d 是固定不变的，可变的是流动相的组成及比例。 在h p l c研究中， 我们用有效结 合常数k a ， 来表 示分析 物与 选择剂 之间 结 合能 力的强弱: k , en n s / n a c, ( 8 ) 元素所 9 8 级硕士毕业论文 2 0 0 1 年 5月 n a s / n 是指 保留 于固 定 相上与 手 性 选择剂 环 糊精 形成 络合 物的 分析 物与 流 动 相 溶液中分析物的摩尔比，它实质是 h p l c 中的保留因子 k ，据此，我们可得出以 下关系式: k e ,r k / c a ( 9 ) ( 9 ) 式中 c e ， 是指 h p l c手性 柱中 手性选择剂的 有效浓 度， 手 性柱上手性 选择 剂的有效浓度 c e ， 可以由 多种渠道获得15 1 -5 2 1 。 文献上通常采用以 柱中有效选择剂的 摩尔 数 ( n , ) 除以 溶液相死体 积 ( v ) 的 方法来获得 ( c,= n , n ) ， 而 n 。 则 通过手 性柱供应商所提供的数据，得到手性柱的含碳量 ( c %) ，然后用柱子上的固定相 的总硅胶质量乘以含碳量，即得到柱上所有日 -c d的含碳质量。由于每摩尔日 一 c d的 含碳质量为5 0 4 g / m o l ， 所以 很容易求出c15c 3 1, n o 三.高效毛细管电泳和高效液相色谱之间的定量关系 在理想状况下，即 h p l c手性柱上的硅胶载体和臂不影响选择剂与分析物的 结 合 作 用的 情况 下， 有 效结 合 平 衡 常 数k e ， 从 理 论 上 讲 应当 与自 由 溶 液中 的 平 衡 常 数k c 。 相 等， 即k , f k c e . 由 此 我 们可以 结 合 式 ( 9 ) 将c e 中 测得 的 结 合 常 数k 和h p l c 中测得的k ，联系起来: k = k / c a ( 1 0 ) 从 ( 1 0 )式看出，对于给定的结合常数 k ，可以 预测其对应的 k 。 对于典型的硅 胶载体的手性柱， 其表面被手性选择剂所覆盖的比 例是1 0 % 一， 0 0 %， 因此c o( 有 效手性选择剂浓度) 的计算值应在 ( 1 -1 0 ) x 1 0 -2 m的范围内。由 此， 公式 ( 9 ) 可 变形 为 k e m - n ( 1 0 -1 0 0 ) k . 表2 - 3 - 1 给出了 不同 结 合 常 数 对 应不同 的 保留 因 子范围。 在实际应用中，我们通常希望将 h p l c的保留因子 k ， 控制在 ， -1 0的范围内， 因为若 k 太大，峰保留时间太长。为了直接实现 c e和 h p l c之间进行分离条件 的转换，理想的结合常数应在， 0 2 数量级。当c e中 求得的k - 1 护 m - 、 时， 说明分 析物与选择剂之间的作用很强， 通常加入有机改性剂如甲醇x5 3 -5 4 1 和乙睛(5 5 1来减小结 合常数 k ;而当k - 2 . 5 ) 溶液中， 硅胶表面的 硅经基( s i-o h ) 电 离成 s i0， 使表面带负电 荷， 于是在贴近管壁的溶液表面会形 成一个同表面电荷异号的偶电层， 在电场作用下，该偶电层会携带体相溶液整体向 阴极移动形成电渗流， 如图3 - 3 - 1 所示。 山于带电粒子在毛细管中同时受到电泳力和电渗流的作用，因此，其表观迁移 元素所9 8 级硕士 毕业论文 2 0 0 1 年5 月 速 度v a p 为 : v a p v e f+ v e o f 乍 于 于于 专 于升升鸿汗于 于于 于 于 于 母 o o 一一一一一一一二 二 气二尸 二留晰二r气二 图3 - 3 - ，毛细管电泳示意图 3 .分析参数一有效淌度和表观淌度 在c e中由实验决定的实际的离子迁移淌度，用有效淌度表示为: “ = i . u t .v ( 1 1 ) 其中 i 为毛细管的进样端至检测窗口的长度，称为有效长度:l为毛细管总长 度; t 为 离子由 进样口 迁移至 检测点 ( 即 等于 有效长 度) 所需时间; v 为工作电 压。 实际上，电泳与电渗流并存. 因此，在有电渗流存在下，不考虑它们之间的相 互作用时测得的离子淌度是电泳和电渗两个淌度的矢量和，即 “ . p = u a f+ “ ，( 1 2 ) 以阳离子为例，由于其电泳和电渗流同向，所以其有效淌度大小为: n e f 11 a p u ，( 1 3 ) 结合公 式( 1 1 ) ， 公 式( 1 3 ) 变形为li e , = i l /v( 1 / t - 1 / t ., f) ( 1 4 ) 同理对于阴离子，由于其电泳和电渗反向， 所以其有效淌度为负值。以 上讨论 的是存在明显电渗流的情况。如果通过 s i-o h表面衍生化( 内 壁涂层) 或加改性剂 到缓 冲 液中 ( 动态 去 活， d y n a m ic d e a c t iv a t io n ) 的 方法 对内 壁 进 行改 性， 能 有 效 地控 制电渗流和消除内壁对样品溶质的吸附，此时电渗流可忽略不计。 实验部分 仪器与试剂 美国b e c k m a n 公 司p /a c e t s y s t e m m d q高 效 毛 细 管电 泳 仪， 配 有二 极 管 矩阵在线检测器( 1 9 0 - 6 0 0 n m ) 和可调波长紫外检测器( 四种可选波长) ，主机( 配备 元素所9 8 级硕士毕业论文 2 0 0 1 年 5 月 b e c k m a n p /a c e t l, s y s t e m m d q色 谱 s作 软 件 ) 毛细管柱: n o . 1熔融石英毛细管柱( b e c k m a n公司) ，6 1 . 6 c m x 7 5 u m i . d ( 有效长度 5 1 .4 c m ) n o . 2涂渍中 性石英毛细管柱归e c k m a n公司) ， 4 7 .4 c mx 5 0 11 m i . d ( 有效长度 3 7 .2 c m )( 电 渗流可忽略，电 渗流时间超过9 0 m in ) n o . 3涂溃中性石英毛细管柱( b e c k m a n公司 ) ， 3 4 c m x 5 0 11 m i .d ( 有效长度 2 3 . 8 c m )( 电 渗流可忽 略，电 渗流时间 超过9 0 m i n ) 试剂: p -c d ( 美国b e c k m a n 公司) n , n 一二甲 基甲 酞胺( d m f ， 分析纯) 三乙 胺( 分析纯) 冰醋酸( 分析纯) o a m氢氧化钠溶液( 用重蒸无离子水配制， 经0 . 2 2 u m纤维素脂膜过滤) 1 m氢氧化钠溶液( 用重蒸无离子水配制， 经。 . 2 2 u m纤维素脂膜过滤) o a n盐 酸( 用重蒸无离 子水 配制， 经0 . 2 2 u m纤维 素脂膜过滤) 二 次 重 蒸 无 离 子 水 ( 经0 .2 2 11 m纤 维素 脂 膜过 滤 ) 甲 醇( 色谱纯) 乙 月 青 ( 色 谱纯 ) 样品: 氯苯甲 酸、 氨 基苯酚( 天津 化学 试剂公司， 分 析纯) 手性医 药( 天 津市药品 检定 所提供 ) 2 .实验方法 2 . ， 背景电解质溶液的配置 将三乙 胺稀释至浓度为0 . 1 m ，以 冰醋酸调节p h至所需值，即为所需缓冲液 0 -c d溶液:准确称取适量的0 -c d ，分别溶于缓冲液中，配成浓度范围 为0 - 2 0 m m o l儿工作缓冲液 元素所9 8 级硕士毕业论文 2 0 0 1 年5 月 样品的 浓度均为0 . 1 m m o l儿 2 . 2电泳的工作条件 熔融石英毛细管柱( n o . 1 ) ， 运行电 压 2 5 k v ，电 极的极性为从正极到负极，二 极管在线检测器检测， 柱温1 7 0 c ， 压力进样0 .3 p s i x 5 s . 进样前， 依次用1 m n a o h , 0 . 1 m n a o h ，重蒸水冲洗2 m i n , 最后用电泳背景电解质冲洗5 m i n ，每个样品连续 运行两次，取其迁移时间的平均值。 涂溃中 性石英 毛细管 柱 ( n o . 2 ) 运行电 压2 0 k v ， 电 极的极性 为从负极 到正 极， 紫外 检 测 波 长为2 1 4 n m ， 柱 温1 7 0 c ， 压力 进 样， 进 样前0 .3 p s i x 5 s ， 先 用0 . 1 n h c i 冲洗 1 m in ，再用重蒸水冲洗 2 m in ，最后用背景电解质冲洗 3 m i n 。每个样品连续 运行两次，取其迁移时间的平均值。 涂溃中 性熔融石英毛细管柱( n o . 3 ) 运行电 压 ， 4 k v ，电极的极性为从正极到负 极， 其它工作条件同上( n o .2 ) e 三.结果与讨论 1 .数据处理 我们选择一系列位置异构体( 氛苯甲 酸和氨基苯酚) 和光学异构体( 扑尔敏、 美沙 酮等) 在合适的 缓冲液条件下， 利用毛细管区带电 泳法，由 迁移率 和0 -c d浓度 的关系求解了0 -c d和各化合物相互作用的结合常数。 1 . 1 位置异构体 毛细管区带电泳是基于带电粒子在电场作用下定向移动，首先要确保所选择的 研究 对象在 适当 酸 度的 缓冲液中 形成离子。 因 此对于酸性 溶 质，当p 日 p k . 时， 溶 质分子以阴离子形态存在。由 表3 - 3 - 1 知， 氯苯甲 酸的分离应选择碱性缓冲液( p h = 表3 3- 1 化合物的p k . 值 舰苯甲酸氨荃苯酚 邻 2 . 9 49 . 2 8 间 3 . 8 29 . 8 3 对3 .9 98 .5 0 7 . 0 , 0 . 1 m三乙 胺一冰醋酸) ， 而氨基苯酚作为一种两性物质，我们选择在酸性缓冲 液 ( p h = 4 .0 , 0 . 1 m三乙 胺 一冰醋酸 ) 条件下分 离。 元素所9 8 级硕士毕业论文 2 0 0 1 年5 月 氛苯甲 酸 0 -c d的 浓度从 0增加到 5 m m o l/ l ， 而氛苯甲 酸( 邻、 间、 对位三异构 体混 合) 样品浓度均为 0 . 0 5 m m o l儿。氛苯甲 酸样品 在不同的0 -c d浓度时， 其迁移时 间、 表观迁移率列于表 3 - 3 - 2 。 表 3 - 3 - 3是0 -c d浓度和校正迁移率u , 的关系。 表3 - 3 - 4 总结了 氛苯甲 酸淌度差 倒数( 1 / 0 u ) 随 环 糊精浓 度倒数( 1 / l ) 变化。由 计算 机数据处理线形回归法得到图3 - 3 - 1 ，分别求出邻位，间位，对位氯苯甲酸与 表3 - 3 - 2 0 -c d 的浓度和迁移时间、表观迁移率u的关系 0 -c d ( m o l/ l . 1 0 - 3 ) 参数 氛苯甲酸 2 - 3 -1 4 - 0 t8 . 6 8 49 . 0 3 19 . 1 4 4 肚r 1 . 6 5 41 . 6 2 71 . 6 0 7 0 . 2 2 t8 . 9 1 69 . 1 3 89 . 3 1 2 pi 1 . 6 4 81 . 6 0 81 . 5 7 8 0 . 7 9 t8 . 9 9 39 . 3 8 39 . 7 5 0 pl 1 . 6 3 41 . 5 6 61 . 5 0 7 1 . 0 9 t9 . 0 0 99 . 5 6 09 . 9 8 2 pi 1 . 6 3 11 . 5 3 71 , 4 7 2 2 . 0 0 t9 . 1 1 51 0 . 0 9 21 0 . 6 9 4 ml 1 . 6 1 21 . 4 5 61 , 3 7 4 3 . 0 0 t9 . 2 1 21 0 . 3 2 61 1 . 1 5 4 pi 1 . 5 9 51 . 4 2 31 . 2 7 3 3 . 9 0 t9 . 2 8 21 0 . 6 6 31 3 . 6 0 6 p. 1 . 5 8 31 . 3 7 81 . 0 8 0 5 . 0 0 t9 . 4 4 9 1 0 . 9 6 61 2 . 3 6 9 u, 1 . 5 5 51 . 3 4 01 . 1 8 8 实验条 件:中 性涂演熔融硅胶毛细管柱( n o .2 ) ，忽略电 渗流，因为电 渗流时间超过 9 0 m in . l = 4 7 .4 c m ,1= 3 7 .2 c m 5 0 u m i .d 缓冲液: 0 . 1 m三乙 胺 - 一冰醋酸p h = 7 .0 0 , 1 0 %甲 醉, 1 7 0 c ,2 3 0 n m ( 加入1 0 %甲醇是考虑研究c e和h p l c导向关系的需要) 表3 - 3 - 2 中u r - - - 溶 质自 由 迁移率( m z .v .s - . 1 0 -8 ) 。 一 溶质表观迁移率( m 2 .v .s - . 1 0 -8 ) p -c d相 互 作 用结 合 常 数k邻 = 3 2 .5 3 , k 间 = 1 0 7 .0 8 k对 二 ， 3 7 .2 4 . 从回 归 线的 相 关系数可看线形关系得到较好的吻合。 元素所98级硕士毕业论文 2 0 0 1 年 5月 表3 - 3 - 3 0 -c d 的浓度和校正迁移率“， 的关系 ( s -c o d ( mo l/ l . 1 0 .3 ) 参数 抓苯甲酸 2 -3 - 4 - 0 林r 1 . 6 5 41 . 6 2 7 1 . 6 0 7 0 . 2 2 i l l, 1 . 6 4 91 . 6 0 91 . 5 7 8 u0 . 0 0 50 . 0 1 8 0 . 0 2 9 0 . 7 9 ” 口， 1 . 6 3 51 . 5 6 61 . 5 0 8 林0 , 0 1 90 . 0 6 10 . 0 9 9 1 . 0 9 p i 1 . 6 3 11 . 5 3 71 . 4 7 3 p0 . 0 2 30 . 0 9 00 . 1 3 4 2 . 0 0 il l, 1 . 6 1 21 . 4 5 81 . 3 7 4 u0 . 0 4 20 . 1 6 90 . 2 3 3 3 . 0 0 il l, 1 . 5 9 61 . 4 2 31 . 2 7 4 p0 . 0 5 80 . 2 0 40 . 3 3 3 3 . 9 0 p i 1 . 5 8 01 . 3 5 41 . 2 3 4 p0 . 0 7 40 . 2 7 30 . 3 7 3 5 . 0 0 ” 于， 1 . 5 5 61 . 3 4 11 . 1 8 9 u0 . 0 9 80 . 2 8 60 . 4 1 8 实验条件同表3 - 3 - 2 表3 - 3 - 3 中， r - - - 溶 质自 由 迁 移率 ( m z .v .s . 1 0 -8 ) i t ,.一 溶 质 校正 迁 移 ( m .v .s . 1 0 -0 ) 。 一 ， 。 ， 。， ， 即 溶 质 分 子自 由 迁 移 率 与 校 正 迁 移 率 之 差 ( m 2 .v .s . 1 0 0 ) 表3 - 3 - 4 氮苯甲酸淌度差倒数 ( 1 / a u)随环糊精浓度倒数 ( 1 / l )变化 【 日 ( m o l/ l . 1 0 -3 ) 1 / l ( l / m o l) ( x ) 1 亿“ ( y ) ( vsm - . 1in 2 -3 -4 - 0 . 2 24 5 7 72 0 4 . 5 65 4 . 6 3 5 0 . 7 91 2 7 15 1 . 5 1 6 . 51 0 . 1 1 . 0 99 1 5 . 34 3 . 4 8 1 1 . 1 07 . 4 6 2 . 0 05 0 02 45 . 9 4 . 3 3 . 0 03 3 3 . 31 7 . 3 4 . 93 . 0 0 3 . 9 02 5 4 . 3 1 4 . 441 . 9 5 . 0 02 0 0 1 0 . 23 . 52 . 3 9 实验条件同 表3 - 3 - 2 元素所 9 : 级硕士毕业论文 2 0 0 1 年 5月 表3 - 3 - 4 中【 l - 一 0 -c d的