（物理学专业论文）免疫吸附磁性涂层碳纤维的研究.pdf

原创性声明 1 1 1 11 1 11 1 1i iii ii ii iiii y 17 19 0 9 6 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：蝉日期业年上月凼 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 日期：也年上月丛日 ，中南大学硕士学位论文摘要 摘要 近年来，免疫吸附治疗技术已成为去除血液中致病物质的一种重 要手段。本项目把磁性微球固定在有良好的生物相容性的碳纤维表 面，制备出免疫吸附磁性涂层碳纤维载体。主要结论如下： ( 1 ) 制备有机溶胶过程中，产物为较高纯度的纳米f e 3 0 4 且f e 3 0 4 颗粒外层包覆了油酸。相对最佳的制备路线为在反应阶段同时滴加表 面改性剂。油酸用量在0 7 m l 时，既能充分包覆f e 3 0 4 颗粒，又能保 持较好的稳定性、分散性。制备水基溶胶过程中，采用不同表面活性 剂得到的产物都为纯度较高的f e 3 0 4 ，且改性后的f e 3 0 4 颗粒表面都 包覆了相应的表面改性剂。聚乙二醇作为表面改性剂制备的水基 f e 3 0 4 溶胶的分散性和稳定性相对最好。 ( 2 ) 有机基f e 3 0 4 溶胶制备的磁性涂层碳纤维由碳和f e 3 0 4 两种 物相组成，且表面光滑，涂层均匀。而在各水基溶胶中，聚乙二醇作 为表面改性剂制备的f e 3 0 4 微球在碳纤维表面涂覆效果最好。 ( 3 ) 静态平行吸附试验表明，进行了表面磁性处理和活化偶联 的碳纤维对b s a ( 牛白蛋白) 的吸附远高于空白活性碳纤维，且吸 附性能相对稳定。并且聚乙二醇水基f e 3 0 4 溶胶制备的免疫吸附磁性 涂层碳纤维的吸附量相对高于有机基溶胶制备的。通过正交试验，得 到了活化偶联过程中各因素对吸附量的影响的主次顺序，获得相对最 好的水平搭配。 ( 4 ) 在设计的模拟免疫吸附柱试验中，两种装填方式并不理想 而淘汰，由此提出了另一种设计，将制备好的免疫吸附磁性涂层碳纤 维编织成过滤布。 关键词：免疫吸附，活性碳纤维，f e 3 0 a 微球，正交试验，吸附性能 中南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，i m m u n o a d s o r p t i o nt h e r a p yh a sb e c o m ea l li m p o r t a n t m e t h o dt or e m o v a lo fp a t h o g e n i cs u b s t a n c e si nb l o o d i nt h i sp r o j e c t ， m a g n e t i cm i c r o s p h e r e sw e r e f i x e do nt h es u r f a c eo ft h e g o o d b i o c o m p a t i b i l i t yc a r b o nf i b e r s t op r e p a r ei m m u n o a d s o r p t i o nm a g n e t i c c o a t e dc a r b o nf i b e rc a r r i e r 砀em a i nc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) i np r o c e s so fp r e p a r a t i o no r g a n i cs o l ，t h ep r o d u c ti sh i g hp u r i t y n a n o f e 3 0 4a n dt h eo u t e rl a y e r so ff e 3 0 4p a r t i c l e sa r ec o a t e dw i t ho l e i c a c i d t h eb e s tp r e p a r a t i o nr o u t ei sd r o p p i n gt h es u r f a c em o d i f i e rd u r i n g t h es y n t h e s i sr e a c t i o n t h ef e 3 0 4p a r t i c l e sc a l lb ef u l l yc o a t e db yo l e i c a c i dt om a i n t a i ng o o ds t a b i l i t ya n dd i s p e r s i o nw h e nt h eo l e i ca c i dd o s a g e i s0 7 m 1 i np r o c e s so fp r e p a r a t i o nh y d r o s o l ，t h ep r o d u c t su s i n gd i f f e r e n t s u r f a c t a n t sa r eh i g hp u r i t yf e 3 0 4 ，a n dt h em o d i f i e ds u r f a c eo ff e 3 0 4 p a r t i c l e sa r ec o a t e dw i t hac o r r e s p o n d i n gs u r f a c em o d i f i e r t h ed i s p e r s i o n a n ds t a b i l i t yo ft h ef e 3 0 4h y d r o s o lp r e p a r e db yp e g a ss u r f a c em o d i f i e r w a st h eb e s t ( 2 ) t h em a g n e t i cc o a t e d c a r b o nf i b e rp r e p a r e db yf e 3 0 4o r g a n i cs o l i sc o m p o s e do fc a r b o na n df e 3 0 4 ，a n dh a ss m o o t hs u r f a c ea n du n i f o r m c o a t i n g i nv a r i o u sf e 3 0 4h y d r o s o l s ，t h ef e 3 0 4m i c r o s p h e r e sp r e p a r e db y p e ga sas u r f a c em o d i f i e rh a v et h eb e s tc o a t i n go nt h es u r f a c eo f c a r b o n f i b e r ( 3 ) t h es t a t i cp a r a l l e la d s o r p t i o nt e s ts h o w st h a tt h ea d s o r p t i o no n t h eb s ao fa c t i v a t e dc a r b o nf i b e r sw i t hm a g n e t i cs u r f a c et r e a t m e n ta n d a c t i v a t i n g c o u p l i n gt r e a t m e n ti s m u c hh i g h e rt h a nt h eb l a n ka c t i v a t e d c a r b o nf i b e ra n dt h ea d s o r p t i o np r o p e r t yi sr e l a t i v es t a b i l i t y t h e a d s o r p t i o no fi m m u n o a d s o r p t i o nm a g n e t i cc o a t e dc a r b o nf i b e rp r e p a r e d b yf e 3 0 4h y d r o s o lt h a tp e g a ss u r f a c em o d i f i e ri sr e l a t i v e l yh i g h e rt h a n p r e p a r e db yf e 3 0 4o r g a n i cs o lp r e p a r a t i o n b yo r t h o g o n a lt e s t ，t h e r ea r e o b t a i n e dt h ei m p o r t a n to r d e ro ft h ef a c t o r so nt h ea d s o r p t i o np r o p e r t yi n a c t i v a t i o n c o u p l i n gp r o c e s s ，a n dg o t t e nt h eb e s tl e v e lc o m b i n a t i o n ( 4 ) i nt h es i m u l a t i o ne x p e r i m e n to fi m m u n o s o r b e n tc o l u m n ，t w o h k i n d so f p a c k i n g s t r u c t u r ew e r ee l i m i n a t e db e c a u s eo fu n s a t i s f a c t o r y , t h u s a l la l t e r n a t i v ed e s i g nw a sp r o p o s e d ，w h i c hi sk n i t t i n gi m m u n o a d s o r p t i o n m a g n e t i cc o a t e dc a r b o nf i b e r si n t of i l t e rc l o t h k e yw o r d s ：i m m u n o a d s o r p t i o n ，a c t i v a t e d c a r b o nf m e r , f e 3 0 4 m i c r o s p h e r e s ，o r t h o g o n a lt e s t ，a d s o r p t i o np r o p e r t y i i i 中南大学硕士学位论文目录 目录 第一章文献综述l 1 1 免疫吸附1 1 1 1 免疫吸附疗法1 1 1 2 免疫吸附剂的分类2 1 1 3 免疫吸附剂常用载体材料2 1 2 磁性微粒概述5 1 2 1 磁性微粒特点5 1 2 2f e 。0 。磁性微球的制备方法6 1 2 3 磁性微球在生物医学中的应用9 1 3 活性碳纤维1 0 1 3 1a c f 的吸附特性：1 0 1 3 2a c e 的吸附选择特性1 1 1 3 3a c e 的电性能1 l 1 3 4a c e 的氧化还原性能1 2 1 3 4a c f 的催化特性1 2 1 3 5a c e 的其它特性1 2 1 4 本文的选题目的及意义与研究内容1 2 1 4 1 本文的选题目的及意义1 2 1 4 2 本文的研究内容1 3 第二章实验试剂、仪器及分析表征方法1 4 2 1 实验试剂1 4 2 2 实验仪器1 5 2 3 分析和表征方法1 6 2 3 1x 射线衍射分析1 6 2 3 2 扫描电子显微镜分析1 6 2 3 3 红外光谱分析1 7 2 3 4 紫外可见分光光度分析1 7 2 3 5 数码照片分析1 7 第三章有机基f e 。0 4 溶胶的制各1 8 3 1 有机基f e 。o 。溶胶的制备1 8 3 2 结果与讨论1 9 3 2 1f e 。0 4 微球分析1 9 中南大学硕士学位论文 目录 3 2 2 工艺条件对产物性能的影响2 1 3 3 本章小结2 4 第四章水基f e 。0 4 溶胶的制备2 5 4 1 水基f e 。0 4 溶胶的制备2 5 4 2 结果与讨论j 2 5 4 2 1f e 。0 4 微球分析2 5 4 2 2 水基溶胶的稳定分散性研究2 8 4 3 本章小结3 0 第五章磁性涂层碳纤维的制备及表征3 2 5 1 磁性涂层碳纤维的制备3 2 5 2 结果与讨论3 2 5 2 1 有机基溶胶制备的磁性涂层碳纤维表征3 2 5 2 2 水基溶胶制备的磁性涂层碳纤维表征3 4 5 3 本章小结3 8 第六章磁性涂层碳纤维的活化偶联以及静态吸附试验3 9 6 1 本研究采用的活化偶联方法3 9 6 2 实验部分4 0 6 2 1 免疫吸附磁性涂层碳纤维的制备4 0 6 2 2 吸附量的测定4 0 6 2 3 牛白蛋白溶液的配制4 0 6 2 4 牛白蛋白溶液标准曲线4 0 6 3 活化偶联正交实验4 l 6 3 1 正交实验的因素和水平4 2 6 3 2 正交实验方案及结果4 2 6 3 3 极差分析和方差分析4 3 6 4 静态吸附试验4 4 6 4 1 有机基溶胶制备免疫吸附磁性涂层碳纤维静态吸附试验4 4 6 4 2 水基溶胶制备免疫吸附磁性涂层碳纤维静态吸附试验4 5 6 5 本章小结4 6 第七章免疫吸附柱模拟吸附实验设计4 7 7 1 免疫吸附磁性涂层碳纤维的制备4 7 7 2 免疫吸附柱模拟吸附设计4 7 7 2 1 免疫吸附柱模拟吸附装置4 7 7 2 2 免疫吸附柱装填4 8 v 中南大学硕士学位论文 目录 7 2 3 吸附柱模拟吸附实验4 8 7 3 吸附柱进一步设计想法4 9 7 4 本章小结5 0 第八章结论5 l 参考文献。5 3 致 射6 l 攻读硕士学位期间的研究成果6 2 v i 中南大学硕士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 免疫吸附剂的研究开始于2 0 世纪5 0 年代，它是在吸附材料表面固定上抗 原、抗体或补体后形成的一种特异性医用吸附剂。1 9 9 9 年，南开大学郭贤权等 人l l j 以醋酸乙烯酯为单体，二乙烯苯为交联剂，制得大孔共聚物，经皂化i 活化 后，偶联乙型肝炎抗体制得免疫吸附剂，其对人血清中的乙型肝炎表面抗原 ( h b s a g ) 具有良好的吸附性能，且稳定性好，可望用于血液灌流辅助治疗乙型 肝炎患者。颜伟荣掣2 】通过对载体材料的优化及对配基的筛选发现，使用纤维素 球形载体，固定l 色氨酸制作的血液灌流材料，选择性较高，可逐步获得临床 应用。2 0 0 3 年，土耳其的蹦等【3 】报道了在磁性甲基丙烯酸羟基乙酯( m p h e m a ) 微球上固载人血清白蛋白( h s a ) 制得的吸附材料进行血液灌流去除血浆中胆红 素。此外，s u z u k i 等【4 】于2 0 0 3 年将l i x e l l e 柱( 以纤维素为载体的免疫吸附柱) 用于血液灌流去除82 微球蛋白治疗d r a 。 1 1 免疫吸附 1 1 1 免疫吸附疗法 免疫吸附( i m m u n o a d s o r p t i o n , i a ) 疗法是指通过体外循环，利用抗原抗体免 疫反应除去血浆中的致病因子或利用吸附材料除去血浆中与免疫有关的致病因 子( 前者在吸附原理上与免疫反应有关，后者在吸附对象上与免疫反应有关) ，达 到治疗疾病目的的技术。免疫吸附疗法是在血浆置换的基础上发展起来的新技 术。从单纯血浆置换到双重血浆滤过，再从双重血浆滤过到免疫吸附，主要的发 展思路和进步体现在两个方面：一是对血浆中致病因子清除的选择性达到更高； 二是对血浆中有用成分的丢失范围与数量更小。免疫吸附疗法对致病因子的清除 达到了高度选择性，几乎不丢失血浆有用成分，不仅具有令人满意的治疗效果， 同时避免了血浆制剂的输入及其相关的各种不良影响【5 1 。 免疫吸附疗法的关键部分是免疫吸附剂( i m m u n o a d s o r - b e n t ) 与免疫吸附器 ( i m m u n o a d s o r b c r ) 。将具有免疫吸附活性的物质固定在高分子化合物上制成免疫 吸附剂，前者称为配体( l i g a n d ) ，是与吸附对象发生吸附反应的核心部分。后者 称为载体( c a r d e r m a t e r i a l ) ，能够通过交联或偶联的方式牢固结合或固定配体，并 作为基质起构架和固定作用。配体的吸附活性本质是与吸附对象( 致病物质) 之间 的选择性或特异性亲和力，即分子问相互作用，包括生物学亲和力( 如抗原一抗体 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 反应) 和物理化学亲和力( 如疏水交互作用) 有关。将不同吸附剂装入特制的容器 里，这种装置称为免疫吸附器。免疫吸附器一般呈圆柱状，又称免疫吸附柱。 免疫吸附疗法的基本操作程序是将患者血液引出体外建立体外循环并抗凝， 血液流经血浆分离器分离出血浆，将血浆引入免疫吸附器与免疫吸附剂接触，以 选择性吸附的方式清除致病物质，然后将净化的血浆回输体内，达到治疗目的。 有的免疫吸附装置不需要分离血浆而直接进行血液灌流式免疫吸附治疗【7 】。 图卜1 免疫吸附疗法的基瓠操作程序 图1 - 2 免疫吸附治疗仪器 1 1 2 免疫吸附剂的分类 根据吸附剂和被吸附物质之间的作用原理，可将吸附剂分为两大类：一生物 亲合吸附剂，主要包括抗原固定型、抗体固定型、补体固定型( c l q 型) 和蛋白 a ；另一类为物理化学亲合吸附剂，主要包括静电结合型和疏水型等。生物亲合 吸附剂依赖于固定的免疫特异性配体，具有特高、吸附容量大等优点。但容易失 活，与血液接触可能产生副作用。物学亲合吸附剂的选择性相对较差，但使用安 全性高、可灭菌、能稳定储免疫吸附剂疗法以其独特的优越性在临床上得到较大 的应用【引。 1 1 3 免疫吸附剂常用载体材料 ( 1 ) 以无机化合物为载体的免疫吸附剂 常用作免疫吸附剂载体的无机化合物有多孔硅胶，可控孔径玻璃( c o n t r o l l e d 2 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 p o r eg l a s s ) 、磷酸盐类等、活性炭。这是因为它们的机械强度高、化学稳定性较 其它无机材料好。并且这些载体的表面有o h 基团或氯化物基团( 活性碳除外) ， 可直接与抗原或抗体键联或引入其它的功能基后于抗原或抗体键联。将上述无机 材料制成适宜应用的球型或不定型的颗粒，经化学键合或涂层法改性后，制成不 同模式的吸附剂，以满足不同的分离目的。其中主要有大孔反相、亲水凝胶、离 子交换、疏水作用以及亲和载体等。但这些材料的血液相容性差，需要使用通透 性和血液相容性比较理想的材料包膜，如丙烯酸及丙烯酸酯类聚合物、硅氧烷、 聚丙烯酰胺、聚氨脂、聚脂等，包膜后的免疫吸附剂的使用效果得到明显改善。 1 ) 多孔硅胶【9 】 多孔硅胶是无机载体类运用最广、用量最大的。多孔硅胶是由硅酸钠在酸性 条件下经过一定的物理化学操作过程聚集而成的，其特点是表面含有硅醇基( 或 硅羟基) s i o h ，这是硅胶可以进行表面化学键合或改性的基础。但同时，其多 孔性也会导致表面可以存在大量水，因而增加了反应的复杂性。由于表面硅醇基 的存在，使得硅胶在碱性条件下不稳定，非特异性吸附较大。可以通过减少载体 的比表面积来降低对碱的敏感和非特异性吸附；高温加热可浓缩硅醇基；涂层上 其他化合物，如氧化铝等，来增加硅胶对p h 的稳定性。硅胶的化学修饰大致可 分为：整体修饰、通过表面硅羟基的化学修饰和涂层改进硅胶的表面性质等。 2 ) 磷酸盐类【l o 】 最具代表的是羟基磷灰石，是由钙盐或氢氧化钙与碱金属磷酸盐或磷酸反应 通过控制反应条件结晶而成的。此外还有偏磷酸盐、结晶焦磷酸盐等，在中性条 件下，生物分子的碱性基团与磷酸根结合，生物的酸性基团与金属离子结合，对 某些生物分子具有独特的分离效果。 3 ) 多孔玻璃 一定成分的含硼酸硅钠的玻璃经过热处理后产生相分离，用稀酸将硼酸硅钠 除去，就可以形成多孔玻璃。由于其成分与多孔硅胶相似，表面有大量硅醇基， 碱性条件下不稳定，非特异性吸附较大。 ( 2 ) 以天然高分子化合物为载体的免疫吸附剂 天然高分子化合物载体主要有纤维素、葡聚糖、壳聚糖以及琼脂糖等，以天 然多糖为母体的载体是“经典的分离生物大分子的材料。这类载体亲水性和生 物相容性较好，可以允许生物大分子透过而不发生变性，在广泛的p h 范围内稳 定，可以用碱液清洗，再生容易，且原料易得。但这类载体的骨架多为软基质， 机械强度差，压降大，不易操作；溶胀程度随溶剂的组成而变化。 1 ) 纤维素【1 1 1 4 】 纤维素及其衍生物用于免疫吸附剂已经有许多年了。纤维素是以1 , 4 1 3 糖 3 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 苷键连结的d 毗喃葡萄糖基，除端基外，每个糖基上都有三个羟基。通常是微晶 状态，不适用于色谱分离，需要通过再生，制备成大小规则的微球。纤维素介质 具有亲水网络，大的比表面积和优良的通透性，吸附容量大，在大规模的分离纯 化中仍广为应用。d e a e s e p h a c e l 是在凝胶合成中破坏微晶结构经重新组合而 得的珠状物，用环氧氯丙烷交联形成大孔，在许多医药企业仍在应用。但是纤维 素载体在湿态时膨胀，干态时又急剧收缩，致使干、湿态时孔度的变化太大；并 且纤维素的非均匀相微晶结构会产生非特异性吸附。由于这些结构特点，也限制 了纤维素用作免疫吸附的载体。 2 ) 葡聚糖【l 5 ，1 6 1 通过加入交联剂提高稳定性，可作为离子交换和凝胶过滤的基质，交联葡聚 糖的容量大，热稳定性好，中性p h 下可于1 2 0 消毒3 0 分钟而不被破坏，与纤 维素不同，交联葡聚糖的骨架为三维网状结构，因此它除了具有离子交换能力之 外，还具有分子筛的作用。葡聚糖载体有很强的亲水性，并且无非专一性吸附， 但是葡聚糖载体有很强的渗透性，并且比较软，强度差，不适于灌流操作。 3 ) 壳聚糖【1 7 - 2 0 1 甲壳素( c h i n t i n 【( 1 4 ) - 2 - 乙酰氨基- 2 _ 脱氧- b - i 卜葡萄糖】) ，是一种自然 资源十分丰富的线性聚合物，是n 二乙酰基- i 卜葡萄糖通过1 3 一( 1 ，4 ) 糖苷键联结 的直链多糖。壳聚糖( c h i t o s a n ) 为其脱乙酰衍生物。壳聚糖具有良好的生物相 容性、血液相容性和安全性，同时含有轻基和氨基，比较活泼，便于活化和偶联。 4 ) 琼脂糖【2 1 2 3 1 琼脂糖是由口半乳糖和3 ，6 - 脱水蚪乳糖组成，是目前蛋白质色谱领域中 应用最为广泛的介质母体，商品名为b i o - g e l 和s c p h a r o s c 两种。研究工作者虽 然常以琼脂糖做为免疫吸附剂的载体，但制备的免疫吸附剂在应用过程中也暴露 了很多缺点。如琼脂糖珠的机械强度较差，用于体外动态吸附时，由于载体的力 学性能差导致流速减慢，延长了操作时间。并且琼脂糖载体常以溴化氰活化，与 配体形成较弱的异脲键，容易导致配体的脱落和被键联的抗原或抗体的活性下 降。为此，很多研究者尝试用其他的活化方法，如用甲苯磺酰氯、n 羟基琥珀酰 亚胺酯，过碘酸盐氧化抗体后固载配体等方法。但是由于琼脂糖珠载体的机械性 能和力学性能较差，限制了它的广泛应用。 ( 3 ) 以合成高分子为载体的免疫吸附剂 吸取了天然高分子化合物载体亲水性、生物相容性的优点，克服其易受微生 物侵蚀，物理性能欠佳以及载体处理和保存麻烦的缺点。通过选择亲水性好的单 体，经过聚合反应，并且控制其孔结构的生成，可得到机械强度高，孑l 径适宜， 表面相容性好的载体材料。 4 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 ) 聚丙烯酰胺类【2 4 , 2 5 聚丙烯酰胺类是以丙烯酰胺为单体，由甲基丙烯酰胺交联成的，在水油体系 中共聚而成。是一种人工合成凝胶，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联 剂的用量可制成各种型号的凝胶。主要用于凝胶过滤，此类介质的排阻限度较低， 限制了其在其他方面的应用。可以通过降低反应体系中聚合物的浓度来提高排阻 限度，但会导致介质的机械强度降低。 2 ) 聚乙烯判2 睨9 l 聚乙烯类是最常见的类型，疏水性强，非特异性吸附较大。较早地应用于生 物分离，通过对其疏水性很强的表面进行修饰后才能用于生物分子的分离。通常， 引入能产生阴离子或阳离子的亲水配基后，可作为吸附剂。目前有不同孔径的亲 水聚乙烯介质，如美国p e r c e p t i v eb i o s y s t c m 公司的p o r o u s 介质。 3 ) 聚苯乙烯判3 0 , 3 1 】 聚苯乙烯类商品名s t y r o g e l ，具有大网孔结构，可用于分离分子量1 6 0 0 到 4 0 0 0 0 的生物大分子，适用于大分子聚合物的分子量测定和脂溶性天然物的分 级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。此外还有m o n ob e a d s 系离子交换 剂该系以亲水性聚醚为骨架；聚丙稀酸羟乙基酯系吸附剂等。 除了单纯用合成高分子聚合物为载体外，还可用合成高分子聚合物修饰无机 化合物载体和天然高分子聚合物载体，以克服这两种载体的不足。有人制备了以 聚丙烯酰胺和琼脂糖的共聚物为载体，通过戊二醛活化后，固载牛血清白蛋白的 免疫吸附剂，用来分离和提纯抗体。 1 2 磁性微粒概述 磁性微粒的概念由磁流体发展而来，磁流体( m a g n e t i cf l u i d ) ( 又称铁磁流体， f e r r o f l u i d ) 是指将磁性粉末( 如f e 3 0 4 ，y - f e a 0 3 等) 通过界面活化剂均匀分散在 一定的基液中所形成的具有高度稳定性和超顺磁性的胶态液体材料，将磁流体与 高分子基质或其它无机材料相互作用便复合得到磁性微粒。通过物理吸附或表面 功能基团，可进行各种生物分子、药物等在其表面的固定化；此外，它具有超顺 磁性，可在外加磁场的作用下快速移动和分离。基于以上特点，磁性微粒在生物 学，医学等领域得到广泛地应用。 1 2 1 磁性微粒特点【3 2 】 2 0 世纪7 0 年代以来，人们开始采用各种不同的技术将磁流体与各种不同类 分子如合成高分子、生物高分子、二氧化硅等相互作用得到多种磁性复合微粒( 简 称为磁性微粒) ，这些磁性微粒具有以下特点： ( 1 ) 超顺磁性：由于磁性内核( 磁核) 的粒径非常小( 通常在3 0n m 以下) ，因而磁 5 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 性微粒表现出超顺磁性( s u p c r - p a r a m a g n c t i c ) ，即磁性微粒在外加磁场中有较好的 磁响应性，但撤去磁场后磁性很快消失，无磁性记忆。 ( 2 ) 表面效应和体积效应：磁性微粒的粒径一般为微米或纳米级，随着微粒的细 化，比表面积激增，微粒表面官能团密度及吸附能力增大，达到吸附平衡的时间 大大缩短。 ( 3 ) 表面可标记生物分子：通过高分子或其它材料与磁性流体复合，在颗粒表面 引入氨基、羧基、巯基、羟基等功能基团，通过共价或物理作用可将酶、抗体、 细胞、核酸及寡核苷酸等生物分子固定在表面，进而应用于细胞分选、酶的固定 化、免疫检测、药物载体及核酸的纯化与分离等生物和医学领域。 ( 4 ) 生物相容性：磁性微粒在生物医学工程中应用，有一个重要方面就是要有生 物相容性。磁性微粒外层的生物高分子，如多聚糖、脂质体、蛋白质类物质等使 得磁性微粒具有良好的生物相容性。 ( 5 ) 操作简便：磁性微粒可以稳定悬浮于溶液中，而自然重力沉降很慢，因此在 外加磁场中很容易被回收；当撤去磁场后，磁性微粒又会很快均匀分散于液相介 质中，所以可利用一个外加磁场对其方便地进行操作。 1 2 2f e 。0 磁性微球的制备方法 f e 3 0 4 磁性微球合成方法众多，主要分为固相法、液相法和气相法。其中液 相法制备纳米颗粒具有成核和成长过程易调配，微粒的化学组成、形状和大小容 易控制的显著特点，而且该方法添加的微量成分和组成较均匀，即使是对于很复 杂的材料也可以获得化学均匀性很高的微粒，因此受到越来越多的关注。 ( 1 ) 固相法 1 ) 高能球磨法 高能球磨法是利用球磨机的转动或震动使硬球对原料进行强烈的撞击，研磨 和搅拌，把原料合成纳米颗粒的方法。其优点是产量高、工艺简单，并能制备出 用常规方法难以获得的高熔点的金属或合金纳米材料。其缺点是产物晶粒尺寸不 均匀，易引入某些杂质。 2 ) 高温分解法 高温分解铁有机物法是将铁前驱体 如f e ( c o ) 5 ，f c ( c u p ) 3 等】高温分解产生 铁原子，再由铁原子生成铁纳米颗粒，将铁纳米颗粒控制氧化得到四氧化三铁。 这种方法制得的纳米颗粒结晶度高，粒径可控，且分布很窄。李文章等【3 3 】利用2 一吡咯烷酮和乙酰丙酮铁为原料制备了粒径较均一、可控、结晶度高、磁响应较 强的f e 3 0 4 纳米粒子。 喷射和激光高温分解法【3 4 】可用来直接地连续地制备较好晶型的磁性纳米微 粒。喷射高温分解法是通过喷射溶液到反应器形成气溶胶，气溶胶的微滴中发生 6 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 溶剂蒸发和溶质浓缩，沉淀的颗粒然后在高温下热分解及干燥就得到固体物质。 激光高温分解法是用持续的二氧化碳波加热一种流动的气态混合物，用激光来引 发和维持化学反应。在一定的压力和激光功率下，在反应区域发生晶核富集，形 成均匀的微粒核化，然后用惰性气体传送到过滤器。 ( 2 ) 液相法 ： ， 1 ) 共沉淀法1 3 5 】 共沉淀法是指使用沉淀剂将液体中的f e 3 + 和f e 2 + 按2 ：1 ( 或3 ：2 ) 的摩尔 比例沉淀出来，形成氢氧化物胶体；胶体失水得到纳米f e 3 0 4 悬浮体系，然后 经过滤、洗涤、干燥等过程得到纳米f e 3 0 4 的方法。依据的基本原理为： f e 2 + + 2 f e 3 + + 8 0 1 - i - - f e 3 0 4 + 4 h 2 0 将f e 2 + 与f e 3 + 的氯化物溶液以一定的比例混合后( 一般物质的量比为l ：2 或 2 ：3 ) ，用过量的n h 3 h 2 0 或n a o h 等溶液作为沉淀剂，在一定的温度和p h 下， 高速搅拌进行反应，高速离心得到沉淀，将沉淀洗涤、干燥，得到纳米级f e 3 0 4 微粒。该法的原理虽然简单，但实际制备中还有许多复杂的中间反应。溶液的浓 度、n f e 2 + n f e 3 + 的比值、反应和熟化温度、溶液的p h 值、洗涤方式等，均对磁 性微粒的粒径、形态、结构及性能有很大影响。因此必须严格选择和控制反应过 程中的诸条件，方能获得理想的超细f e 3 0 4 微粒。 林本兰等【3 6 1 将f e c l 2 4 h 2 0 和f e c l 3 6 h 2 0 混合加入蒸馏水，温度控制在( 3 0 4 - 1 ) ，强烈搅拌并缓慢滴加n h 3 h 2 0 至p h = 9 ，将溶液高温恒温水浴晶化一定 时间。反应结束，f e 3 0 4 晶体粒子经沉淀、离心分离，并用去离子水多次洗涤至 溶液p h = 7 ，得到纳米级f e 3 0 4 颗粒。z h a oy u a n b i 等【3 刀在f e 3 + 和f e 2 + 的摩尔比为 3 ：2 下，以氨水( 0 3t o o l l ) 作为沉淀剂，用p e g 包覆，得到f e 3 0 4 磁性纳米 微粒在标准条件下是立方型，分散和统一，其平均直径大约是1 1 4 n m ，粒度分 布范围从5 - - 2 0 h m 。b i n gt a n g a 等【3 8 】用超声辅助化学共沉淀合成了纳米f e 3 0 4 ， 原料是钢表面处理业的废酸洗酒。超声辅助引入化学共沉淀过程是为了控制产生 的粒子大小。这一种制备新方法具有高价值，并且环保。 2 ) 微乳化法【3 9 , 4 0 l 微乳液是由油、水、表面活性剂( 有时存在助表面活性剂) 组成的透明、各向 同性、低粘度的热力学稳定体系，其中不溶于水的非极性物质作为分散介质，反 应物水溶液为分散相，表面活性剂为乳化剂，形成油包水型( w o ) 或水包油( o w ) 微乳液。这样反应空间仅限于微乳液滴这一微型反应器的内部，可有效避免颗粒 之间的进一步团聚。因而得到的纳米粉体粒径分布窄、形态规则、分散性能好且 大多为球形。可通过控制微乳化的液体中水的体积及各种反应物的浓度来控制成 核、生长，以获得各种粒径的单分散纳米离子。谢钢等【4 l 】在制备超细f e 3 0 4 磁性 7 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 粒子的基础上，以3 种低分子量聚合物d i s p e r b y k 2 1 0 6 、d i s p e r b y k 2 1 0 8 和 d i s p e r b y k 2 1 1 1 为f e 3 0 4 微粒在单体相中的分散稳定剂，采用细乳液聚合法制备 了平均粒径为3 4 0 n m 的p s f e 3 0 4 磁性复合微球。 3 ) 溶胶一凝胶法 ， 它利用金属醇盐为原料在一定的温度和条件下进行水解和缩聚反应，制备金 属氧化物或金属氢氧化物的均匀溶胶，而随着缩聚反应的进行以及溶剂的蒸发， 具有流动性的溶胶逐渐变为略显弹性的固体凝胶，凝胶经干燥，热处理后可得到 氧化物超微粉。z l l u 等【4 2 】将f e ( n 0 3 ) 3 9 h 2 0 在5 0 c 下溶解于去离子水中形 成透明溶液，然后加入柠檬酸和乙二醇，用氨水调整p h 值到7 。将混合溶液在 6 0 c 下持续搅拌2 4 h ，使其慢慢蒸发形成凝胶，再在烤箱中1 5 0 ( 2 干燥成胶质前 体。所得凝胶在空气中8 5 0 c 初步煅烧4 h 获得粉末粒子。x uj i n g 4 3 】等用 f e t n 0 3 ) 3 9 h 2 0 作为铁源，溶解在乙二醇中，在8 0 c 下制得溶胶，多步烘干后， 在真空条件下对所得粉末进行2 0 0 , - - - 4 0 0 ( 2 退火，得到f e 3 0 4 纳米颗粒。 4 ) 水热法m ，4 5 j 水热合成法是利用高温高压下一些氢氧化物在水中的溶解度大于对应的氧 化物在水中的溶解度，于是氢氧化物溶入水中同时析出氧化物的原理来合成纳米 粒子的。如果氧化物在高温高压下溶解度大于相对应的氢氧化物，则无法通过水 热法来合成。水热法的优点在于可直接生成氧化物，避免了一般液相合成法需要 经过煅烧转化为氧化物这一步骤，从而极大地降低乃至避免了硬团聚的形成。用 水热法制备的超细粉末最小粒径达到纳米的水平。 5 1 辐照化学法 用辐照化学技术制备是一种较新的方法，目前比较广泛使用的为y 射线辐射 法，它是利用钴6 0 c o 同位素释放的y 射线辐照反应体，以获取纳米材料，该方 法的缺点是：6 0 c o 同位素是放射性物质，当它不能被利用时，将成为放射性废 物，对环境不利。周瑞敏 4 6 1 等通过电子加速器产生的电子束作为辐射源来制备 纳米四氧化三铁。首先，将三氧化二铁容于蒸馏水中，然后加入聚乙烯醇( p v a ) ； 搅拌均匀后再加入氧化性自由基o h 自由基清除剂异丙醇( 姒) ，然后再加入氨 水，使其形成氢氧化铁胶体溶液。将得到的溶胶在2 5 m e v ，4 0 m a 地纳米电子 加速器产生的电子束的辐射下进行辐照处理，最后将试样在真空干燥箱中烘干最 终可得到黑色的纳米f e 3 0 4 粉末。 ( 3 ) 气相法 气相法，即化学气相沉积法( c v d ，c h e m i c v a p o rd e p o s i t i o n ) ，是指利用气 体原料，通过气相化学反应形成构成物质的基本粒子一分子、原子等，经过成核 和生长两个过程合成薄膜、颗粒、晶须或晶体等固体材料的工艺过程。 8 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 除以上方法外，还有电化学法、有机物模板法、超临界流体干燥法、声化 学法、溶剂蒸发法、喷雾热解法、络合物分解法、直流电弧等离子体法、回流法 等。 1 2 3 磁性微球在生物医学中的应用 磁性微粒由于粒径微小、比表面积大、能够偶联蛋白、核酸等有机生物分 子，同时还有磁响应性，能在外加磁场的作用下迅速分离，操作简便，费用低廉， 在酶的固定化、细胞分选、免疫学检测、蛋白质提纯、靶向药物以及基因治疗等 诸多领域中有着广泛的应用前景。 ( 1 ) 酶的固定化 4 7 , - 4 9 酶的固定化是利用固体材料将酶束缚或限制在一定区域内，仍能进行其特有 的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。生物高分子都具有很多官能团， 可以通过物理吸附、交联、共价偶合等方式将他们固定在磁性颗粒的表面。 ( 2 ) 细胞分选【删 细胞分离是生物细胞学研究中一种十分重要的技术，高效的细胞分离在临床 中是首要的、重要的步骤。这种细胞分离技术在医疗l 临床诊断上有广范的应用， 例如治疗癌症需在辐射治疗前将骨髓抽出，且要将癌细胞从骨髓液中分离出来。 传统的细胞分离技术主要采用离心法，利用密度梯度原理进行分离，时间长、效 果差。随着合成磁性粒子的发展，免疫磁性粒子在分离细胞方面已经获得了快速 的发展经动物临床试验已获成功。磁性微球作为不溶性载体，在其表面接上具有 生物活性的吸附剂或其它配体( 如抗体、荧光物质外源凝结素等) 活性物质，利用 它们与目标细胞的特异性结合，在外加磁场的作用下将细胞分离、可用于细胞的 分类以及对其种类、数量分布进行研究。 ( 3 ) 免疫检测【5 1 , s 2 1 免疫检测在现代生物分析技术中是一种重要的方法，它对蛋白质、抗原、抗 体及细胞的定量分析发挥着巨大的作用。在免疫检测中，磁性微粒替代传统酶标 板作为固相载体，包被在磁粒表面的抗体( 或抗原) 可与环境中特异性抗原( 或抗 体) 结合，形成抗原。抗体复合物，在外加磁场作用下，使特异性抗原( 或抗体) 与其它物质分离，这种分离方法克服了放射免疫测定( r i a ) 和传统酶联免疫测定 方法的缺点，具有灵敏度高、检测速度快、特异性高、重复性好等优点。 ( 4 ) 靶向药物【5 3 ，s 4 1 制备出生物相容性和单分散性较好的无机磁性纳米颗粒载体( 主要为铁系氧 化物) ，再用生物高分子( 氨基酸、多肽、蛋白质、酶等) 包覆磁性纳米颗粒载体， 再将包覆好的磁性载体与药物分子结合，将这种载有药物分子的磁性纳米粒子注 射到生物体内，在外加磁场的作用下，通过纳米颗粒的磁性导向性使药物更准确 9 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 地移向病变部位，增强其对病变组织的靶向性，有利于提高药效，达到定向治疗 的目的，从而降低药物对正常细胞的伤害，改变目前放疗和化疗中正常细胞和癌 细胞统统被杀死的状况，减少副作用。 ( 6 ) 基因治疗【”，5 6 】 ： 2 0 世纪7 0 年代，医学领域提出了“基因治疗 这一概念，即将遗传物质导 入细胞或组织，进行疾病的治疗即将遗传物质导入组织或细胞进行疾病治疗。目 前常用病毒载体和脂质体载体，病毒载体存在制备困难，装载外源d n a 大小有 限制，能诱导宿主免疫反应及潜在的致瘤性等缺点。多价阳离子聚合物，具有病 毒载体的优点，而没有病毒载体的缺点。但是聚合物的颗粒大小是影响转染效率 的因素之一。磁性纳米粒子的出现克服了它