（动物学专业论文）三种鳖线粒体dna部分基因序列的比较分析和分子鉴定标记.pdf

摘要 本文利用线粒体d n a 分子标记技术研究了中华鳖、砂鳖和山瑞鳖 线粒体d n a 部分基因的序列并进行了比较分析，在分子水平证实了砂 鳖为鳖属一新种并获得了这三种鳖各自的分子鉴定标记，主要结论如 下： ( 1 ) 对中华鳖、砂鳖线粒体d n a1 2 sr r n a 基因片段进行了序列 测定和p c r - r f l p 分析。结果表明：中华鳖、砂鳖线粒体d n a1 2 sr r n a 基因片段的碱基序列长度相同，均为5 6 2 b p ，其a 、t 、c 、g 含量相 似，两序列间共有1 3 处碱基不同，序列差异率为2 3 1 ，而中华鳖 与砂鳖各自个体间的平均序列差异率分别为0 5 3 和0 3 6 ，种间差 异显著；用内切酶m s pi 酶切两种鳖的1 2 sr r n a 基因片段，在砂鳖 中可得到大小为5 1 9 b p 和4 3 b p 两个片断，而中华鳖无此酶切位点， 这可作为准确鉴别中华鳖和砂鳖的分子鉴定标记。 ( 2 ) 对中华鳖、砂鳖和山瑞鳖线粒体d n a1 2 sr r n a 、1 6 sr r n a 基因进行了序列测定、序列的比较分析和系统进化分析。对三种鳖线 粒体d n a 两个r r n a 基因全序列核苷酸差异率的分析表明：中华鳖与 砂鳖1 2 sr r n a 基因序列问的差异率为4 0 ，中华鳖、山瑞鳖间的序 列差异率为1 1 0 ，砂鳖、山瑞鳖间的序列差异率为l o 8 ；中华鳖 与砂鳖1 6 sr r n a 基因全序列的差异率为4 0 ，中华鳖、山瑞鳖间的 序列差异率为1 3 2 ，砂鳖、山瑞鳖间的序列差异率为1 2 8 。基于 三种鳖m t d n a1 2 sr r n a 、1 6 sr r n a 基因全序列的系统进化分析结果 均支持砂鳖为鳖属一新种。 ( 3 ) 对中华鳖、砂鳖和山瑞鳖线粒体d n a 细胞色素b 基因进行 了序列测定、序列的比较分析、系统进化分析和p c r r f l p 分析。结 果表明中华鳖、砂鳖与山瑞鳖线粒体d n ac y t b 基因的序列全长相同， 均为1 1 4 0 b p ，其a 、c 、g 、t 含量相似。序列间的差异率分析表明： 中华鳖与砂鳖此基因序列间的差异率为7 7 ，中华鳖、山瑞鳖间的 序列差异率为1 5 o ，砂鳖、山瑞鳖间的序列差异率为1 5 9 ，种间 差异显著，且中华鳖与砂鳖的差异率相对较小。p c r r f i 。p 分析表明： 用内切酶n d ei 可准确鉴别砂鳖，而用内切酶舶洲i 则可准确鉴别 【l i 瑞鳖。内切酶n d ei 和舶新 i 的联用分析，可使这三种鳖在分子 水平都苻到明确的箍定。基于三种鳖m t d n a 细胞色素b 基围全序列的 系统进化分析结采也支持砂鳖为鳖属一。新种。 从中华鳖、砂鳖和由瑞鳖线粒体d n ai 2 sr r n a 、1 6 sr r n a 和c y t b 基阕碱基痔捌静显著差异相酶诱位点的变纯，在分子水平证瞬了砂鳌 是不弱予中华鳖酶鳖属一新种；基予3 个不同基因髂全痔绷稀分掰构 建的系统进化树均显示中华鳖、砂鳖有较近酶亲缘关系，扶舔从分予 进化角度涯明了砂鳖为鳖属一新零申。 关键词：中华鳖，砂鳖，山瑞鳖，线粒体d n a ，t 2 sr r n a 基因，1 6 sr r n a 基因，细胞色素b 基因，p c r - r f l p 分橱，分子鉴定标记 a b s t r a c t s o m eg e n e so fm i t o e h o n d r i a ld n ao fp e l o d i s c u ss i n e n s i s ， f e 1 0 d i s c u sa x e n a r i aa n dp a l e as t e i n d a c h n e r iw e r e c 、o n e da n d s e q u e n c e db yu s i n g m 0 1 e c u l a rt e c h n o l o g yo f m i t o c h o n d r i a ld n a b a s e do nt h ec o m p a r a t i v ea n a l y s i so nt h e i rs e q u e n e ed a t a ，w e e o n f i r m e dp e l o d i s c u sa x e n a r i ai s an e ws p e c i e si up e l o d i s c u s f r o t h e1 1 1 0 l e c u l a rl e v e la n dg o tt h e i rm o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n a r k e r si nt h r e es p e c i e so fs o f t t u r t le s t h em a i nr e s u l t s w e r e s u m m a r i z e da sf 0 1 1 0 w s ： ( 1 ) t h ep r i m e r sf o rp e l o d i s e u ss i n e n s i sa n dp e l o d i s c u s a x e n a r i aw e r ed e s i g n e da n d5 6 2b a s ep a i r so fm i t o c h o n d r i a ld n a 1 2 sr r n ag e n ew e r ea m p l i f i e da n ds e q u e n c e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h e 1 e n g t ho f t h e i rs e q u e n t eist h es a m e ，t h ea 、t 、g 、 cc o n t e n t sa r es i m i l a r b a s e do nt h e i rs e q u e n t ed a t a ，w ef o u n d t h e r ea r e1 3d i f f e r e n tn u c l e o t i d es i t e s ( p e r c e n t a g ed i v e r g e n c e is2 31 ) b e t w e a np o l o d i s e u ss i n e n s i sa n d 尸e o d j s c “sa x e n a r i a b yu s i n gt h es o f t w a r eo fc 1 u s t a l w ，w h e r e a st h ea v e r a g en u m b e r o fd i f f e r e n tn u c l e o t i d es i t e si s3 ( p e r c e n t a g ed i v e r g e n c eis 0 5 3 ) i np e l o d i s c u ss i n e n s i sa n d2 ( p e r c e n t a g ed i v e r g e n e eis 0 3 6 )i np e i o d i s c u sa x e n a r i a t h e n u c1 e o ti d e p e r c e n t a g e d i v e r g e n c e i so b v i o u sb e t w e e n s p e e i e s ， s oi t s u g g e s t s p e l o d i s e 盯sa x e n a r i ai san e ws p e c i e si np e l o d i s e u s r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e a n a l y s i s b a s e do n s e q u e n e e d a t ao ft h i sd n a f r a g m e n tr e v e a l e dt h ep r e s e n c eo fp 0 1 y m o r p h i cs i t e sf o rm s pi e n d o n u c l e a s e ，t h e r e i so n es i t ef o rm s pie u d o n u c l e a s ei n p e l o d i s c u sa x e n a r i a ，b u tn o n ei np e l o d i s c u ss i n e n s i s t h e r e s t r i c t i o np r o f i t e so b t a i n e db ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s w h e n a m p l i c o n sw e r ec u tw i t h l i s p i e n z y m e a l1 0 w e dt h e u d e q u i v o c a l i d e n t i f i c a t i o nb e t w e e np e l o d i s e u ss i n e n s i sa n d p elo d i s c u sa x e n a r i a ( 2 ) t h ep r i m e r s f o r1 2 sr r n aa n d1 6 sr r n ag e n e so f p p ，d d i s c u ss i n e n s i s ，p e l o d i s c u s a x e n a t i aa n dp a l e a s t e i n d a c h n e r iw e r ed e s i g n e da n dt h ec o m p l e t es e q u e n c e so ft h e t w or r n ag e n e sw e r ea m p l i f i e da n ds e q u e n c e d b a s e d 0 nt h e i r s e q u e n t e d a t ao f1 2 sr r n ag e n e ，w ec a nk n o w t h en u c l e o t i d e p e r c e n t a g ed i v e r g e n c ei s4 o b e t w e e np e l o d i s c u ss i n e n s i sa n d p e l o d i s c u sa x e n a r i a 11 o b e t w e e np e l o d i s c u ss i n e n s i sa n d 几l e as t e i n d a c h n e r i ，10 8 b e t w e e np e l o d i s e u sa x e n a r i aa n d p a l e as t e i n d a c h n e r i ，w h e r e a s t h en u c1e o ti d e p e r c e n t a g e d iv e r g e n c ei s4 0 b e t w e e np e l o d i s c u ss i n e n s i sa n dp e l o d i s c u s a x e n a r i a 1 3 2 b e t w e e np e l o d i s c u s s i n e n s i sa n dp a l e a s t e i n d a c h n e r i 1 2 8 b e t w e e np e l o d i s c u s a x e n a r i aa n dp al e a sz e i n d a e h n o r iw h a nt h es e q n e n c ed a t ao f 1 6 sr r n a g e n e i s a n a l y s i s e d t h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po f1 2 sr r n aa n d 1 6 s r r n ag e n e so ff o u rs p e c i e so f s o f t t u r t l e sw a sr e s p e c t i v e l y d e s c r i b e d a 1 lo ft h em o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ct r e e si n d i c a r e d t h a tp e l o d i s e u s a x e n a r i a ism o r ec l o s e l yr e l a t e dw i t h p e l o d i s c u ss i n e n s i st h a nt h eo t h e rt w os p e c i e so fs o f t t u r t l e s a n d s u p p o r t e d p e l o d i s e u sa x e n a r i ai s an e w s p e c i e s i n 尸e l o d i s c u s ( 3 ) t h ep r i m e r s f o rp o l o d i s e u ss i n e n s i s ，p e l o d i s e u s a x e b a t l aa n dp a l e as t e i n d a c h n e r iw e r ed e s i g n e da n d11 4 0b a s e p a i r so fm i t o c h o n d r i a ld n ac y t o c h r o m e bg e n ew e r ea m p l i f i e da n d s e q u e n c e d t h er e s u i t ss h o w e dt h a tt h el e n g t ho ft h e i rs e q u e n c e i st h es a m e a 、c 、g 、tc e n t e n t sa r es i m i l a r b a s e d o nt h e i r s e q u e n c ed a t a ，w ec a nk n o wt h en u c l c o t i d ep e r c e n t a g ed i v e r g e n e e is7 1 b e t w e e np e l o d i s e u ss i n e n s i sa n dp e l o d i s e u sa x e n a r i a 1 5 o b e t w e e np e l o d i s e u ss i n e n s i sa n dp a l e as t e i n d a c h n e r i ， 1 5 9 b e t w e e np e l o d i s c u sa x e n a r i aa n d p a 【l e as t e i n d a c b n e r i ， w h e r e a st h ei n d i v i d u a l n u c l e o t i d e p e r c e n t a g ed i v e r g e n c e i s 2 37 i np e l o d i s c u ss i n e n s i s ，0 8 8 i np e l o d i s e u sa x e n a r i aa n d 0 1 8 i np a l e as t e i n d a c h n e r i t h eh u e l e o t i d ep e r c e n r a g e i v di v e r g e n c e i so b v i o u s b e t w e e ns p e c i e s ， s oi t s u g g e s t s p e l o d i s c u sa x e n a r i aisan e ws p e e i e si np e l o d i s c u s r e s i r i c t i o n e n d o n u c l e a s ea n a l y s i s b a s e do n s e q u e n c e d a t ao ft h i sd n a f r a g m e n tr e v e a l e dt h ep r e s e n c eo fp o y m o r p h i c s i t e sf o rh w ei a n db a m hie n d o n u c l e a s e s t h er e s t r i c t i o np r o f i l e so b t a i n e db y a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sw h e na m p l i c o n sw e r er e s p e c t i v e l y c u tw i t ha w eia n db a m l tie n z y m e s a l1 0 w e dt h e u n e q u i v o c a l m o l e c l l l a ri d e n t i f i c a t i o na m o n g p e l o d i s c u ss i n e n s i s ， p e l o d i s c u sa x e n a r i aa n dp a l e as t e i n d a e h n e r i b a s e do n t h e i r s e q u e n e ed a t a ，t h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po fm i t o c h o n d r i a l d n ac y t bg e n eo ff o u rs p e c i a so fs o f t t u r t l e sw a sd e s c r i b e d r e s i l l t si n d i c a t e dt h a tp e l o d i s c u sa x e n a r i ai s m o r e c l o s e l y r e l a t e dw i t hf e l o d i s c u ss i n e n s i st h a nt h eo t h e rt w os p e c i e so f s o f t t u f t l a sa n ds u p p o r t e dp e l o d i s c u s a x e n a f l ai san e ws p e c i e s i np e i o d i s c u s b a s e do nt h eo b v i o u sn u c l e o t i d ep e r c e n t a g ed i v e r g e n e eo f 1 2 sr r n a 1 6 sr r n a a n d c y t bg e n e s a n dt h e p r e s e n e e o f d o l y m o r p h i c s it e sf o re n d o n u cl e a s e s ，w ec a nk n o wp e l o d i s c u s a x e n a r i ai s an e w s p e c i e s i np e l o d i s e u s t h ep h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i po f1 2 sr r n a ，1 6 sr r n aa n dc y t bg e n e s o ff o u rs p e c i e s o fs o f t t u r t l e s w a s r e s p e c t i v e l yd e s c r i b e d ， in d i c a t e dt h a tp e l o d i s c u sa x e n a r i ai sm o r ee l o s e l y p e l o d i s c u ss i n e n s i st h a nt h eo t h e rt w os p e c i e so f a n d s u p p o r t e d p e l o d i s c u sa x e n a r i ai s an e w p e o d l s c u s t h er e s u l t s r e l a t e dw it h s o f t t u r t l e s s p e c l e s 1 n k e yw o r d s ：p e l o d i s c u ss i n e n s i s ，p e l o d i s c u sa x e n a r i a ，助l e a s t e i n d a c h n e r i ，m i t o e h o n d r i a ld n a ，1 2 sr r n ag e n e ，1 6 sr r n ag e n e c y t o c h r o m ebg e n e ，p c r r f l pa s s a y ，m e l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o n m a r k e f s v 绪论 1 。1 动物线粒体基因组的结构、特征与主要检测方法 1 1 1 动物线粒体基因组的结构 线粒体是具有双层膜结构的细胞器，它在动物细胞中被酋先发 凌( 矗l t f a a n n ，1 8 9 7 ) ，1 8 9 7 年b e n d a 将其禽名为攘i t o c h o n d r i o n ，1 9 0 4 年m e v e s 在植物细胞中也发现了线粒体的存在，从而确认线粒体是普 遍存在于真核生物所有细胞中的一种重要的细胞器“。线粒体自身 揍豢d n a ，霹自我复裁、表达，并蠢棱基因缡玛憋蛋爨矮窈酶从缨憨质 输入线粒体，共同完成生物氧化的生理功能。通过多年来对各种生物 线粒体基网组结构和功能的研究，人们推测线粒体起源于紫色光合细 蕊，这种细菌入侵真核生物，与寞核生物形成内共生体，逐渐退化为缨 胞器。1 9 8 1 年a n d e r s o n 等入强3 测定了入线粒体基因组的全痔剿，垂目 前为止已柯多种动物的线粒体基因组全序列被测定出来，如哺乳动物 的牛、大鼠、小鼠、鲸、海豹、马等，鸟类的鸡，两牺类的爪蠛，以及 鱼类酶鲣惫、泥鳅、虹鳟、七鳃鳗、黥兔、矛尾壁、b i c h i r 等，还有 一些动物的部分线粒体基因序列也已被测定。高等动物细胞的线粒体 d n a ( m i t o c h o n d r i a l d n a ，m t d n a ) 分子都具有双链环澎的结构，已发 表懿全澎列溅定工终表饔，脊椎动耱线粒舞基因缝魄长度大多在 1 6 1 8 k b 之间，根据碱性氯化铯密度梯度离心中双链密度不嗣分为 霾链( h - 链) 和轻链( l - 链) ，其基因组包括1 3 个蛋白质编码基因， 2 个r r n a 基因、2 2 个t r n a 基因、控制区( d 一环区) 和轻链复铡起始 区。除个簧臼质基因( n d 6 ) 和8 个t r n a 基因由l 一链编码外，其余的 大部分基闳都由h 一链编码。高等动物细胞的线粒体d n a 各基网问排 列紧密，非编码序列魄铡小，基因捶列的蹶序基本致，基因内不含蠹 含子，碱基豹使用节约、高效。线粒体基阑组的这搴中长度短小、结构 紧密的特点被认为是适应于细胞器快速复制的选择的结果。 ( 1 ) 、蛋白质基因 脊稚动物线粒体基因组含有1 3 个餐自质基因，包撬细胞色素b 基因( c y t b ) 、细胞色素c 氧化酶三个亚基基因( c o i ，c o i i ，c o m ) 、氢 化辅酶i ( n a d h ) 脱氢酶的七个皿基基因( n d l ，n d 2 ，n d 3 ，n d 4 ，n d 4 l ， n d 5 ，n d 6 ) 秘a t p 酶瑟令耍基綦闲( a t p a s e 6 ，a t p a s e 8 ) 。这1 3 个鬣自矮 或亚基都怒线粒体内膜呼吸链的组分。不阿脊椎动物相应基因序列的 比较显示，c y t b 、c o i 、c o i i 、c o i i i 基因最保守，同源性最高，a t p a s e 6 、 a t p a s e 8 基因、n d 纂困变异比较大。大多数蛋白质麓因闻都有t r n a 基因间隔，只有n d 4 l n d 4 、a t p a s e 8 a 羊p a s e 6 、a 1 p a s e 6 c oi i l 、 n d s n d 6 ( 分别由h l 链编码) 基因紧密相连，甚至彼此重叠，重热基因 的阕读框彼此相对位移一个碱綦。在已测序的线粒体蛋白质基因中， 翻译起始糍码子麓经翔磁较一致。a t g 慧簸常嗣静起始密码，懿鱼类 和鸡，除c o i 基因使用g t g 外，其余1 2 个基因都使用a t g h 。9 1 。g t g 是 箕核生物线粒体基因组中另一类起始密码子，它的使用并不鲜觅，鼠 懿n d l 、a t p a s e 8 墓溺，鬃褥酶n d 5 基因澄及藤核生秘懿菜些基戮也鞋 g q 、g 为起始密码子。线粒体蛋白质基因的终止密码予分两类：1 完全 终止子，为三联体密码子；2 不完全终止子，只有t 或t a ，另外所需的 矗塞麓缀转录本麴p o l y a 尾提供。骜盘密褥子的镬麓在不嚣种类中存 在些差辨，完全终+ 止子t a a 、t a g 较常见，a g a 、a g g 比较少觅，以t 或t a 不完全终止子结尾的基因各物种各有不同。 ( 2 ) 、t r n a 基戮 脊椎动物线粒体基因组含裔2 2 个t r n a 基因，可以满足线糙体蛋 白质翻译中所有密码子的需要。其中t r n a - g l u ，a l a ，a s h ，c y s ，t y r ， s e r ，g l n ，p r o 由l 一链编码，其余瞧 l 一链编码。t r n a 基因一般散布予蛋 自质基因稀r r n a 基因之阊，樱邻基因穗隧l 一3 0 个碱基或紧密襁连， 甚至也发生重叠。 ( 3 ) 、r r n a 基因 线粒体的1 2 sr r n a 帮1 6 sr r n a 墓蘸定位子嚣一镶t r n a p h e 霖 t r n a - l e u 基因之间，中间以t r n a - v a l 基因为间隔，1 2 sr r n a 基因比 1 6 sr r n a 基因更保守。 ( 4 ) 、菲编码区 在线粒体基因组中主要存在两段非编码区，一段是控制区 ( e o n t r o lr e g i o n ) ，另一段是l 链复制起始区。控制区又称d 环区 ( d s p 】a c e l l l e n t l o o pr e g i o n ) ，位于t r n a p r o 窝t r n a - p h e 基因之阙， 是整个线粒体基因组序列和长度变异最大的区域，假其中也包含有傈 守片段。脊椎动物转环5 藕通常含商串联重复序歹g ，拷煲鼗在i 一8 个之闯，楚线粒体基阂缀长度燮舜的主要豚因。拷礅数不仅种闻有羞 肄，种志个体阉也存在靛异，只怒小于种闯。 1 。 。2 动耪线栽傣蒸颡缝豹特缀 动物线粒体基因缀的基因结构其有如下几个特点： t 、分子较小和茏组织特异性。已发袭的全序列测定结浆表踺， 脊雄麓携线粒钵基因缀酶长度大多在1 6 1 8 k b 之淘，显个露离不嗣 躐织舆有嵩艘的一致骶，敌任何缀织都可用于分析。 2 、遵循母系遗传藕遗传的独立性。线粒体d n a 其有典型的蹲系 遗绩方式，嚣受线粒体是存在予辩缨巍震中，纛精予孛靛线粒钵极少 滋入窝子，只麓逶过郛缨藏囊传递给瑟我，簸较少麓样本靛能够反映 瓣体结构“。由于线粒体瞧身携带d n a ，霹自我复制、表达，敬髓够 独立缝遗传。 3 、基因组结鞫籁攀虽保守、一缀结褥避诧速度疑，葵进纯速率 为核d n a 的5 l o 倍。内于线粒体d n a 基因组内不同隧域的进化速率 不闵，赦适合不嗣水平的进化研究。c y t b 秘n o 基因嫩于避纯快速， 适合耱群承平差异载检涮，也葡溺予释阏分辑。r n a 基因避纯速度缓 慢，常用于种或科以上水平的检测1 “。 4 、拷贝数多，每个细胞中礴1 0 0 0 1 0 0 0 0 个拷贝，翳于从缝织 孛分离、筑纯，结果蓬复援好。 5 、编粥效率高，嗣核i ) n a 相比，m t d n a 编码效帮较高n ”。鬣自质 编鹃基因茏内含子，黼蘸困间分黼常少于l o b p ，有时甚至福互交搭。 1 1 。3 动物线粒蒋蒸阑缝懿圭簧棱测方法 目前对m t d n a 的多态性分析与群体间或种间遗传变异的研究方 法主要有如下几种： l 、隈涮牲幽翻酶法：斑切薅图谱滋，一般耀双酶落澄豫麸丽 构建m t d n a 限制性酶切图谱。内切酶图谱法是一种较早的研究方法， 诧法虽在稔测点突变上较为壹躐，但费时髓须徽双酶切，其谱落亦较 复杂，若个体寝褒多态惶藏更难瓣释。蔽翻洼蠹韬酶片袋长度多态 法( r f l p ) ，该法步骤懿似图谱分析法，值髭颁双酶切，醑前该法应用 较广泛。 探针法，亦称杂交法，该法只麓估舞栩倾性和平均相戗僚， 缺少详细资料，对种内检测不太敏感。用放射性标志探针与靶m t d n a 逡行分子杂交，窝透通过翅显影嚣检测，在秘阀标志土缀有意义。 p c i l c r f l p 法，该方法可利用p c r 扩增总d n a ，避免了纯化m c d n a 的繁 琐，因而在m t d n a 分析中广为采用。 2 、直接测序法，通过测定m t d n a 全序列或部分蒸因序列以挝：铰 l i 葡物种或个体闯相关序列的羞异，从丽探讨迸纯关系。m t d n a 瓣 r f l p 分析与d n a 序列分析相比，不仅简单、快速、耗赞低，而且从理 论上讲，只要选择的酶足够多，就可检测到足够的变异，但它毕竟怒 静闷接检测d n a 序藏变异的方法，强磊与d n a 序残努橱方法褶毙，撬供 的信息很有限。近年来，随着p c r 技术的广泛应用，特别是全自动序列 分析技术在分子生物学领域的推广与应用，动物m t d n a 多态性的研究 主要集中在m t d n a 麓序爨分褥上。 1 2 m t d n a 多态性在动物系统学相种群识：；0 、物种保护中的威用 线粒体d n a 具有多态性，其在阋神群体阅或个体阅表现出变异现 象，这种现象可透过穿到测定耪限制性内诱酶等方法寒分奉厅。线粒体 d n a 多态性可分为位点多态性和长度多态憔两类，长度多态性大部分 来源于串联麓复序列，此外还有长度不等的辅入和缺失。自8 0 年代以 来，线粒体d n a 分橱在动耪迸纯遗转学、分子分类学、遗传多群性、 生物地理学殿保护生物学等领域门得到了广泛的应用。随着分子生物 学技术向生物学各研究领域的渗透，以m t d n a 作为分予标记，己成为 动物蒋裂是鱼类群俸遗传缝梅与篾统演纯关系磷究中融重要王爨。当 前，对动物m t d n a 研究的热点包括m t d n a 的信息、结构和功能遗传， m t d n a 在系统进化中的应用，m t d n a 在种群 = 别、物种保护中的j 睦l 用， 不问生物m t d n a 的进他等。 1 2 1 在动物系统学中的应用 较早期通过m t d n a 进行系统发育的研究主要采用r f l p 分析法。 嚣i l s o d 等( 1 9 8 5 年) 鞠t h o m a s 等( t 9 8 6 年) 裂建m t d n a 瓣r f l p 探讨了 几种鲑科鱼类种问和种内的系统进化关系，他们的大部分结果与经典 的形态分析结果一致“。 随着d n a 溺序技术秽生物售息学的块逮发展，分予系统学也豳臻 完善。m t d n a 由于具有独特的优点，在动物分子系统学研究中得到了 广泛的应用“5 。蚓。以m t d n h 序列研究物种的进化关系，大致分两大步 骤：1 ) 根据研究的对象与目的，选择适当的m t d n a 区域，测定强标篾段 的序列。对于近缘物种的研究，应选用进化速率较快的区域，对于远缘 物神的磺究，应选用襁对保守龅医域；2 ) 通过m t d n a 同源序列的比较， 采翔基本静翱蔽麓掰班及一定静系统重建途径与方法，茹篱约法、距 离法、似然法等综合分析m t d n a 序列，提取进化信息，构建分子系统 树。近年来，吴平等n7 1 用1 2 sr r n a 基因序列研究了潮龟科闭壳龟类 的系统遗纯；吴豢兵等h 础蠲t 2 sr r n a 蘩因序列探讨了8 耱鳄类酶系 统学关系；韩德民等n 引用1 2 sr r n a 基阏序列探讨了中国十种壁虎的 系统关系。彭作刚等旧伽采用线粒体c y t b 基因序列变异分析了东亚鳞 秘鱼类酶系统发鸯；谤爨乎等强“采嗣线粒薅c y t h 基医序雍分橱了东 亚鲤科趣类的系统发育；s a n j u r 等磕引利用线粒体c y t b 基因研究了伊 比亚半岛的1 4 种欧洲s q u a l i u s 鱼类的遗传络构，揭示了此半岛 s q u a l i u s 鱼群群的物摹孛形成及分纯魄历史和地理藏因；杨学= ；l 二等瞳引 用细胞色素b 基因部分序列研究了我国林蛙属动物的系统发生；李庆 伟等妇引基于线粒体细胞色素b 基因序列的差异对鹰科四种鸟类的分 子进化关系进行了研究；营祥荣等妇”耀缨胞色素b 基因的部分序列 对毛冠纛与3 释麓满动物懿系统迸纯关系进行了探讨。l i u 等瞪朝利霜 m t d n a 控制区序列变异探讨了鲤科鱼的系统发育关系；张四明等弛7 1 利用m t d n a 控制区序列探讨了达氏鲟、豫洲和北美洲中吻鲟的分类地 位；裁海等强8 1 剩麓m t d n a 控捌区序列变异醑究了中莺大陵梅花瘫静 系统发育关系。 在无背景资料的情况下，为获得较为客观的进化树，近来一般主 张选择m t d n h 不隧区域戆多缝客到数攒，再罴翔“联合”或“一致” 的途径；或选择m t d n a 不同聪域和核d n a 相结合的方法；或者选择整 个m t d n a 全序列来进行研究。江建平等瞳朝用线粒体d n a1 2 8 和1 6 s r r n a 基因熬分序列对囊螓鼹辩部分瓣魏进行了系统发弯关系酶探 讨；p o n d e l l a 等引利用线粒体1 6 sr r n a 和1 2 sr r n a 基因序歹f j ，探讨 了鲈形目的p a r a l a b r a x 及其相关种的系统发生关系；d u n n 等b “利用 线粒体1 2 sr r n a 基因、4 个t r n a 基医鄹嚣个蛋自矮编码基因探讨了 t l y i i o b a t i f o r m 韵分子系统发生关系；o b e r m i l l e r 等强23 分析了3 3 种 海鲢总翻( e l o p o m o r p h ) 鱼的线粒体1 2 sr r n a 和1 6 sr r n a 基因序列来 探讨它们的系统发生关系；k o s k i n e r t 等综合河鳟( t h y m a l l u s s p p ) me d n a 和核d n a 的生物地理学分析，对贝加尔湖的水文学理论进行了 研究；s a i t o h 等曲4 3 利用整个m t o n a 全序列探讨了1 4 种o s t a r i o p h y s a n 稻9 释 o s t a r i o p h y s a n 憋褒餐鱼鼹系统进化关系；m i y a 等列剥耀 整个m t d n a 全序列探讨了硬骨鱼类( t e l e o s t e a l l ) 的系统进化关系。 1 2 2 在种群识别、物种保护中的应用 利震动物m t d n a 研究技术可了解动物种群的遗传结构，并探求其 形成的原因。目前以m t d n a 作为分子遗传标记在动物分子群体遗传学 特别是在种群谈别、物种保护中得到了广泛的应用。传统的形态标记、 缨您学标记、阉工酶标记等已被藏功遗应用予多静动物酶秘群识裂， 但荐全面的形态学、细胞学和同工酶分析往往也难揭示出重要的遗传 交异，而m t d n a 的丰富变异可作为种群识剐的标志。近年 来，b e h e r e g a r a y 等口纠结合m t d n a 控制区部分序列和微卫璧分极，发瑗 海洋的银汉鱼群体与江河口的银汉鱼群体存在遗传分化。k o t l i k 等阳7 翻雳线粒俸c y t b 基因静序列分析，揭示爨分夺在多疆河流域的b a r b b a r b u sp e t e n y i 可分为3 个地区或河流特异性的地理型。k a i 等i 蚓 结合m t d n a 序梦l j 和m t d n a 的r f l p 分析，发现3 个b l a c kr o c k i s h 形态 型存在静群分化。杨金投等口鲍对分凑在长江秘珠江淡域的秀耪缕辩 鱼类线粒体c y t b 基因序列进行了分析，结果表明两种地理型间存在 明显的遗传交异，并且依箔分子迸化速率推测了长江和珠江两求系两 糟鳞科鱼类的分歧时间。周建峰等h 刚运用p c r - r f l p 方法分析了鲤鱼 3 个诬种线粒体d n an d 5 6 区段来了解它们之间的遗传关系，找到了 区分缝鱼3 个踅种的线粒体d n a 分子遗镥标逮。a n ac 6 s p e d e s 等“ 利用线粒体d n a1 2 sr r n a 部分片段的p c r - r f l p 标记，对比目鱼的骶 个近缘种进行了明确的分予鉴别；a n g e lsc o r e s a f i a 等h 23 利用线粒 体d n a1 2 sr r n a 部分片段靛p c r r f l p 标记，对蠢用毙娶鱼鲍5 个不 同的种进行了准确的鉴别。王义权等副在对c y t b 基因片段进行序列 分析的基础主，设计了一对高度特异性弓i 物震予金钱自花蛇的鏊瘸， 结果袭明该对引物在对金钱白芯蛇的鉴别中，用6 0 6 5 的复性 温度，可以1 0 0 检出金钱囱花蛇，是理想的用于鉴别金钱白花蛇及其 镑瀑品静分子遗传标记。 种群识剐在物耱保护上有其独特酶 乍瘸。由于传统的群霸翌种中 的划分大多基于地理分布和形态的考虑，丽没有涉及到遗传多样性， 因此不宣作为生物保护的基本单元。根据里约热内卢生物多样性保 护公约，将遗传趋异季孛群作为保护单元较为合适，与其分类地理关系 不大n “。在现代保护生物学中，动物m t d n h 多态性分析占据着非常重 要的堍位。旱在1 9 9 1 年，b a r l e t t 等仅粥3 0 7 b p 的c y t b 基因序列数 据，就非常清晰地将加拿大东海岸处予濒危状态下，但外部表型缀难 判窳的蓝色金枪鱼与大眼金枪鱼、黄鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼区分开i 蚓 为鏊色金枪鱼憋保护、检测窥管理撬供了技术。鬣羚c a p r i c o l i i ss h m a t r a e n s i s ) 是一种有重要应用和研究价值的珍惜动物，同时也是国 家二级保护动物。催雨新等n 朝通过c y t b 基因序列分析，认为鬣羚在 中图至少存在3 个进化骚著擎元，先确定鬣羚保护的重点单元提供了 理论依据。 1 3 分子速传标记及其在物种鉴定中的应用 1 3 1 分子速传标记概述 遗传标记( g e n e t i cm a r k e r s ) 麓基隧型酶特殊的易予识剐的表现 形式，其是进行分类学、育种学和物种鉴定、物种进化研究的主要技 术指标之一。当前遗传标记主要分为4 大类： 形态标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) ，靼生物蛇形态特征，戴 种形态标记简单直观，是分类学的主要研究手段，是物种的主要遗传 标记，早期久纲警逶采霜形态标记对鑫种送幸亍镶嗣。僵形态标记数少、 多态性差，遗传表达不太稳定，且受环境条件和基阑显隐性的影响较 大，不能真藏代表物种的遗传组成。细胞标记( c y t o l o g i c a m a r k e r s ) ，主要是染色体核型( 染色体数基、大小、随体、着丝点位 置等) 和带型( c 带、n 带和g 带等) ，显然这类标记的数目也很有限。 生纯标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) ，包括蛋臼质稻同工酶等，它们 是第一代应用予物种分类研究的分予生物学遗传标记。生化檬记具有 简单、迅速且缀济方便的优点，但其标记数量有限，且一种生物的同 工酶稻蛋自震翁受筇境耧生长阶段交仡昀影响，不麓满足种餍资源签 定和育种工作的需要。分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r s ) 。它是随耱 分子克隆和重组d n a 技术的完善而诞生的另一类重要的遗传标记，蕻 能反映生物个体之间或种群之间具有差异性的d n a 片段。与。i 二述三种