（化学工程专业论文）混合模式吸附层析分离猪血免疫球蛋白研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 本文将新型的混合模式吸附层析应用于猪血免疫球蛋白的分离纯化。混合 模式吸附层析结合了静电与疏水相互作用，吸附容量大，具有非盐依赖的吸附特 性，在高盐和低盐条件下都可以高效吸附目标蛋白。一般可以通过调节p h ，改 变蛋白质和或吸附剂的所带电荷，利用静电排斥作用协助洗脱。我国年产猪血 1 0 0 多万吨，目前大部分废弃，造成资源的严重浪费和环境污染。猪血中富含蛋 白质，其中免疫球蛋白高达2 ，具有抗菌、抗病毒等生物活性。开发合适的分 离工艺，实现猪血蛋白的高效经济分离，变废为宝，具有重要的意义。 首先考察了不同沉淀法分离猪血浆中的纤维蛋白原，包括冻融法、乙醇法、 聚乙二醇法和硫酸铵法，比较发现硫酸铵法简单易行，成本低，周期短，分离纤 维蛋白原效果好。无需调节血浆p h ，用2 0 饱和度的硫酸铵溶液沉淀分离猪血 浆中的纤维蛋白原，离心后的上清液中富含免疫球蛋白，便于后续分离。 考察了商品混合模式吸附介质m e p h y p e r c e l 对猪血免疫球蛋白的吸附性 能，包括静态吸附平衡和吸附动力学，研究了p h 和盐浓度对吸附的影响，确定 了合适的上样和洗脱条件，从硫酸铵沉淀的上清液中直接分离免疫球蛋白，纯度 达到7 7 4 ，得率为1 1 5 m g m l 血浆。 进一步研究了实验室自制的3 种亲硫性混合模式吸附剂 ( c e l l t u c d v s m m i ，c e l l t u c d v s m e p 和c e l l t u c d v s m b i ) 对猪血免疫 球蛋白的吸附性能。研究发现，p h 是影响吸附的关键因素，c e l l t u c d v s m m i 吸附容量比较大，对p h 敏感，吸附选择性较好，适合于分离猪血免疫球蛋白。 优化了层析分离条件，以硫酸铵沉淀的上清液为料液，p h 5 平衡上样，p h 7 洗脱 去除杂蛋白，p h 3 8 洗脱得到猪血免疫球蛋白，电泳分析纯度达到9 4 3 ，纯化 倍数为5 6 。 本文实现了硫酸铵盐析和混合模式吸附层析的有机结合，利用硫酸铵沉淀分 离纤维蛋白原，沉淀上清液无需处理，直接利用混合模式吸附层析分离，得到纯 度较高的猪血免疫球蛋白。本文工作为猪血资源的综合开发利用提供了新方法。 关键词：混合模式吸附层析，免疫球蛋白，猪血，m e p h y p e r c e l ，亲硫性混合 模式吸附剂 t t 浙江大学硕上学位论文 a b s t r a c t t h en e wt e c h n o l o g yo fm i x e d m o d ea d s o r p t i v ec h r o m a t o g r a p h yw a sa p p l i e df o r t h ep u r i f i c a t i o no fi m m u n o g l o b u l i n ( i g ) f r o mp o r c i n e p l a s m a c o m b i n i n gt h e e l e c t r o s t a t i ca n dh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n s ，m i x e d - m o d ea d s o r p t i v ec h r o m a t o g r a p h y h a sah i g ha d s o r p t i o nc a p a c i t ya n ds h o w st h es a l t i n d e p e n d e n tp r o p e r t y t h et a r g e t p r o t e i nc a nb ea d s o r b e du n d e rb o t hh i g ha n dl o ws a l tc o n c e n t r a t i o n s t h ee l u t i o ni s i n d u c e d 、) l ，i t ht h ee l e c t r o s t a t i cr e p u l s i o nb e t w e e nt h ep r o t e i na n da d s o r b e n t sb y a d j u s t i n gt h ep hv a l u e i nc h i n a , t h e r ei sa b o u t1m i l l i o nt o n sp o r c i n eb l o o de v e r y y e a r , w h i c hi sm o s t l ya b a n d o n e d ，r e s u l t i n gi nt h ew a s t eo fr e s o u r c e sa n ds o m e e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n p o r c i n eb l o o di sr i c hi ns o m eu s e f u lp r o t e i n s ，e s p e c i a l l yi t c o n t a i n su pt o2 o fi m m u n o g l o b u l i n m o s to fi m m u n o g l o b u l i nh a sa n t i b a c t e r i a l a n t i v i r a la n do t h e rb i o l o g i c a la c t i v i t i e s t h e r e f o r e ，d e v e l o p i n gas u i t a b l ep r o c e s sf o r t h ee c o n o m i ca n de f f i c i e n ts e p a r a t i o no fp o r c i n eb l o o dp r o t e i n si sn e c e s s a r y f i r s t l y , s e v e r a lp r e c i p i t a t i o nm e t h o d sw e r ee x p l o r e dt os e p a r a t et h ef i b r i n o g e n f r o mp o r c i n ep l a s m a , i n c l u d i n gf r e e z i n ga n dt h a w i n g ，a d d i t i o no fe t h a n o l ，p e ga n d a m m o n i u ms u l p h a t e a f t e rc o m p a r i s o n ，t h ep r e c i p i t a t i o nm e t h o dw i t l la m m o n i u m s u l p h a t ew a sc h o s e na n do p t i m i z e d t h es a t u r a t i o no fa m m o n i u ms u l p h a t ew a s2 0 ， a n dn on e e dt o a d j u s tp ho fp o r c i n ep l a s m a t h es u p e r n a t ew a sr i c h i n i m m u n o g l o b u l i n ，w h i c hi sb e n e f i tf o rt h ef o l l o w i n gs e p a r a t i o n s e c o n d l y ，t h ec o m m e r c i a lm i x e d - m o d ea d s o r b e n tm e p h y p e r c e lw a se x p l o r e d f o rt h es e p a r a t i o no fp o r c i n ei m m u n o g l o b u l i n t h ea d s o r p t i o np r o s p e r i t i e sw e r e i n v e s t i g a t e d ，i n c l u d i n gt h ea d s o r p t i o ni s o t h e r ma n dk i n e t i c s t h ei n f l u e n c eo fp ha n d s a l tc o n c e n t r a t i o nw e r es t u d i e d ，a n dt h ea p p r o p r i a t ec o n d i t i o n sf o rs a m p l el o a d i n ga n d e l u t i o nw e r ec h o s e n t h ep o r c i n ei m m u n o g l o b u l i nw a ss e p a r a t e df r o mt h es u p e m a t e o fa m m o n i u ms u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n 、i t hm e p - h y p e r c e l t h ep u r i t yc o u l dr e a c h 7 7 4 a n dt h ey i e l dw a sa b o u t11 5 m g m lp o r c i n ep l a s m a f i n a l l y , t h r e e k i n d so fh o m e - m a d e t h i o p h i l i cm i x e d - m o d e a d s o r b e n t sw e r e i n v e s t i g a t e d ，i n c l u d i n gc e l l t u c - d v s - m m i ， c e l l t u c d v s m e pa n d i i i 浙江大学硕士学位论文 c e l l - t u c - d v s m b i i tw a sf o u n dt h a tp hw a st h ek e yf a c t o rt oa f f e c ta d s o r p t i o n c e l l - t u c - d v s m m lw a sb e s tf o ri m m u n o g l o b u l i np u r i f i c a t i o n 埘t 1 1h i 曲a d s o r p t i o n c a p a c i t y , g o o dp hs e n s i b i l i t ya n dh i g hs e l e c t i v i t yf o ri m m u n o g l o b u l i n m o r e o v e r , t h e s e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d w i t ht h es u p e r n a t eo fa m m o n i u ms u l p h a t e p r e c i p i t a t i o na ss a m p l el o a d i n ga tp h5 ，t h ea l b u m i n sc o u l db er e m o v e d 晰t 1 1t h e e l u t i o na tp h7 ，a n dt h ep o r c i n ei m m u n o g l o b u l i nw a so b t a i n e dw i t l lt h ee l u t i o na t p h 3 8 t h ep u r i t yr e a c h e d9 4 3 a n dt h ep u r i f i c a t i o nf a c t o rw a sa b o u t5 6 i nt h ep r e s e n tw o r k , t h ep r e c i p i t a t i o n 、v i t l la m m o n i u ms u l p h a t ea n dm i x e d - m o d e c h r o m a t o g r a p h yw e r ec o m b i n e d t h ef i b r i n o g e nw a ss e p a r a t e dw i n la m m o n i u m s u l p h a t ep r e c i p i t a t i o nf r o mp o r c i n ep l a s m a , t h es u p e m a t ew a sl o a d e dd i r e c t l yf o r m i x e d m o d ec h r o m a t o g r a p h ya n dt h ei m m u n o g l o b u l i nw i t hl l i g hp u r i t yw a so b t a i n e d t h i st e c h n o l o g yp r o v i d e dan e wa p p r o a c hf o rt h ec o m p r e h e n s i v ed e v e l o p m e n ta n d u t i l i z a t i o no fp o r c i n eb l o o dr e s o u r c e s k e yw o r d s ：m i x e d m o d ea d s o r p t i v ec h r o m a t o g r a p h y ，i m m u n o g l o b u l i n ，p o r c i n e b l o o d ，m e p h y p e r c e l ，t h i o p h i l i cm i x e d m o d ea d s o r b e n t i v 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得逝鎏太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：豇甜钳 签字日期： 皿佑年习月 1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝望盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权澎江盘堂可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：左甜甜 导师躲，f i 职1 2 2 、 导师签名：t ( 、。、 签字日期： 勾f 。年弓月f 1 日 签字日期：呵。l 汐年1 7 月日 浙江大学硕士学位论文 致谢 在浙大将近三年的求学经历，将是我一生中宝贵的财富。 首先要特别感谢我的导师林东强教授。三年来的学习和实验工作都是在林老 师的悉心指导下完成的，林老师渊博的知识和丰富的经验给予我的研究工作巨大 的启发与帮助。在林老师身上，我学到了踏实严谨的工作作风和求是创新的科研 精神，此外，从全局上把握，细节处着手，深入的分析问题，灵活的运用经验， 也都将让我受益匪浅。林老师对学生非常关心，不论学习或者生活中，他的勤奋、 乐观和平易可亲深深地感染着我。在此，我向林老师三年以来对我的指导和帮助 表示诚挚的感谢，老师，谢谢您! 此外，非常感谢本课题组其他老师的大力支持。姚善泾教授为我们的科研工 作创造了良好的环境和条件，他以严谨治学的态度为我们竖立了好榜样。关怡新 教授是我的德育老师，在生活上给予了贴心的关怀。梅乐和教授也给我的实验提 出了很多建设性的意见，在这里谢谢各位老师。 感谢2 0 0 4 级本科生尤馨李师妹，2 0 0 5 级本科生胡雨晨师弟以及浙江树人大 学2 0 0 6 级本科生骆晶师妹，他们都参与了部分实验工作，论文的顺利完成与他 们的帮助密不可分。 特别感谢已经毕业的夏海锋师兄，他对我的科研工作提出很多建议，并在实 际操作中给予指导。还有陈振明师兄，也给予我非常多帮助。此外，课题组的赵 瑶、胡升、沈冬钱、余金鹏、朱丽英、杜悦娴、陈慧英、谢瑜亮、马茜岚、李久 红、杜哲、王琪、范恩宇等所有人，也对我的科研和生活提供了无私的帮助。谢 谢你们! 我会永远怀念跟你们在一起共渡的美好时光。 感谢国家高技术研究发展专项经费( 8 6 3 计划，2 0 0 6 a a 0 2 2 2 1 0 ) 和国家自 然科学基金( 2 0 7 7 6 1 2 9 ，2 0 9 7 6 1 5 4 ) 对本课题研究的资助。 感谢我的母亲，她永远是我最坚强的依靠。 感谢所有的朋友。 感谢浙大。 庄甜甜 2 0 1 0 年1 月 i 浙江大学硕士学位论文 1 1 引言 第一章文献综述 随着肉制品工业的迅猛发展，猪血等血液副产品产量急剧增加，提高血液的 综合利用度，充分利用这一宝贵的蛋白资源，开发高附加值产品，具有重要的学 术意义和良好的应用前景。 我国每年出栏生猪约4 亿头，年猪血产量可达1 0 0 万吨以上。目前除部分猪 血被加工成血粉，作为饲料添加剂及用于生化制药外，大部分废弃，造成资源严 重浪费和环境污染，加强猪血资源的综合利用非常重要【l 】。 猪血含有丰富的蛋白质，纤维蛋白原占血浆蛋白的2 5 ，是新一代生物止 血材料纤维蛋白胶的主要组成成分，在临床医学上有巨大的应用前景。猪血免疫 球蛋白( i g ) 含量达2 ，具有抗菌、抗病毒等生物活性，可应用于食品、饲料、医 疗等领域。 混合模式吸附层析是分离免疫球蛋白抗体的新方法，充分结合了疏水基团 的高结合力、含硫基团的高选择性和荷电基团的静电排斥力，是p r o t e i na 亲和 层析的潜在替代方法。混合模式吸附剂又具有耐盐吸附的特性，因此可结合盐析 法对目标蛋白进行分离纯化，简化分离过程，提高分离效率。 本章将从猪血综合利用的现状出发，综述猪血中纤维蛋白原的用途与提取， 免疫球蛋白的功能与分离纯化方法，分析混合模式吸附层析的特点、发展和应用， 从而提出本文的研究思路和研究目标。 1 2 猪血组成及应用现状 1 2 1 猪血组成 猪血由红细胞和血浆组成。猪全血中蛋白质的含量约为1 8 9 ，比鸡蛋高 6 2 ，比大米高1 2 7 t 2 1 。如图1 1 和图1 2 所示：血浆蛋白约占血液总量的4 6 ； 新江大学碰士# 位论文 血浆蛋白中含量最高的是白蛋白，其次为免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n i g ) ，l g 约为血浆蛋白的1 63 ，全血的o 7 5 吐 囤】2 猪血蛋白的组成 f i 9 1 2 c o m p o n e n t s o f p o r c i n eb l o o d p r o t e i n 猪血蛋白中氨基酸含量高达1 4 1 ，是肉、乳、蛋含量的两倍，含有8 种必 需氨基酸。除丰富的蛋白质外，猪血中还含有多种生物酶、低分子氨化物，葡萄 糖、维生素( b i 、b 2 、b 6 、b 1 2 、d ) 微量矿物质( c al8l m 龃。、p9 88 m 班f e i o g m g l ) ，猪血浆中的f e 高达64 。 122 猪血利用 猪血制品目前主要应用于以下几个方面 2 浙江大学硕士学位论文 1 2 2 1 食品工业 猪血最主要的应用领域。利用猪全血可以制作水解蛋白粉，提取蛋白质、氨 基酸，作为食品材料、食品增量剂或者食品添加剂，在一些营养滋补的功能食品 中得到广泛应用。 1 2 2 2 饲料及肥料工业 猪血富含氨基酸，在人工控制条件下，辅以米糠、骨粉等，按照一定比例配 合微生物发酵制成价格低廉、营养丰富的高蛋白饲料，能够最大程度地满足机体 对氮和氨基酸的需求，节约成本，提高经济效益。 利用猪血降解物作为肥料，含有利于植物生长发育的多种氨基酸，且具有改 善土壤品质，降低农药残留的功效【4 1 。 1 2 2 3 生物制品 从猪血中可以提取一些生物活性物质。例如，血红素是抗癌药一一血卟啉的 主要原料；超氧化物歧化酶( s o d ) - 与机体衰老、肿瘤发生、自身免疫性疾病和辐 射防护有密切关系，广泛应用于医药、日用品、食品等行业；猪血清和血浆还用 于疫苗试验。 1 2 3 我国猪血应用现状 我国猪血资源丰富，年产量1 0 0 万n 屯以上，如果进行充分转化和利用，经济 效益相当可观。猪血虽然营养丰富，但色泽差，有较重的血腥味，适口性差，血 红蛋白不易消化吸收，因而未被很好利用1 5 。 我国是猪血资源大国，有肉联厂1 2 0 0 余家，但在猪血资源开发利用上却明 显落后于发达国家 6 i ，许多猪血作为废弃物白白流失。畜血利用仅有数十家，年 产血粉约三千吨。另外少数制成“血豆腐”供人食用，但卫生条件难以控制。大 量肉联厂的猪血几乎全部废弃，既造成资源浪费，又污染环境，直接影响工厂的 经济效益。 3 浙江大学硕士学位论文 影响我国猪血综合利用的制约因素主要有两大方面。首先是生猪屠宰和采血 方式比较落后。由于屠宰和经营比较分散，卫生管理和检疫困难较大，血液的卫 生质量难以保证，影响了血液的规模化处理和血液食品的生产。另外，在技术和 设备方面缺乏系统的研究。 血液是一种结缔组织，本身是一个很复杂的生化系统，正常生理情况下在体 内很稳定，离体后却不稳定，很快发生一系列生化变化，如凝血、溶血、氧化等。 血液是很好的营养基质，离体后易受微生物的侵害而变质，从而失去利用价值。 这就要求血液在采集后很快进行稳定化处理，在保证卫生质量和加工性质的情况 下集中处理，才具有产业化的意义，即具有适当的规模、较高的回收利用率、较 高的产品档次，才会形成明显的经济效益和社会效益【6 1 。 因此，重视猪血资源的综合利用，利用先进技术开发高附加值产品，如血红 素、超氧化物歧化酶、纤维蛋白原、免疫球蛋白等，具有较高的经济效益和社会 效益，具有广阔的市场前景【7 1 。血红素和超氧化物歧化酶的提取已有较多研究， 以下针对纤维蛋白原和免疫球蛋白做进一步展开。 1 3 纤维蛋白原及其分离 1 3 1 纤维蛋白原的功能 纤维蛋白( f i b r i n o g e n ) 是所有凝血因子中含量最高的一种凝血蛋白，含量为 2 4 5 9 l 血浆，由肝细胞和巨核细胞合成。纤维蛋白原是一种大分子的可溶性 糖蛋白，分子量3 3 0 3 4 0 k d a ，等电点5 5 ，沉降常数7 7 7 9 ，5 6 c 以上变性。 纤维蛋白原分子为一个长条状二聚体，长度约5 0 6 0n l t l ，含有3 对多肽键，由二 硫键连接。电镜下，数条肽链形成螺旋盘曲的四级结构，整体呈现团状。 纤维蛋白原是重要的凝血因子之一，在凝血酶的作用下，溶胶状的纤维蛋白 原会生成两种纤维蛋白肽和纤维蛋白分子，后者进一步聚合形成凝胶状血块，促 使血液凝固【8 】。 医学上常用的止血胶便是由纤维蛋白原和凝血酶组成，当凝血x i i i 因子和钙 离子存在时，可形成不溶性纤维蛋白，达到快速局部止血，并具有不透气、不透 4 浙江大学硕士学位论文 液、能生物降解的特点【9 】。正常人血浆内纤维蛋白原含量水平在3 0 0 0 4 0 0 0 m g l l ， 要维持正常的凝血机能，血浆中纤维蛋白原含量必须在1 5 0 0m g l 以上【l o l 。纤维 蛋白原水平的变化不仅与凝血障碍、出血性疾病、弥漫性血管内出血( d i c ) 、应 激等有关，而且与冠心病( c h d ) 、心肌梗死、脑血管病等有关，因而纤维蛋白原 的研究倍受关注。 1 3 2 纤维蛋白胶 纤维蛋白胶( f i b r i ns e a l a n t s ) 作为止血剂和组织黏合剂，正是模仿了凝血过程 中的最后步骤，可以引发纤维蛋白凝聚，从而减少血液流失，使组织边缘伸长， 促进一般伤口的愈合，同时具有良好的组织相容性与可降解性。在外科手术中， 凝血的快慢对手术有着重大的影响。尽早放松止血钳对血管的夹持，不仅可以缩 短手术时间，同时也可有效地防止器官局部缺血而引发的坏死或其他并发症【1 1 】。 纤维蛋白胶由两部分组成。第一部分为浓缩纤维蛋白原、凝血x i i i 因子和抑 肽酶，其中纤维蛋白原含量最为关键，与凝固强度、止血效果、粘合力直接相关。 第二部分含凝血酶和氯化钙。应用时，将两者混合，凝血酶作用于纤维蛋白原， 释放出纤维蛋白a 肽及b 肽，促进纤维蛋白原转化为纤维蛋白，形成纤维蛋白单 体，后者可聚合成不稳定的可溶性纤维蛋白纤维。凝血酶进一步激活凝血x i i i 因 子，活性态的凝血因子x i i i a 在钙离子存在下参与纤维蛋白多肽的交联，形成稳 定的不易降解的凝块【1 2 】。 1 3 3 纤维蛋白原的分离 血浆中纤维蛋白原的分离方法主要有冻融法、有机溶剂沉淀法、聚合物沉淀 法和盐析法。 1 3 3 1 冻融法 纤维蛋白原在低温下会形成絮状沉淀，经过低温冷冻、融化、离心分离，提 取得到纤维蛋白原1 3 】。冻融得到的纤维蛋白原，样品中无任何试剂残留，低温 5 浙江大学硕士学位论文 操作也未对剩余血浆造成不良影响，这对剩余血浆的后续分离比较有利。 1 3 3 2 有机溶剂沉淀法 一些与水互溶的有机溶剂，能够破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质的溶 解度降低而沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等【1 4 】。为了防止蛋白质 在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度一般不能太高( 3 0 一5 0 ) ，且需要在低温 条件下进行。 1 3 3 3 聚合物沉淀法 聚合物沉淀法通常采用聚乙二醇( p e g ) 。p e g 对蛋白有稳定效果，缓慢搅拌 下逐渐增大溶液中的p e g 浓度，蛋白沉淀，通过离心或者过滤得到沉淀，可以 长期保存【15 1 。 1 3 3 4 盐析法 硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐，硫酸铵分级沉淀常作为实验室初步分离蛋 白的重要手段【1 6 】。在规模化生产上，硫酸铵沉淀方法仍存在一些i 口- j 题，如硫酸 铵盐析分离的选择性不高等。也可用其它盐，如硫酸钠，但纯化效果不如硫酸铵。 1 4 猪血免疫球蛋白 1 4 1 免疫球蛋白定义 早在1 8 世纪，生物学家就发现动物机体被细菌感染后，血清中会出现保护 机体的抗菌成份。德国学者b e b r i n g ( 1 8 9 0 ) 将白喉毒素注射给正常动物后，该动 物的血清中产生了一种能够“中和”白喉毒素的物质，这种物质被称为抗毒素 ( a n t i t o x i n ) 。将这种血清转移给未经白喉毒素感染的正常动物后，亦可起到对机 体的保护作用。随后研究者在血清中又发现了其它抗菌成分或与疾病相关的因 子，如杀菌素、溶菌素、沉淀素、溶血素、红斑狼疮因子、类风湿因子等物质， 6 浙江大学硕士学位论文 到二十世纪三十年代，此类抗菌物质的蛋白质本质被逐渐发现，并统称为抗体 ( a n t i b o d y ) 1 刀。 1 9 4 0 年前后，t i s e l i n s 和k a b a t 根据血清自由电泳的研究，发现抗血清中丫 球蛋白的比例要明显高于正常血清，直到六十年代初期，人们都普遍认为所有抗 体都属于丫球蛋白。随后研究证实，抗体存在于仅到丫球蛋白的广泛区域，并且 丫球蛋白并不都具有抗体活性。因此国际卫生组织( 1 9 6 4 ) 和国际免疫协会( 1 9 7 2 ) 将免疫球蛋白定义为抗原刺激应答中，b 淋巴细胞产生的能与相应抗原特异性结 合，产生各种免疫效应( 生理效应) 的一类球蛋白，即i m m u n o g l o b u l i n ，i g ，在这 个意义上，免疫球蛋白与过去命名的抗体通用 1 8 1 。 1 4 2 免疫球蛋白结构 免疫球蛋白相对分子量较大，通常由1 0 0 0 个以上的氨基酸连接而成。在血 清中g 型免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i ng ，i g g ) f f , j 含量最高，研究也最多。1 9 6 3 年，p o r t e r 对i g g 结构提出了一个4 条肽链的模式图( 见图1 3 ) ，其它几种免疫球 蛋白的结构与i g g 相似【例。 一n 图1 3g 型免疫球蛋白分子结构图 f i g1 3m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fi m m u n o g l o b u l i ng i g g 由四条肽链组成，外侧两条较短的为轻链( l i g h tc h a i n ，l 链) ，分子量约 为2 4 k d a ，内侧两条较长的为重链( h e a v yc h a i n ，h 链) ，分子量约为5 5 k d a 。轻、 重链之间和两重链之间由二硫键连接。免疫球蛋白的每一条肽链内，由链内二硫 键连接成几个封闭环结构，每一个结构代表不同的功能k ( d o m a i n ) 。因重链上结 7 浙江大学硕士学位论文 合有不等量的糖，因此i g g 为糖蛋白。 木瓜蛋白酶酶解i g g 时，可以产生两个片断：n 端片断和c 端片断。n 端 片断可结合抗原，称为抗原结合位点，由两个相同的f a b 片断( 抗原结合片断， f r a g m e n ta n t i g e nb i n d i n g ，f a b ) 组成，表示为f ( a b ) 2 。f a b 片断的氨基酸序列随 目标抗原的不同而变化，因此被称为抗体的可变区( v a r i a b l er e g i o n ，v 区) 。每 个f a b 片断含一个完整的轻链和重链靠n 端的一半，通过二硫键结合在一起， 共同完成与抗原决定簇的结合。因此，i g g 能够结合两个抗原，表现为二价。c 端片断含有两条重链的c 端部位，通过二硫键和非共价键结合成一个二聚体f c 片断( 结晶片断，f r a g m e n tc r y s t a l l i z e d ，f c ) 。f c 片断的氨基酸序列基本不随i g g 种类不同而改变，被称为稳定区( c o n s t a n tr e g i o n ，c 区) 。i g g 的f c 片断通常起 到结合补体，激活补体酶系，产生溶菌、溶细胞效应的作用2 0 1 。 1 4 3 免疫球蛋白分类和功能 人类免疫球蛋白包括5 类不同的重链，分别为丫、p 、a 、和6 ，与其相对 应的免疫球蛋白分别命名为i g g 、i g m 、i g a 、i g e 和i g d 。对于同一类免疫球蛋 白，其重链结构也并非完全相同，根据其氨基酸构成和排列顺序的差异可以将其 划分为不同的亚类，如人类i g g 就包括4 个亚类。其它哺乳动物的免疫球蛋白在 类别和分子结构方面与人类相似。 i g g 相对分子量为1 6 0 k d a ，含量为血清的1 5 1 8 ，约占血清蛋白总量的 1 7 ，血清免疫球蛋白总量的7 5 8 0 。i g g 是人类血清中最重要的抗体，在体 液免疫中起着“主力免疫”的作用。 i g g 的免疫功能主要通过以下几种途径实现： ( 1 ) 中和毒素和病毒 一些引起疾病的细菌，如破伤风杆菌、白喉杆菌、志贺氏痢疾杆菌以及内毒 素杆菌等，都能产生外毒素( e x o t o x i n ) ，从而引发疾病。由这些外毒素诱导产生 的i g g 在体内与之结合，使其丧失毒性，起到保护机体的作用。 ( 2 ) 凝集作用和沉淀作用 i g g 分子表现为2 价，能与两个抗原决定簇结合，而细菌和病毒一般都表现 8 浙江大学硕上学位论文 为多价，能与多个抗体结合，因此抗原、抗体相互结合后可形成大的网络结构， 出现凝集、制动和沉淀等现象。 ( 3 ) 激活补体 血清中游离的i g g 不能固定补体，只有在两个以上的i g g 与抗原结合后， 才能固定补体，激活补体。因此当抗原一抗体复合物处于聚集状态时，i g g 能够 与补体结合，激活其生理功能，溶化细菌。 ( 4 ) 亲细胞功能 i g g 可以与巨噬细胞、单核细胞和核嗜中性粒细胞结合，提高这些细胞的吞 噬能力，免疫学上称为“调理作用”。 1 4 4 免疫球蛋白制品及应用 免疫球蛋白广泛应用于开发新型功能性食品添加剂、仔畜饲料以及生化药物 和诊断检测试剂等。例如，可以作为功效因子用于功能性食品开发；作为婴幼儿 食品添加剂，提高婴幼儿防病抗病能力，促进生长；作为活性添加剂用于饲料， 特别是幼畜饲料，降低死亡率和促进生长；作为生物医药产品，医治因肠道致病 菌或病毒引起的腹泻等；用于免疫力低下病人( 如癌症、艾滋病病人) 的辅助治疗； 用于生物检测，如免疫亲和层析、免疫痕迹技术、免疫治疗、免疫诊断等1 2 1 , 2 2 。 免疫球蛋白制品可以利用牛初乳、蛋黄、动物血液分离提取得到。目前市场 上已有多种利用牛初乳分离提取的免疫球蛋白片剂、胶囊和口服液，从血液中提 取的免疫球蛋白制品目前仅在制药行业，食品和保健品方面尚属空白。动物血液 来源广泛，原料成本低廉，被认为是提取免疫球蛋白( 主要是i g g ) t 均良好原料。 其中，猪血中免疫球蛋白( i g ) 含量达2 ，具有广阔的开发前景。 1 4 5 猪血免疫球蛋白的提取 根据蛋白质的分子大小、电荷、溶解度以及免疫学特征等，从血液中提取免 疫球蛋白。常用方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、有机聚合物沉淀法、变性沉淀 法等【2 3 】。 9 浙江大学硕士学位论文 1 4 5 1 盐析法 用于盐析的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠等，其中以硫酸铵最 为常用。具有以下优点：溶解度大( 2 5 。c 时可达4 1 m o u l ) ，随温度变化小；对蛋 白质有保护作用，高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性，价格低廉。硫酸铵盐 析法是由德国科学家h o f m e i s t e r 于1 8 8 8 年最早报道，此后不断得到改正和补充。 缺点是缓冲力比较差，使用前需要调整p h 值，盐析后必须经过充分除盐等1 2 4 1 。 罗磊【2 5 】通过s d s p a g e 研究发现l o 倍稀释猪血清i g g 的最佳沉淀条件为硫酸铵 饱和度3 7 ，p h 7 4 ，i g g 收率8 0 5 ，纯度7 2 9 。 1 4 5 2 有机溶剂沉淀法 常用的试剂是丙酮和乙醇等，其中以乙醇最为常用。冷乙醇分离法提取免疫 球蛋白是由e j c o h n 于1 9 4 9 年提出，用于制备i g g ，不仅分离物质多，分辨率 较高，提纯效果好，而且有抑菌、清除和灭活病毒的作用，但是需要在低温下操 作。陈晓明等2 6 1 用一次低温乙醇沉淀，结合明矾、碱吸附除杂，得到猪血i g g 的纯度达到9 5 t j x 上，回收率5 7 。还有辛酸沉淀法，吴健敏等【2 7 1 先以辛酸去 除犬、兔血清中杂蛋白，上清经d e a e 纤维素吸附得到i g g 的生物活性好，收 率高，但是纯度较低。 1 4 5 3 聚合物沉淀法 常用聚l - - 醇( p e g ) 沉淀，p e g 是非离子型水溶性聚合物，不引起蛋白质变 性，且沉淀时间比硫酸铵和乙醇都短。p o i s o n 用3 5 p e g 8 0 0 0 沉淀脂类，再用 1 2 p e g 沉淀上清中的免疫球蛋白。改进后使用氯仿去脂，1 2 p e g 6 0 0 0 沉淀 免疫球蛋白，该法比单独使用p e g 产量提高了2 7 5 倍【2 羽。 1 4 6 免疫球蛋白的纯化 纯化免疫球蛋白主要通过层析来实现，常见的有凝胶过滤层析、离子交换层 析和亲和层析。 1 0 浙江大学硕士学位论文 1 4 6 1 凝胶过滤层析 凝胶过滤根据样品分子大小不同达到分离目的，对样品分子的活性无影响。 对于i g g 类抗体，通常使用交联葡聚糖凝胶层析，去除电荷性与免疫球蛋白相同 的杂质，如转铁蛋白等。凝胶过滤可以去除二聚体。四聚体和多聚体，通常用于 纯化的最后一步。刘生杰等【2 9 1 通过辛酸法粗提猪血清i g m ，结合s e p h a d e xg 2 0 0 凝胶过滤提纯i g m ，纯度6 3 8 ，得率1 2 8 m g m l 血清。 1 4 6 2 离子交换层析 离子交换层析根据分子荷电性来实现分离纯化免疫球蛋白，常用d e a e 琼脂 糖介质或者葡聚糖介质。带电荷的蛋白质结合在带异种电荷的介质上，通过改变 洗脱液的盐浓度或p h 值来改变蛋白质与介质之间的吸附强度，从而使不同的蛋 白质分别洗脱下来。离子交换层析技术成熟，容量大，收率高，通常作为多步层 析中的第一步。陈天豹等【3 0 】以d e a et o y o p r a r l6 5 0 m 阴离子交换色谱柱一步洗脱 纯化卵黄抗体i g y ，电泳分析纯度达9 3 。 1 4 6 3 亲和层析 亲和层析依照生物大分子特有的生物活性而实现分离，免疫球蛋白纯化常用 p r o t e i na 亲和介质，具有高效、快速、纯度高的优点，但是p r o t e i na 亲和介质 价格昂贵，容量较低，在位清洗困难，需要低p h 洗脱而影响抗体活性，且存在 p r o t e i na 亲和配基脱落等问题。周华蕾等【3 1 】应用p r o t e i na 亲和层析，从小鼠腹 水中纯化出抗凝血因子v i i 单克隆抗体，类别为i g g ，纯度达到电泳纯，特异性 强。 以上传统层析分离方法的诸多缺点限制了免疫球蛋白的大规模化生产，寻求 免疫球蛋白分离的新方法是目前需要解决的问题。混合模式吸附层析正是一种经 济高效的免疫球蛋白分离新技术。 浙江大学硕士学位论文 1 5 混合模式吸附层析 1 5 1 混合模式吸附层析的特点 混合模式吸附层析( m i x e d m o d ea d s o r p t i v ec h r o m a t o g r a p h y ) 是一种新型的层 析分离技术，兼有两种或两种以上的相互作用模式，一般为静电作用和疏水作用。 介质同时结合有疏水配基和离子交换配基，可以利用静电吸引( 或排斥) 来强化吸 附( 或协助洗脱) ，充分结合了疏水基团的高结合力和荷电基团的静电排斥力。混 合模式吸附具有明显的非盐依赖吸附( s a l t i n d e p e n d e n ta d s o r p t i o n ) 特性，在低盐和 高盐条件下，都可以实现对目标物的有效吸附，而解吸一般是通过改变流动相 p h 来实现。混合模式吸附可避免对料液的预处理( 包括稀释、加盐等步骤) ，有 效提高分离效率，减少分离成本。 1 5 2 混合模式吸附层析的发展 混合模式吸附技术的发展历程，大致分为3 个阶段，如图1 4 所示。起源于 “d e t e r g e n t ”型疏水层析，发展为耐盐性混合模式吸附，直到形成新型的疏水性 电荷诱导层析( h y d r o p h o b i cc h a r g ei n d u c t i o nc h r o m a t o g r a p h y ) 。 1 2 浙江人学硕士学位论文 l i i 图1 4 混合模式吸附层析的发展 f i g1 4d e v e l o p m e n to fm i x e d m o d ec h r o m a t o g r a p h y 1 5 2 1“表面活性剂”型疏水作用层析 最初的疏水作用层析吸附剂常常先用溴化氰( c n b r ) 活化，再与疏水性配基偶 联。研究者将这种同时含有亲水和疏水配基的吸附剂形象地称为“表面活性剂” 型疏水吸附剂( “d e t e r g e n t ”h i c ) 3 3 ，利用其特殊的配基结构和基质材料，提供 多种模式的作用力。吸附剂同时提供疏水和静电作用力，低盐条件下表现为离子 交换层析，高盐条件下表现为疏水层析，因此受离子强度的影响较大。 1 5 2 2 耐盐性亲和层析 以p r o t e i n a 为配基的亲和层析是纯化免疫球蛋白抗体的主要途径，比例占 到7 0 8 0 【3 4 1 。亲和层析本质上也是一种多模式共同作用的吸附过程，具有一 定的耐盐特性。蛋白a 对i g g 有很强的亲和力和特异性，在生理p h 下两者紧密 1 3 浙江大学硕士学位论文 结合，p h 降低至2 3 2 5 时，两者又可解离。蛋白a 吸附剂可以直接从初始料 液( 电导率1 3 1 6m s c m ，p h 7 0 ) e e 捕获抗体，具有一定的耐盐吸附特性。正如 前文所述，实际应用中蛋白a 吸附剂存在一些问题，严重限制了蛋白a 吸附剂 的应用。 1 5 2 3 离子交换型混合模式层析 混合模式吸附中，疏水相互作用和离子交换作用最为常见。当溶液中离子强 度较低时，离子交换作用占主导地位，离子强度逐渐增加时，离子交换作用被屏 蔽，疏水作用增强。离子交换型混合模式吸附剂的配基密度、疏水基团与静电基 团之间的比例很重要，对介质与蛋白质之间的相互作用影响最大。h a m i l t o n 等【3 5 】 以烯丙基活化s t r e a m l i n e 空白基质，采用n b s 修饰，偶联苄胺( b a ) ，得到阴离 子交换型吸附剂，用于分离蛋白酶。g a o 等【3 6 】以自制的纤维素不锈钢复合微球 为基质，偶联苄胺，制备离子交换型混合模式吸附剂，考察了牛血清白蛋白( b s a ) 的吸附性能，并用于卵黄抗体的分离【3 7 1